积雪草总苷在制备防治慢性肾功能衰竭药物中的应用的制作方法

专利名称：积雪草总苷在制备防治慢性肾功能衰竭药物中的应用的制作方法
所属领域本发明涉及植物有效成份的医药用途，具体地说是积雪草总苷在制备防治慢性肾功能衰竭药物中的应用。
背景技术：
积雪草为伞形科积雪草属植物，全草入草，其性甘、辛、凉、消热解毒。民间常用于治疗感冒、扁桃腺炎、传染性肝炎、痢疾、跌打损伤、疗疮肿毒、外伤出水等。积雪草的有效组份积雪草总苷药理及药学用途已有很多研究与报道。例如该总苷具有抗胃清疡作用(浦培炎等《现代应用药学》1989，b(1)8)。增强记忆作用Nallni k，etat Fitoterapia.1992，63(3)232)；对中枢神经的抑制作用(Piwan pv，et at.Fitoterapia 1991，62(3)253)；刺激生物合成作用(Tenai R et at，ItalJ Biochem，1988，37(2)69)等等，在临床上用于治疗静脉功能不合(MonleverdtA et al Aeta Ther，1987.13(6)629)治疗微血管病(Pelearo G，et al Carr Ther Res ClinExp，1989，46(6))，治疗皮肤病和创伤(CTiardinaA，etal，Cbrcn.bermalol，1987，18(Suppl，1)109)等等。目前人们一直在继续研究探询积雪草总苷更多更好的医药新用途。

发明内容
本发明的目的就是提供一种积雪草总苷的医药新用途。
本发明的目的是这样实现的本发明人经长期研究发现积雪草总苷在防治慢性肾功能衰竭中具有一定的作用。鉴此发明了其在制备防治慢性肾功能衰竭药物中的应用。
慢性肾功能衰竭是各种肾脏疾病发展到终末期的共同通路，是各种肾小球、血管和小管间质本身疾病的最后结局。是在各种致病因子如炎症、各种损伤、药物、糖尿病和遗传因素等的作用下，间质细胞及细胞基质增多，基质降解受抑造成细胞外基质的大量堆积导致的肾小球硬化和小管间质的纤维化，伴之肾功能逐渐减退和丧失。目前西医学对慢性肾功能衰竭的治疗尚无良策。
本发明研究证明，积雪草总苷具有良好的抗慢性肾功能衰竭的作用。
本发明的有益效果通过以下实施例得到了证明。
实施例1积雪草总苷对腺嘌呤肾功能衰竭的研究实验材料 雄性SD大鼠，体重120g左右(南京中医药大学实验动物中心)。腺嘌呤(C5H5N5)，分子量135.13，上海伯奥生物科技有限公司生产。免疫组织化学主要试剂一抗羊抗大鼠TGF-β1、TIMP-1、PAI-1多克隆抗体；二抗兔IgG免疫试剂盒；三抗SABC试剂盒，TGF-β1、TIMP-1原位杂交试剂盒博士德生物技术公司。
给药方法大鼠适应性喂养3天，体重增加后进行实验。实验组用含量为98.0％腺嘌呤混悬液灌胃(剂量为100mg/kg.d、150mg/kg.d、200mg/kg.d，依次各一周)，造模3周后给予积雪草总苷9mg/kg，治疗2周后处死动物心脏采血检测肝肾功能，并取肾组织分成两部分，一部分进行病理检查，另一部分经多聚甲醛固定后进行原位杂交检测，对照组灌胃同等体积的蒸馏水。
免疫组化方法切片脱蜡至水，0.3％H2O2灭活内源性过氧化物酶，92℃抗原热修复，加TGF-β1、TIMP-1、PAI-1多克隆抗体，4℃过夜。加用山羊抗兔IgG二抗，加SABC复合物，DAB-H2O2显色。苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片。镜下观察拍照，阳性物质呈棕黄色。本实验设空白对照和血清替代对照，各对照结果均为阴性。
原位杂交方法恢复室温，0.6％H2O2灭活内源性过氧化物酶，暴露mRNA核酸片段，加20μl预杂交液，37℃-40℃恒温3小时，加20μl杂交液，40℃杂交过夜，洗涤，滴加牛血清白蛋白封闭液和生物素化鼠抗地高辛，加SABC和生物素化过氧化物酶，DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。镜下拍片观察，核蓝染，胞浆内阳性物为棕黄色。空白对照不加杂交探针，结果为阴性。
结果与分析图像分析采用北京航空航天大学病理图像分析系统，每组分析6个标本，每个标本取6个肾小球或6个分区；免疫组化及原位杂交图片分析每标本6个分区的阳性反应物的含量。
结果见表1、表2
表1积雪草总苷对腺嘌呤慢性肾功能衰竭大鼠24h蛋白定量的影响

注 & 与模型组相比p＜0.01，#与正常组相比p＜0.01表2积雪草总苷对腺嘌呤慢性肾功能衰竭大鼠肝肾功能的影响

注 & 与模型组相比p＜0.01，#与正常组相比p＜0.01积雪草总苷对腺嘌呤肾衰大鼠病理形态学的影响积雪草总苷组小管上皮细胞空泡变性，偶见蛋白管型及局部单核细胞浸润，模型组大鼠则见肾小管多灶性萎缩，肥大，明显蛋白管型，间质明显纤维化及水肿，弥漫性单核细胞浸润。模型组显示肾小管排列紊乱，管腔重度变形，小管基底膜明显增厚，小管细胞崩解，形态不清。间质局部水肿，部分纤维增生明显，淋巴细胞浸润。部分肾小球纤维化，形态消失，部分肾小球体积缩小，包曼氏囊腔狭窄，基膜部分断裂、粘连。系膜增宽，大部分毛细血管腔变形、消失，病变受累＞80％。部分小球包曼氏囊基膜增厚，囊腔变宽。
积雪草总苷对腺嘌呤肾衰大鼠TGF-β1、TIMP-1、PAI-1的影响实验结果趋势表明免疫组化和原位杂交结果表明PAI-1、TGF-β1、TIMP-1的蛋白和mRNA阳性反应物主要分布在肾间质，反应强度模型组明显强于积雪草总苷组。
转化生长因子β1(TGF-β1)、是介导ECM沉积的主要因子，在肾组织损伤中，其浓度表达持续增高，与ECM成分增加相平行。基质金属蛋白酶(MMPS)为ECM降解三个主要系统之一(丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、MMPS)之一，MMP抑制物(TIMP)的浓度及纤溶酶系统与MMPS作用密切相关。纤溶酶原激活物(PA)是丝氨酸蛋白酶系统主要成员，EMC的堆积过程中，蛋白酶的调节变化是t-PA和纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)平衡的改变，在基质扩增过程中可能倾向于PAI-1，且PA的活性与PAI活性及浓度相关。鉴于三者在肾组织EMC堆积过程中的重要作用及相互影响关系，故本研究以这三种分子变化作为主要观察指标。TGF-β1、PAI-1、TIMP-1与CRF的关系。TGF-β在肾脏炎症、硬化与修复过程中的作用已有大量文献报道，其对肾脏细胞的增生、肥大、凋亡及局部和全身免疫反应都起重要作用，但最突出的是ECM的代谢调节作用。TGF-β1是肾小球硬化的重要介质。有实验证实体外培养的人、小鼠、大鼠系膜细胞、上皮细胞中，TGF-β1可诱导ECM不同成分的表达。同时，TGF-β1还是包括PAIS、TIMPS在内的多种分子的上游因子而起到多种调节作用。PAI和PA是调节纤溶系统活性的重要物质。被PA激活的纤溶酶本身具有降解ECM某些成分的作用，如纤维连接蛋白、层粘蛋白及纤维蛋白等，且为基质金属蛋白酶的激活剂。体外研究证明，肾脏固有细胞(系膜细胞、肾小球上皮细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞)可合成PA、PAI-1、及U-PA受体，PAI-1作为PAI主要成分在肾小球硬化及肾间质纤维化过程中起重要作用，其浓度的升高是导致肾脏ECM成分分泌增加、沉积的重要因素之一。TIMP-1是四种TIMP之一，广泛分布于组织与体液中，能参与多种疾病的发生发展过程，在实验中Nakamura发现，模型大鼠肾组织TIMP-1mRNA水平增加，则胶原蛋白、层粘蛋白明显增多。也有实验证实，在单侧肾切除加高胆固醇血症大鼠模型中，肾间质纤维化与TGF-β1、TIMP-1mRNA水平共同增高相关，而给予抗氧化剂可明显抑制间质纤维化。
积雪草总苷能阻止CRF病情发展，改善实验动物生存质量，降低实验动物血BUN和Scr水平。
积雪草总苷干预治疗后目标分子mRNA表达水平均不同程度上低于模型组，可降低肾小球、肾小管TGF-β1、PAI-1、TIMP-1mRNA表达水平，抑制ECM沉积，延缓肾纤维化过程。
实施例2积雪草总苷对5/6肾切除大鼠慢性肾功能衰竭的实验研究实验材料雄性SD大鼠，体重120g左右(南京中医药大学实验动物中心)。兔抗鼠ColIV、FN多克隆抗体。
动物模型的制作按照5/6肾切除方法。
适应喂养1周后，第2周的星期一摘除大鼠左侧2/3肾脏，第3周的星期一摘除大鼠右侧肾脏。手术后第4周的星期一按动物的血清肌酐水平随机分为(1)模型组；(2)积雪草组。分组后，开始分组每日灌胃给药(1)正常组、模型组给蒸馏水3ml/d；(2)积雪草总苷组按9mg/kg灌胃。治疗12周后杀检时，尾动脉取血，测定血清肌酐和尿素氮水平，并取肾组织行病理学检查。并于手术后4、8、12、16周测定24h尿蛋白定量。
肾组织形态学检测取新鲜肾组织，10％中性福尔马林固定，石蜡包埋做HE、PAS染色。对肾小球硬化进行半定量分级。每组取6只动物。每张切片观察20个肾小球。计算出肾小球基质面积占肾小球面积的百分比，用HPIAS-1000病理图象分析系统对PAS染色切片进行分析。同时对各组大鼠肾小管间质病变进行半定量分析。即根据小管间质正常、小管扩张、小管萎缩、管型、炎细胞浸润、间质纤维化分为正常(-)、轻(+)、中(++)、重(+++)4个级别。
免疫组化检测切片脱蜡至水，0.3％H2O2灭活内源性过氧化物酶，92℃抗原热修复，加ColIV、FN多克隆抗体，4℃过夜。加用山羊抗兔IgG二抗，加SABC复合物，DAB-H2O2显色。苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片。镜下观察拍照，阳性物质呈棕黄色。本实验设空白对照和血清替代对照，各对照结果均为阴性。
结果一般情况模型组动物明显营养不良，精神萎靡、活动迟缓、食欲不振、皮毛蓬松、枯槁无光泽，死亡率20％。积雪草组较好，死亡率为8％。
积雪草总苷对5/6肾切除大鼠24h蛋白定量的影响见表3表3 积雪草总苷对24小时尿蛋白定量的影响

注#与模型组相比P＜0.01从第8周开始，积雪草组与模型组相比，有显著性差异p＜0.01，提示积雪草总苷能明显降低模型组大鼠的尿蛋白。
积雪草总苷对5/6肾切除大鼠肾功能和血浆蛋白的影响(见表4)表4 积雪草总苷对5/6肾切除大鼠肾功能和血浆蛋白的影响

注#与模型组相比，p＜0.05或0.01，说明积雪草总苷能改善模型组大鼠的肾功能，提高血浆蛋白。
肾脏病理学检查 见表5、表6模型组肾小球系膜区呈局灶性或弥漫性中重度增宽，以系膜基质增多为主，系膜细胞增生不明显，毛细血管腔受增宽的系膜压迫变窄和或闭塞。部分肾小球毛细血管襻与肾小囊粘连，有的肾小球硬化、萎缩，肾小囊增厚，甚至与小球周围纤维化融合为一体。病变肾小球周围的近曲小管上皮细胞变性肿胀，使管腔变小，部分小管腔内可见蛋白管型。间质有散在的纤维组织增生，尤以硬化的肾小球周围明显，部分区域有大量的纤维组织增生，并见有散在的或局灶性炎细胞浸润，以淋巴细胞为主。
积雪草组肾小球毛细血管腔开放，多数肾小球系膜区呈轻度增宽，亦有少数肾小球系膜区成轻度或重度增宽，亦以系膜基质增多为主，偶见球囊粘连。有少数近曲小管上皮细胞变性，间质有少量的纤维组织增生及炎细胞浸润。
表5 肾脏病理检查结果

注 # 与模型组相比，p＜0.05或0.0l表6 肾小管间质变化情况

注与正常组相比#p＜0.05，##p＜0.0l&与模型组相比p＜0.05免疫组化结果ColIV表达主要分布于肾小球毛细血管基底膜、系膜区以及肾小囊基底膜等部位；FN的表达主要分布于肾小球系膜区，基底膜上亦有表达，但着色浅淡，与正常组相比，模型组的表达范围和强度明显扩大和增强，而积雪草总苷组与模型组相比，显著减轻。见表7表7 各组系膜基质中FN、ColIV相对含量的比较

注 *与正常组相比p＜0.01#与模型组p＜0.05或p＜0.01
本实验通过利用5/6肾切除制作慢性肾功能衰竭模型，给予积雪草总苷治疗，结果发现，积雪草总苷能显著减轻模型组大鼠的24小时尿蛋白，降低血肌酐、尿素氮，提高血浆蛋白。减少细胞外基质在硬化区域的沉积，防治肾小球硬化、纤维化的形成。所以说积雪草总苷对防止终末期肾衰的发生有至关重要的意义。
实施例3积雪草总苷对慢性血清病系膜增生性肾炎的影响实验动物及分组远交系健康雄性SD大鼠50只，体重150±21克，10周龄，由南京中医药大学实验动物中心提供。，动物经普通饲料适应性喂养1周后，尿蛋白定性结果阴性，随机分为正常组，模型对照，积雪草总苷组。每组10只。
主要试剂完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂(GIBCO公司)，牛血清白蛋白(BSA)和大肠杆菌内毒素(SIGMA公司)。一抗包括兔抗鼠TGFβ1多克隆抗体、小鼠抗大鼠PDGF单克隆抗体(北京中山生物技术公司)，Tris碱、30％H2O2(南京创瑞生物技术公司)。SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物技术公司)。
大鼠实验性系膜增生性肾炎模型的复制采用改良的慢性血清病性MsPGN模型[1]，40只雄性SD大鼠，氯胺酮静脉麻醉后经背部切除左侧肾脏，休养1周后进行预免疫。在每只大鼠背部皮下分点注射完全弗氏佐剂0.1ml加BSA3mg，于1周末、2周末背部皮下注射不完全弗氏佐剂0.1ml加BSA3mg，3周末，腹腔注射BSA连续4次，每次间隔1h，注射剂量每只分别为0.5、1、1.5、3.0mg；次日每只在腹腔注射BSA2mg。正式免疫于预免疫完成后第一天起，尾静脉与腹腔注射隔日交替进行，每只鼠尾静脉注射BSA剂量从0.5mg开始，每次增加0.5mg，至2.5mg为止，继续每周加量0.5mg，至每日用量5mg为止。腹腔注射量是尾静脉注射量的1倍，至每日用量10mg为止。免疫2周后尾静脉注射大肠杆菌内毒素100μg/只。全部大鼠与正式免疫8周后处死取肾组织。
生化及病理学检查生化检查(1)24小时尿蛋白定定量；(2)尿C3、NAG；(3)血尿素氮、肌酐；(4)血清总蛋白、白蛋白。半自动生化分析仪检测肾脏组织形态学的检查免疫组化检测切片脱蜡至水，0.3％H2O2灭活内源性过氧化物酶，92℃抗原热修复，加TGF-β1、PDGF多克隆抗体，4℃过夜。加用山羊抗兔IgG二抗，加SABC复合物，DAB-H2O2显色。苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片。镜下观察拍照，阳性物质呈棕黄色。本实验设空白对照和血清替代对照，各对照结果均为阴性。
结果湿热伤肾大鼠模型尿蛋白及药物干预情况自造模第六周起，模型组与积雪草组均有不同程度的蛋白尿，且随时间推移逐渐加重，第六、八、十周末时，24小时尿蛋白定量各积雪草组显著低于模型组。积雪草总苷组提示积雪草总苷能明显减轻MsPGN大鼠的蛋白尿。见表8表8 第六、八、十周末24h尿蛋白定量变化情况(mg/24h)

注 # 与正常组相比p＜0.01，△与模型组相比p＜0.01湿热伤肾大鼠模型血肌酐、尿素氮及血浆蛋白变化情况第十周末时，模型组的血CRE、BUN均明显高于正常组(p＜0.01，积雪草组血CRE、BUN与模型组相比有极显著性差异(p＜0.01，说明积雪草总苷能改善MsPGN大鼠的肾功能，第十周末时，积雪草组血浆蛋白与模型组相比有极显著性差异(p＜0.01，说明积雪草总苷能明显提高MsPGN大鼠的总蛋白、白蛋白。见表9表9第十周末血肌酐、尿素氮及血浆蛋白变化情况

注 # 与正常组相比p＜0.01，&与模型组相比p＜0.01湿热伤肾大鼠模型的肾小管间质病变情况第十周末杀检时，模型组的尿NAG、UUC3明显升高，与正常组相比，有极显著性差异(p＜0.01。积雪草组能降低尿NAG、UUC3。见表10表10 第十周末尿NAG、UUC3的变化情况

注#与模型组相比P＜0.05或P＜0.01
肾组织学检查光镜检查 模型组免疫6周部分肾小球增大，肾小球毛细血管明显扩张，内皮细胞肿胀，炎细胞浸润，肾小管上皮细胞呈颗粒及空泡变性，有红细胞管型及透明管型形成。免疫8周系膜细胞局灶节段性增生，部分肾小囊粘连，炎细胞浸润。免疫10周主要表现为个别肾小球出现萎缩而至纤维化，多数呈现弥漫的轻重不等的系膜组织增生，大部分区域为中度增生，表现为系膜区增宽，增宽的系膜区内系膜细胞和系膜基质均有增生，个别区域出现重度增生，毛细血管腔狭小，个别结构破坏，血管消失。炎症细胞浸润明显，积雪草总苷组个别区域肾小球系膜细胞轻度增生，系膜基质轻度增宽，管腔无挤压现象。见表11。
表11 大鼠的病理检测结果

注△与模型组相比P＜0.01电镜模型组可见肾小球系膜区系膜细胞增生，系膜基质增多，上皮细胞可见节段性足突融合或绒毛变，系膜区可见云雾状电子致密物沉积，与模型组相比积雪草总苷组未见明显系膜细胞增生及系膜基质增多现象。
免疫荧光正常组肾小球系膜区无IgG、C3沉积，模型组免疫6周表现为肾小球内有细颗粒状IgG(+~++)和C3(+~++)在系膜区沉积，免疫8周肾小球内有粗颗粒状的IgG(++~+++)和C3(++~+++)在系膜区沉积，免疫10周末杀检时IgG(+++~++++)和C3(+++~++++)呈粗大颗粒状在系膜区沉积。积雪草总苷组IgG(+~++)和C3(+~++)沉积明显减少，呈散在颗粒状。
免疫组化结果结果显示正常组TGFβ1肾小球有极其微弱的表达，而在肾间质的分布较在肾小球内为多。模型组在第6、8周时TGFβ1主要分布在包曼氏囊、肾小球的上皮基底膜，同时在肾间质的分布亦明显增多。在第10周杀检时模型组可以见到TGFβ1大量分布在包曼氏囊、肾小球的上皮基底膜、血管内皮，同时在肾间质的分布亦明显增多，部分呈团块状。积雪草总苷TGFβ1在肾小球的分布较模型组相比明显减少p＜0.01＝说明积雪草总苷能明显减少MsPGN大鼠肾组织中TGFβ1的分布。
结果显示正常组有PDGF的基础表达，在第6、8周时可见PDGF主要分布于系膜基质和某些肾小囊的上皮细胞及小管间质部位。第10周杀检时模型组的PDGF染色明显增强，主要分布在系膜基质和肾小囊的上皮细胞和小管间质部位，与正常组相比，模型组的PDGF染色范围显著增强(p＜0.01＝，积雪草总苷的PDGF的染色范围较模型组相比，显著减少(p＜0.01＝，提示积雪草总苷能明显减少MsPGN大鼠系膜基质中PDGF在肾小球的分布。见表12表12 PDGF和TGF-β1的免疫组化分析

注#与模型组相比P＜0.01在肾脏疾病中，细胞因子至少通过两种途径参与病变过程一是作为攻击性炎症介质，主要有IL-2、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、PDGF、TGFβ1等；二是作为抗炎细胞因子，参与肾脏疾病的自我防御，促进炎症的消散与修复，主要有IL-4、IL-10、IL-13、IL-1ra等。致炎性和抗炎性细胞因子的平衡，决定肾脏病的转归。
PDGF是系膜细胞的一种最强的有丝分裂因子，在动物和人类MsPGN均以发现肾组织中具有PDGF-A或PDGF-BmRNA及PDGF-B受体mRNA和蛋白的高表达。PDGF在影响炎症增殖过程的同时，可能还影响细胞骨架蛋白的表达改变和重组。有研究发现应用PDGF-B的拮抗剂和PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂STI571能减轻肾小球硬化、小管间质破坏，肾小球和间质部位III、IV胶原的聚集以及TGF的过度表达，提示通过拮抗PDGF-B可以延缓进展性肾病尤其使系膜增生性肾炎的进展。
转化生长因子-β1(TGFβ1)是一种多功能的细胞因子，其过度表达，能导致组织器官的纤维化。大量的临床和实验证明，TGFβ1与肾小球硬化密切关系，TGFβ1通过促使系膜细胞分泌产生IV型胶原和纤维连接蛋白而导致细胞外基质聚集。TGFβ1可刺激培养的肾小球系膜细胞、上皮细胞和近曲小管上皮细胞的ECM合成增加。应用TGFβ1特异性抑制剂Decorin转染人系膜细胞来拮抗肾纤维化。所以说TGFβ1在肾小球疾病进展到硬化的过程中是一个关键的介导因素。
实验结果表明，在正常肾小球TGFβ1的分布在肾间质较肾小球内为多，与文献报道一致。而在模型组的第6、8周TGFβ1在肾小球的分布逐渐增多，10周末杀检时TGFβ1的分布主要在肾小球基膜、系膜区、肾小囊壁层上皮及小管间质部位，积雪草总苷能明显减少PDGF和TGFβ1在肾小球尤其是在肾小管间质部位的分布，降低其mRNA水平，说明积雪草总苷能通过抑制PDGF与TGFβ1的蛋白和mRNA表达从而抑制系膜细胞增生和基质增加。
实施例4积雪草总苷对膜性肾病大鼠的影响实验动物选择健康SD大鼠40只，日龄46天，体重200±20克，购于南京中医药大学实验动物中心。实验期间给予大鼠全价颗粒饲料及自由饮水。保持温度18～24℃，空气相对湿度40～70％。
主要试剂及仪器阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)自备，弗氏不完全佐剂(美国Gibco公司)，羊抗大鼠I、III型胶原(福州迈新生物技术公司)，积雪草总苷，按9mg/kg剂量灌胃。ACETM全自动生化分析仪(美国国际核电集团产品)，BHS-313荧光显微镜(日本OLYMPUS产品)。
实验方法抗原制备根据文献方法改变N-BSA的等电点，用双蒸水(4℃)透析48h，冷冻干燥后测得C-BSA PI≥10，贮存于-80℃超低温冰箱中备用。
模型制作参照文献方法稍加改进后制作大鼠膜性肾病(MN)动物模型。将1.1mg-BSA溶于0.55ml生理盐水中，与等量IFA充分乳化后，给大鼠多点皮下注射为预免疫；于1周后开始致病免疫，即隔日一次给大鼠尾静脉注射(iv)C-BSA4mg，连续4周。
分组及给药SD大鼠购回后先适应饲养1周，尿检蛋白全部阴性。预免疫后，根据大鼠体重随机分为4组，每组各10只，即正常组、模型组、积雪草组。
正常组每日一次予双蒸水3ml ig，1h后隔日一次尾部iv 1ml。
模型组每日一次予双蒸水3ml ig，1h后隔日一次尾部iv C-BSA 4mg(将C-BSA用配制成5mg/ml的溶液)。
积雪草组造模同模型组，同时给药治疗。
观察指标一般情况观察观察大鼠的精神状态、活动情况、体重、体毛、饮食及大小便等。
实验室检查24h尿蛋白定量(24hUTP)、血清白蛋白(ALB)、血脂(TC、TG)和肾功能(Scr、BUN、Ccr)。ACE全自动生化分析仪检测上述指标。
肾脏组织病理学检查光镜做HE、PAS两种染色；免疫荧光。
免疫组化方法切片脱蜡至水，0.3％H2O2灭活内源性过氧化物酶，92℃抗原热修复，加羊抗鼠Col III和Col I多克隆抗体，4℃过夜。加用山羊抗兔IgG二抗，加SABC复合物，DAB-H2O2显色。苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片。镜下观察拍照，阳性物质呈棕黄色。本实验设空白对照和血清替代对照，各对照结果均为阴性。
计算机图像分析采用HPIAS-1000病理图像分析系统，测量每个肾小球中着色的阳性物质面积及整个肾小球的面积，以二者的比值表示每种成分在肾小球中的相对含量，每个标本取3个肾小球，每组分析6个标本。
一般状况变化正常组反应敏捷，活动正常，毛色光泽，饮食与饮水正常，大便呈颗粒状，24h尿量10ml左右，尿色淡黄。其余3组在实验期间，出现精神不振，反应迟钝；毛发欠光泽，倦怠踡卧，喜拱背扎堆；饮食与饮水减少，活动量少，体重增长缓慢；尿量减少，大便稀溏等。上述表现以模型组最为明显，有的出现腹部胀大、会阴部水肿，有的处死时、剖腹可见有大量腹水。
尿量的变化24h尿量的变化，除正常组外，其余各组大鼠尿量均有减少，而以模型组减少最为明显；经统计学分析大鼠尿量变化情况有显著差异(P＜0.05)，见表13。
表13 积雪草总苷对膜性肾病大鼠尿量的影响(X±SD，ml/24h)

△与模型组比P＜0.05；实验室检查24h尿蛋白的变化于致病免疫2周末，除正常组外，其余2大鼠24h尿蛋白均明显增加，尤以模型组增加明显且最高，于致病免疫4周末，除正常组外，模型组大鼠24h尿蛋白增高明显。经方差分析，2周末和4周末各组大鼠尿蛋白变化情况，均有非常显著性差异(P＜0.01)，见表14。
表14 积雪草总苷对膜性肾病大鼠24h尿蛋白的影响(X±SD，mg/24h)

*与模型对照组比P＜0.01；血清白蛋白变化于致病免疫2周末，除正常组外，其余2大鼠血清白蛋白均有降低，尤以模型组降低明显且最低，致病免疫4周末，仍以模型组最低。经方差分析，2周末和4周末积雪草组大鼠血清白蛋白的变化情况，有非常显著性差异(P＜0.01)，见表15表15积雪草总苷对膜性肾病大鼠血清白蛋白的影响(X±SD，g/L)

*与模型组比P＜0.0l；血浆胆固醇情况于致病免疫2周末，除正常组外，其余2大鼠血浆胆固醇均明显升高，尤以模型组升高明显且最高，于致病免疫4周末，仍以模型组最高，经方差分析，2周末和4周末积雪草组大鼠血浆胆固醇的变化情况，均有非常显著性差异(P＜0.01)，见表16。
表16 积雪草总苷对膜性肾病大鼠血浆胆固醇的影响(X±SD，mmol/L)

*与模型组比P＜0.01；血浆甘油三脂的变化情况于致病免疫2周末，除正常组外，其余2组大鼠血浆甘油三脂均明显升高，尤以模型组升高明显且最高，于致病免疫4周末，仍以模型组最高，2周末和4周末积雪草组大鼠血浆甘油三脂的变化情况，均有非常显著性差异(P＜0.01)，见表17。
表17 积雪草总苷对膜性肾病大鼠血浆甘油三脂的影响(X±SD，mmol/L)

*与模型对照组比P＜0.01血肌酐的变化情况于致病免疫2周末，除正常组外，其余2组大鼠血肌酐均有明显升高，尤以模型组升高明显，致病免疫4周末，仍以模型组最高，经方差分析，2周末与4周末积雪草组大鼠血肌酐变化情况，均有非常显著性差异(P＜0.01)。见表18表18 积雪草总苷对膜性肾病大鼠血肌酐的影响(X±SD，μmol/L)

*与模型对照组比P＜0.01。
血尿素氮变化情况于免疫2周末，除正常组外，其余2组大鼠血尿素氮均有明显升高，尤以模型组升高明显且最高，致病免疫4周末，仍以模型组最高，经方差分析，2周未与4周末积雪草组大鼠血尿素氮的变化情况，均有非常显著性差异(P＜0.01)，见表19。
表19 积雪草总苷对膜性肾病大鼠血尿素氮的影响(X±SD，mmol/L)

*与模型组比P＜0.01。
肾脏组织病理学改变情况光镜检查正常组HE染色可见肾小球形态结构正常，肾小球毛细血管袢开放良好，GBM无增厚、上皮细胞足突形态正常，系膜细胞及系膜基质无增多。
模型组进行HE、PAS、染色在镜下观察，可见肾小球体积稍增大，GBM明显增厚，细胞数略增加，基质稍增多；积雪草组肾小球体积稍微增大，GBM无明显增厚，细胞数略增多，与正常对照组无明显差异。
免疫组化检测结果正常组Col-III主要表达在肾小管上皮细胞基底膜及间质处，且染色较浅。模型组Col-III表达显著增强，膜性肾病是成人肾病综合征常见的病理类型之一，主要是由于肾小球基底膜上原位免疫复合物沉积而形成的一种典型的自身免疫性疾病。其病理特点是有多数位于肾小球上皮细胞下或基底膜外侧的免疫复合物沉积，从而表现为肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚。临床上则表现为大量蛋白尿或肾病综合征。
本次实验积雪草组的尿蛋白较模型组明显减少，推测积雪草总苷可能是通过减轻尿蛋白排泄量、改善肾脏小血管内血流动力学及高代谢状态而达到保护肾小管的目的。血尿素氮和血肌酐的改善也提示积雪草组能提高肾小球滤过率，促进尿素氮和肌酐的排出，改善肾功能。同时发现，积雪草总苷具有减少免疫复合物沉积，减轻肾小球基膜增厚，减轻肾小球病理损害的作用。
本实验免疫组化结果显示，正常组Col-III主要表达在肾小管上皮细胞基底膜及间质处，且染色较浅。模型组Col-III表达显著增强，积雪草组与模型组比较有显著性差异。提示积雪草总苷可显著减少Col-III在肾小管间质的表达，延缓MN模型大鼠肾间质纤维化的发生。
综上所述，积雪草总苷能显著减轻模型组大鼠的24小时尿蛋白，降低血肌酐、尿素氮，提高血浆蛋白，提高肾小球滤过率；减少细胞外基质在硬化区域的沉积，减轻肾小球基膜增厚，减轻肾小球病理损害，防治肾小球硬化、纤维化的形成；所以，积雪草总苷完全可以在制备防治慢性肾功能衰竭药物中得到应用，特别是在制备防治膜性肾病药物中的应用更具有显著意义。
积雪草总苷原料药可以在医药市场上购得。以其为活性成分，可制备成用于防治慢性肾功能衰竭或防治膜性肾病的各种药物制剂。
以下实施例例举了积雪草总苷的几种剂型
实施例5积雪草总苷口服液将250mg积雪草总苷()，溶于1000ml水中，制成0.25％浓度的水溶液，加热溶解，混合均匀，装入20ml药瓶中，封口、消毒。
服用方法口服，每日服用积雪草总苷50-100mg。
实施例6积雪草总苷注射液取积雪草总苷2000mg，按注射剂常规制备方法，制成4mg/2ml/支浓度的注射液，蒸汽流通灭菌30分钟。
用法用量肌注或静脉注射，每日20-100mg。
实施例7积雪草总苷片剂取积雪草总苷2000mg，按常规片剂制备方法，加入淀粉，糊精、硬酯酸镁等，混合制成湿粒，机器冲压成片，每片含积雪草总苷25mg。
用法用量口服，每日2-3次，每次25mg-100mg。
本发明的药物剂型不完全限于此，它可以制备成更多的剂型，如滴丸、胶囊剂、软胶囊剂、缓控释制剂等等。
本发明的药物用法用量，也不完全限于此。临床医师也可以根据病人的具体情况决定药物的用法用量。
权利要求
1.积雪草总苷在制备防治慢性肾功能衰竭药物中的应用。
2.积雪草总苷在制备防治膜性肾病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种雪草总苷在制备防治慢性肾功能衰竭药物中的应用。本发明证实积雪草总苷能显著减轻模型组大鼠的24小时尿蛋白，降低血肌酐、尿素氮，提高血浆蛋白，提高肾小球滤过率；减少细胞外基质在硬化区域的沉积，减轻肾小球基膜增厚，减轻肾小球病理损害，防治肾小球硬化、纤维化的形成；所以，积雪草总苷完全可以在制备防治慢性肾功能衰竭药物中得到应用，特别是在制备防治膜性肾病药物中的应用更具有显著意义。
文档编号A61K31/7028GK1712013SQ200410012358
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月22日 优先权日2004年6月22日
发明者黄怀鹏 申请人:神威药业有限公司