专利名称：亮菌发酵物制得的口服液体药物的制作方法
技术领域：
本发明属于一种口服液体药物。他是采用亮菌其学名为假密环菌(Armillariella tabecens)经固体发酵或液体深层发酵获得的发酵物后，进行煮提、浓缩、灌装、灭菌而得的口服液体药物。
背景技术：
亮菌是药用真菌，其有效成分是亮菌甲素、乙素、丙素及多糖和氨基酸，并含有多种微量元素。能增强人体体质，提高免疫功能，并且有消炎、止痛、降酶、退黄疸及利胆作用。临床可用于治疗急、慢性肝炎、迁延性肝炎、慢性胆管炎和胆囊炎以及慢性、浅表性、萎缩性胃炎、中耳炎及放疗、化疗引起的白细胞减少症等。公告号CN1031915C的中国专利文献公开了一种“亮菌糖浆”的生产方法。其菌丝体培养时间长，不利于工业化大生产，并且菌丝体的浸煮时间长达40小时，除可破坏菌丝体所含有效成分和氨基酸、多糖等，也不利于工业化大生产。另一公告号CN1066331C的中国专利文献公开了一种以亮菌为原料制备的液体口服药物，该专利只有一个培养基的碳、氮比例，不知其培养基总量。每一级的培养基相同，不利于大生产且生产成本高。所得亮菌液体口服药物标准只有两个简单指标相对密度和总氮量。没有明显的有效成分指标。
发明内容
本发明的目的是提供一种全新的亮菌发酵物制得的口服液体药物。其具有稳定的质量保证，较广泛的适应症，兼有较先进的生产工艺；可不受限制的进行工业化大生产，除已知适应症外，还可以用于治疗放疗、化疗引起的白细胞减少症，以及肿瘤、小儿黄疸、免疫力低下等病症。
本发明解决其技术问题，采用的技术方案为 使用的菌种购自于中科院菌种保藏中心。液体发酵方法如下 液体发酵培养基成分如下 碳源每升中含 葡萄糖5～10克 蔗糖 5～100克 饴糖 5～100克 淀粉 5～50克 玉米粉5～50克 米粉 5～50克 山芋粉5～50克 马铃薯 5～50克 燕麦粉 5～50克 以上成分1种或两种以上； 氮源，每升中含 豆粉 3～40克 大豆粉 3～40克 豆粕粉 3～50克 花生蛋白粉 3～40克 花生粕粉 3～50克 芝麻 3～40克 芝麻粕粉 3～50克 小麦胚芽粉 3～30克 玉米胚芽粉 3～30克 蚕蛹粉 3～40克 酵母粉 3～40克 酒糟 3～40克 以上成分1种或2种以上； 其他，每升含 珍珠粉 0.2～20克 贝母粉 0.2～20克 活性钙粉 0.2～20克 牡蛎粉 0.4～20克 骨粉 0.4～20克 以上成分1种或2种以上。
本发明按以下发酵条件进行发酵培养 斜面菌种培养温度18～32℃，培养时间6～10天； 摇瓶种子通过三级逐级扩大培养 一级500毫升摇瓶，培养基装量50～200毫升(按常规高压灭菌)，接种量，斜面菌种0.5～4cm2/瓶，18～32℃，100～250rpm振荡培养5～8天； 二级除接种量3～30％以外，其他同一级摇瓶； 三级5升摇瓶，培养基装量0.5～2升，接种量3～30％培养条件与时间同一、二级种子培养。
种子罐分1～2级，采用搅拌方式或者气升式发酵罐，容量一级种子罐50～200升，二级种子罐300～2000升，接种量3～30％，发酵温度18～32℃，搅拌速度50～300rpm，通气量1∶0.2-1，培养时间2～8天； 发酵罐，采用搅拌式或气升式发酵罐，容量200～10000升，接种量与发酵条件与种子罐相同，发酵时间2～6天，当醪液淀粉反应阴性，可终止发酵，得到发酵原液。
本发明采用以下方法将发酵原液加工制成含亮菌发酵物的口服液体药物。
发酵原液经过滤，分为菌丝和滤液两部分。菌丝加2～8倍水，在80～100℃温度下提取0.5～6小时，同样步骤重复1～3次，合并得到的提取液与前述分离菌丝后的滤液混合，浓缩，测定其多糖含量≥9.0mg/ml，多肽含量≥7.0mg/ml时，停止浓缩，加入防腐剂和调味剂等辅料，罐装至玻璃瓶内，封口后，在121℃温度下湿热灭菌20～60分钟，制得含亮菌发酵物的口服液体药物。
本发明的固体发酵方法如下 一级菌种的制备 一级菌种培养基配方 马铃薯(去皮去芽) 80～120g 琼脂 5～15g 葡萄糖5～15g 蛋白胨1～2g 酵母膏0.5～1.5g 麦芽膏0.5～1.5g 骨粉 0.25～1g 水适量 制成 500ml 方法先将马铃薯切成小块加水适量，煮沸15～20分钟，过滤，滤液中加入琼脂、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、麦芽膏、骨粉，加热使其溶化，加水至500ml，加热至沸，趁热分装试管，装量为试管的1/4～1/5，塞好棉塞，用牛皮纸包好，于121℃湿热灭菌30分钟，45°斜面放置3天，观察有无杂菌生长。在无菌条件下进行接种亮菌原种(原种购于中科院)在25℃～28℃生化培养箱中培养8～15天。
二级菌种的制备 二级菌种培养基配方 山芋粉∶玉米粉∶黄豆粉∶水＝10∶8∶1∶70 按上述比例称取培养基原料，混匀，加少量冷水使之调成糊状，按比例取余下的水加热至沸腾后，加入调成糊状的培养基中，边加边搅拌，使之充分混匀，并加热至95℃以上为止。将上述培养基装入发酵瓶内，每瓶约装400ml，用棉塞塞好，用牛皮纸包扎后，放入高压灭菌器内，以125℃，0.15Mpa灭菌45分钟。将灭菌后的培养基在无菌条件下以每瓶2g亮菌一级菌种量接种一级菌种，接种后在20～30℃相对湿度为65％至80％中培养28～45天。
亮菌发酵物的制备 除培养时间为32～48天外其他均同二级菌种的制备。
本发明采用以下方法将固体发酵方法制得的发酵物加工成含亮菌发酵物的口服液体药物。
将培养成熟的亮菌固体发酵物切碎置于提取罐中，加入2～8倍的水，煮沸提取0.5～6小时，过滤得提取液。同样步骤重复1～3次，合并得到的提取液。浓缩提取液，测定其多糖含量≥9.0mg/ml，多肽含量≥7.0mg/ml时，停止浓缩，加入防腐剂和调味剂等辅料，灌装至玻璃瓶内，封口后，在121℃温度下湿热灭菌20～60分钟，制得含亮菌发酵物的口服液体药物。
与现有技术相比，本发明有益效果是 1、与其它亮菌制品不同，有效成分量化。
2、发酵培养基完全采用天然食物成分，特别是以淀粉或含淀粉的食物成分为碳源，以酵母、大豆、花生、芝麻、燕麦、玉米或小麦胚芽为氮源，以珍珠粉、牡蛎粉、活性钙粉、骨粉代替一般发酵培养基中的无机成分，克服了无机成分中的有害物质对人体的危害。
3、与前人报道相比，发酵物有效成分成倍提高。
4、经毒理试验，证明本产品安全无毒。
5、本产品具有消炎、止痛、降酶、退黄及利胆作用，并能增强人体体质，提高免疫功能。
临床可用于治疗急、慢性肝炎、迁延性肝炎、慢性胆管炎和胆囊炎以及慢性、浅表性、萎缩性胃炎、中耳炎及放疗、化疗引起的白细胞减少症，还可用于小儿黄疸、肿瘤等病症。
以下用具体实例对本发明作进一步说明，但本发明主题的范围并非仅限于下述实例。
具体实施例方式 实施例 按以下组成配制1升培养基 葡萄糖20克 豆粉5克 酵母粉2克 玉米粉5克 山芋粉5克 骨粉 0.5克 加水至1升pH自然 以上培养基分装于500ml三角烧瓶，每瓶150ml，0.1Mpa灭菌，每瓶接种亮菌(中科院购得亮菌菌种)1cm2，置于140rpm旋转摇瓶机上，在25±1℃温度下振荡培养8天，得到一级摇瓶种子液；用500ml三角瓶，上述同样培养基，每瓶接种一级摇瓶种子液5ml，在同样条件下培养4天得到二级摇瓶种子液； 按以下组成配制10升培养基 葡萄糖200克 酵母粉20克 玉米粉50克豆粉 50克 山芋粉50克骨粉 5克 加水至10升pH自然 以上培养基分装于5升三角瓶，每瓶1.5升，0.1Mpa灭菌，每瓶接种二级摇瓶种子液70ml，与一、二级摇瓶同样条件下振荡培养4天，得到三级摇瓶种子液。
用200升不锈钢搅拌式发酵罐，按以下配比投料 葡萄糖3公升 酵母粉0.3公升 玉米粉1.5公升 豆粉 1.5公升 山芋粉1.5公升 骨粉 75克 0.14Mpa下灭菌0.5小时，接入三级种子液7.5升。发酵温度25±1℃，搅拌速度80rpm，通风量1∶0.5，96小时后终止发酵，放罐，得到亮菌发酵原液140升，原液呈浅棕色粘稠，有特殊香味，淀粉反应阴性。
发酵原液经过滤后，分为菌丝和滤液两部分，菌丝加6倍量水，在80～100℃温度下提取4小时，过滤，重复提取一次，合并两次提取液并与前述分离菌丝后的滤液混合，减压浓缩，当浓缩液的多糖含量≥9.0mg/ml，多肽含量≥7.0mg/ml时，停止浓缩，浓缩液中加入0.25％的苯甲酸钠防腐剂和0.05％香蕉香精调味剂，灌装至10ml的玻璃瓶内，封口后在121℃温度下湿热灭菌30分钟，制得本发明所称的含亮菌发酵物的口服液体药物。
以本发明上述含亮菌发酵物的口服液体药物对有关疾病进行的临床效果观察的试验如下 1、病毒性肝炎疗效观察 天津市第一医院，天津市肝病研究所应用本发明的口服液体药物治疗病毒性肝炎患者45例，并与同期应用甘利欣，苦黄注射液等药的对照组患者30例，进行临床疗效比较。两组病人大部分有不同程度的腹胀、恶心、乏力、纳差、肝区不适或疼痛，巩膜或身体黄染等。另外，两组患者肝功能化验指标均有ALT、AST和BIL不同程度的升高。两组病人均使用5％葡萄糖200ml加甘利欣150mg静脉输入，每日一次，作为基础治疗。治疗组使用本发明的亮菌口服液体药物，每次20ml，每日三次。对照组合并黄疸者予以5％葡萄糖150ml或生理盐水150ml加苦黄注射液20ml静脉输入，每日一次。30天为一个疗程。以各种症状及体征均消失，肝功能恢复正常，各抗原均阴性，抗体生成为“治愈”。以症状及体征消失，肝功能恢复正常，HbeAg转阴，部分HbeAb生成为“好转”。以症状及体征、实验室各项指标无明显改善为“无效”。治疗结果为 治疗组显效16例(35.5％) 有效25例(55.55％) 无效4例(8.88％)。总有效41例(91.11％) 对照组显效7例(23.33％) 有效13例(43.33％) 无效10例(33.33％)。
总有效20例(66.66％) 两组比较治疗组疗效显著(P＜0.01)表1 两组临床表现改善情况比较治疗组对照组 X2异常 恢复 复常率异常 恢复 复常率例数 例数 (％) 例数 例数 (％)纳差恶心乏力肝痛腹胀肝大脾大 393692.3 272385.1 323196.8 1313100 382976.3 241979.1 363186.1 181055.5 302686.6 201050 332678.3 188 44.4 241562.5 156 40 4.57** 6.287** 4.73** 注**P＜0.05 表2 两组肝功能改善情况比较治疗组对照组 X2治疗 复常 复常率治疗 复常 复常率例数 例数 (％) 例数 例数 (％) A/G BiL ALT AST 421638.09301136.66 453885.70301756.66 453884.44301860 453680.0 301583.33 12.29*4.46** 注**P＜0.05 *P＜0.01 表3 两组患者BiL，ALT，AST治疗前后的变化 BiLALT AST 治疗组治疗前 (n＝45)治疗后 对照组治疗前 (n＝30)治疗后71.6±19.314.5±3.7**△△69.1±20.418.6±5.2**80.7±24.137.4±11.2**△△76.3±23.76.4±12.1** 93.6±49.6 37.8±10.9** 90.4±42.3 35.6±9.7** 经本次临床试验证实本发明的亮菌口服液体药物可以明显的降低ALT、AST、BiL的升高。ALT是判断肝内炎症的可靠指标。因此ALT的降低或复常有力的证明了肝内炎症被有效的控制及肝脏功能的恢复。病毒性肝炎时BiL的升高，说明了在肝细胞受损时胆红素摄取、转运、结合及排泄受影响，但排泄是胆红素的限速步骤。故肝病是血液中胆红素浓度增高且以结合胆红素为主，从而发生肝细胞性黄疸。经服用本发明药物后BiL的降低或复常有力的证明此药在恢复肝脏功能的同时，其对BiL的代谢具有理想的促进作用。通过临床疗效观察充分证实本发明药物治疗病毒性肝炎，特别是伴黄疸型肝炎其效果尤为显著。本发明亮菌发酵物口服液体药物是一种理想的口服治疗病毒性肝炎的有效药物，未发现不良反应。是一种安全、有效、使用方便的药物。
2、治疗活动性肝炎肝硬变临床疗效观察试验 北京302医院采用本发明的口服液体药物治疗活动性肝炎肝硬变30例，受到了较好的效果，其试验过程和结果如下 一、病例选择全部病例系302医院住院患者，符合1995(北京)病毒性肝炎全国会议制定的标准，诊断为肝炎肝硬变乙型活动性60例，B超示无腹水或少量腹水，无其它并发症。随机分为2组，治疗组30例，对照组30里，两组病例的资料见下表，两组病人比较无显著性差异，具有可比性。
表1 治疗组和对照组年龄、性别差别比较 组别例数性别 男女年龄分布 25-4041-55＜56治疗组对照组3030 246 255 519 6 618 6 P＞0.05 两组比较无差异 表2 治疗组和对照组病程、有无腹水的比较 组别例数 病程分布5＞ 6-10 11-20 ＜20 腹水情况无腹水少量腹水治疗组对照组30304 8 12 63 9 13 5 27 3 25 5 P＞0.05 两组比较无差异 表3 治疗组和对照组生化情况的比较组别例数 ALT(u/L) TBIL(umol/L) A(g/L) BLA(mmol/L)治疗组对照组3030 216±52 212±6389±1882±19 29±4 28±560±1862±17 P＞0.05 两组比较无差异 二、治疗方法 对照组口服VitC、肝泰乐，静点能量合剂、VitK1，及还原型谷光甘肽。
治疗组加用本发明的亮菌口服液体药物20ml。
每日2次，疗程为8周。两组病例有少量腹水者加用双氢克尿塞及安体舒通。
三、观察项目 两组病人在治疗前后查血、尿、便常规，心电图。观察临床症状体征及副作用发生，每周查肝功能ALT、BiL、ALB及BLA。
四、疗效评定 1、临床治愈自觉症状消失，ALT正常，BIL降至34umol/L以下。
2、好转自觉症状基本消失，ALT、BIL降至原值50％以下。
3、无效未达到上述标准。 结果 <一>总体临床疗效 亮菌口服液治疗肝炎肝硬变30例，总临床治愈率40％，有效率36.67％，对照组临床治愈率为10％，有效率16.67％，经统计学处理有显著性差异(P＜0.01)。
表4 两组病例疗效比较 组别例数例数(％)临床治愈例数(％)有效例数(％)无效例数(％)治疗组对照组303012(40％)3(10％)11(36.67％)5(16.67％)7(23.33％)22(73.33％) P＜0.01 两组比较有显著差异 <二>肝功能比较 表5 两组病例治疗前后ALT和TBIL的比较 组别例数ALT(u/L)治疗前治疗后 P值TBIL(umol/L)治疗前治疗后P值治疗组对照组3030216±52 61±21 P＜0.01212±63 82±19 P＞0.0589±1825±5 P＜0.0182±1968±12P＞0.05 表6 两组病例治疗前后ALB和BLA的比较 组别例数ALB(g/L)治疗前 治疗后 P值 BLA(mmol/L)治疗前治疗后P值治疗组对照组303029±434±5 P＜0.0528±529±6 P＞0.0560±1852±16P＞0.0562±1755±13P＞0.05 <三>不良反应 用药过程中，未发现严重不良反应。
本研究用本发明的亮菌口服液体药物治疗活动性肝炎肝硬变30例，总临床治愈好转率为76.67％，而对照组仅26.27％，两组经统计学处理有显著性差异。本研究显示本发明亮菌口服液体药物具有降低血清谷丙转氨酶、胆红质作用，提高血清白蛋白的作用，对血氨无任何影响，且易为人体吸收，起效快，不发生蓄积，无毒副作用。是治疗活动性肝炎肝硬变的安全有效的药物。
3、新生儿高胆红素血症的防治 陕西省人民医院产科采用本发明的亮菌口服液体药物，防治新生儿高胆红素血症取得好的效果。
方法将90例足月正常新生儿随机分为A、B、C三组，每组各30例，A组口服本发明的亮菌口服液体药物，B组口服鲁米那，C组为对照组，用皮疸仪于生后第1-6d，每天测黄疸程度1次，记录皮疸测定数值，对各组新生儿生后第1-6d皮疸测定数值，发生高胆红素血症的例数进行对比。结果A组第3d 10.29±2.25，第4d 11.13±1.28，第5d 11.08±1.86，第6d 10.57±2.76；B组第3d 10.84±1.12，第4d 11.36±1.28，第5d 11.24±1.60，第6d 11.34±2.48；C组第3d 11.58±1.70，第4d 12.22±1.76，第5d 12.38±2.35，第6d 12.46±1.94。A、B组分别与C组比较第3-6d均有显著性差异。高胆红素血症发生例数比较，A组无1例发生，B组有1例，C组共发生了5例，结论本发明的亮菌口服液体药物可降低新生儿黄疸的程度，降低新生儿高胆红素血症的发生率，因无嗜睡等不良反应，口感好，服用方便，优于传统退黄药鲁米那，故可作为一种防治新生儿高胆红素血症的新药在临床推广应用。
4、治疗慢性胃炎临床观察试验 四川省人民医院对60例慢性胃炎临床采用本发明的亮菌口服液体药物进行治疗，患者男女各30例，年龄在22-70岁之间，平均45.2岁，采用随机原则分成两个组，治疗组利对照组。治疗组采用本发明的亮菌口服液体药物，每次服用20ml，每天3次，疗程4周。对照组丽珠得乐冲剂，每次服1包，每天4次，，疗程4周。治疗期间不用其他治疗慢性胃炎药物及杀灭HB约物。治疗组治疗慢性胃炎总有效率89.8％，对照组总有效率为83.3％，两组病人治疗前血尿粪常规及肝肾功能检查均正常，治疗结束复查均未见异常，两组病人均未见明显不良反应出现。证明本发明的亮菌口服液体药物是一种安全有效的治疗慢性胃炎的药物，无毒副作用。
5、治疗慢性胆囊炎的疗效观察试验 采用本发明的亮菌口服液体药物治疗急性和慢性胆囊炎(胆石症)病人共101例，获显效者43例，好转45例，无效13例，总有效率87.1％。
临床中观察到，胆囊炎病人服药后，大部分病人腹痛很快缓解，逐渐趋向消失。对胆石症引起的慢性胆囊炎，原来吃油腻食物会引起绞痛的，服药1-2月后，再吃油腻食物(包括肥肉)未引起绞痛。大部分病人服药后食欲增加，个别病人还有排石现象，无毒副作用。
6、治阑尾炎 采用本发明的亮菌口服液体药物治疗阑尾炎98例，有效率达83.8％，治愈率达74.1％，未见不良反应。
7、治疗中耳炎 采用本发明的亮菌口服液体药物治疗中耳炎59例，治愈26例，有效19例，无效14例。治疗慢性中耳炎5例，痊愈3例，有效2例。疗程急性者3-15天，慢性者5-18天。未见不良反应。
8、抗肿瘤试验 取接种7天的小白鼠艾氏腹水癌细胞，用生理盐水洗涤癌细胞，然后200rpm离心10分钟，弃去上清夜。按上法连续洗涤三次，以Hanks氏溶液稀释成8×106/ml的瘤细胞悬浮液。将本发明的亮菌液体药物与瘤细胞悬浮液等量混合，置37℃培养箱中作用3小时，再给小白鼠皮下注射0.2ml，接种后生长2-3周，解剖称取瘤重，与对照组比较称得本发明的亮菌液体约物对艾氏腹水瘤的抑制率为81％。
9、辐射防护和升白作用的实验 一、辐射防护作用 <一>对小鼠的防护作用小鼠按体重随机分为防护组和对照组，防护组与幅照前一天腹腔注射本发明的亮菌液体药物一次，剂量分别为50、75和100mg/鼠，对照组注射等量生理盐水。各组动物以钴60丙线源一次全身幅照9戈瑞，观察20天活存率。结果如表1，三个给药组都有防护效果，其中以75mg/鼠防护效价最好，20天活存率为59.1％，而对照组仅为12.5％，两组差别非常显著(P＜0.001)。表1 亮菌液体药物对小鼠的辐射防护作用 药剂量 (mg) 动物活存数(只)活存率(％)P值防护组对照组 防护组 对照组507510011/3052/8811/255/3512/965/35 36.6 59.1 44.0 14.3 12.5 14.3＜0.05＜0.001＜0.01 <二>对狗的防护效价狗按体重、年龄、肩宽配对随机分为防护组、对照组，每组4～5条，防护组于幅照前一天按80～100mg/Kg肌肉注射本发明的亮菌液体药物1次，两组动物全身幅照3戈瑞幅照一半剂量时转身1次，观察30天活存率。结果防护组25条狗，活存14条，活存率56.0％，对照组21条，活存1条，活存率4.8％，差别非常显著(P＜0.001)，表明本发明的亮菌液体药物对狗放射病有明显的防护作用。
二、本发明的亮菌液体药物的升白作用 对正常及注射环磷酰胺小鼠外周血白细胞的影响小鼠按体重随机分为四组，每组20只，①、③组每鼠腹腔注射本发明的亮菌液体药物75mg，②、④组为对照，注射等量生理盐水，第二天③、④组每鼠皮下注射环磷酰胺1次，剂量为75mg/Kg，①、②组注射等量生理盐水，第五天取尾血计数白细胞总数。结果见表2，③、④组白细胞总数差别显著(P＜0.05)，①、②组差别不显著，提示本发明的亮菌液体药物对环磷酰胺所致小鼠白细胞的降低有提升作用，对正常小鼠无影响。
表2 本发明的亮菌液体药物对正常及注射环磷酰胺小鼠外周血细胞的影响 组别 外周血白细胞数(个/mm3)P值①亮菌液体药物②生理盐水 9950±1100 9850±1050③亮菌液体药物+环磷酰胺④生理盐水+环磷酰胺 4950±200 3190±150 ＜0.0权利要求
1、一种亮菌发酵物制得的口服液体药物，它含有亮菌菌丝或亮菌整体发酵物的提取物。
2、根据权利要求1所述的含亮菌菌丝或亮菌整体发酵物的提取物的口服液体药物，其特征在于此制剂可以是乳液、混悬液或澄清液。
3、根据权利要求1所述的含亮菌菌丝或亮菌整体发酵物的提取物的口服液体药物，其特征在于此口服液体药物可以是单独由亮菌菌丝或亮菌整体发酵物的提取物构成，也可以与食品或其它药品成分构成复方。
4、根据权利要求1所述的含亮菌菌丝或亮菌整体发酵物的提取物的口服液体药物，其特征在于此口服液体药物多糖含量≥9.0mg/ml，多肽含量≥7.0mg/ml。
5、根据权利要求1所述的含亮菌菌丝或亮菌整体发酵物的提取物的口服液体药物，其特征在于此亮菌菌丝或亮菌整体发酵物可以由液体深层发酵获得，也可以由固体发酵获得。
全文摘要
本发明公开了一种亮菌发酵物制得的口服液体药物，它含有亮菌菌丝或亮菌整体发酵物的提取物。它具有稳定的质量保证，较广泛的适应症，兼有较先进的生产工艺；可不受限制的进行工业化大生产，除已知适应症外，还可以用于治疗放疗、化疗引起的白细胞减少症，以及肿瘤、小儿黄疸、免疫力低下等病症。
文档编号A61P1/04GK1679642SQ20041004015
公开日2005年10月12日 申请日期2004年7月9日 优先权日2004年7月9日
发明者杨兴明 申请人:四川隆盛药业有限责任公司