齐墩果酸丁二酸单酯的合成及其治疗急慢性肝炎药物制剂的制作方法

专利名称：齐墩果酸丁二酸单酯的合成及其治疗急慢性肝炎药物制剂的制作方法
技术领域：
本技术领域属于中药现代化研究及有机合成技术范畴。
背景技术：
齐墩果酸是广泛存在于植物和中草药中的一种五环三萜类化合物，是植物中很广泛的次生物质。许多植物如青叶胆、女贞子、雪胆、楤木、人参、夏枯草、连翘、山楂、木通、怀牛膝等均可从中分离得到齐墩果酸。齐墩果酸具有抗菌消炎、护肝降酶、强心利尿、增强机体免疫功能、升白细胞、降血脂、降血糖及抗癌等方面的生理活性，在临床上已用于传染性急性黄疸型肝炎以及慢性迁延性肝炎，能有效地改善临床症状和体征，成为较常用的护肝药物，但是由于齐墩果酸极难溶于水的特性，影响了其在胃肠道的溶出和吸收，因而口服吸收不理想，为了增大其水溶性，增进吸收，提高生物利用度，我们对齐墩果酸进行了化学结构修饰，以吡啶为催化剂，使齐墩果酸3位的羟基与丁二酸酐反应结合成酯，即齐墩果酸丁二酸单酯(简称齐丁酯)发明内容通过有机半合成方式对齐墩果酸进行了结构修饰，生成了新的复合化合物。其化学结构为新的化合物，其合成工艺为新的工艺技术，故申请专利予以保护。


附图为齐丁酯的化学结构图，即在3β位置将丁二酸酐与齐墩果酸羟基形成单酯化合物，其分子式C34H52O6，分子量为556.77。“齐丁酯”纯品，为白色针状结晶，无臭；熔点为256～258℃；比旋度为+83.0°～+84.0°(氯仿，C＝1％)。易溶于氯仿，略溶于甲醇、乙醇、丙酮，极微溶于水。合成的“齐丁酯”一方面在水溶性上有所提高，分散性较齐墩果酸好；另一方面，还保留有一定的脂溶性，因而在胃肠道的吸收增加，药效增强，提高了生物利用度。药效学实验也表明，“齐丁酯”的保肝降酶作用优于其母体药物齐墩果酸。
具体实施例方式
1.“齐丁酯”的合成工艺优化是采用正交试验设计进行四因素三水平正交试验，从而优选出了最佳合成条件丁二酯酐的用量为齐墩果酸的7倍(摩尔比)，吡啶的用量为齐墩果酸的4倍(ml∶g)；反应温度为100℃；反应时间为8小时。待反应完毕(齐墩果酸完全反应成为“齐丁酯”)，将反应液冷却后缓缓倾入大体积冷水中，同时不断搅拌，使絮状沉淀逐渐析出，放置过滤，反复洗涤沉淀物后将其置80℃干燥，即可得到类白色粉末，即为“齐丁酯”的粗品，将“齐丁酯”粗品以无水乙醇重结晶，即可得到“齐丁酯”纯品，合成产物纯度可达98％以上。粗品收率可达95％。

2.“齐丁酯”的合成工艺优化2.1工艺设计根据“齐丁酯”的合成反应原理，可知影响“齐丁酯”生成的条件主要有反应物齐墩果酸与琥珀酸酐的用量比(A)；溶剂兼催化剂吡啶与齐墩果酸的用量比(B)；反应温度(C)；反应时间(D)。根据预试验分别选取了以上四个因素的三个水平进行四因素三水平正交试验，选择条件见表1。
表1.正交试验的因素水平表

2.2考核指标考核产物“齐丁酯”的收得率，以收得率最高者为最佳。按因素水平数选用L9(34)正交表(表6)设计试验方案并进行实验。
表2.正交试验设计数据及结果计算表

2.3实验操作通法称取齐墩果酸4.56g(0.01mol)，置于带有冷凝管的干燥三颈瓶中，按表1要求加入规定量的琥珀酸酐、吡啶，并在规定温度水浴加热反应所需时间。反应结束后，所得各批反应液均在相同条件下按合成反应的操作步骤洗涤、干燥，待干燥至恒重后，称量各批样品重量，并分别取样进行含量测定。
2.4“齐丁酯”的含量测定经查阅文献，参考齐墩果酸的含量测定方法，采用薄层比色法进行“齐丁酯”的含量测定。
2.4.1标准曲线绘制精密称取齐丁酯对照品加氯仿制成1mg/ml的标准溶液，精密吸取此标准溶液10μl、20μl、30μl、40μl、50μl分别点于硅胶GF254薄层板上，以CHCl3∶Me2CO∶HOAc(10∶1∶0.1)为展开剂进行展开，于λ254nm紫外灯下将斑点定位，刮取齐丁酯位置硅胶，加入5％香草醛、冰醋酸溶液0.3ml、高氯酸0.6ml，于70℃水浴加热15min，冷却，加冰醋酸5ml，同时取与标准品斑点大小相同平行位置的空白硅胶同样操作，作为空白对照。将上述待测液离心，取上清液于570nm波长处测吸收度，由吸收度和相应浓度求算回归方程，结果表明，齐丁酯点样量在10～50μg之间时，线性关系良好，其回归方程为Y＝11.40×10-3X-0.0034(r＝0.9995)2.4.2样品含量测定精密称各批试验号样品，分别配制成1mg/ml的氯仿溶液，吸取30μl点于硅胶GF254薄层板上，余同标准曲线绘制项下操作，测定A值并计算含量，结果见表2中试验结果的产物纯度项。
根据试验结果直观分析表(表2)上极差R的大小可知，影响齐丁酯合成反应收得率的主要因素为A(琥珀酸酐的用量)，C(反应温度)次之，D(反应时间)及B(溶剂兼催化剂吡啶用量)对收得率的影响较小。由表2得出较好的试验方案为A3B1C3D2，最优水平组合为A3B1C3D3。由以上的分析可知齐丁酯合成的最佳条件为琥珀酸酐用量为齐墩果酸的7倍(摩尔比)；吡啶的用量为齐墩果酸的4倍；反应温度为100℃；反应时间为8小时。
实施例1称取齐墩果酸45.6g(0.1mol)，置于带有冷凝管的干燥三颈瓶中，加入琥珀酸酐70g(0.7mol)，再加入吡啶180ml，100℃水浴反应8小时，反应结束后，待反应液冷却，将反应液缓缓倾入大体积冷水中，同时不断搅拌，使絮状沉淀逐渐析出，滤取沉淀物，用蒸馏水反复洗涤至无吡啶味后，将沉淀物置80℃干燥，得到类白色粉末53.5g，即为齐丁酯粗品，用乙醇重结晶即可得到齐墩果酸丁二酸单酯纯品。
3.本发明的药物制品是作为口服应用的，其剂型可以是胶囊剂或片剂等，相对比较而言，胶囊剂的制备在工艺上更为简便一些。
以下是制剂的组成及制法实施例实施例2胶囊剂(龙牙肝泰胶囊)处方齐丁酯50g 淀粉22g 制成1000粒制备方法将处方量的齐丁酯和淀粉混匀，过5号筛，装胶囊，即得。
4.齐丁酯具有保肝降酶的药理作用，其实验及结果如下4.1齐丁酯对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响取健康昆明种小白鼠70只，体重20±2g，雌雄各半。按体重随机分七组，每组10只，雌雄各半。在实验室温度26±2℃，夜间16±2℃，湿度75％，阳光充足，通风良好的条件下实验。
正常对照组急性实验前24小时分三次以等体积生理盐水0.2ml灌胃(30ml/kg)，于次日24小时腹腔注射橄榄油一次，剂量为10ml/kg。模型损伤对照组急性实验前24小时分三次以等体积生理盐水灌胃(30ml/kg)，于次日24小时改用0.1％橄榄油溶液10ml/kg腹腔注射一次；联苯双酯阳性药物组(9.75mg/kg)、齐墩果酸阳性药物组(11.7mg/kg)、齐丁酯低剂量组(1.404g/kg)、中剂量组(2.808g/kg)、高剂量组(4.68g/kg)，分三次以等体积0.2ml灌胃，并于次日24小时腹腔注射0.1％氯化碳橄榄油溶液10ml/kg一次。
于腹腔注射四氯化碳肝脏毒物24小时后，断头处死小鼠，收集血液分离血清，用722型光栅分光光度计在520nm处测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)值，各实验组均与模型对照组比较，用t检验进行统计，并做肝脏组织学镜检，即每只动物取同一叶肝脏并且部位大致相同的一块肝组织，固定于10％福尔马林溶液中，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，镜检。肝脏病变情况组织学改变按5级分类。各剂量组肝脏病变组织学镜检结果均与模型损伤组组织学镜检结果比较，用Ridit检验进行处理，其结果见表3。
表3.齐丁酯对CCL4致小鼠急性肝损伤ALT、AST及肝组织学的影响(X±SD)

注ΔΔΔP＜0.001，ΔΔ示P＜0.01为损伤组与对照比较。
***示P＜0.001，**示P＜0.01，*示P＜0.05为各给药组与损伤组比较注示(0)正常；(1)肝细胞变性(主要是浊肿)，范围不超过肝小叶半径1/2；(2)肝细胞变性范围超过肝小叶半径的1/2；(3)肝细胞变性，有少数散在肝小叶中央坏死；(4)肝细胞呈大片严重变性、坏死从表3的结果看出，齐丁酯的三个剂量组均能明显抑制CCL4致急性肝损伤时ALT、AST升高，使转氨酶值显著降低。组间比较，齐丁酯中、低剂量组使转氨酶降低值经t检验均显著优于联苯双酯及齐墩果酸阳性药物组。
四氯化碳对肝组织的损伤程度，按五个等级分类用Ridit检验处理，结果是齐丁酯低、中、高三个剂量均能使肝脏病理损伤程度显著减轻，并且有优于联苯双酯及齐墩果酸组的趋势。
4.2齐丁酯对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的影响选取昆明种小白鼠70只，体重20±2g，雌雄各半。按体重随机分七组。正常对照组(30ml/kg生理盐水)、模型损伤对照组；阳性药物联苯双酯组(9.75mg/kg)和齐墩果酸组(11.7mg/kg)；实验药物齐丁酯分低(1.404g/kg)、中(2.808g/kg)、高(4.68g/kg)三个剂量组。
生理盐水对照组实验前24小时分三次以等体积0.2ml生理盐水灌胃(30ml/kg)，于次日24小时用生理盐水10ml/kg腹腔注射一次。
模型损伤组实验前24小时以等体积生理盐水0.2ml灌胃三次，于次日24小时腹腔注射D-氨其半乳糖800mg/kg一次。
联苯双酯、齐墩果酸组、齐丁酯低剂量组、中剂量组、高剂量组均于实验前24小时，分别按各组剂量以等体积0.2ml灌胃给药三次，于次日24小时腹腔注射D-氨基半乳糖800mg/kg一次。
各组均于腹腔注射D-氨基半乳糖24小时后，将小鼠用断头法处死，收集血液，分离血清，同前法测定ALT、AST值，各实验组与模型损伤组比较，用t检验统计。并做肝组织学镜检(肝脏取材及病理切片同上法)，而各剂量组肝脏组织镜检结果均与模型损伤组镜检结果相比较，用Ridit检验处理。其结果见表4。
表4.齐丁酯对D-GaLN致小鼠急性肝损伤ALT、AST及肝组织学的影响(X±SD)

注ΔΔΔ示P＜0.001，ΔΔ示P＜0.01为损伤组与对照组比较***示P＜0.001，**示P＜0.01，*示P＜0.05为各给药组与损伤组比较从表4结果指出，齐丁酯低、中两个剂量组能非常显著对抗D-GalN致小鼠急性肝损伤ALT、AST的升高，使转氨酶显著降低。组间t检验证明，齐丁酯低、中两个剂量组对ALT及AST值降低水平极显著优于联苯双酯组及齐墩果酸组。而齐丁酯的高剂量组能抑制急性肝损伤ALT、AST的升高，使转氨酶的降低并不明显。
D-GalN对肝脏组织的损伤程度，同样按五个等级分组为Ridit处理，结果同样是齐丁酯低、中二个剂量组能使肝脏病理损伤非常显著减轻，具明显优于对照药联苯双酯及齐墩果酸。而齐丁酯高剂量组只能使肝脏损伤减轻，但并不明显。
4.3齐丁酯对大鼠实验性慢性肝损伤的影响4.3.1橄榄油正常对照组和四氯化碳肝慢性损伤模型的建立选取大鼠120只，体重120-150g，雄雌各半。按体重随机分为橄榄油对照组(20只，雄雌各半)和四氯化碳模型组(100只，雄雌各半)。
橄榄油对照组用橄榄油给大鼠皮下注射5ml/kg，每周两次，连续二个月。
肝损伤模型组用10％四氯化碳/橄榄油溶液5ml/kg皮下注射，与对照组同一时间，每周两次，连续二个月。
4.3.2实验动物分组及药物治疗将皮下注射橄榄油两个月的大鼠仍作为正常对照组；注射四氯化碳两个月剩下的80只大鼠按体重随机分为六组损伤对照组，阳性对照药联苯双酯组(13.5mg/kg.d-1)和齐墩果酸组(40.5mg/kg.d-1)、齐丁酯低剂量组(8.1mg/kg.d-1)和中剂量组(40.5mg/kg.d-1)、高剂量组(81mg/kg.d-1)三个剂量组。除继续四氯化碳中毒外，按各组确定的药物剂量于中毒后两个月开始给药治疗，每天po给药一次，连续给药治疗一个半月。正常对照组用橄榄油5ml/kg皮下注射，每周两次，连续一个半月，其它各组继续用10％CCL4的橄榄油溶液5ml/kg皮下注射，每周两次，连续一个半月。
4.3.3测定结果(1)齐丁酯对CCL4致大鼠慢性肝损伤ALT、AST、TP、ALB、A/G的影响。治疗一个半月后24小时即于末次给药24小时后，断头处死大鼠，收集血液，分离血清，用日立7020全自动生化分析仪测定ATL、AST、TB(总蛋白)、ALB(白蛋白)、A/G(白蛋白/球蛋白)比例，各给药组与损伤对照组间各项测定指标的比较t检验处理结果见表5。
1.齐丁酯对CCl4致大鼠慢性肝损伤ALT、AST、TP、ALB、A/G的影响(表5)表5.齐丁酯对CCl4致大鼠慢性肝损伤ALT、AST、TP、ALB、A/G的影响(X±SD)

注ΔΔΔ示P＜0.001，ΔΔ示P＜0.01，ΔP＜0.05为损伤组与对照组比较***示P＜0.001，**示P＜0.01，*示P＜0.05 ，为各给药组与损伤组比较从表中各项指标看出，齐丁酯能使转氨酶活性明显下降，尤其高剂量组能使转氨酶非常显著下降，其作用与联苯双酯相近；齐丁酯低剂量组对转氨酶的抑制作用与齐墩果酸相近。而齐丁酯高剂量组对转氨酶的抑制作用经t检验显著优于齐墩果酸组。另一方面对蛋白的影响看，虽然对TP、ALB无明显影响，而齐丁酯各剂量组均能明显对抗CCL4对白蛋白的损伤破坏作用，因为A/G值同损伤组比较明显升高，与联苯双酯的作用相近，而齐墩果酸组的A/G值虽然升高，而与损伤组比较却不明显，因此，齐丁酯对肝脏合成白蛋白有一定的保护作用，明显抑制CCL4对肝脏合成白蛋白的影响。
(2)齐丁酯对CCL4致大鼠慢性肝损伤肝纤维化的保护作用将上述取过血的大鼠摘取肝脏的同一部位按前述方法用福尔马林液固定，切片染色，镜检，其结果与模型损伤组对照比较。用Ridit检验处理，检验肝纤维化程度。
同时摘取肝脏另一相同部分，放入95%酒精中去水半日，取出后去掉酒精，放入丙酮中浸泡脱脂两天，取出后于110℃烘干，研成粉末。准确称取40mg肝粉放在磨口试管中，加入3ml6mol/L盐酸，加盖，于125℃水解2小时，冷却后将水解液移入50ml容量瓶中，用6mol/L氢氧化钠调PH值至6，然后稀释至刻度，滤过。吸取2ml放入试管中，加入1ml氯氨T溶液混匀，室温放置20分钟，加入1ml过氯酸溶液，5分钟后加入1ml10％对二甲氨基苯甲醛溶液，在60℃水溶中保温20分钟上，显色，冷却后在550nm处比色，随行试剂做空白对照。与此同时，取不同浓度的标准羟脯氨酸(2，5，8，10，16，20μg)按上述方法测定标准曲线。羟脯氨酸的含量按下式计算按光密度查标准曲线所得的羟脯氨酸的μg数×25×25＝1g肝粉中所含的羟脯氨酸的μg数。各给药组与损伤组的测定指标用t检验检查。结果见表6。
表6、齐丁酯对四氯化碳所致大鼠慢性肝损伤肝纤维化的保护作用

注ΔΔΔ示P＜0.001，ΔΔ示P＜0.01为损伤组与对照组比较。
***示P＜0.001，**示P＜0.01，*示P＜0.05为各给药组与损伤组比较(0)为正常细胞；(1)仅汇管区有少量纤维，向肝小叶内呈放射状；(2)增生的纤维分割小叶，但未形成嫩小叶；(3)假小叶形成从表6可以看出，齐丁酯三个剂量组均能明显降低实验性肝损伤中羟脯氨酸的含量，进而减少胶原蛋白的合成。病理切片检查表明齐丁酯高、中两个剂量组均能明显减轻四氯化碳所致的肝纤维化病理表改变。
4.4齐丁酯对BCG加LPS引起的小鼠免疫性肝损伤的作用将70只小鼠随机分为7组空白对照组，肝损伤模型组(给予等体积蒸馏水)，阳性药联苯双酯组及齐墩果酸组，齐丁酯低、中、高三个剂量组，其给药量同急性试验中的剂量。
以上各组除空白对照组iv0.2ml生理盐水外，其它各组均ivBGC7.95×106个活菌/鼠后，次日，阳性药物联苯双酯(9.75mg/kg.d-1)组、齐墩果酸(11.7mg/1kg.d-1)组以及齐丁酯低剂量组(1.404g/kg.d-1)组、中剂量组(2.808g/kg.d-1)高剂量组(4.68g/kg.d-1)po试验剂量的药物，空白对照组及肝损伤模型组给po0.2ml/鼠d-1生理盐水。于感染BCG后10日，未次给药2小时后，肝损伤模型组及各给药组ivLPS10μg/鼠，空白对照组iv0.2ml/鼠的生理盐水后10小时，断头处死小鼠，留血液，分离血清，测ALT、AST值，各组实验结果均与模型损伤组比较，用t检验进行统计。并做肝组织镜检，方法同急性肝损伤实验。实验结果见表7。
从表7可以看出，齐丁酯三个剂量组均能显著抑制BCG加LPS所致小鼠实验性免疫肝损伤所致的ALT及AST的升高。病理切片检查表明，齐丁酯的中、低剂量组可明显抑制肝组织的免疫性病变。
表7.齐丁酯对BCG加LPS引起的小鼠免疫性肝损伤的作用(X±SD)

注ΔΔΔ示P＜0.001，ΔΔ示P＜0.01为损伤组与对照组比较。
***示P＜0 001，**示P＜0.01，*示P＜0.05为各给药组与损伤组比较注示(0)没有损伤正常细胞；(1)轻度损伤小叶炎症细胞呈围管性浸润；(2)中度损伤，肝小叶内呈现数炎症细胞浸润灶；(3)严重损伤，肝细胞呈现多数坏死。
5.本发明的药物制品的临床应用及结果急慢性肝炎是严重威胁人类健康的多发病之一，且治疗棘手，为了开发良好的治疗急慢性肝炎的药物，我们对龙牙肝泰胶囊进行了123例急慢性肝炎的临床研究，取得了较为满意的疗效，现将结果报告如下5.1临床资料5.1.1一般情况全部病例180例随机分为两组，龙牙肝泰胶囊治疗组133例，其中急性肝炎55例，男32例，女23例，年龄21～47岁，平均年龄31岁；慢性肝炎78例，男47例，女31例，年龄23～61岁，平均年龄48岁。齐墩果酸对照组47例，其中急性肝炎20例，男11例，女9例，年龄19～45岁，平均年龄30岁；慢性肝炎27岁，男17例，女10例，年龄34～57岁，平均年龄47岁。两组患者的一般慢况具有可比性。
5.1.2诊断标准参照1984年南宁第三次肝炎会议修订的《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准。
5.2治疗方法与结果5.2.1治疗方法治疗组龙牙肝泰胶囊由黑龙江久久药业有限责任公司提供，每粒胶囊含齐丁酯50mg。用法急性肝炎，每次一粒，每日两次，疗程一个月；慢性肝炎，每次二粒，每日两次，疗程三个月。
对照组联苯双酯片由浙江仙居制药厂提供。用法急性肝炎，每次50mg，每日三次，疗程一个月；慢性肝炎，每次100mg，每日三次，疗程三个月。
1、疗效标准急性肝炎(1)无效主要症状无改善，肝区仍有压痛和叩痛，肝功能检查异常。
(2)临床治愈主要症候群消失，肝区无明显压痛和叩痛，肝功能检查正常。
(3)基本治愈临床治愈各项指标随访半年无异常改变者。
(4)治愈临床治愈各项指标随访一年无异常改变者。
慢性肝炎(1)基本治愈自觉症状消失；肝脾肿大稳定不变或缩小，且无明显压痛和叩痛；肝功能检查正常；以上各项指标稳定一年以上者。
(2)有效主要症状消失或基本消失；肝脾肿大稳定不变，且无明显压痛及叩痛；肝功能检查正常或原值下降至50％以上，并持续3个月者。
(3)无效疗程结束后，SGPT不下降者。
5.2.3治疗结果表8急性肝炎治疗结果

经统计学分析表明，两组总有效率和治愈率无显著差异(P＞0.05)，但龙牙肝泰胶囊中提取物的剂量仅为联苯双酯的2/3，表明该药的药效确于联苯双酯。
表9慢性肝炎治疗结果

统计学分析表明，龙牙肝泰治疗组有效率(88.46％)明显高于对照组(81.48％)5.3结论5.3.1龙牙肝泰胶囊在治疗急慢性肝炎方面确有较好疗效，与联苯双酯对照组比，急性肝炎二者总有效率差异不显著(P＞0.05)，从数据上看，治疗组(81.82％)有高于对照组(80.00％)的趋势；慢性肝炎龙牙肝泰胶囊治疗明显优于对照组(P＞0.05)。
5.3.2在服药期间，心、肾功能正常，未发生毒性反应，亦未见其它副作用。
5.3.3该药服用次数少、方便、实用。
权利要求
本品请求专利保护的范围为“齐丁酯”的化学结构及合成技术以及合成工艺。1、齐丁酯化学结构为 齐丁酯分子式C34H52O6齐丁酯分子量556.77
2.合成技术将齐墩果酸与丁二酸酐反应，以无水吡啶为催化剂兼溶剂，加热反应，从而合成了齐墩果酸丁二酯单酯，即“齐丁酯”。
3.合成工艺将一定量的齐墩果酸加入7倍量(摩尔比)的丁二酸酐，再加入4倍量(ml/g)的吡啶，在100℃加热反应8小时，反应完毕，经水洗去剩余的丁二酸酐以及催化剂吡啶，即可得到最终合成产物“齐丁酯”。
4.按权利要求3所述的合成工艺合成齐丁酯，其特征在于该制品有保肝降酶作用。
5.按权利要求3所述的药物制品，其特征在于该制品为口服制剂。
6.按权利要求5所述的药物制品，其特征在于该制品为胶囊剂。
7.按权利要求6所述的药物制品，其特征在于该制品含齐丁酯50mg。
8.按权利要求4所述的药物制品，其特征在于该制品经口服在有效量下可降低转氨酶，保护肝脏，减轻肝损伤。
全文摘要
本技术属于中药现代化研究及有机合成技术范畴。利用中药中的天然成分齐墩果酸，与丁二酸酐在无水吡啶做催化剂条件下进行酯化合成，生成齐墩果酸丁二酸单酯(简称齐丁酯)，获得新化学结构的化合物。技术方案要点是在合成反应中，将齐墩果酸加7倍量的丁二酸酐，再加4倍量吡啶，100℃加热反应8小时，反应完毕，经水洗去剩余丁二酸酐及吡啶，得齐丁酯。进一步纯化用无水乙醇重结晶。发明所获新的化合物齐丁酯结构见附图。分子式C
文档编号A61P1/16GK1715291SQ20041004365
公开日2006年1月4日 申请日期2004年6月28日 优先权日2004年6月28日
发明者田振坤 申请人:田振坤, 王建明, 匡海学