专利名称：热疗促进树突状细胞疫苗功能临床治疗恶性实体瘤的制作方法
技术领域：
本发明是一种恶性肿瘤治疗的新方法，属于肿瘤生物免疫治疗范畴。肿瘤生物免疫治疗包括细胞因子治疗、单克隆抗体治疗、过继免疫治疗、肿瘤疫苗治疗和基因治疗，本发明属于肿瘤疫苗范畴内的树突状细胞治疗新方法。
背景技术：
树突状细胞(Dendritic Cell，DC)疫苗抗肿瘤治疗效应的基础和临床研究，是近年来国内外肿瘤免疫学研究的新热点(1)。近年来，国外文献相继报道了树突状细胞疫苗临床抗肿瘤治疗的研究和取得的较佳临床治疗效果，但国内尚未见相关报道。DC是能力最强的抗原提呈细胞，无论在体内和体外条件下，均证实其在起始和诱导免疫反应中起着关键的枢纽作用(2)。他们最显著的特征就是能够俘获，加工抗原，并与共刺激分子如MHCII，B7-2，B7-1一同将抗原提呈给免疫效应细胞，同时释放免疫调控分子，如IL-12，某些趋化因子等。不成熟DC在遇到抗原时，能够获取并加工抗原，在某些炎性因子或细胞因子的刺激下，其经历成熟的过程并迁移至淋巴组织，激活T，B淋巴细胞和初始T细胞。因而，DC在抗感染和抗肿瘤免疫反应中扮演着至关重要的角色(3)。
有效的抗肿瘤治疗要求DC能够较好地呈递肿瘤抗原，但肿瘤细胞往往低表达MHC分子和缺乏共刺激分子，抗原刺激T细胞在缺乏共刺激分子的情况下可引起T细胞的失能-T细胞的无反应状态。另外，肿瘤细胞甚至还可以分泌免疫抑制因子，如IL-10，TGFβ，VEGF等抑制DC进入肿瘤组织，抑制DC成熟和向二级淋巴组织迁移并呈递肿瘤抗原(4)。研究证实，肿瘤组织内DC的侵润数量与肿瘤患者的预后密切相关；且肿瘤体内侵润的DC经证实均为不成熟DC，这些DC无能力迁移至淋巴组织激活淋巴细胞而引起抗肿瘤免疫反应(5)。
对DC的分离纯化和功能研究成为近年免疫学研究的热点之一，同时为抗肿瘤免疫治疗提供了一个全新的治疗概念和方法。体外分离纯化DC后，用肿瘤抗原冲击后回输治疗肿瘤无论在动物实验还是临床实验中均取得了成功。他们采用的方法主要有如下几种；1.应用肿瘤细胞的冻融物或照射灭活的肿瘤细胞冲击DC体内回输可以产生明显的抗肿瘤效应。2.采用肿瘤抗原MHC I类多肽冲击DC，可以具有更好的靶向性，且肿瘤抗原的浓度更大，可以产生“冲击致敏”的效应，促进T细胞的有效激活，但由于真正特异性的肿瘤抗原目前仍仅发现于黑色素瘤，因而限制了其应用范围。3.已报道应用多种方式将肿瘤抗原基因转移入DC，体内诱导特异性抗肿瘤免疫功能。肿瘤细胞来源的RNA也可用作抗原冲击DC。4.特异性抗体是肿瘤细胞的内影象，应用特异性抗体，体外冲击致敏DC后回输，临床报道取得了较好的疗效。5.细胞因子，趋化因子基因转染DC或肿瘤细胞后可明显增强DC的抗肿瘤功能(6-8)。
早期DC的输注途径多采用静脉注射。近年来，采用皮下、皮内、淋巴管内、瘤体内注射的方法得到了广泛的重视。目前，多数学者认为，皮内、瘤体内注射可能更有利于DC发挥其生物学功能(9)。大部分临床报道DC每次注射的细胞数量为106-108，研究认为DC注射的细胞数量与肿瘤缓解的时间成正比。
DC回输发挥抗肿瘤效应的关键步骤之一即是DC对肿瘤抗原的成功摄取。体外研究有报道发现DC可摄取TUNEL+凋亡肿瘤细胞裂解物；亦有研究证实细胞坏死比凋亡更具有免疫原性，坏死后的细胞裂解物更有利于肿瘤抗原被DC摄取。凋亡或坏死肿瘤细胞所释放的蛋白，如热休克蛋白HSP70，在DC的抗原摄取和呈递途径中能起到有效地促进作用(10)。这种HSP70促进作用的机制是HSP可作为伴侣分子促进肿瘤免疫原性肽进入DC之中。另外，细胞死亡之后所释放的因子能够促进DC的成熟和向淋巴组织的迁移。
我们通过动物实验已经证实(11-12)，射频热疗之所以取得较好的临床效果的原因，是因为部分肿瘤细胞经42℃以上高温处理后的坏死或凋亡的裂解物和释放的HSP等分子，能够促进DC对肿瘤抗原的摄取和促进DC的成熟和迁移能力，从而激发了免疫系统对肿瘤细胞的特异性免疫反应所致。我们把这一理论应用于临床，拟采用从患者外周血分离纯化DC后，体外培养7-9天，再注射至经局部射频热疗后的肿瘤瘤体内，以期产生更好的临床肿瘤治疗效果。这是因为本设计方案有如下理论支持1.肿瘤细胞经热疗后释放的HSP等分子可促进DC对肿瘤抗原的摄取和提呈。2.肿瘤细胞坏死后所释放的细胞因子可促进DC的成熟和向二级淋巴组织迁移，增强DC活化T细胞的能力。3.肿瘤瘤体内DC浸润较少，DC浸润的数量又与肿瘤患者的预后密切相关，将体外培养的大量DC直接注射至瘤体内，可极大地提高瘤体内DC的数量。4.肿瘤细胞缺乏共刺激分子，低表达MHC，热疗后肿瘤细胞坏死可释放肿瘤抗原，利于DC摄取肿瘤抗原。5.肿瘤细胞分泌表达的抑制DC进入和摄取肿瘤抗原以及成熟迁移的抑制因子随着肿瘤细胞坏死后被破坏，这些抑制因子对患者DC的抑制作用，随着DC体外培养后得到恢复，因而为DC在肿瘤局部发挥功能提供了更好的微环境。
本发明依据树突状细胞生物学特性以及射频热疗的生物学效应，用射频热疗来增强DC疫苗抗肿瘤临床治疗效果，发现了DC抗肿瘤治疗新的理论和效果更佳的临床肿瘤治疗方法，国内外均未见此类报道。因而，本发明存在着巨大的经济效益和社会效益潜力。
参考文献1.Guo J，Chen T，Zhang M，et al.2003.Cyclosporin A impairs dendritic cell migration by regulatingchemokine receptor expression and inhibiting cyclooxygenase-2 expression.Blood.Sep 22[Epub aheadof print].
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3.Gilboa-E；Nair-SK and Lyerly-HK.1998.Immunotherapy of cancer with dendritic-cell-based vaccines.Cancer-Immunol-Immunother.4682.
4.Katsuaki.S，Kawasaki.H，Nagayama.H，Enomoto.M，Morimoto.C，Tadokoro.K，Juji T and Takahashi.TA.2000.TGF-β1 reciprocally controls chemotaxis of human peripheral blood monocyte-deriveddendritic cells via chemokine receptors.J Immunol.1642285.
5.Bell DP，Chomarat D，Broyles G，Netto G，M.Hard S，Lebecque J，Valladeau J，Davoust K，Palucka A and J Banchereau.1999.In breast carcinoma tissue，immature dendritic cells reside within thetumor，whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas.J Exp Med.19014176.Guo J，Chen T，Wang B，et al.2002 Macrophage-derived chemokine gene transfer results in tumorregression in murine lung carcinoma model through efficient induction of antitumor immunity.GeneTher，9(12)793-8037.Guo J.Chen T，Zhang M，Wang B et al.2003 Fractalkine transgene induces T cell-dependent antitumorimmunity through chemoattraction and activation of dendritic cells.Int J Cancer，130(2)213-2208.Guo J.Zhang M，et al.2003 Chemoattraction，adhesion and activation of natural killer cells are involvedin the antitumor immune response induced by fractalkine/CX3CL1.Immunol Lett 9；89(1)1-7.
9.Triozzi PL，Khurram R，Aldrich WA，Wallker MJ，Kim JA，Jaynes S.2000 Intratumoral injection ofdendritic cells derived in vitro in patients with metastatic.Cancer.15264610.Todryk S et al.1999.Heat shock protein 70 indnced during tumor cell killing induces Th1 cytokines andtargets immature dendritic cells precursors to enhance antigen uptake.J Immunol.163139811.Guo J et al.2004.Exosomes derived from heat shock-induced lung cancer cells elicit effective antitumorimmunity by chemoattracting dendritic cells and T cells.Cancer Res(in press)12.Guo J.et al.2004.HSP70 is involved in heat shock-induced chemokine production of tumor cells JBiol Chem(in press)三、发明内容
发明内容
拟采用从患者外周血分离，纯化DC后，体外培养7-9天，流式细胞检测DC表型及其生物学特性；再将体外培养的患者DC注射至经42-43摄氏度热疗后的患者肿瘤瘤体内，临床观察肿瘤治疗效果；经ELISPOT，FACS等方法检测DC及细胞因子的改变；四聚体实验检测肿瘤特异性T细胞；体内迁移实验观察注入DC的体内迁移；取淋巴结行免疫组化和免疫荧光检测DC激活抗肿瘤免疫合用DC活化剂，如CPG，卡介苗或IL-2激活的T细胞等观察活化DC增强抗肿瘤疗效的作用。
发明目的发现新型的，效果更佳的临床肿瘤治疗方法。
发明解决的关键问题在体内治疗条件下，肿瘤细胞经热疗后释放的HSP等分子可促进DC对肿瘤抗原的摄取和提呈极其成熟和向二级淋巴组织迁移，增强DC活化T细胞的能力，同时热疗提供了诱导免疫反应产生所必需的“危险信号”，因而能够极大地提高DC疫苗抗肿瘤效果，为临床肿瘤治疗提供除放化疗外新的，更有效的临床肿瘤治疗方法。
具体实施例方式
一、病例选择1.病种经病理组织学(或细胞学诊断)证实的肾透明及颗粒细胞癌、恶性黑色素瘤、惰性非何杰金氏淋巴瘤及其它恶性实体瘤。
2.年龄范围18-75岁3.性别男女不限。
4.临床分期按照1997年国际抗癌联盟提出的TNM临床分期标准，III期-IV期的患者。
5.病例数50-150例6.病例选择与淘汰标准6.1选择标准●经病理学鉴定证实的恶性黑色素瘤、肾透明及颗粒细胞癌、惰性非何杰金氏淋巴瘤。
●志愿接受DC临床试验的患者。
●经B超或CT证实肿瘤直径大于2.5cm的实体瘤●至少在近四周内未进行过放化疗的患者●卡氏评分大于60分●器官功能大致正常●白细胞数＞3000/mm3，血红蛋白＞8mg/dl，血小板＞100,000/mm3，血清肌酸酐＜2.5mg/dl，血胆红素＜2.0mg/dl。
●预期生存时间至少在3个月以上。
6.2排除标准●重要生命脏器(心脏、肝、肾)严重功能不良者。
●曾接受过器官移植的患者。
●伴有其他恶性肿瘤，或已发生脑转移的患者。
●有自身免疫性疾病史(色素丢失除外)的患者。
●处于孕期、哺乳期的患者。
●处于急性传染病或慢性传染病活动期，HBV、HCV、HIV阳性者。
●有精神疾病者。
●4周内，曾接受免疫抑制剂(环孢素A、FT207等)或参与其他免疫治疗的患者。
●同时接受其他临床试验者。
二、射频热疗后树突状细胞瘤体内注射临床治疗方案1.方式瘤体经42度射频热疗1个小时后，B超引导下瘤体内DC多点注射。
2.剂量5-10×107个/次
3.时间及疗程每个疗程共输注3次，每次间隔2天。患者共接受2个疗程，间隔21天。
三、评估疗效的客观标准患者在接受该方案治疗前，需要通过CT或MRI或超声扫描进行转移性病变的确定，以及其他细胞免疫应答指标实验室检测。从进入治疗开始1年内(或到疾病发生进展为止)，每隔3月，进行上述肿瘤转移灶、以及其他细胞免疫应答指标的检查。临床反应按照WHO制定的标准判断。
四、实验室检测1.皮肤迟发性超敏反应2.非特异性T细胞应答检测3.细胞因子的检测EISPOT方法检测Th1型细胞因子(IFN-γ)。IFN-γ的升高，表明患者机体内产生对肿瘤细胞的Th1型细胞免疫反应，预后好。反之，预后差。
4.T细胞亚群的检测5.肿瘤抗原特异性T细胞的检测1五、毒副作用的评估及试验终点的标准1.根据国家卫生部药政局制定的《新药临床及临床前研究指导原则》中的毒性分级部分标准和可能出现的副作用进行各项指标的记录。
2.临床试验终点的界定标准及解决毒副作用的方案2.1 I期临床试验终点的界定标准●从开始接受治疗算起，经过两次疗程治疗，随访至1年。
●如果1年内出现疾病进展，则停止随访。
●在治疗过程中反复出现难以控制的毒性反应或副作用，可以终止治疗。
2.2可能出现的主要毒性反应及解决方法出现I-II级毒性反应，采取临床上常规的方法进行治疗，观察症状缓解后可继续进行治疗。
权利要求
1.一种树突状细胞的治疗方法，其特征在于利用热疗来促进树突状细胞的功能，并为诱导抗肿瘤特异性免疫提供危险信号。
2.如权利要求1所述的树突状细胞治疗方法，其特征在于先用射频热疗使瘤体内加温到42-43摄氏度1个小时，使肿瘤细胞释放热休克蛋白(HSP)并部分凋亡，之后将树突状细胞注射到瘤体内。由于HSP能够携带肿瘤抗原以及热疗诱导的瘤体内细胞因子的改变，使树突状细胞易于摄取肿瘤抗原，从而诱导特异性抗肿瘤免疫反应。
3.如权利要求1所述的树突状细胞治疗方法，其特征在于通过瘤体局部热疗，使肿瘤细胞释放热休克蛋白(HSP)，为肿瘤特异性免疫反应的起始提供了必需的“危险信号”。
全文摘要
树突状细胞(Demdritie Cell，DC)疫苗抗肿瘤治疗效应的基础和临床研究已成为国内外肿瘤免疫学研究的新热点。本发明依据树突状细胞生物学特性以及射频热疗的生物学效应，用射频热疗来增强DC疫苗抗肿瘤临床治疗效果，探讨DC抗肿瘤治疗新的理论和效果更佳的临床肿瘤治疗方法，国内外均未见此类报道。采用从患者外周血经血细胞分离机分离单个核细胞，体外诱导培养为未成熟DC后，再将其注射至经射频热疗1小时后患者肿瘤瘤体内，监测肿瘤动态变化；皮肤迟发性超敏反应；非特异性/特异性T细胞应答检测；细胞因子RNA及蛋白表达的改变；T细胞亚群的检测；DC的体内迁移；合用DC活化剂增强DC抗肿瘤疗效等指标。目标意义建立肿瘤细胞经射频热疗后，促进DC对抗原的摄取，呈递以及诱导肿瘤特异性T淋巴细胞的能力，增强DC疫苗的抗肿瘤效应的新理论，建立临床恶性肿瘤治疗疗效确切的新的技术方法。
文档编号A61P35/00GK1569235SQ20041003732
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月28日 优先权日2004年4月28日
发明者郭军, 朱军, 王小沛, 张运涛, 郑文, 勇威本, 顾晋, 游伟程 申请人:郭军