增加纤连蛋白的方法

专利名称：增加纤连蛋白的方法
技术领域：
本发明通常涉及皮肤修复和维护的领域。
背景技术：
改善、维护和修复皮肤的状况由于医学和化装的原因而是重要的。例如，象湿度、紫外线、化装品、疾病、紧张状态、创伤和饮食习惯这些因素可以影响皮肤并且会导致各种皮肤问题。随着年龄增长皮肤弹性也会减小，如皱纹的形成可说明这点。因而，帮助促进、维护和修复皮肤状况的试剂是需要的。
皮肤含有负责维持皮肤弹性特征的弹性蛋白纤维的精细网络结构。然而，响应于各种因素例如过度暴露于太阳光，弹性纤维系统会开始增生、瓦解和最终破坏。这个过程称为光化性弹性纤维病，并且它是皮肤产生皱纹、退色和松弛的主要原因。然而，如同新的成纤维细胞、内皮细胞和角质细胞形式，皮肤能自我修复。不幸的是，随着皮肤衰老其这方面能力开始减弱。因而，需要能促进皮肤例如过早衰老的皮肤生长和修复的试剂。
纤连蛋白(一种糖蛋白)参与包括组织修复、胚胎发生、血液凝固、细胞迁移、伤口修复和细胞粘着的许多细胞过程。有2种主要的纤连蛋白形式(1)用作细胞外基质(ECM)连接体的不溶性糖蛋白二聚体；(2)在血浆中发现的可溶性二硫化物连接的二聚体。ECM形式的纤连蛋白由成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞和某些上皮细胞产生。血浆形式的ECM由肝细胞产生。通过将细胞锚定在胶原蛋白或蛋白聚糖底物上，纤连蛋白可作为普通细胞粘着分子。纤连蛋白也可以通过结合到ECM成分和细胞表面的膜结合纤连蛋白受体上来组织细胞间相互作用。纤连蛋白在胚胎发生期间对细胞的迁移也很重要并且已被认为是在介导各种处理的抗皱和紧肤(skim-firming)效果中起重要作用的蛋白(Chi等人，(2002))。
因而，需要能增加组织中纤连蛋白量的试剂和组合物来维护、促进和修复皮肤状况。这类试剂和组合物将用来治疗、更新和恢复衰老皮肤的状况。
发明概述本发明提供肽和含有这些肽的组合物，所述肽和组合物用作维护健康皮肤和改善皮肤状况的试剂。这些肽和组合物也用作防止和治疗皮肤相关状况例如皱纹的试剂。在本发明的各方面，这些肽和组合物用于加强皮肤、收紧皮肤、更新或恢复皮肤的状况。这些肽和组合物也用作抗衰老治疗和用作治疗光损害(photodamage)皮肤的试剂。预期含有所述肽和组合物的局部洗剂和敷料(dressings)，同样预期使用所述肽和组合物的方法。所述肽和组合物增加了组织中纤连蛋白的量。
本发明的组合物包括具有与横跨基质金属蛋白酶两个球形结构域的连接区域相同或相关的氨基酸序列的肽。已知几种类型的基质金属蛋白酶和其序列，包括基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12和基质金属蛋白酶-13。本发明预期包括具有来自任何基质金属蛋白酶连接区域氨基酸序列的肽的组合物。例如，组合物可包括具有来自基质金属蛋白酶-2序列(SEQ ID NO14)的从大约氨基酸70到大约氨基酸120的任何区域和所有其它基质金属蛋白酶的类似区域的氨基酸序列的肽。
本发明提供了的肽和含有这些肽的组合物，所述肽具有式(I)、(II)、(III)中的任意一个式Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1、Xaa4和Xaa6各自分别是非极性氨基酸；
Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族、非极性或碱性氨基酸；和Xaa10是极性、酸性、碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性、碱性、脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族、脂族、极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族、非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性、极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性、极性、脂族、非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽能增加组织中纤连蛋白的量。
所述肽也能抑制下列基质金属蛋白酶的活性基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12和基质金属蛋白酶-13。在某些实施方案中，所述肽能抑制基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8或基质金属蛋白酶-9的活性。
肽中的非极性氨基酸以是，例如，甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。碱性氨基酸可以是，例如，组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸。半胱氨酸样氨基酸可以是，例如，半胱氨酸、高米胱氨酸、青霉胺或β-甲基半胱氨酸。脂族氨基酸可以是，例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸。酸性氨基酸可以是，例如，天冬氨酸或谷氨酸。极性氨基酸可以是天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，或非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。芳族氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸，4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯并噻吩丙氨酸(benzothienyl alanine)。
本发明也提供含有式(IV)的肽(SEQ ID NO18)的组合物Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaam-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)其中Xaaa是脯氨酸；Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是苏氨酸；Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaa4是甘氨酸；Xaae是天冬氨酸或谷氨酸； Xaa5是缬氨酸或天冬酰胺；Xaaf是亮氨酸；Xaa6是脯氨酸；Xaag是天冬氨酸； Xaa7是天冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸； Xaa8是缬氨酸或亮氨酸；Xaai是天冬酰胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸；Xaaj是苏氨酸；Xaa10是天冬酰胺或精氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸； Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸；Xaa12是天冬酰胺或谷氨酰胺；Xaam是苏氨酸或丙氨酸；Xaa13是苯丙氨酸或苏氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa14是苯丙氨酸；Xaao是精氨酸；Xaa15是脯氨酸或谷氨酸；Xaap是赖氨酸或苏氨酸；Xaa16是精氨酸或甘氨酸；Xaa17是赖氨酸或天冬氨酸； Xaa18是脯氨酸或亮氨酸；Xaa19是赖氨酸；和其中所述肽能增加组织中纤连蛋白的量。所述肽也能抑制基质金属蛋白酶的活性。所述基质金属蛋白酶可以是基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13。在某此实施方案中，除了增加组织中纤连蛋白的量外，所述肽还抑制基质金属蛋白酶-2或基质金属蛋白酶-9。
肽所来源的连接区域具有，例如，在SEQ ID NO14的从大约位置70到大约位置120间的氨基酸序列，和其它基质金属蛋白酶的类似区域。在本发明的某些实施方案中，所述肽具有在SEQ ID NO14的从大约位置77到大约位置110间的氨基酸序列，和其它基质金属蛋白酶的类似区域。一些所述肽的例子包括那些含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12或SEQ ID NO13所列氨基酸序列的肽。这些肽中的任何一个可用于本发明的实践。
肽对不同的基质金属蛋白酶具有不同的亲和力。例如，在本发明的一个实施方案中，所述肽可以以大约1.0μM到大约500.0μM的Ki抑制基质金属蛋白酶-2。在另一个实施方案中，所述肽可以以大约1.0μM到大约400.0μM的Ki抑制基质金属蛋白酶-2。而在另一个实施方案中，所述肽可以以大约1.0μM到大约50.0μM的Ki抑制基质金属蛋白酶-2。
本发明进一步提供了包含治疗有效量的肽和药物学可接受载体的组合物。也预期伤口治疗和皮肤洗剂。
本发明进一步提供了用于治疗伤口或逆转衰老效应的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的式I、II、III或IV的肽
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO21)其中Xaa1、Xaa4和Xaa6各自分别是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族、非极性或碱性氨基酸；和Xaa10是极性、酸性、碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性、碱性、脂族或非极性或酸性氨基酸；Xaa13是芳族、脂族、极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族、非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性、极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性、极性、脂族、非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；Xaaa是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸；Xaac是苏氨酸；
Xaad是甘氨酸；Xaae是天冬氨酸或谷氨酸；Xaaf是亮氨酸；Xaag是天冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸；Xaai是天冬酰胺或丙氨酸；Xaaj是苏氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸；Xaam是苏氨酸或丙氨酸；Xaan是甲硫氨酸；Xaao是精氨酸；和Xaap是赖氨酸或苏氨酸；其中所述肽能增加组织中纤连蛋白的量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于在哺乳动物皮肤中增加纤连蛋白量的方法，所述方法包括给皮肤施用治疗有效量的肽，所述肽为SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12或SEQ ID NO13所列的肽。
附图描述

图1提供了选择的MMP酶原的横跨切割区域的CLUSTALXTM(版本1.8)多序列比对。图1A提供了突出保守残基的比对。‘*’表示序列之间的完全相同，‘:’表示7/9保守的位置，和‘.’表示具有最保守取代的大于80％相同的位置。图1B表示粗体标记的异质位置。
图2提供了MMP-1原(蛋白数据库文件1FBL.ENT)的结构。显示于表1中的SEQ ID NOS2-10的区域横跨两个大结构域之间的短区域。在活化期间这个区域被切割。
图3提供MMP-9的三维模型。产生活性蛋白酶N末端的切割区域用双向影线显示。两个锌原子用球体表示。切割结构域肽可在其在酶原中正常位置的附近连接到MMP上。该结合(也邻近起催化作用的锌)在空间上封闭了活性位点部分。该封闭防止底物结合。
图4表示用19-聚体(SEQ ID NO11)抑制MMP-9的活性。将MMP-9与19-聚体在FRET测定前混合。19-聚体的浓度如下0mM(实心圆圈)、0.01mM(空心圆圈)、0.03mM(实心正方形)、0.06mM(空心正方形)、0.125mM(实心三角形)、0.25mM(空心三角形)、0.5mM(x’s)、1mM(实心倒三角形)、2mM(空心倒三角形)。
图5表示用10-聚体抑制MMP-9的活性。将MMP-9与10-聚体在FRET测定前混合。10-聚体的浓度如下0mM(实心三角形)、0.25mM(空心三角形)、0.5mM(空心倒三角形)、1.0mM(实心倒三角形)、2.0mM(x’s)。
图6表示用9-聚体抑制MMP-9的活性。将MMP-9与9-聚体在FRET测定前混合。9-聚体的浓度如下0mM(实心三角形)、0.25mM(空心三角形)、0.5mM(空心倒三角形)、1.0mM(实心倒三角形)、2.0mM(x’s)。
图7表示用19-聚体(SEQ ID NO11)抑制MMP-9的活性。将MMP-9与19-聚体在荧光胶原蛋白测定前混合。19-聚体的浓度如下0mM(实心圆圈)、0.06mM(空心菱形)、0.1mM(空心正方形)、0.25mM(空心圆圈)、0.5mM(x’s)。
图8表示用19-聚体(SEQ ID NO11)对MMP-9活性的更长时程的抑制。将MMP-9与19-聚体在荧光胶原蛋白测定前混合。19-聚体的浓度如下0mM(实心圆圈)、0.06mM(空心菱形)、0.1mM(空心正方形)、0.25mM(空心圆圈)、0.5mM(x’s)。
图9表示用10-聚体(SEQ ID NO11)对MMP-9活性的更长时程的抑制。将MMP-9与10-聚体在荧光胶原蛋白测定前混合。10-聚体的浓度如下0mM(空心圆圈)、0.1mM(空心菱形)、0.2mM(空心正方形)、0.4mM(x’s)。
图10表示用9-聚体对MMP-9活性的更长时程的抑制。将MMP-9与9-聚体在荧光胶原蛋白测定前混合。9-聚体的浓度如下0mM(实心圆圈)、0.06mM(空心菱形)、0.1mM(空心正方形)、0.25mM(空心圆圈)、0.5mM(x’s)。
图11提供了一般剪接反应的HPLC洗脱图。箭标表示第一个峰在所述反应过程中面积下降(MMP-9原(pro-MMP-9)峰)，而第二部分两个峰(分别为成熟MMP-9和N末端切割产物)的面积增加。
图12表示通过stromilysin将MMP-9原转化成N末端和C末端结构域。MMP-9原在0(实心圆圈)、0.5μM(空心正方形)或1.0μM(实心正方形)19-聚体(SEQ ID NO11)存在的情况下与stromilysin反应。在指定的时间点，取出等分试样并进行HPLC。将MMP原峰面积积分并且对0时间点的样品设定为100％。空心圆圈表示温育在不含stromilysin或19-聚体(SEQ ID NO11)的缓冲液中的MMP原。
图13A提供19-聚体(SEQ ID NO11)和MMP-9相互作用的等温滴定量热分析。各峰显示通过注射和随后的结合反应产生的热。图13B提供了通过对时间积分来自图13A中的各注射峰值产生的结合等温线。
图14提供了19-聚体(SEQ ID NO11)和MMP-2相互作用的等温滴定量热分析。图14A提供了在25℃时将19-聚体(1mM)滴定到二甲基胂酸盐(pH6.8)、10mM NaCl中的MMP-2(20μM)的原始等温量热数据。各峰表示通过注射和随后的结合反应产生的热量。图14B提供了通过对时间积分来自图14A中的各注射峰值产生的结合等温线。
图15提供了当19-聚体(SEQ ID NO11)流过固定的MMP-9表面时产生的表面等离子体共振结合等温线。
图16提供的条形图表示相对于正对照，用两种浓度的肽处理后的皮肤模型中活细胞的百分比。第一个用磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理的样品是用于建立表示100％生存力的细胞计数的正对照。第二个样品是显示所述测定可检验细胞死亡的负对照，其中细胞暴露于1％Triton-X100。接下来的三个样品是以500μM浓度使用的19-聚体(SEQID NO11)、10-聚体(SEQ ID NO13)和9-聚体(SEQ ID NO12)。最后三个样品是以2mM浓度使用的19-聚体、10-聚体和9-聚体。显示的数据表示三个检验的平均值。
图17图示了在db/db糖尿病小鼠中伤口愈合的时程。图表显示用正常盐水(空心圆圈)或20μg/mL 19-聚体(实心圆圈)处理的小鼠相对于受伤后天数的相对平均伤口面积。提供的数据表示来自10个受试动物的平均相对伤口直径。
图18图示了在19-聚体(SEQ ID NO11)存在和不存在时正常人皮肤成纤维细胞(Clonetics，CC-2509)的增殖。通过在三种不同浓度下490nm的光密度(OD)测量值检测细胞生长。标记“19聚体6”的条形反映19-聚体以1×10-6M浓度存在的情况下细胞的生长。标记“19聚体5”的条形反映19-聚体以1×10-5M浓度存在的情况下细胞的生长。标记“19聚体4”的条形反映19-聚体以1×10-4M浓度存在的情况下细胞的生长。“对照”细胞在不添加肽的情况下生长。
图19图示了正常人角质细胞在19-聚体(SEQ ID NO11)存在和不存在情况下的增殖。如所描述的，19-聚体导致角质细胞以剂量依赖性方式加速生长。不加19-聚体的对照细胞具有最低的细胞密度。接受低至1×10-5M 19-聚体(19聚体5)的细胞展现出显著大于(P＜0.01)不接受19-聚体细胞的细胞密度。接受1×10-4M 19-聚体(“19聚体4”)的细胞展现出甚至更快的细胞生长(P＜0.001)。然而，接受1×10-6M 19-聚体(“19聚体6”)的细胞只展现出在统计学上不显著的少量细胞增殖(P＞0.05)。
图20描述了用于正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)迁移测定的48孔趋化性室(Neuroprobe，Inc.)。
图21A和21B表示正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的迁移。图21A显示无NHDF存在时用于迁移测定的具有8μm孔(显示为圆圈)的膜(300X放大率)。图21B的图显示在NHDF迁移后的膜，所述NHDF的迁移是由于加入正对照化合物(1.25μg/mL血浆纤连蛋白)引起的。这张照片是用300X放大率拍摄的。将NHDF的核染成紫色。一些NHDF已经迁移穿过所述膜，而其它的似乎陷在8μm孔中。
图22提供的条形图表示相对于暴露于正对照(血浆纤连蛋白)或各种浓度19-聚体下的NHDF迁移，正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)迁移的百分比。因为某些趋化性物质具有非常窄范围的活性浓度，所以将稀释10倍的19-聚体(SEQ ID NO11)用于初始实验。显示了三个独立实验的平均值(100μg/mL的数据是六个实验的平均值)。1000和100μg/mL浓度的19-聚体对成纤维细胞具有趋化性(分别是正对照的55±3％和46±3％)。使用小于100μg/mL浓度19-聚体的成纤维细胞迁移实验大约地比负对照高2倍并且不被认为是显著的。
图23提供的条形图表示在各种浓度19-聚体(SEQ ID NO11)和其衍生物时相对于暴露于正对照(纤连蛋白)的NHDF迁移的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)迁移的百分比。在100μg/mL时，乙酰化的19-聚体(Ac-19-聚体)触发NHDF迁移的程度与19-聚体大致相同，但在更高浓度，Ac-19-聚体并不同样有效。9-聚体和10-聚体只在1000μg/mL时触发NHDF迁移。有趣的是，在任何浓度下14-聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)肽对NHDF均没有趋化性(数据没有显示)。14-聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)的肽序列来源于MMP酶，只是起点上稍微更靠近N末端。因而，所述肽的氨基酸序列对NHDP迁移诱导很重要。
图24提供的条形图表示加入19-聚体(SEQ ID NO11)导致在人皮肤成纤维细胞中增加胶原蛋白的生产。不加入19-聚体的对照人皮肤成纤维细胞只产生较低量的胶原蛋白。相反地，接受少至1×10-6M的19-聚体(19聚体6)或1×10-5M的19-聚体(19聚体5)的细胞表现出比没有接受19-聚体的细胞显著更高的密度(p＜0.001)。
图25提供的条形图表示加入19-聚体(SEQ ID NO11)导致在人皮肤成纤维细胞中增加的胶原蛋白。与没有接受19-聚体(对照)的细胞相比，接受1×10-6M的19-聚体(19聚体6)的细胞表现显著更大的密度(p＜0.05)，接受1×10-5M 19-聚体(19聚体5；P＜0.001)和接受1×10-4M19-聚体(19聚体4，P＜0.001)的细胞也表现同样的效果。
发明详述本发明提供肽和含有这些肽的组合物，所述肽和组合物用作维护健康皮肤和促进皮肤状况的试剂。这些肽和组合物用作防止和治疗皮肤相关状况例如皱纹的试剂。所述肽和组合物增加组织中纤连蛋白的量。在本发明的一些实施方案中，所述肽和组合物也抑制基质金属蛋白酶的活性基质金属蛋白酶在体内作为无活性的酶原产生。酶原的蛋白水解切割导致成熟基质金属蛋白酶的活化和形成。切除的肽序列是长度大约100到110个氨基酸的酶原前导序列，发现该序列最靠近所述蛋白的氨基末端。这些酶原的前导肽可封闭基质金属蛋白酶的活性位点并且抑制所述基质金属蛋白酶的活性。基质金属蛋白酶酶原的前导肽的施用减小了细胞外基质的破坏速率并提供更快的伤口愈合速率。
绝大多数抑制策略涉及阻止带有有机小分子的基质金属蛋白酶的酶促活性。这些化合物通常对身体有毒性并且不是天然存在的分子。使用天然的肽抑制活化的基质金属蛋白酶可在没有毒性副作用的情况下提供高度的蛋白酶控制。与小分子抑制策略不同，在本发明的某些实施方案中，所述肽可用来同时抑制单个或所有基质金属蛋白酶类的活化。
所述肽可以很自由地导到皮肤、进入伤口环境或可通过皮肤覆盖物(covering)或创伤敷料限制或递送。
某些实施方案中，本发明提供了对愈合慢性伤口和改善衰老效应的蛋白酶活性水平的高度控制。例如，如在慢性伤口愈合过程中要求一定量的蛋白酶水平(Agren等人，1999)，本领域技术人员可选择只是部分地抑制蛋白酶活性。通过调节所用抑制剂肽的种类和量，就可控制基质金属蛋白酶被抑制的程度。
肽根据本发明，含有在切割位点区域具有与基质金属蛋白酶酶原前导序列相关序列的肽的组合物用于维护健康皮肤和促进皮肤状况。这些肽和组合物也用作防止和治疗皮肤相关状况例如皱纹的试剂。这些肽增加了组织中纤连蛋白的量。所述肽也可抑制许多种类基质金属蛋白酶的活性，并提高成纤维细胞和角质细胞的生长和迁移。
所述基质金属蛋白酶酶原前导序列被切割的位置大致是在所述酶原氨基酸序列的氨基酸位置110。所述肽具有与在酶原氨基酸位置70到大致氨基酸位置120以内的任何区域相关的序列。这些肽可抑制多种基质金属蛋白酶的活性。所述肽也可以阻止基质金属蛋白酶酶原的活化以及抑制成熟基质金属蛋白酶的酶促活性。含有在各种基质金属蛋白酶中更保守序列(例如朝向切割区域N末端一侧的序列)的肽可用于提供通常有效对抗各种基质金属蛋白酶的抑制剂。然而，含有较不保守序列(例如朝向所述切割区域C末端一侧的序列)的肽可用来提供对单个基质金属蛋白酶特异的抑制剂。
因此，本发明预期包含来自基质金属蛋白酶的任何酶原前导区域序列的肽以及包含一个或更多个取代基质金属蛋白酶中天然存在氨基酸的氨基酸的变体肽。具有不同序列的肽的混合物也是预期的。
总之，所述肽、肽的变体和肽的混合物以最优化伤口愈合、皮肤再生、防止结疤或逆转和防止形成皱纹的方式来配制和使用。因而，可改变本发明肽的组合物和制剂，以便获得更低或更高的纤连蛋白水平，只要提高愈合和抗衰老即可。
肽的大小可以变化。总之，只有大约5个氨基酸的肽可能太小而不能提供纤连蛋白的最佳增长。然而，多于大约8到9个氨基酸的肽，其长度足以提供纤连蛋白的增加。因而，尽管总体长度不是关键的，但在本发明中通常使用比8个氨基酸更长的的肽。其它应用于本发明的肽长度超过9个氨基酸。其它应用于本发明的肽长度超过10个氨基酸。更有甚者，长度超过大约15个氨基酸的肽也用于本发明。肽大小上没有特定的上限。然而，通常制备较短肽要比制备较长肽便宜。因而，所述肽通常短于大约100个氨基酸。许多用于本发明的肽短于大约50个氨基酸。其它用于本发明的肽短于大约30个氨基酸。短于大约25个氨基酸的肽也可以使用。类似地，短于大约23个氨基酸的肽也可用于本发明。用于实践本发明的肽的例子有SEQ ID NO11，其具有19个氨基酸。
表1提供了几个来自酶原的从大致氨基酸位置70到大致氨基酸位置120的代表性基质金属蛋白酶的序列。
表1基质金属蛋白酶切割区域的序列
表1中所列的各肽，以及具有SEQ ID NO1、11、12和13的肽，预期作为应用于本发明实践的肽。此外，具有SEQ ID NO1-13任一项的肽的变体和衍生物也是有用的。只要所述肽的变体或衍生物能增加组织中的纤连蛋白，这类肽的变体和衍生物可具有一个或更多个氨基酸取代、缺失、插入或其它修饰。
所述分离的肽的氨基酸残基可以是遗传编码的L氨基酸、天然存在的非遗传编码的L氨基酸、合成的L氨基酸或上述任何氨基酸的D型对映异构体。此处用于20种遗传编码的L氨基酸和常见非编码氨基酸的氨基酸符号是常规的并且于表2中显示。
表2
在本发明范围内的肽可具有一个或更多个用具有类似化学和/或物理性质的氨基酸取代的氨基酸，只要这些变体或衍生肽保持增加组织中纤连蛋白的能力即可。这些肽也可以抑制基质金属蛋白酶的活性，刺激成纤维细胞或角质细胞的细胞生长或刺激成纤维细胞的细胞迁移。
可相互取代的氨基酸通常位于相似的类或亚类。正如本领域技术人员所知道的，氨基酸可分为三个主要的类亲水性氨基酸、疏水性氨基酸和半胱氨酸样氨基酸，这主要依赖于所述氨基酸侧链的特征。这些主要的类可进一步分成亚类。亲水性氨基酸包括具有酸性、碱性或极性侧链的氨基酸而疏水性氨基酸包括具有芳族或非极性侧链的氨基酸。其中非极性氨基酸可进一步分成包括脂族氨基酸。此处使用的氨基酸类的定义如下“疏水性氨基酸”是指具有在生理pH下不带电荷并且被水溶液排斥的侧链的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸的例子包括Ile、Leu和Val。非遗传编码的疏水性氨基酸的例子包括t-BuA。
“芳族氨基酸”是指具有含有至少一个具有共轭π电子系统的环(芳基)的侧链的疏水性氨基酸。芳基可进一步用基团例如烷基、链烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基和氨基基团以及其它基团取代。遗传编码的芳族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。通常遇到的非遗传编码的芳族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
“非极性氨基酸”是指具有在生理pH下通常不带电荷和没有极性的侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的非极性氨基酸的例子包括甘氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。非遗传编码的非极性氨基酸的例子包括Cha。
“脂族氨基酸”是指具有饱和或不饱和的直链、分支或环状烃侧链的非极性氨基酸。遗传编码的脂族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非编码的脂族氨基酸的例子包括Nle。
“亲水性氨基酸”是指具有被水溶液所吸引的侧链的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸的例子包括Ser和Lys。非编码的亲水性氨基酸的例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”是指具有pK值小于7的侧链的亲水性氨基酸。由于氢离子的丢失，酸性氨基酸在生理pH下通常具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸盐)和谷氨酸(谷氨酸盐)。
“碱性氨基酸”是指具有pK值大于7的侧链的亲水性氨基酸。由于缔合有水合氢离子，碱性氨基酸在生理pH下通常具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非遗传编码的碱性氨基酸的例子包括非环状氨基酸鸟氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“极性氨基酸”是指具有在生理pH下不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，但所述侧链中所含的某一键中通常由两个原子共有的电子对被其中一个原子结合得更紧密一些。遗传编码的极性氨基酸的例子包括天冬酰胺和谷氨酰胺。非遗传编码的极性氨基酸的例子包括瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
“半胱氨酸样氨基酸”是指具有能与另一个氨基酸残基的侧链形成共价连接例如二硫键的侧链的氨基酸。一般地，半胱氨酸样蛋白通常具有含有至少一个硫羟(SH)基团的侧链。遗传编码的半胱氨酸样氨基酸的例子包括半胱氨酸。非遗传编码的半胱氨酸样氨基酸的例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
如本领域技术人员所意识到的，上述分类不是绝对的。几种氨基酸展现出超过一种特征性质，因而可以归入超过一种类别。例如，酪氨酸同时具有芳环和极性羟基基团。因此，酪氨酸具有双重性质并且可归入芳族类和极性类。类似地，除了能形成二硫键外，半胱氨酸也具有非极性特征。因此，尽管不很严格地分类为疏水性或非极性氨基酸，但在许多情况下半胱氨酸可用于将疏水性赋予肽。
某些通常遇到的非遗传编码的和可在肽和肽类似物中存在或取代氨基酸的氨基酸包括，但不限于β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-氨基酸例如3-氨基丙氨酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)、ε-氨基己酸(Aha)、δ-氨基戊酸(Ava)、甲基甘氨酸(MeGly)、鸟氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、叔丁基丙氨酸(t-BuA)、叔丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、环己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl)、2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))、3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、青霉胺(Pem)、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸(Tic)、β-2-噻吩丙氨酸(Thi)、甲硫氨酸亚砜(MSO)、高精氨酸(hArg)、N-乙酰赖氨酸(AcLys)、2，3-二氨基丁酸(Dab)、2，4-二氨基丁酸(Dbu)、ρ-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))、N-甲基缬氨酸(MeVal)、高半胱氨酸(hCys)和高丝氨酸(hSer)。这些氨基酸也落在上面定义的类别中。
表3概述了上述遗传编码和非编码的氨基酸的分类。应当理解表3只是用于说明目的，而并不意味着是可包括在此处描述的肽和肽类似物的氨基酸的完全列表。其它用于制备此处描述的肽和肽类似物的氨基酸残基可见于，例如在Fasman，1989，CRC Practical Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc.和其中引用的文献。在这里没有特别提到的氨基酸可以根据与明确鉴定的氨基酸相比已知的行为和/或它们的特征性化学和/或物理特性方便地分成上述类型。
表3
肽可以通过用任何相似类型的氨基酸取代任意氨基酸以产生变体或衍生肽，只要所述肽变体和衍生物保持增加组织中纤连蛋白的能力。
在一个实施方案中，所述组合物包含含有式I、II或III中任意一个式的肽。
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6Xaa7-Xaa8-Xaa9(I)Xaa10-Xaa11-Xaa12Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(II)
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1、Xaa4和Xaa6各自分别是非极性氨基酸，例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸；Xaa2碱性氨基酸，例如，组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸，例如，半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺或β甲基半胱氨酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸，例如，极性氨基酸例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高半胱氨酸，或脂族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸；Xaa7是酸性氨基酸，例如，天冬氨酸或谷氨酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸，例如脂族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸，或极性氨基酸例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸；Xaa9是脂族、非极性或碱性氨基酸，例如，脂族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸，非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，或碱性氨基酸例如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸；Xaa10是极性、酸性、碱性或非极性氨基酸，例如，极性氨基酸例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，酸性氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸，碱性氨基酸例如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸，或非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸；Xaa11是极性氨基酸或芳族氨基酸，例如，极性氨基酸例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，或芳族氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯并噻吩丙氨酸；Xaa12是极性、碱性、脂族或非极性氨基酸，例如，极性氨基酸例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，或碱性氨基酸例如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸，或脂族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸，或非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸；Xaa13是芳族、脂族、极性或酸性氨基酸，例如，芳族氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯并噻吩丙氨酸，或脂族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸，或极性氨基酸例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，或酸性氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸；Xaa14是芳族、非极性或极性氨基酸，例如，芳族氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯并噻吩丙氨酸，或非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，或极性氨基酸例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸，例如，非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，或酸性氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸；Xaa16是碱性、极性或非极性氨基酸，例如，碱性氨基酸例如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸；或极性氨基酸例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，或非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸；Xaa17是碱性、极性、脂族、非极性或酸性氨基酸，例如，碱性氨基酸例如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、瓜氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸，或极性氨基酸例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，或脂族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸，或非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，酸性氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸，例如，非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸，或脂族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸；和Xaa19是碱性或脂族氨基酸，例如，碱性氨基酸如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸，或脂族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸。
在某些实施方案中Xaa1是脯氨酸，Xaa2是精氨酸，Xaa3是半胱氨酸，
Xaa4是甘氨酸，Xaa5是缬氨酸或天冬酰胺，Xaa6是脯氨酸，Xaa7是天冬氨酸，Xaa8是缬氨酸、亮氨酸或丝氨酸，Xaa9是丙氨酸、甘氨酸或组氨酸，Xaa10是天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸，Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸，Xaa12是天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或甲硫氨酸，Xaa13是苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸或谷氨酸，Xaa14是苯丙氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，Xaa15是脯氨酸或谷氨酸，Xaa16是精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸，Xaa17是赖氨酸、苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺，Xaa18是脯氨酸或亮氨酸，和Xaa19是赖氨酸、缬氨酸或精氨酸。
在本发明的某些实施方案中，组合物可包含含有SEQ ID NOs 1-13中任意一个序列的肽。例如，本发明的一些组合物包含具有SEQ IDNO11(PRCGNPDVANYNFFPRKPK)的19个氨基酸的肽。该肽横跨MMP-2的切割位点。表示SEQ ID NO11肽两个一半的两个更小的肽(PRCGNPDVA(SEQ ID NO12))NYNFFPRKPK(SEQ IDNO13))也可以包含于组合物中。组合物也可以包括多于一个肽的组合。
具有与基质金属蛋白酶切割区域相关的序列单个肽可用于增加组织中的纤连蛋白，并且也可以抑制单个或只是少数基质金属蛋白酶的活性。这种单个肽的制剂可抑制一个或更多个但通常不是全部基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶活性的这种部分抑制可有助于愈合。可选择地，可将两个或更多个肽组合以靶向两个或更多个基质金属蛋白酶，这样可提供更完全的对基质金属蛋白酶活性的抑制。
通过使用可获得的教导并结合此处提供的教导，本领域技术人员可设计包含合适肽或肽的组合的组合物以获得大量想要的纤连蛋白。
通过使用可获得的指导并结合此处提供的指导，本领域技术人员可设计包含合适的肽或肽的组合的组合物来获得想要的基质金属蛋白酶被抑制的质和量。抑制的“质”是指受抑制的基质金属蛋白酶的类型。不同的基质金属蛋白酶可具有略微不同的底物和活性位点。抑制的“量”是指对所有基质金属蛋白酶抑制的总量。可通过调节所使用的肽抑制剂的类型和量来调节抑制的质和量。本领域技术人员可容易地修饰由本发明提供的肽并且观察给定的基质金属蛋白酶受抑制的类型和程度。
例如，本领域技术人员可比较和比对图1中显示的肽序列并且设计肽抑制剂以获得想要的抑制的质和量。在一个实施方案中，以举例的方式提供，比较三个伤口位点基质金属蛋白酶mmp2、mmp9和mmp1的比对的氨基酸序列以鉴定序列上的同源区域和趋异区域。
MMP序列SEQ ID NOmmp2MUKFFGLFQTGDLDQNTIETMRKPRCGNPDVANYNFFPRKPKW NO15mmp9LQKQLSLPETGELDBATLKAMRTPRCGVPDLGRFQTFEGDLKW NO16mmp1MQEFFGLKVTGKPDAETLKVMKQPRCGVPDVAQFVLTEGNPRW NO17在这个序列比对中，粗体表示在MMP-1中发现的而在MMP-2或MMP-9中未发现的氨基酸，并且下划线表示在MMP-1中并且仅在MMP-2或MMP-9中发现的氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，除了增加组织中纤连蛋白，也需要抑制MMP2和MMP9，但要保持MMP-1的水平相对不受调节以愈合慢性伤口。基于上述的序列比对，本领域技术人员可设计具有在MMP2和MMP9酶原序列中发现的但在MMP1酶原序列中没有的氨基酸的肽，以产生可抑制MMP2和MMP9同时使MMP1不受抑制的肽。由式IV提供这样的肽。
Xaaa-Xaab-Xaac-Xaad-Xaae-Xaaf-Xaag-Xaah-Xaai-Xaaj-Xaak-XaaL-Xaam-Xaan-Xaao-Xaap-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(IV)(SEQ ID NO18)
其中Xaaa是脯氨酸；Xaa1是脯氨酸；Xaab是谷氨酰胺或谷氨酸； Xaa2是精氨酸；Xaac是苏氨酸；Xaa3是半胱氨酸；Xaad是甘氨酸；Xaa4是甘氨酸；Xaae是天冬氨酸或谷氨酸； Xaa5是缬氨酸或天冬酰胺，理想地是天冬酰胺；Xaaf是亮氨酸；Xaa6是脯氨酸；Xaag是天冬氨酸； Xaa7是天冬氨酸；Xaah是谷氨酰胺或丝氨酸； Xaa8是缬氨酸或亮氨酸，理想地是亮氨酸；Xaai是天冬酰胺或丙氨酸； Xaa9是丙氨酸或甘氨酸，理想地是甘氨酸；Xaaj是苏氨酸；Xaa10是天冬酰胺或精氨酸；Xaak是异亮氨酸或亮氨酸， Xaa11是酪氨酸或苯丙氨酸，理想地是异亮氨酸； 理想地是酪氨酸；XaaL是谷氨酸或赖氨酸，Xaa12是天冬酰胺或谷氨酰胺；理想地是谷氨酸； Xaa13是苯丙氨酸或苏氨酸；Xaam是苏氨酸或丙氨酸；Xaa14是苯丙氨酸；Xaan是甲硫氨酸； Xaa15是脯氨酸或谷氨酸，理想地是脯氨酸；Xaao是精氨酸；Xaa16是精氨酸或甘氨酸，理想地是精氨酸；Xaap是赖氨酸或苏氨酸；Xaa18是脯氨酸或亮氨酸，Xaa17是赖氨酸或天冬氨酸； 理想地是亮氨酸；和Xaa19是赖氨酸。
肽的修饰本发明也预期对所述肽进行修饰以稳定它们、促进它们的摄取和吸收、并改善本领域技术人员所知的所述肽的任何其它特征或性质。例如，可环化所述肽，中和所述肽上的电荷和将所述肽与其它化学部分连接。
可通过任何本领域技术人员可获得的方法环化肽。例如，通过已知的方法可将N末端和C末端缩合以形成肽键。也可连接存在于肽中氨基酸侧链上的官能团以环化所述肽。例如，可形成共价键的官能团包括--COOH和--OH、--COOH和--NH2以及--COOH和--SH。可用于环化肽的氨基酸对包括Asp和Lys、Glu和Lys、Asp和Arg、Glu和Arg、Asp和Ser、Glu和Ser、Asp和Thr、Glu和Thr、Asp和Cys以及Glu和Cys。其它能与另一个氨基酸形成共价键的氨基酸残基的例子包括半胱氨酸样氨基酸例如Cys、hCys、β-甲基-Cys和Pen，所述氨基酸相互可形成二硫键。想要的半胱氨酸样氨基酸残基包括Cys和Pen。其它可用于肽环化作用的氨基酸对对本领域技术人员而言是显而易见的。
用于环化肽的基团不必是氨基酸。能够与肽的氨基末端形成共价键的官能团的例子包括羧酸和酯。能够与肽的羧基末端形成共价键的官能团的例子包括--OH、--SH、--NH2和--NHR，其中R是(C1-C6)烷基、(C1-C6)链烯基和(C1-C6)炔基。
两个具有适合于形成这种互连的官能团的侧链之间的各种反应以及适合于形成这种互连的反应条件对于本领域技术人员而言是显而易见的。用于环化肽的想要的反应条件要足够温和以免降解或破坏所述肽。用于必要时保护各种功能性的合适的基团在本领域是熟知的(参见，例如Greene&Wuts，1991，第2版，John Wiley&Sons，NY)，同时各种用于制备这类保护分子的反应方案在本领域也是熟知的。
在一个实施方案中，N末端和C末端的电荷被有效去除。可通过本领域技术人员可获得的任何方法例如，通过乙酰化N末端和酰胺化C末端可实现之。
用于通过其它方式制备环肽和修饰肽的方法在本领内是熟知的(综述参见，例如，Spatola，1983，Vega Data 1(3))；Spatola，1983，“PeptideBackbone Modifications”InChemistry and Biochemistry of AminoAcids Peptides and Proteins(Weinstein，ed.)，Marcel Dekker，NewYork，p.267(综述)；Morley，1980，Trends Pharm.Sci.1463-468；Hudson等人，1979，Int.J.Prot.Res.14177-185(--CH2NH--、--CH2CH2--)；Spatola等人，1986，Life Sci.381243-1249(--CH2--S)；Hann，1982，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.1307-314(--CH＝CH--，顺式和反式)；Almquist等人，1980，J.Med.Chem.231392-1398(--COCH2--)；Jennings-White等人，Tetrahedron.Lett.232533(--COCH2--)；European Patent Application EP 45665(1982)CA9739405(--CH(OH)CH2--)；Holladay等，1983，Tetrahedron Lett.244401-4404(--C(OH)CH2--)；和Hruby，1982，Life Sci.31189-199(--CH2--S--)。
维护和治疗皮肤本发明提供肽和含有这类肽的组合物，所述肽和组合物可用作维护健康皮肤和促进皮肤状况的试剂。这些肽和组合物也可用作防止和治疗皮肤相关的状况例如皱纹的试剂。在本发明的各方面，这些肽和组合物用于加强皮肤、收紧皮肤、更新或恢复皮肤状况。这些肽和组合物也可用作抗衰老治疗和用作治疗光损害皮肤的试剂。本发明组合物可用于愈合伤口，例如，愈合慢性伤口。可在制剂中组合单个肽、肽变体、肽衍生物和其混合物(例如具有不同序列的)。含有肽和组合物的局部洗剂和敷料以及使用所述肽和组合物的方法也是预期的。
最佳的愈合和皮肤再生可能需要某些基质金属蛋白酶活性。因而，当本发明的组合物和制剂抑制基质金属蛋白酶时，它们不必提高对基质金属蛋白酶的最大抑制。相反，所述制剂的活性是根据最优化愈合和改善健康皮肤发育的需要变化的。可通过改变肽的类型、内容物和量来获得更小或更大的抑制水平以促进愈合和健康皮肤发育。
为了促进健康皮肤发育和/或治疗伤口，将含有肽的组合物以领域技术人员选择的任意方式引到皮肤上或引入伤口。例如，可将肽配制到含有治疗有效剂量的一种或更多种肽和药物学载体的治疗组合物中。这种组合物可被施到皮肤上或施入伤口，例如以乳膏、喷雾剂、泡沫、凝胶或任何其它的制剂形式。在某些实施方案中，所述组合物是局部软膏。在另外的实施方案中，可将肽配制成含有治疗有效剂量的一种或多种肽的皮肤覆盖物或敷料，所述肽被浸渗到、共价附着到或以其它方式结合到覆盖物或敷料材料上。在本发明的一个实施方案中，皮肤覆盖物或敷料允许所述肽的释放。所述肽的释放可以是以不可控或是可控的方式进行。因而，本发明的皮肤覆盖物或伤口敷料可以慢速或定时地将所述肽释放入伤口或到皮肤上。皮肤覆盖物和敷料材料可以是任何用于本领域的材料，例如，绷带、纱布、灭菌的包裹物、水凝胶、水胶体和类似材料。
肽的治疗有效剂量是能将组织中纤连蛋白增加到维护健康皮肤和/或促进皮肤状况所需程度的肽量。肽的治疗有效剂量也是将组织中纤连蛋白增加到防止和/或治疗皮肤相关状况例如皱纹所需程度的肽量。此外，肽的治疗有效剂量也是将组织中纤连蛋白增加到加强或收紧皮肤、更新和/或恢复皮肤状况例如恢复受伤的或光损害的皮肤所需程度的肽量。例如，当提供到治疗或药物学组合物中时，所述肽的量可以是组合物重量的大约0.001％到大约35％的范围。所述肽可构成组合物重量的大约0.5％到大约20％。可选择地，所述肽可构成组合物重量的大约1.0％到大约10％。肽抑制剂的治疗有效剂量可随施用途径而变化。例如，在每Kg体重30到112,000μg之间的治疗量对静脉内施用可以是有效的。然而，健康皮肤发育或伤口治疗所需要的所述肽抑制剂的量不仅随施用途径而变化，而且也随受治疗状况的特性和病人的年龄和状况而变化，且最终由主治医师或临床医生判断。
施用的剂量和方法可依赖于受治疗的皮肤或组织的位置和/或伤口的严重性而变化。所述肽和肽缀合物的有用剂量可通过使其体外活性和此处描述的动物模型的体内活性相关联来确定。所述化合物可用单位剂量形式施用；例如，每单位剂量形式含有大约0.001μg到大约10mg、大约0.01μg到大约5mg、大约0.10μg到大约1mg，大约1.0μg到大约500μg的肽。想要的剂量可以以单一剂量、以分开剂量或以连续输注的方式提供。想要的剂量也可以按合适间隔施用，例如，每天二次、三次、四次或更多次亚剂量施用。通过使用此处提供的教导，本领域技术人员可以容易地利用可获得的信息制备和施用有效制剂。
所述肽可配制成药物学组合物并且以各种适合于所选择的施用途径的剂量形式施用于哺乳动物宿主，例如人类患者，所选择的施用途径即，经口或肠胃外、通过静脉内、肌内、局部或皮下途径。
因此，可全身性地施用含有肽的所述组合物，例如，通过输注或注射静脉内或腹膜内施用。可在水中制备肽溶液，任选地与无毒表面活性剂混合。可在甘油、液体聚乙二醇、三醋精和其混合物和油中制备分散体。在普通贮存和使用的条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合于注射或输注或局部应用的药物学剂量形式包括无菌水溶液或分散体或无菌粉末(其包含的活性成分适合用于临时制备无菌可注射的或可输注的溶液或分散体任选地被囊化在脂质体中)。最终的剂量形式在生产和贮存条件下应该是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或运载体可以是溶剂或液体分散介质，包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其合适混合物。合适的流动性可通过，例如，通过脂质体的形成、在分散体的情况下通过维持所需颗粒的大小或通过使用表面活性剂得以保持。可通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等产生对微生物作用的防护。在某些情况下，本领域技术人员可选择包括等渗剂，例如，糖、缓冲液或氯化钠。通过在组合物中使用延长吸收的试剂例如一硬脂酸铝和明胶来产生可注射组合物的延长的吸收。
通过将所需要量的所述肽或肽缀合物按需要整合到具有各种其它上述成分的合适溶剂中，接着通过过滤灭菌可制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，所述方法产生具有活性成分加上任意额外的存在于前述无菌过滤的溶液中的想要成分。
在某些情况下，所述肽也可结合药物学可接受的运载体例如惰性稀释剂或可同化的可食的载体经口施用。它们也可包裹在硬的或软的壳状明胶胶囊内，也可压缩成片剂或可直接整合入到病人饮食的食物中。对于口服治疗施用，所述肽可与一个或更多个赋形剂组合，并以可消化的片剂、口腔片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等使用。这类组合物和制剂可含有至少0.1％的活性化合物。当然，所述组合物和制剂的百分比可以是变化的并且变动范围可以是按给定单位剂量形式重量计算从大约2％到大约60％。在这种治疗性有用组合物中的活性化合物的量就是将要获得的有效剂量水平。
所述片剂、锭剂、药丸、胶囊等也可含有下列成分粘合剂例如黄蓍树胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；和增甜剂例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或调味剂例如胡椒薄荷、冬绿油或可加入樱桃调味剂。当单位剂量形式是胶囊时，除了上述类型材料，其可包含液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可以以涂层形式提供或用以修饰固体单位剂量形式的物理形式。例如，片剂、药丸或胶囊可用明胶、蜡、紫胶或糖等涂覆。糖浆或酏剂可含有活性化合物，作为增甜剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、染料和调味剂例如樱桃或柑桔调料。当然，任何用于制备任何单位剂量形式的材料应该是药物学可接受的并且基本上在使用的量内是无毒的材料。此外，可将所述肽整合到持续释放的制剂和装置中。
有用的固体载体包括精细粉碎的固体例如滑石粉、粘土、微晶纤维素、硅石和矾土等。有用的液体载体包括水、醇或1，2-乙二醇或水-醇/1，2-乙二醇掺合物，通过任选地无毒表面活性剂的帮助，本发明化合物可以以有效水平在所述掺合物中溶解或分散。可加入佐剂例如香料和额外的抗微生物剂以最优化给定使用的性质。
为了直接应用于使用者的皮肤，也可将增稠剂例如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、修饰的纤维素或修饰的矿物质材料与液体载体一起使用来形成可涂开的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等。
一般地，本发明的组合物是用于局部施用的。可通过任何方式直接地或间接地将活性肽局部施用于选择的组织，所述方式例如喷雾剂、泡沫、粉末、乳膏、胶冻、糊剂、栓剂或溶液。本文中所使用的术语糊剂应当被理解为包括乳膏和其它粘滞性的可被涂开的组合物，例如那些通常直接用于皮肤或涂抹在绷带或敷料上的组合物。肽可以共价地附着到、稳定地吸附在或应用到皮肤覆盖物或伤口敷料材料中。为了帮助手术后的愈合，所述活性肽可直接应用于靶组织或假器官装置或可植入的持续释放装置中。所述组合物可作为泡沫或雾与或不与其它试剂一起通过气溶胶直接在皮肤或伤口上施用。
所述肽可以以制剂形式施用，所述制剂包括所述肽在蜡、油、乳化剂、水和/或基本上不溶于水且能在水存在的情况下形成凝胶的材料中形成的乳剂。所述制剂提供了想要的乳剂性质，因为其是可涂开且具有乳剂的奶油状稠度，但是当进行正常的灭菌过程，例如蒸汽灭菌时不会解体，因为凝胶稳定了所述乳剂。同时该乳剂也表现出比常规凝胶更好的保水性，因为水既被保留在乳剂中又被保留在凝胶中。
所述制剂也可包含减少乳膏或洗剂中水的蒸气分压的湿润剂以降低乳膏或洗剂干燥的速率。合适的湿润剂相当容易于与水混溶并通常适合应用于皮肤。多元醇特别适合于所述目的，且合适的多元醇可包括丙二醇(monopropylene glycol)或甘油(丙三醇)。所述多元醇可占总制剂比例的20％到50％(按重量计算)；可选择地所述范围是30-40％。这个相对较高比例的多元醇比例也保证如果糊剂干燥到任何程度，所得的糊剂仍保持柔软和具有柔性，因为甘油为可作为所述聚合物的增塑剂。当将所述糊剂用于绷带时，例如，在所述糊剂失去水时其仍然能容易地从皮肤上揭离而不需要将绷带剪除。当所述多元醇与皮肤或伤口特别是感染的伤口接触时也具有防止细菌在糊剂中增殖的功能优势。
所述制剂可包括其它成分。可使用的成分包括氧化锌、鱼石脂、炉甘石(calamine)、磺胺嘧啶银、醋酸氯己定、煤焦油、葡萄糖酸洗必太、水杨酸、甲硝哒唑或其它抗细菌剂或其组合。其它成分发现也可适合于整合到所述乳膏中。
可以有益量包含这些成分，例如，可加入最多大约15wt％的氧化锌；一般地使用6-10％的氧化锌，可能和另外的成分例如鱼石脂(0-3wt％)和/或炉甘石(0-15％wt)组合。鱼石脂或炉甘石也可以单独使用。醋酸氯己定可以以最高按重量计算1％浓度使用；通常是0.5wt％。
用于乳剂的蜡的例子是硬脂酸苷油酯，或以CITHROLGMS/AS/NA形式从Croda Universal Ltd.商业购得的硬脂酸甘油酯和PEG100硬脂酸酯的组合。该组合提供了蜡和特别容易与蜡相容的乳化剂(PEG100硬脂酸酯)以在水中形成乳剂。第二个乳化剂可以包括在制剂中以增加乳剂的稳定性，例如PEG20硬脂酸酯，例如由Croda Universal Ltd.提供的CITHROL 1OMS。乳膏中乳化剂的总浓度正常地应该为3到15％。其中使用了两种乳化剂，一种可以以大于另一种的浓度存在。
不溶于水的材料与制剂中的水形成凝胶。因而所述材料是亲水性的但不会以任何程度溶于水。所述材料可以是聚合材料，例如吸水性非水溶性聚合物。然而，也可使用与水形成凝胶的非聚合材料和在升高温度时稳定的非聚合材料，例如粘土例如高岭土或膨润土。某些用于本发明的聚合物是高吸水性聚合物例如那些公开于WO92/16245的聚合物并且包括部分交联形成三维结构的亲水性纤维素衍水物。合适的交联型纤维素衍生物包括那些羟基低碳烷基化纤维素，其中烷基基团含有1到6个碳原子，例如羟乙基纤维素或羟丙基纤维素，或羧基纤维素例如羧甲基羟乙基纤维素或羧甲基纤维素。可用于本发明的聚合物的例子是由Akzo Chemicals B.V.以AKUCELL X181形式提供的部分交联的羧甲基纤维素钠聚合物。该聚合物是高吸水性聚合物，因为其可吸收至少10倍于其自身重量的水。所述聚合物的交联结构防止其溶解于水中但水可很容易地吸收到并且保持在所述聚合物的三维结构中以形成凝胶。水从这样的凝胶中丢失要比从溶液中慢并且在减慢或防止乳膏制剂干燥方面是有利的。所述制剂的聚合物含量正常情况下低于10％，例如，所述聚合物含量按重量计算可为大约0.5％到大约5.0％或为大约1.0％到大约2％。
所述制剂可进行灭菌并且应当选择所述制剂的组分(通过改变所述聚合物的含量)以提供终产物想要的流动性质。即，如果产物要进行灭菌，那么应当选择制剂以在灭菌前给产物以相对高的粘性/弹性。如果某些制剂组分不能进行灭菌，那么可在加入那些成分前先对所述制剂进行灭菌，或可对各组分分别进行灭菌。接着通过在无菌条件下混合各灭菌成分可制备所述制剂。当组分分开灭菌然后混合在一起时，可调整所述聚合物含量以产生具有终产物想要的流动性质的产物。所述乳剂含量决定所述制剂的操作性质和感觉，更高乳剂含量导致增加的可涂开性和乳脂状。
所述制剂可包装到管中、盆中或其它合适形式的容器中进行贮存或涂到基底上然后进行包装。合适的衬底包括敷料，包括膜敷料，以及绷带。
牙科上的应用本发明也预期组合物和制剂和使用这些组合物和制剂在牙龈组织中增加纤连蛋白的方法，所述组合物和制剂包含能增加组织中纤连蛋白的肽。这些组合物和制剂用于治疗或防止各种牙齿或口腔状况，包括牙龈退缩、龈炎和牙龈疾病。除了所述肽以外，这些组合物可包含有效量的羟酸化合物、茉莉酮酸化合物、赤霉酸化合物或玉米素化合物以及口可接受的载体和其它成分。这些组合物可配制成漱口剂、配制成用于戴在牙齿上的牙齿托盘(dental tray)的凝胶、或配制成能粘在牙齿或牙龈表面的粘合剂。
在某些实施方案中，所述载体可包括混合在一起会产生粘性基质材料的胶粘剂和溶剂。所述基质材料粘性足以使牙齿托盘保持并且留靠在人的牙齿上。合适的粘性基质材料优选地是具有粘滞性的并且不容易溶解在唾液中。各种胶粘剂是可购得的并且本领域技术人员可以容易地选择胶粘剂。可用于形成粘性和粘滞性的基质材料的胶粘剂包括羧基聚亚甲基(carboxypolymethylene)，例如，CARBOPOL 934P。羧基聚亚甲基可用于形成胶状牙齿组合物，所述组合物自身可充当将舒适的、非自保持的牙齿托盘留靠在人牙齿上的粘合剂。羧基聚亚甲基的使用消除了对使用自保持牙齿托盘(即，坚硬的和机械地将人的牙齿或牙龈互锁并且倾向于使用较少的粘性组合物的一般牙齿托盘)的需要。参见美国专利6,309,625。
一般地，本发明的牙齿组合物可包括按所述牙齿组合物重量计算浓度为大约0.5％到大约25％的羧基聚亚甲基，或为大约2％到大约12％和/或为大约3％到大约10％。在想要增加粘性、粘滞性和抵抗唾液稀释的时候，人们可以调节羧基聚亚甲基的浓度以达到任何一个或所有这些性质的想要水平。增加粘性有助于将优选的牙齿托盘留靠在人的牙齿上。可选择地，如果需要特别是不用牙齿托盘直接应用时，可以使组合物的粘合性和粘性减小。
为了获得羧基聚亚甲基树脂在牙齿组合物中良好扩散，推荐在试图加入其它组分前将羧基聚亚甲基与合适的溶剂混合，所述组分与羧基聚亚甲基相容性较低，例如水。与羧基聚亚甲基一起使用的合适溶剂的例子包括甘油、其它多元醇、聚(亚烷基)二醇和其它多元醇等。甘油似乎能使大量的羧基聚亚甲基分散到水中。在本发明的某些实施方案中，作为牙齿增白组合物溶剂的甘油、多元醇等物质加入的浓度按牙齿增白组合物重量计算为大约15％到大约85％；在本发明的某些实施方案中，按重量计算为大约25％到75％；和在本发明的某些实施方案中，按重量计算为大约30％到65％。然而，应当理解的是羧基聚亚甲基的实际量对获得粘性的、粘滞性的牙齿组合物不是至关重要的。
粘性基质材料可包括其它胶粘组分，所述胶粘组分与羧基聚亚甲基组合或代替部分或全部羧基聚亚甲基可产生牙龈刺激性组合物，所述组合物具有将优选的、舒适适配的牙齿托盘置于人牙齿的位置时所需要的想要的粘性水平。可使用其它合成聚合物和/或天然树胶、蛋白或其它形成凝胶的混合物，只要其产生粘性牙龈刺激组合物即可。
除了羧基聚亚甲基外，其它合适的胶粘剂和增稠剂的例子包括树胶例如黄原酸胶、塔尔哈胶(talha gum)、黄蓍胶、刺槐豆胶、瓜耳胶、爱尔兰藓胶(Irish moss gum)、茄替胶、红藻胶、角叉菜聚糖胶、阿拉伯树胶、褐藻酸树胶、琼脂树胶、藻酸盐树胶。另外合适的胶粘剂以PEMULENTM(B.F.Goodrich所有的化合物)或其组合物的或化学等同物的形式销售。PEMULENTM包含大量的具有轻度疏水性末端和强亲水性末端的聚丙烯酸共聚物。合适胶粘剂的另外的例子包括聚环氧乙烷例如由Union Carbide销售的POLYOXTM。这些胶粘剂可以以如上所述的关于羧基聚亚甲基的相同范围存在。
本领域技术人员可包括其它活性牙科试剂来治疗或防止其它类型的牙齿和/或牙龈问题。例如，结合本发明的牙龈刺激组分，这些技术人员可提供抗生龋剂的和抗脱矿质剂例如氟化物盐，更特别的是单氟磷酸钠、氟化钠和氟化亚锡。依赖于想要的氟化物治疗水平，和依赖于组合物是否是“非处方的”或“通过处方的”，可包含按牙齿增白组合物重量计算大约0％到大约1％的氟化物，更优选的是按重量计算大约0.1％到大约0.5％。可包括与本发明的牙龈刺激组分结合的抗微生物剂(例如用于抗牙龈疾病)。有用的抗微生物剂的例子包括氯己定、四环素、西吡氯铵、苯扎氯铵、溴化十六烷基吡啶、苯甲酸甲酯和苯甲酸丙酯。按重量计算，优选地包含0％到大约15％或大约1％到大约5％的与牙龈刺激组分结合的抗微生物剂。
在本发明范围内分配粘性的和粘滞性牙龈刺激组合物的一个方法是使用注射器。可挤压的管子和其它类似分配装置也可用来分配所述组合物。分配后，牙龈刺激组合物要有足够粘滞性这样一旦被分配它们就不容易沉积或扩展，而是牙龈刺激组合物一般保持为单一挤压出的链或珠状物，例如，沿着牙龈线。此外，可使用瓶子、管或其它本领域已知的分配装置，特别是当所述牙龈刺激组合物具有更低的粘滞性、低粘性并且不含增稠剂时。
在某些实施方案中，本发明在注射器或类似的分配装置中提供了单位剂量的牙龈组合物。通过这个方式，人们可以在每个治疗期内将精确量的牙龈刺激组合物装入牙齿托盘。通过使用这种分配装置，能够监控人已经接受和使用了多少剂量。然而，在其他实施方案中可将牙龈组合物在不使用牙齿托盘的情况下直接用于人的牙齿，或根据本发明的粘滞性和粘性较低的刺激组合物可用与本领域已知的自保持牙齿托盘配合使用。
当给定牙龈刺激组合物能将牙齿托盘留靠在人的牙齿上持续例如10小时或更长时，所述组合物一定能在本发明范围内任何想要的时间段使用，例如15分钟、1小时或任何想要的持续时间。为了最大化治疗时间和减少将牙齿托盘置于人口内的不便，可在晚上人睡觉期间使用牙齿托盘。
下面的例子用来说明但不限制本发明。
实施例1肽抑制剂一般材料所有的肽由Sigma-Genosys，Inc合成。由该公司用RP-HPLC纯化所述释放的肽至＞95％的均一性。对所汇集的洗脱的峰材料进行脱盐和冻干。质谱分析确定所述肽的分子量和纯度。除非另外指出，所有化学试剂购自Sigma Chemical Corp，或Fluka Chemical Co。活性MMP-9酶购自Calbiochem。
分子建模分子建模使用两个可视化程序，Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch，1997)和Rasmol(Sayle和Milner-White，1995)。建模工作在运行Windows 95的Compaq PC上和Silicon Graphics，Inc.Octane UNIX工作站上进行。另外，来自Molecular Simulations，Inc.的Cerius2分子包在Octane上使用。三维结构文件从如下Protein Databank下载而来(文件名，参考文献)MMP-1(1FBL，Li等人，1995)、MMP-2(1GEN，Libson等人，1995)、MMP-8(1JAO，1JAN，Grams等人，1995；Reinemer等人，1994)、MMP-9(1MMQ，Browner等人，1995)、TIMP-2/MT-1MMP复合物(1BUV，Fernandez-Catalan等人，1988)、TIMP-2(1BR9，Tuuttila等人，1998)和TIMP-1/MMP复合物(1UEA，Gomis-Ruth等人，1997；Huang等人，1996；Becker等人，1995)。这些文件用于分析所述蛋白的三维结构，并做为原始序列数据来源。
抑制测定进行两个酶促测定。第一个测定测量作为时间函数的MMP-9对荧光素化胶原蛋白的酶促水解作用。将荧光素化胶原蛋白(MolecularProbes，Inc.)以5μM的浓度加入到反应缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)中，放入Speetrosil石英荧光计比色杯中。将MMP以0.1μM的浓度与各种量的肽混合并在25℃下温育10分钟以实现结合。将该蛋白混合物加入到胶原蛋白底物中，并快速混合。在Shumadzu RF5301荧光计(Lakowicz，1983)测量作为时间函数的520nm处的荧光发射强度(激发波长为495nm)。根据Segel(1993)，运用Dixon图(1/v对[I])，由荧光素释放测定来确定肽抑制剂([I])的抑制常数(Ki)，从而斜率＝Km/(Vmax Ki[S]) (1)其中，Km为米氏常数，Vmax为反应最大速率，[S]为底物浓度。
第二个测定利用荧光共振能量传递技术(FRET)。7个氨基酸的底物肽(Calbiochem)被偶联到一个羧基末端的二硝基苯基受体和一个氨基末端的2-氨基苯并氨茴酰(Abz)部分供体。由MMP-9对该底物的切割导致一个荧光产物(365nm激发，450nm发射)的释放。浓度为5μM的肽被加入到反应缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)中，然后放置在一个黑色的96孔微量滴定板孔中，该板孔事先用1％BSA进行封闭。将浓度为0.1μM的MMP与各种量的9-聚体、10-聚体或19-聚体相混合并在25℃下温育10分钟以实现结合。该蛋白混合物被加入到荧光肽底物中并快速混合。作为时间函数的荧光强度用Dynex MFX荧光微量滴定板读数器来检测。通过用一个带有非FRET肽的Abz制作标准曲线，将荧光强度与被切割肽的摩尔数联系起来。抑制常数由上述的曲线推导出来。其他的基质金属蛋白酶类通过使用特异的底物FRET肽(均购自Calbiochem)采取相似的方式进行测试。
抗激活测定本测定检测有多少酶原被转化为成熟的基质金属蛋白酶。酶原MMP-9原(100μg)与在PBS中配制的0.5μg的Stromilysin相混合。该反应在35℃下温育。在80分钟的时间过程中从反应物中获取等分试样。每一份等分试样与EDTA相混合至最终浓度为1mM，然后注射到BioSelect 125 HPLC柱，在PBS中进行色谱分析。零时间点(注射)为一单峰，其在大约750秒从柱上洗脱下来。该峰大小作为时间的函数减小，随后出现两个新峰。第一个峰在大约800秒处洗脱，代表MMP-9的成熟形式。第二个峰在大约1100秒处洗脱，对应于N末端的前结构域片段。通过在全部洗脱曲线上积分确定峰的面积，并且标出面积变化的百分比。
等温滴定量热法用来自MicroCal，Inc.的VP-ITC仪器进行等温滴定量热法(ITC)。通过向1.4mL搅拌的反应测定池中注射入5μL的抑制剂肽溶液(浓度变化范围从0.5mM到2.0mM)进行滴定。测定池中MMP-9的浓度变化范围是从50到80μM。所述抑制剂和酶都存在于20mM二甲基胂酸钠(pH5.5-7.0)、40mM NaCl或20mM Tris-HCl(pH7.0-7.5)，40mM NaCl中。滴定在20℃和40℃之间进行。进行滴定的一般实验条件是10秒注射时间段，接着在注射之间延迟240秒，总共进行40次注射。为了校正因稀释和混合而产生的热，进行将抑制剂肽滴定入缓冲液中的空白滴定。
多结合位点的独立集是用于结合实验估量的最常见模型。对总热的分析解决方案由(Freire等人，1990)确定Q=VΔH×[[L]+1+[M]nK-(1+[M]nK-[L]K)2+4K[L]2K]···(2)]]>其中Q是总热，V是测定池体积，ΔH是焓，M是大分子浓度(测定池中的结合配偶体)，n是结合化学计量，L是配体浓度(注射器中的结合配偶体)且K是缔合常数(association constant)。用第5版的Origin(MicroCal，Inc.)将数据拟合该模型。
表面等离子体共振使用BiaCore-X表面等离子体共振(SPR)仪(BiaCore，Inc.)测量19-聚体(P)与MMP-9之间的相互作用。为进行这些实验，用50mMN-羟基琥珀酰亚胺、0.2M N-乙基-N’-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺以每分钟10μL的流速激活羧甲基葡聚糖传感器芯片(CM-5，Lofas等人，1993)10分钟。将75ng/μL浓度的MMP-9以每分种10μL的流速偶联到所述活性表面10分钟。通过将1M乙醇胺-HCl以每分钟10μL的速度流过传感器表面5分钟来进行终表面的灭活。所述19-聚体以每分钟20μL的速度流经传感器表面，并且浓度为10到50nM。通过在构建速度常数前使用自动化FFT程序使结合等温线的缔合相和离解相平滑。通过同时拟合正向(Ka)和反向(Kd)速度常数到d[P～MMP-9]/dt＝(Ka[p][MMP-9])-(Kd[P～MMP-9]) (3)来估计结合等温线(Karlsson and Falt，1997)，其中[P]、[MMP-9]和[P～MMP-9]分别是游离肽、游离MMP-9和所述复合物的浓度。因而平衡亲和常数(KA)定义为KA＝ka/kd(4)根据SPR信号(Morton等人，1995)，式3正确地表达为dR/dt＝kaC Rmax-(kaC+kd)R (5)其中R是在时间t的SPR信号(响应单位，RU)，Rmax是以RU为单位的最大MMP-9结合能力，且C是螯合肽浓度。使用来自Microcal，Inc.的Origin进行动力学分析(O’Shannessy等人，1993)。
生存力测定使用来自MatTek Corp.的皮肤模型Epiderm测定9-聚体、10-聚体和19-聚体的相对毒性。在加入所述肽之前将单个皮肤样品容器在培养基中于37℃下、5％CO2中预温育2小时。将样品容器转移到含有新鲜培养基的6孔平板上。将所有的肽以终浓度10mM溶解在PBS中，并且用移液器将100μL各肽溶液加到Epiderm样品容器的表面。在37℃下、5％CO2中继续温育12小时。温育期过后，将样品容品用PBS洗涤3次，并且将样品容器转移到24孔平板中，所述平板中每个孔含有300μL的MTT测定培养基(MTT浓度为1mg/mL)。允许比色测定进行3小时显色(温育在37℃下、5％CO2中)。然后将样品容器转移到24孔培养板中，每个孔中含有2mL的异丙醇。在室温下4个小时期间内，提取有色沉淀。采集各样品在570nm和650nm的吸收度读数。各样品相对于PBS对照的百分比生存力计算为100×(OD570sam-OD650sam)/(OD570con-OD650con) (6)通常地，所述肽样品重复三次测定。
结果以下提供基质金属蛋白酶-2(SEQ ID NO14)的序列以帮助定义基质金属蛋白酶中各种结构域和区域。
1 MEALMARGAL TGPLRALCLL GCLLSHAAAA PSPIIKFPGD41 VAPKTDKELA VQYLNTFYGC PKESCNLFVL KDTLKKMQKF81 FGLPQTGDLD QNTIETMRKP RCGNPDVANY NFFPRKPKWD121 KNQITYRIIG YTPDLDPETV DDAFARAFQV WSDVTPLRFS161 RIHDGEADIM INFGRWEHGD GYPFDGKDGL LAHAFAPGTG201 VGGDSHFDDD ELWTLGEGQV VRVKYGNADG EYCKFPFLFN241 GKEYNSCTDT GRSDGFLWCS TTYNFEKDGK YGFCPHEALF281 TMGGNAEGQP CKFPFRFQGT SYDSCTTEGR TDGYRWCGTT321 EDYDRDKKYG FCPETAMSTV GGNSEGAPCV FPFTFLGNKY361 ESCTSAGRSD GKMWCATTAN YDDDRKWGFC PDQGYSLFLV401 AAHEFGHAMG LEHSQDPGAL MAPIYTYTKN FRLSQDDIKG441 IQELYGASPD IDLGTGPTPT LGPVTPEICK QDIVFDGIAQ481 IRGEIFFFKD RFIWRTVTPR DKPMGPLLVA TFWPELPEKI521 DAVYEAPQEE KAVFFAGNEY WIYSASTLER GYPKPLTSLG541 LPPDVQRVDA AFNWSKNKKT YIFAGDKFWR YNEVKKKMDP601 GFPKLIADAW NAIPDNLDAV VDLQGGGHSY FFKGAYYLKL641 ENQSLKSVKF GSIKSDWLGC使用CLUSTALTM程序可计算9个MMP氨基酸序列切割区域的稳健的成对比对(Higgins等人，1992)。该比对确定了活性蛋白酶切割位点两侧的保守和非保守氨基酸的位置。选择活性切割位点的任意数目的N末端氨基酸以及C末端氨基酸数目来进行比对。显示于图1的MMP序列(表1)的比对表明所有MMP活性区域可以以统计学显著方式进行比对。选择用来比对的区域大致对应于氨基酸70-120，假定平均MMP信号序列结构是氨基酸1-20，所述前肽结构域是氨基酸21-100，并且成熟活性酶是从氨基酸101到末端。选择用以研究的19-聚体序列包含在比对区域里。特别地，在MMP-2中，所述19-聚体对应于氨基酸100-118。
MMP序列的比对表明活性结构域的中心区域PRCGVPDV(SEQID NO1)高度保守，并且在该区域两侧有更大程度的序列变化。序列的不均一性可简单地通过氨基酸(基于该比对)的选择用于设计抑制特定MMP酶或MMPs组合的肽序列。此外为了调节能力，特定肽的长度可以变化。
图2提供了MMP-1原的三维结构，表明显示于表1和图1中的活性区域各构建了使两个大球状结构域互相连接的桥。所述切割区域定义为一段短的连接前肽结构域和活性酶结构域的无结构结构域。作为活化步骤的一部分，该序列被切割成两部分。这也是在体外对HgCl2介导的活化敏感的区域。
活化过程消除了空间区段(其是前肽结构域)暴露了成熟酶的活性位点。所述N末端靠近催化性的锌离子，所述锌离子通常是酶促活性所必需的。图3显示了活性MMP-9结构，锌离子描述为实心球体。第二个锌离子是结构离子，即，其对蛋白的稳定性有贡献，但不对催化有贡献。现在19-聚体的C端半段是酶的最远氨基末端，如图3左侧所显示的作为最后的环的上升部分(双向影线)。构造激活结构域肽到活化的MMPs表面的模型表明所述肽(特别当如果更长的N端区域被包括进来时)可与活性位点区域相互作用，从而有效地阻断底物接近所述活性位点。通过这种方式其可充当小的前结构域或酶的“帽子”。
酶可被蛋白酶解成片段并且这些片段可以重建以再生活性的酶。各种肽结构域重新装配并且通过分子间非共价作用力维持在一起。这种肽-蛋白相互作用的经典例子包括核糖核酸酶S肽/核糖核酸酶S蛋白相互作用(Levit和Berger，1976)。核糖核酸酶S肽在其正确的位置结合到S蛋白上并且得到的复合物恢复RNASE-S的酶促活性。
根据本发明，所述激活结构域肽可重新结合到激活的MMP的区域上形成无活性复合体，所述区域是在MMP原上发生这种结合的区域。可测量这种结合(参见下面)。此外，所述19-聚体可通过其半胱氨酸残基连接锌，重新阻止催化作用。
MMP酶促活性的抑制使用19个氨基酸的肽(SEQ ID NO11)进行抑制研究，所述肽来源于MMP-2切割结构域区域。该肽选自CLUSTAL比对的区域，所述区域显示最高程度的保守性。选择的19-聚体在N末端严格保守，但在C末端区域显示高度可变性。对两个代表该肽的N末端和C末端半部分的更小的肽也进行检验。所述两个半部分将该肽大致分成了保守的N末端部分(9-聚体)和非保守的C末端(10-聚体)。这不仅允许检验整体的抑制功效，也允许检验选择性。
19-聚体PRCGNPDVANYNFFPRKPK (SEQ ID NO11)9-聚体PRCGNPDVA (SEQ ID NO12)10-聚体NYNFFPRKPK (SEQ ID NO13)所有这三个肽都能在两个基于荧光的测定中抑制MMP-9。在所有研究的情况中，所述19-聚体是比两个半肽更好的酶促抑制剂。9-聚体是比C末端的10-聚体更有效的抑制剂。这些结果表示半胱氨酸可能是必需的因为其充当锌的配体，或N末端区域需要用来影响酶活性位点的空间阻断。可通过生产含有更靠N末端序列(指在残基100之前的氨基酸)的抑制剂肽来检验该假说。图4显示用19-聚体滴定MMP-9的一般抑制曲线。
图5和6分别显示了用10-聚体和9-聚体进行的类似抑制分析。在基于FRET的测定中，各肽能抑制MMP-9，抑制剂常数(Ki’s)的变化范围是从45.2到327.7μM(参见表4)。底物的选择(FRET肽或荧光素化的胶原蛋白)在对三种肽的相对抑制作用上产生很小的不同，具有如下一致的趋势19-聚体＞9-聚体＞10-聚体。图7-9表示用肽滴定MMP-9的一般反应曲线。
对于胶原蛋白底物的抑制剂常数总体上稍微偏低，对于胶原蛋白的变化范围是从30.3到221.3μM而对于FRET-肽为45.2到327.7μM。这些数据表明当使用胶原蛋白底物时所述肽是稍微更有效的抑制剂，暗示着抑制剂肽封闭了活性位点并且因为胶原蛋白明显比FRET肽底物更大，所以更容易阻止其与酶活性位点接近。甚至在抑制剂肽存在的情况下，更小的FRET-肽底物可以更容易地接近活性位点。
一般的酶测定(图4-7显示)通常进行30-40分钟。更长时间的测定显示19-聚体有效地抑制MMP-9催化胶原蛋白水解的时间超过1000分钟(图8)。在长时间点(图9)上10-聚体防止胶原蛋白破坏不如9-聚体(图10)有效。19-聚体再次显示最大程度的抑制作用。
对其它MMP酶进行类似的酶研究以检验19-聚体的有效性。这些测定使用了FRET肽，所述FRET肽在其序列中整合了特定MMP切割位点。所述19-聚体能够潜在地抑制多个MMPs。19-聚体对抗各种MMPs的有效性如下MMP-2＞MMP-3＞MMP-8＞MMP-7＞MMP-9＞MMP-1，抑制常数变化范围从3.1μM(MMP-2)到41.1μM(MMP-1)。这些数据总结于表4。
表4.抑制剂数据总结
19-聚体的抗剪接活性MMPs是以无活性酶原形式生物合成产生的。酶原的蛋白酶解切割导致MMP活化，所述蛋白酶解切割通常是通过不同种类的膜结合的MMPs进行的。所述酶原的前导序列长度约100个氨基酸(从MMP到MMP之间稍微有点变化)并且发现位于蛋白的最远氨基端。抑制酶原活性可能是在慢性伤口中降低MMP酶活性的有用方法。如果这些酶不能行使功能，那么ECM降解的速度就会下降，这样依次可导致慢性伤口更快速地愈合。
明显地，激活结构域肽(19-聚体、9-聚体和10-聚体)抑制各种MMPs的酶活性。除了该活性外，19-聚体还阻止MMP-9原(无活性)形式的活化。因而，通过抑制已经活化的MMPs或阻止新合成的MMP原的激活，19-聚体可在皮肤和慢性伤口渗出液中降低总体MMP活性水平。
图11表示一般的剪接测定。在大约700秒处洗脱的第一个峰是MMP-9原。随着剪接反应进行，该峰强度下降(如使用向下箭标标记的)，并且出现两个新的峰。在大约800秒处洗脱出来的第一个新峰是成熟和活性MMP-9。在大约1050秒处洗脱的第二个新峰是前结构域。随着剪接反应进行，这两个峰的强度增加(如用向上的箭标标记的)。当所述反应完成时，没有可检测的MMP-9原剩下。用19-聚体滴定标准剪接反应物阻止了MMP-9原转化成前结构域和活性酶。图12显示该滴定的结果。剪接反应可用大分子19-聚体以剂量依赖方式进行抑制。
等温滴定量热法将量热法用来确定19-聚体是否与活性MMP-9形成稳定的非共价复合物。这些数据提供了对19-聚体的酶抑制作用机制和抗激活性质的理解。图13表示确定19-聚体MMP抑制剂与MMP-9相互作用的等温量热实验。将所述肽1mM的最终浓度溶解在20mM二甲基胂酸盐(pH6.8)，20mM NaCl中。将MMP-9以20μM的终浓度透析到相同的缓冲液中。如上所述进行一系列标准注射。有关MMP-9和19-聚体之间相互作用的结果如下化学计量0.975±0.02ΔH(kcal/mol) -26.1±1.45ΔS(cal mol-1K-1) -11.6±2.2KA(M-1) 1.65×106±4.5×104这些结果表明19-聚体和MMP-9之间的相互作用是焓驱动的，就是说，ΔH是负值。正如ΔS的负值所证明的，熵不利于所述反应。但是，焓项在量级上大于TΔS项，因而总体自由能(ΔG)是负的。
19-聚体与MMP-2的反应经观察和发现是焓驱动的而是熵不利的。通过用MMP-2滴定19-聚体产生显示于图14的等温量热分析。从这些实验获得下列值。
化学计量 0.99±0.03ΔH(kcal/mol) -15.4±2.05ΔS(cal mol-1K-1) -21.1±1.8KA(M-1)2.40×106±3.7×104因而，熵不利于所述结合反应的进行。这大概是因为结合引起的构象熵损失造成的。要知道完全柔性的肽含有大量的自由能。在所有结合的情况中，肽对MMP的化学计量是1∶1，表明单个19-聚体与单个MMP分子相互作用。
表面等离子体共振使用表面等离子体共振(SPR)技术对19-聚体与MM-9的结合进行动力学研究。通过按照厂商推荐的标准化学反应将活性MMP-9连接到BIACore，Inc.CM-5芯片的表面上来构建传感器芯片。使19-聚体流过BIACore-XTM设备中的MMP-9表面并且实时监控结合与离解。图15表示一般的结合等温线。缔合相(30-430秒)与单结合位点模型拟合最好并且产生2.2×104M-1s-1的缔合速度常数(ka)。离解相(440-700秒)显示类似的拟合并且产生4.1×10-3s-1的离解速度常数(kd)。计算的平衡缔合常数(Ka＝ka/kd)5.3×106与热力学数据接近一致。在没有被模拟的离解相的初期，观察到一个大约100个反应单位的整批运输效应。因此，19-聚体结合到MMP-9上既是动力学有利的也是热力学有利的。
生存力测定与许多小分子MMP抑制剂不同，本研究中的三个肽当被施用在EpiDermTM皮肤模型上时对细胞是无毒的。图16表示与PBS对照相比，两种浓度(500μM和2mM)的肽仅导致生存力稍微下降。对于所述肽总的平均生存力是97.6％(对于19-聚体)、89.6％(对于10-聚体)和95.8％(对于9-聚体)。这些结果表明在治疗慢性伤口愈合的方法中使用这些肽对哺乳动物细胞是无毒的。标绘在图16中的数据是三次重复样品的平均值。在本研究中生存力的标准差变化范围是从2.2到3.7并且显示与剂量或肽的同一性无关。生存力在更高肽浓度时稍微降低。
这些数据表明在EpiDermTM皮肤模型中所述肽是无毒的，其在动力学和熵上有利于与MMPs形成结合复合物，并且其抑制酶促活性和阻止基质金属蛋白酶的激活。
实施例2伤口愈合方法从The Jackson Laboratories获得小鼠并且在开始创伤方案前让其长到3-7个月大小。在创伤前，对所有的小鼠进行麻醉。用4mm活组织检查打孔器在C57BL6/KsJ db/db小鼠身上制造伤口。通过将皮肤从下面的结构中拉出并将打孔器推过分离的皮肤在每只动物的上背部引入两个伤口。一般地，产生的伤口平均深1.7mm，具有1.3到2.2mm的变化范围。在创伤过程中没有涉及肌肉。受伤后立即用生理盐水(用作未处理对照组)处理伤口或用5μL 20μg/mL的19-聚体处理伤口。
每天都对伤口进行数码拍照并且通过计算机积分照片以确定伤口面积。所有伤口处理和随后的数据分析都以盲式方式进行(参见例如，Brown等人，1994)。对所有伤口，在创伤时刻(第0天)的伤口面积被任意地设为相对值1；这样随后的伤口面积通过将第n天的伤口面积除以第0天的伤口面积而转换成为相对伤口面积。
结论如图17所示，单剂19-聚体的应用(在创伤时刻，第0天)在糖尿病小鼠模型中极大地加速伤口的完全闭合的时间。平均地，与盐水处理对照所需14天相比，用19-聚体处理的伤口在受伤后第9天闭合。此外，用19-聚体处理的伤口显示在受伤后第一天伤口的炎症减轻。还要指出的是观察到19-聚体处理的伤口开始收缩的过程比盐水处理对照的快(第5天对第8天)。
实施例3成纤维细胞生长的刺激本实施例提供表示刺激成纤维细胞增殖的肽的数据。
材料与方法对人皮肤成纤维细胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮肤成纤维细胞，新生儿的(neonatal)，商品目录号CC-2509)进行检验以确定暴露于肽是否能刺激细胞增殖。使用无血清培养基作对照，在96孔测定系统中测量人皮肤成纤维细胞系对19-聚体的增殖反应。在水中制备含有0.5g/L 19-聚体的母液，然后用无血清Dulbecco氏修饰的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)进行稀释以形成含有1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M的肽的溶液。将细胞以在100μl DMEM中含有1×103个细胞的浓度接种到96孔平板中，所述DMEM含有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。将平板在37℃下于潮湿的5％CO2气氛中温育24小时。温育后，将培养基吸出并且将孔用100μl无血清DMEM漂洗二次。将最终的漂洗液吸出并将100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M的19-聚体溶液加入到20个孔中。此外，将100μl的运载体(无血清DMEM)加入10个孔中作对照。所有的孔都在37℃下于潮湿的、5％CO2气氛中温育28小时。温育后，将20μl的Cell Titer 96 Aqueous One Solution加入到所有孔中。将平板轻轻地旋转并放回到培养箱中进行45分钟，并且在490nm读取分光光度吸收度。用one-way ANOVA对结果进行统计分析。
结果如图18所示，19-聚体的加入导致成纤维细胞以剂量依赖性方式加速生长。没有加入19-聚体的对照具有最低的细胞密度。接受低至1×10-5M的19-聚体(图18中标记为19聚体5)的细胞表现出比没有接受19-聚体的细胞显著更高的细胞密度(P＜0.01)。接受1×10-4M的19-聚体(图18中标记为“19聚体4”)的细胞表现出甚至更多的细胞生长(p＜0.001)。然而，接受1×10-6M 19-聚体(图18中标记为“19聚体6”)的细胞表现出在统计学上发现不是非常显著的少量细胞增殖(p＜0.05)。
因此在细胞生长方面，在对照细胞和用19-聚体处理的细胞之间观察到统计学上显著的差异。基于这些统计学显著差异，对于成纤维细胞来说19-聚体似乎是良好的细胞增殖剂。
实施例4角质细胞生长的刺激本实施例提供了表示刺激角质细胞增殖的肽的数据。
材料与方法将来自Clonetics(Walkersville，MD，正常人表皮角质细胞、新生儿的(neonatal)、商品目录号cc-2503)的人皮肤角质细胞系暴露于19-聚体中以确定该肽是否能刺激角质细胞增殖。使用角质细胞基本培养基(KBM，Clonetics，商品目录号CC-3103)作对照，在96孔测定系统中测量这些人皮肤角质细胞系对19-聚体肽的增殖反应。在水中制备含有0.5g/L 19-聚体的母液然后用KBM进行稀释以形成含有1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M的肽的溶液。将细胞以在100μl KBM中含有2.5×103个细胞的浓度接种到96孔平板中。将平板在37℃下于潮湿的5％CO2气氛中温育24小时。温育后，将100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M 19-聚体溶液各加入到10个孔中。此外，将100μl的运载体KBM加入10个孔中作对照。将平板在37℃下于潮湿的、5％CO2气氛中温育48小时。温育后，将20μl的Cell Titer 96 Aqueous OneSolution加入到所有孔中。将平板轻轻地旋转并放回到培养箱中进行3小时。在490nm读取各孔的分光光度吸收度。用one-way ANOVA对结果进行统计分析。
结果如图19中所见，19-聚体的加入导致角质细胞以剂量依赖性方式加速生长。没有加入19-聚体的对照细胞具有最低的细胞密度。接受低至1×10-5M的19-聚体(图19中标记为19聚体5)的细胞表现出比没有接受19-聚体的细胞显著更高的细胞密度(P＜0.01)。接受1×10-4M的19-聚体(图19中标记为“19聚体4”)的细胞表现出甚至更高的细胞生长(p＜0.001)。然而，接受1×10-6M 19-聚体(图19中标记为“19聚体6”)的细胞表现出在统计学非显著的少量细胞增殖(p＞0.05)。
因此，在对照细胞和用19-聚体处理的角质细胞之间观察到统计学上显著的差异。因此，对角质细胞来说19-聚体似乎是良好的增殖剂。
实施例5肽刺激成纤维细胞迁移本实施例提供说明能刺激成纤维细胞迁移的肽的数据。
材料与方法正常的人皮肤成纤维细胞(NHDF)从Biowhittaker(Walkersville，MD)商业购得并且在T75瓶中的FBM培养基(500mL，Biowhittaker)中繁殖最多12代，所述培养基含有胰岛素、hFGF-b、GA-1000和胎牛血清(10mL)。为进行迁移测定，用10mL Hank氏缓冲盐溶液(HBSS)洗涤NHDF一次。将3毫升溶于EDTA中的胰蛋白酶(0.25％)加入到T75瓶中不超过5分钟以从瓶中取出NHDF。将胰蛋白酶溶液中的NHDF加入到7mL的不加补料的FBM中。将NHDF离心5分钟并移去上清液。将NHDF重新悬浮于10mL的FBM中用以计数。将NHDF再离心5分钟并将上清液移去。将NHDF在无补料的FBM中以每mL 1×106个细胞重新悬浮。在迁移测定中只使用FBM培养基是很重要的，因为完全培养基含有成纤维细胞生长因子和血清，两者都将触发成纤维细胞的迁移。
通过Emory University的Microchemical Facility或通过SigmaGenesis合成和纯化肽。在进行HPLC后通过质谱法对所有的肽进行分析以估量纯度。对于各迁移测定，大约使用0.5-2.0毫克的肽来制备新鲜母液(5mg/mL于PBS中)。将所述肽在PBS中的母液用于在FBM(无补料)中制备更加稀释的溶液(1mg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL)以用于迁移测定。
用90％的乙醇洗涤8mm孔的无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(Neuroprobe，Inc.，Gaithersburg，MD)15分钟并且用去离子水漂洗4次。然后将膜放入含有5μg/mL明胶水溶液的玻璃皿中。将所述玻璃皿放在约90℃下进行水浴1小时。将膜从明胶溶液中取出并且充许在37℃培养箱中干燥1小时。
将48孔趋化性的小室(Neuroprobe，Inc.，Gaithersburg，MD)(参见图20)用于迁移测定。将28μL的各检验溶液按4份重复加入到小室底部的孔中。将明胶处理的膜小心地放在底部孔的上部。然后将小室的垫圈和上部小心地放在膜的上方。用6个指旋螺丝将仪器拧紧。通过将320μl的每mL中1×106个细胞的溶液加入到1.28mL FBM(无补料)中制备含有估计的细胞密度(2×105个细胞/mL)的NHDF溶液。将50微升2×105个细胞/mL的NHDF溶液加入到小室各孔的上部。将小室于37℃/5％CO2下放入培养箱中温育3小时。将小室取出，去除指旋螺丝并将小室翻转过来放在纸巾上。将小室的底部移走，展现出具有迁移通过朝上膜面的NHDF的膜。将膜小心地取出。用PBS湿润膜的一面并且用细胞刮棒(Neuroprobe，Inc.)将没有迁移通过膜的细胞从膜上刮去。用甲醇将膜固定并且用Diff-Quik StainingSolution I和II染色。NHDF的细胞核被染成紫色。用香柏浸镜用油和盖玻片将膜封固于玻璃载玻片上。用Zeiss光学显微镜(25X物镜x10X目镜x1.25X)对位于对应于不同小室的三个区域的每一区域上三个分开的视野中的细胞进行计数。从实验(肽)数据和正对照数据中减去负对照中迁移的NHDF平均数目。然后将所述数据按照与血浆纤连蛋白正对照(1.25μg/mL)比较的迁移的NHDF百分比来表示，定义如下。
结果如图21A(上部)所示用于成纤维细胞(NHDF)迁移的膜具有8μm的孔。所述化学引诱物溶液发出使成纤维细胞穿膜迁移的信号。一旦成纤维细胞通过膜，其将附着在朝向化学引诱物面的膜上。如图21B(底部)所示，成纤维细胞的细胞核被染成紫色以便可视计数。陷在孔中的细胞(孔显示出具有暗紫色颜色)包括在总细胞计数中。正对照引起的NHDF迁移产生变化范围为每个视野从27到60个NHDF的细胞计数。用于NHDF迁移测定的正对照是血浆纤连蛋白(1.25μg/mL溶解于FBM培养基中)。纤连蛋白是在损伤修复中帮助补充ECM的分子。结合到成纤维细胞的α4β1整联蛋白受体上的纤连蛋白在非常窄的浓度范围(0.8-1.6μg/mL)内具有趋化性。Postlethwaite，A.E.；Kang，A.H.“Fibroblast Chemoattractants”in Methods ofEnzymology，163卷，Academic PressNew York，1988，pp.694-707。负对照(无补料的FBM)细胞计数是每个视野中1到7个NHDF(＜10％的正对照)(参见图22)。
几种浓度的19-聚体用于NHDF迁移测定中。因为血浆纤连蛋白对NHDF具有趋化性的狭窄浓度范围，所以使用10倍稀释的肽以使能检查大范围的浓度。如图23所示，在高于0.1mg/mL的19-聚体浓度下，显著数量的NHDF已经迁移穿过膜(55％±3％和46％±3％分别对应1000μg/mL和100μg/mL)。19-聚体浓度低于100μg/mL时只有轻微的趋化性。因为这些浓度的19-聚体诱导大约20％NHDF迁移，只是负对照中NHDF迁移的大约2倍，所以这些数据被认为不显著。通过从两个不同商业来源制备的19-聚体母液诱导的迁移没有差别(数据未显示)。
合成和纯化19-聚体序列的不同变体以确定氨基酸序列的改变是否会影响成纤维细胞的迁移。对下列肽进行检验9-聚体PRCGNPDVA(SEQ ID NO12)、10-聚体NYNFFPRKPK(SEQ IDNO13)、14-聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)。14-聚体和17-聚体序列分别基于近一步靠近MMP-2和MMP-9的N末端的序列。9-聚体和10-聚体抑制MMP活性。也合成在N末端和C末端分别具有保护性乙酰和酰胺基团的19-聚体(Ac-19-聚体)以确定这些基团的加入是否会改变对成纤维细胞迁移的影响。如图23所示Ac-19-聚体在100(44±3％)和1000(40±6％)μg/mL时对成纤维细胞都具趋化性。10-聚体在1000μg/mL(30±2％)时具有趋化作用，但在100μg/mL(11±0％，如图22所示与负对照相似)时没有。9-聚体在1000μg/mL(32±2％)时具有趋化作用，而在100μg/mL(16±0％)时没有。有趣地是，在9-聚体的N末端加入氨基酸导致不存在NHDF迁移。14-聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)在浓度范围从1000μg/mL到10ng/mL内都不会诱导NHDF迁移(数据未显示)。因为在不同肽之间NHDF迁移变化很大，所以氨基酸序列对激活NHDF迁移是很重要的。
成纤维细胞迁移到伤口位点是正确愈合的关键。使用NHDF迁移测定已证明了19-聚体(≥100μg/mL)和Ac-19-聚体、9-聚体和10-聚体衍生物的趋化性性质。因为9-聚体和10-聚体都诱导大约相同程度的NHDF迁移，所以很难估计是否特定的氨基酸对激活是至关重要的。有趣地是，14-聚体TMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO19)和17-聚体TLKAMRKPRCGNPDVAN(SEQ ID NO20)对成纤维细胞迁移性无影响。尽管还不清楚19-聚体的趋化性作用的确切机制，但所述肽的氨基酸序列对成纤维细胞的激活是很重要的。
实施例6肽不会刺激嗜中性粒细胞迁移本实施例提供说明不刺激嗜中性粒细胞迁移的肽的数据。
材料与方法通过使用Emory University的Microchemical Facility 或通过SigmaGenesis合成和纯化肽。经过HPLC后对所有肽进行质谱分析以估量纯度。将大约0.5-2.0毫克肽用于制备新鲜母液(5mg/mL于HBSS/HSA中)以用于各迁移测定。用于测定时，将所述肽的母液用于在HBSS/HSA中制备成更多的稀释溶液(1mg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL和10ng/mL)。
通过在50mL Falcon管中将血液/EDTA混合物(约20mL)铺在HistopaqueTM1119(底层，18mL)和1077(上层，7mL)组成的双层之上，可将嗜中性粒细胞从人血液(采集在含有EDTA的VacutainerTM管中)中分离。将管子在1800rpm离心30分钟(无制动)。离心后在管中显现4层(从上到下层)血浆、1077、1119和红细胞。血浆和1077层之间的棕黄层含淋巴细胞、单核细胞和一些血小板。将血浆层、棕黄层和大部分1077层取出并遗弃。将含有嗜中性粒细胞的1119层取出并放入干净的50mL管中。加入Dulbecco氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS)将体积增至50mL。以2100rpm将细胞离心15分钟。将细胞重新悬浮于10mL DPBS中，转移到15mL管中，并且再以2000rpm离心10分钟。再次重复该过程以对所述细胞进行第二次洗涤。在取出上清液后，通过加入6mL冷的无菌水到各15mL的上清液中来裂解红细胞。将细胞在水中仅混合30秒。然后再加入6mL 2％的冷的无菌盐水。再次以2000rpm离心细胞10分钟。移走红色上清液(含有来自红细胞的血红蛋白)。超过两次重复裂解红细胞的过程以去除所有的红细胞。在绝大部分红细胞去除后，将嗜中性粒细胞重新悬浮于10mL HBSS/HSA以用锥虫蓝进行计数。将细胞离心并且以1.25×106细胞/mL的浓度重新悬浮于HBSS/HSA中。
使用24孔跨孔(transwell)平板(3μm孔径大小的膜)重复两次进行嗜中性粒细胞迁移测定。用20-40μl的HBSS/HSA(0.04-0.4％)预湿润跨孔膜。将趋化性溶液(500μl)加入各孔底部。将嗜中性粒细胞(200μl 1.25×106细胞/mL的溶液)加在跨孔的膜上。然后将跨孔放入趋化性溶液中。将平板放入培养箱(37℃，5％CO2)温育1小时。使用锥虫蓝对迁移通过膜的细胞进行计数。
结果在嗜中性粒细胞迁移实验中，分离的嗜中性粒细胞有大约95％的生活力。为进行本实验将嗜中性粒细胞重新悬浮于HBSS/0.4％HSA中。用IL-8(10nM于HBSS/0.4％HSA缓冲液中)作为嗜中性粒细胞迁移的正对照。所使用的19-聚体浓度是1mg/mL、100、10和1μg/mL。
表5中第二栏描述了来自第一个实验的结果。负对照和正对照分别是HBSS/HSA和IL-8。
表5.各趋化性底物的嗜中性粒细胞迁移百分率
*实验1和实验2中HSA的浓度分别是0.4％和0.04％。
19-聚体诱导的嗜中性粒细胞迁移与负对照的相似。IL-8的加入导致81％加入的嗜中性粒细胞迁移穿过膜。尽管正对照似乎表现良好，但负对照(29％)似乎相当高。因此在第二个实验中，HSA的量减少10倍达到0.04％。如表5第三栏所示，负对照的嗜中性粒细胞迁移已急剧下降到0％。IL-8正对照也下降了但仍显示大量的嗜中性粒细胞迁移(51％)。如在第一个实验中一样，19-聚体对嗜中性粒细胞迁移没有影响。
成纤维细胞迁移到伤口位点对正确的愈合至关重要。通过使用NHDF迁移测定已证明了19-聚体的趋化性性质。然而，19-聚体显示对嗜中性粒细胞迁移没有影响。也许在成纤维细胞中存在固有的参与19-聚体识别、结合和趋化性信号传导的受体，而在嗜中性粒细胞在不存在这种受体。
实施例7刺激胶原蛋白产生通过使用由Panvera(Madison，WI)出售的Takara BiomedicalsEIA测定试剂盒(TAK MK101)测量人皮肤成纤维细胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮肤成纤维细胞，新生儿的，商品目录号CC-2509)中19-聚体肽对胶原蛋白产生的刺激反应。首先使用具有10％胎牛血清(FBS)的DMEM使细胞生长在96孔测定系统中，所述胎牛血清和DMEM都购自Sigma Chemical Co，St.Louis，MO。无血清DMEM用作对照。在水中制备含有0.5g/L的19-聚体的母液，然后用无血清DMEM稀释形成含有1×10-5M和1×10-6M的肽的溶液。将细胞以在100μl DMEM中含有5×103个细胞的浓度接种到96孔平板中，所述DMEM含有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。将平板在37℃下、潮湿的5％CO2气氛中温育24小时。温育后，将培养基吸出并且用100μl无血清DMEM将孔漂洗两次。将最终漂洗液吸出并且将100μl 1×10-5M或1×10-6M的19-聚体溶液加入到孔中(对于每个浓度n＝2)。此外，将100μl运载体(无血清DMEM)加入到4个孔中作为对照。将所有的孔置于37℃下、潮湿的5％CO2气氛中温育48小时。
使用推荐的来自96孔平板各孔20μl的上清液进行测定。在进行测定前现配标准缓冲液和终止溶液。将100μl抗体-POD缀合物溶液(由试剂盒提供)加入到用前抗体(pre antibody)涂覆的96孔平板(由试剂盒提供)的孔中。将20μl标准和检验溶液(来自其它含有成纤维细胞的96孔平板)加入到合适的孔中。将平板轻柔地混合、密封并在37℃下温育3小时。
温育后，用PBS缓冲液(400μl)仔细洗涤各孔4次。洗涤结束时将所有孔中的任何液体倒空。将100μl的底物溶液(存在于缓冲液中的过氧化氢和四甲联苯胺，由试剂盒提供)加入到各孔并且将平板温育15分钟。这时，以与加入底物同样的顺序向各孔中加入100μl终止溶液(现配的1N H2SO4)。将平板轻柔混合并在450nm读取吸收度。使用one-way ANOVA对结果进行统计分析。
结果从图24和表6中可见，在两个所使用的浓度上，19-聚体的加入导致胶原蛋白生产增加。不加19-聚体的对照细胞具有最低量的胶原蛋白。在浓度为10-5和10-6M时，19-聚体肽产生统计学显著的胶原蛋白量(p＜0.001)。这些结果表明19-聚体刺激胶原蛋白的产生。
表6数据总结
实施例8增加纤连蛋白通过使用由Panvera(Madison，WI)出售的Takara BiomedicalsEIA测定试剂盒(TAK MK115)测量19-聚体的应用对人皮肤成纤维细胞系(Clonetics，Walkersville，MD，正常人皮肤成纤维细胞，新生儿的，商品目录号CC-2509)的影响。19-聚体的应用导致显著的纤连蛋白水平增加。
材料和方法首先使用具有10％胎牛血清(FBS)的DMEM使细胞生长在96孔测定系统中，所述胎牛血清和DMEM都购自Sigma Chemical Co，St.Louis，MO。以三种浓度(1×10-4M、1×10-5M和1×10-6M)应用19-聚体，重复二次。无血清DMEM用作对照。将细胞以在100μl DMEM中含有9×103个细胞的浓度接种到96孔平板中，所述DMEM含有10％胎牛血清(FBS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。将平板在37℃下、潮湿的5％CO2气氛中温育48小时。温育后，将培养基吸出并且用100μl无血清DMEM将孔漂洗两次。将最终漂洗液吸出并且将100μl 1×10-4M、1×10-5M或1×10-6M的19-聚体溶液连同100μl无血清DMEM加入到孔中(对于每个浓度n＝2)。此外，将100μl运载体(无血清DMEM)加入到2个孔中作为对照。将平板置于37℃下、潮湿的5％CO2气氛中温育48小时。
使用推荐的来自96孔平板各孔100μl的上清液进行测定。在进行测定前现配标准缓冲液和终止溶液。将前抗体涂覆的96孔平板(由试剂盒提供)用来转移检验样品和对照。将平板混合、密封并在37℃下温育1小时。在取出样品溶液后，用洗涤缓冲液将所有孔洗涤三次(300μl)。将100μl的抗体-过氧化物酶缀合物溶液加入孔中。将平板混合、密封并在37℃下温育1小时。将溶液取出并且用洗涤缓冲液将孔洗涤3次。洗涤结束时将所有孔中的所有液体完全倒空。将100μl的底物溶液(存在于缓冲液中的过氧化氢和四甲联苯胺)加入到各孔，并且将平板在室温下温育15分钟。以与底物同样的顺序向各孔中加入100μl终止溶液(现配的1N H2SO4)。将平板轻柔混合并在450nm读取吸收度。使用one-way ANOVA对结果进行统计分析。
结果从表7和图25中可见，在所有使用的浓度上，检验的19-聚体都增加纤连蛋白存在量。所述“19聚体6”组构成了暴露于浓度为1×10-6M的19-聚体的细胞。“19聚体5”组构成了暴露于浓度为1×10-5M的19-聚体的细胞。“19聚体4”组构成了暴露于浓度为1×10-4M的19-聚体的细胞。“对照”细胞暴露于不加肽的溶液中。
结果表明所有浓度的检验的19-聚体都在统计学上刺激纤连蛋白产生。该效应在10-4M时更加显著，与对照和10-6M浓度相比，在10-4M时19聚体肽对纤连蛋白的刺激效果超过两倍。
表7纤连蛋白数据总结
参考文献下列参考文献和本文中引用的任何其他参考文献均在此处引入作为参考。
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<400>3Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Asp Asn1 5 10 15Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Lys Met Asn Leu35 40 45Thr Tyr50<210>4<211>56<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Glu Thr Gly Lys Leu Ser Pro Arg1 5 10 15Val Met Glu Ile Met Gln Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Glu Phe Ser Leu Met Pro Asn Ser Pro Lys Trp His Ser Arg Thr Val35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Ser Tyr Thr50 55<210>5<211>54<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Ser Asp1 5 10 15Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30His Phe Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Asn50<210>6<211>55
<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Met Gln Lys Phe Leu Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Thr Asp1 5 10 15Thr Leu Glu Val Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly20 25 30His Phe Ser Ser Phe Pro Gly Met Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Val Asn Tyr50 55<210>7<211>54<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>7Met Gln His Phe Leu Gly Leu Lys Val Thr Gly Gln Leu Asp Thr Ser1 5 10 15Thr Leu Glu Met Met His Ala Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val His20 25 30His Phe Arg Glu Met Pro Gly Gly Pro Val Trp Arg Lys His Tyr Ile35 40 45Thr Tyr Arg Ile Asn Asn50<210>8<211>47<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly20 25 30Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp His His His Asn35 40 45<210>9<211>54<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)<400>9Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu1 5 10 15Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp Glu Gln Thr His Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Glu Asn50<210>10<211>55<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Met Gln Arg Phe Phe Gly Leu Asn Val Thr Gly Lys Pro Asn Glu Glu1 5 10 15Thr Leu Asp Met Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Ser Gly20 25 30Gly Phe Met Leu Thr Pro Gly Asn Pro Lys Trp Glu Arg Thr Asn Leu35 40 45Thr Tyr Arg Ile Arg Asn Tyr50 55<210>11<211>19<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>11Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg1 5 10 15Lys Pro Lys<210>12<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>12Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala1 5<210>13<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>13Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys1 5 10<210>14<211>660<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Met Glu Ala Leu Met Ala Arg Gly Ala Leu Thr Gly Pro Leu Arg Ala1 5 10 15Leu Cys Leu Leu Gly Cys Leu Leu Ser His Ala Ala Ala Ala Pro Ser20 25 30Pro Ile Ile Lys Phe Pro Gly Asp Val Ala Pro Lys Thr Asp Lys Glu35 40 45Leu Ala Val Gln Tyr Leu Asn Thr Phe Tyr Gly Cys Pro Lys Glu Ser50 55 60Cys Asn Leu Phe Val Leu Lys Asp Thr Leu Lys Lys Met Gln Lys Phe65 70 75 80Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn Thr lle Glu Thr85 90 95Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Ash Tyr Asn Phe100 105 110Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp Lys Asn Gln Ile Thr Tyr Arg Ile115 120 125Ile Gly Tyr Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Val Asp Asp Ala Phe130 135 140Ala Arg Ala Phe Gln Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Arg Phe Ser145 150 155 160Arg lle His Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp165 170 175Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala180 185 190His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Val Gly Gly Asp Ser His Phe Asp
195 200 205Asp Asp Glu Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gln Val Val Arg Val Lys210 215 220Tyr Gly Asn Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn225 230 235 240Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe245 250 255Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly260 265 270Phe Cys Pro His Glu Ala Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly275 280 285Gln Pro Cys Lys Phe Pro Phe Arg Phe Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Ser290 295 300Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr305 310 315 320Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala325 330 335Met Ser Thr Val Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro340 345 350Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg355 360 365Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp Asp370 375 380Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val385 390 395 400Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gln Asp405 410 415Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg420 425 430Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Ser435 440 445Pro Asp Ile Asp Leu Gly Thr Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val450 455 460Thr Pro Glu Ile Cys Lys Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln465 470 475 480Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr485 490 495Val Thr Pro Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe500 505 510Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln515 520 525Glu Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser530 535 540Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly
545 550 555 560Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys565 570 575Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn580 585 590Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp595 600 605Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln610 615 620Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu625 630 635 640Glu Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp645 650 655Trp Leu Gly Cys660<210>15<211>43<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>15Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn1 5 10 15Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala20 25 30Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp35 40<210>16<211>43<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>16Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala1 5 10 15Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly20 25 30Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp35 40<210>17<211>43
<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>17Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu1 5 10 15Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala20 25 30Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp35 40<210>18<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>能够抑制金属蛋白酶活性的合成的肽<220>
<221>SITE<222>2<223>Xaa＝谷氨酰胺或谷氨酸<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝天冬氨酸或谷氨酸<220>
<221>SITE<222>8<223>Xaa＝谷氨酰胺或丝氨酸<220>
<221>SITE<222>9<223>Xaa＝天冬酰胺或丙氨酸<220>
<221>SITE<222>11
<223>Xaa＝异亮氨酸或亮氨酸<220>
<221>SITE<222>(12)...(12)<223>Xaa＝谷氨酸或赖氨酸<220>
<221>SITE<222>(13)...(13)<223>Xaa＝苏氨酸或丙氨酸<220>
<221>SITE<222>(16)...(16)<223>Xaa＝赖氨酸或苏氨酸<220>
<221>SITE<222>(21)...(21)<223>Xaa＝缬氨酸或天冬酰胺<220>
<221>SITE<222>(24)...(24)<223>Xaa＝缬氨酸或亮氨酸<220>
<221>SITE<222>(25)...(25)<223>Xaa＝丙氨酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(26)...(26)<223>Xaa＝天冬酰胺或精氨酸<220>
<221>SITE<222>(27)...(27)<223>Xaa＝酪氨酸或苯丙氨酸
<220>
<221>SITE<222>(28)...(28)<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺<220>
<221>SITE<222>(29)...(29)<223>Xaa＝苯丙氨酸或苏氨酸<220>
<221>SITE<222>(31)...(31)<223>Xaa＝脯氨酸或谷氨酸<220>
<221>SITE<222>(32)...(32)<223>Xaa＝精氨酸或甘氨酸<220>
<221>SITE<222>(33)...(33)<223>Xaa＝赖氨酸或天冬氨酸<220>
<221>SITE<222>(34)...(34)<223>Xaa＝脯氨酸或亮氨酸<400>18Pro Xaa Thr Gly Xaa Leu Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa1 5 10 15Pro Arg Cys Gly Xaa Pro Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Lys35<210>19<211>14<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>19Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala Asn1 5 10<210>20<211>17<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>20Thr Leu Lys Ala Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala1 5 10 15Asn<210>21<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>能够抑制金属蛋白酶活性的合成的肽<220>
<221>SITE<222>2<223>Xaa＝谷氨酰胺或谷氨酸<220>
<221>SITE<222>5<223>Xaa＝天冬氨酸或谷氨酸<220>
<221>SITE<222>8<223>Xaa＝谷氨酸或丝氨酸<220>
<221>SITE<222>9<223>Xaa＝天冬酰胺或丙氨酸
<220>
<221>SITE<222>11<223>Xaa＝异亮氨酸或亮氨酸<220>
<221>SITE<222>(12)...(12)<223>Xaa＝谷氨酸或赖氨酸<220>
<221>SITE<222>(13)...(13)<223>Xaa＝苏氨酸或丙氨酸<220>
<221>SITE<222>(16)...(16)<223>Xaa＝赖氨酸或苏氨酸<220>
<221>SITE<222>(17)...(17)<223>Xaa＝任何非极性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(18)...(18)<223>Xaa＝任何碱性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(19)...(19)<223>Xaa＝任何半胱氨酸样氨基酸<220>
<221>SITE<222>(20)...(20)<223>Xaa＝任何非极性氨基酸<220>
<221>STTE
<222>(21)...(21)<223>Xaa＝任何极性或脂族氨基酸<220>
<221>SITE<222>(22)...(22)<223>Xaa＝任何非极性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(23)...(23)<223>Xaa＝任何酸性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(24)...(24)<223>Xaa＝任何脂族或极性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(25)...(25)<223>Xaa＝任何脂族、非极性或碱性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(26)...(26)<223>Xaa＝任何极性、酸性、碱性或非极性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(27)...(27)<223>Xaa＝任何极性或芳族氨基酸<220>
<221>SITE<222>(28)...(28)<223>Xaa＝任何极性、碱性、脂族或非极性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(29)...(29)<223>Xaa＝任何芳族、脂族、极性或酸性氨基酸
<220>
<221>SITE<222>(30)...(30)<223>Xaa＝任何芳族、非极性或极性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(31)...(31)<223>Xaa＝任何非极性或酸性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(32)...(32)<223>Xaa＝任何碱性、极性或非极性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(33)...(33)<223>Xaa＝任何碱性、极性、脂族、非极性或酸性氨基酸<220>
<221>SITE<222>(34)...(34)<223>Xaa＝任何非极性或脂族氨基酸<220>
<221>SITE<222>(35)...(35)<223>Xaa＝任何碱性或脂族氨基酸<400>21Pro Xaa Thr Gly Xaa Leu Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa3权利要求
1.包含治疗有效量的肽和药物学可接受的载体的组合物，所述肽包含式III的肽，其中式III的肽为Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19(III)其中Xaa1、Xaa4和Xaa6各自分别是非极性氨基酸；Xaa2是碱性氨基酸；Xaa3是半胱氨酸样氨基酸；Xaa5是极性或脂族氨基酸；Xaa7是酸性氨基酸；Xaa8是脂族或极性氨基酸；Xaa9是脂族、非极性或碱性氨基酸；Xaa10是极性、酸性、碱性或非极性氨基酸；Xaa11是极性或芳族氨基酸；Xaa12是极性、碱性、脂族或非极性氨基酸；Xaa13是芳族、脂族、极性或酸性氨基酸；Xaa14是芳族、非极性或极性氨基酸；Xaa15是非极性或酸性氨基酸；Xaa16是碱性、极性或非极性氨基酸；Xaa17是碱性、极性、脂族、非极性或酸性氨基酸；Xaa18是非极性或脂族氨基酸；Xaa19是碱性或脂族氨基酸；且其中所述肽能增加组织中纤连蛋白的量。
2.权利要求1的组合物，其中非极性氨基酸是甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。
3.权利要求1的组合物，其中碱性氨基酸是组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸。
4.权利要求1的组合物，其中半胱氨酸样氨基酸是半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺或β-甲基半胱氨酸。
5.权利要求1的组合物，其中脂族氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸。
6.权利要求1的组合物，其中酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。
7.权利要求1的组合物，其中极性氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，或非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。
8.权利要求1的组合物，其中芳族氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯并噻吩丙氨酸。
9.权利要求1的组合物，其中所述肽抑制基质金属蛋白酶-2。
10.权利要求1的组合物，其中所述肽抑下列任何一种基质金属蛋白酶的蛋白酶活性基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13。
11.权利要求1的组合物，其中所述肽是成纤维细胞或角质细胞的化学引诱物。
12.权利要求1的组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO11。
13.权利要求1的组合物，其中所述肽是SEQ ID NO11。
14.权利要求1的组合物，其中所述组合物是洗剂。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物是敷料。
16.用于防止皱纹的方法，所述方法包括向哺乳动物皮肤施用安全和有效量的权利要求1的组合物，其中药物学可接受的载体是皮肤病学可接受的载体。
17.权利要求16的方法，其中非极性氨基酸是甲硫氨酸、甘氨酸或哺氨酸。
18.权利要求16的方法，其中碱性氨基酸是组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸。
19.权利要求16的方法，其中半胱氨酸样氨基酸是半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺或β-甲基半胱氨酸。
20.权利要求16的方法，其中脂族氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸。
21.权利要求16的方法，其中酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。
22.权利要求16的方法，其中极性氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，或非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。
23.权利要求16的方法，其中芳族氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯并噻吩丙氨酸。
24.权利要求16的方法，其中所述肽抑制基质金属蛋白酶-2。
25.权利要求16的方法，其中所述肽抑下列任何一种基质金属蛋白酶的蛋白酶活性基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13。
26.权利要求16的方法，其中所述肽是成纤维细胞或角质细胞的化学引诱物。
27.权利要求16的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO11。
28.权利要求16的方法，其中所述肽是SEQ ID NO11。
29.权利要求16的方法，其中所述组合物是洗剂。
30.权利要求16的方法，其中所述组合物是敷料。
31.增加哺乳动物组织中纤连蛋白的方法，所述方法包括对组织施用安全和有效量的权利要求1的组合物，其中所述药物学可接受的载体是皮肤病学可接受的载体。
32.权利要求31的方法，其中非极性氨基酸是甲硫氨酸、甘氨酸或哺氨酸。
33.权利要求31的方法，其中碱性氨基酸是组氨酸、赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸、鸟氨酸、高精氨酸、ρ-氨基苯丙氨酸和2，4-二氨基丁酸。
34.权利要求31的方法，其中半胱氨酸样氨基酸是半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺或β-甲基半胱氨酸。
35.权利要求31的方法，其中脂族氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基甘氨酸或α-氨基异丁酸。
36.权利要求31的方法，其中酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。
37.权利要求31的方法，其中极性氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸、甲硫氨酸亚砜或高丝氨酸，或非极性氨基酸例如甲硫氨酸、甘氨酸或脯氨酸。
38.权利要求31的方法，其中芳族氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯基甘氨酸、萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、吡啶丙氨酸或3-苯并噻吩丙氨酸。
39.权利要求31的方法，其中所述肽抑制基质金属蛋白酶-2。
40.权利要求31的方法，其中所述肽抑下列任何一种基质金属蛋白酶的蛋白酶活性基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13。
41.权利要求31的方法，其中所述肽是成纤维细胞或角质细胞的化学引诱物。
42.权利要求31的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO11。
43.权利要求31的方法，其中所述肽是SEQ ID NO11。
44.权利要求31的方法，其中所述组合物是洗剂。
45.权利要求31的方法，其中所述组合物是敷料。
46.权利要求31的方法，其中所述组织是皮肤。
47.权利要求31的方法，其中所述组织是牙龈组织。
48.局部软膏，所述软膏包含了治疗有效量的包含SEQ ID NO11的肽和药物学可接受的载体，其中所述肽增加了组织中纤连蛋白的量。
49.权利要求48的软膏，其中软膏中的肽量为按软膏重量计算大约0.001％到大约35％。
50.权利要求49的软膏，其中软膏中的肽量为按软膏重量计算大约0.5％到大约20％。
51.权利要求50的软膏，其中软膏中的肽量为按软膏重量计算大约1.0％到大约10％。
全文摘要
本发明提供了肽和含有这些肽的组合物，所述肽和组合物增加了组织中纤连蛋白的量。这些组合物用于促进健康皮肤的维护和发育、用于预防和治疗皱纹以及治疗伤口。所述肽可配制成促进愈合和健康皮肤发育、防止结疤和形成皱纹以及改善愈合效果的治疗性组合物、洗剂、乳膏、皮肤覆盖物和伤口敷料。
文档编号A61K38/00GK1756839SQ200380110036
公开日2006年4月5日 申请日期2003年11月18日 优先权日2002年12月30日
发明者S·马利克, S·奎尔克 申请人:金伯利-克拉克环球有限公司