专利名称：一种含多种病毒抗原表位的禽多价核酸疫苗制备方法
技术领域：
本发明涉及疫苗制备技术领域，特别是一种含多种病毒抗原表位的禽多价核酸疫苗制备方法。
背景技术：
传统的疫苗是以减毒或灭活的病原微生物作为免疫原，接种动物体内引起免疫反应。随着生物技术的发展，把病原体的基因片段导入作为载体的非致病性微生物，再进行免疫动物。近年来，随着生物安全和食品安全在现代社会日益重要，由于减毒疫苗存在因病毒返祖或变异产生强毒株的潜在可能，而灭活疫苗则由于免疫原性差而需要大剂量和添加佐剂。特别是疫苗诱导的是一种特异性免疫应答，所以，一种疫苗只能预防一种相应的病原。为了预防传染病，家畜禽在短时间内必须接种多种疫苗。由于疫苗剂型和种类不同，必须多次接种。由此产生应激反应等，影响畜禽生产性能，如生长速度、产蛋等。
免疫学研究表明，尽管病原体存在多种抗原，但是其中具有诱导动物机体产生免疫应答功能，使动物获得免疫力的抗原只是极少数，这类抗原被称作保护性抗原。重要的是在一个保护性抗原分子中，存在多个抗原表位，即由5至7个氨基酸序列组成的多肽；其中只有个别抗原表位具有作用，它们被称作保护性抗原表位。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服减毒疫苗因变异、返祖的潜在毒力增强的危险、灭活疫苗的免疫原性差和一种疫苗只预防一种疫病的缺点，提供一种安全、高效，且只进行一次免疫，就能使动物同时获得抗多种病毒的特异性免疫能力的疫苗的含多种病毒抗原表位的禽多价核酸疫苗制备方法。本发明的目的是通过如下技术措施和步骤实现的；一种含多种病毒抗原表位的禽多价核酸疫苗制备方法，包括针对新城疫、禽流感和法氏囊炎等多种病毒的单克隆抗体的制备和该多种病毒保护性抗原表位核苷酸序列的确定和构建重组真核质粒，其特征在于对上述多种病毒的单克隆抗体应用噬菌展示技术确定编码该多种病毒保护性抗原表位的核苷酸序列，最后用特定引物经PCR获得连接它们的核苷酸链并插入真核表达质粒内。与现有的疫苗相比较，本发明制备的多价抗原表位的核酸疫苗。具有以下优点
1.一次免疫接种可特异性预防多种病原。如新城疫、禽流感、法氏囊炎等多种病毒。
2.由于核酸疫苗不存在病原返祖和变异的可能，所以安全可靠。
3.由于接种的是特定的多种抗原表位，动物机体的免疫应答也只是针对该特定的多个特异抗原表位，所以，与灭活疫苗相比，动物的免疫应答产生的应激反应较小，有利于动物生产性能的维持。
图1为本发明的引物示意图；图2为本发明PCR扩增合成的含编码3种病毒保护性抗原表位基因片段和连接臂的示意图；图3为本发明所用的pcDNA3真核表达质粒示意图。
具体实施例方式
实施例1。制备含新城疫、禽流感和法氏囊炎三种病毒抗原表位的禽多价核酸疫苗。
1，制备针对新城疫、禽流感和法氏囊炎三种病毒保护性抗原的单克隆抗体。
1)病毒的复制与纯化分别接种新城疫、法氏囊炎和禽流感病毒0.2mL于9～10日龄的SPF鸡胚绒毛尿囊腔内，37℃孵育，去除24h内死亡的鸡胚，取死亡鸡胚立即置于4℃过夜，无菌收取尿囊液。反复冻融尿囊液3次，分别经3000rpm、5000rpm、8000rpm各离心30min，上清经100000g离心2h，用少量TEN缓冲液将病毒沉淀悬浮，再用20～60％，梯度为20％的蔗糖溶液经密度梯度法进一步纯化，即将前一步初步纯化的病毒液加于蔗糖梯度上，经100000g离心8h，收集40～60％梯度层内的病毒带，用pH7.4 0.01mol/1PBS透析48h，小量分装，于-20℃冻存备用。获取纯化蛋白抗原，其蛋白质浓度不低于1mg/mL，在聚丙烯酰鞍凝胶电泳图谱少于两条区带。
2)免疫小鼠取6～8周龄雌性Balb/C小鼠6只，初次免疫皮下注射约100～200μg/只(按体积比1/1的比例与弗氏完全佐剂)，15天后以同样剂量皮下注射NDV(按体积比1/1的比例与弗氏不完全佐剂)，21天后以同样剂量(不加佐剂)尾静脉加强免疫。
3)SP2/0骨髓瘤细胞的准备使SP2/0细胞处于对数生长期，轻轻吹打使之悬浮、分散成单个细胞，经1000rpm离心5min，再用1640基础培养基重悬洗涤3次，活细胞95％以上，取约2×107～5×107用于细胞融合。
4)免疫脾细胞的准备于加强免疫后3天，取鼠眼球放血致死，无菌取脾，将脾脏移入含1640基础培养基的平皿中，剪碎、研磨，经200目尼龙筛过滤，过滤液经小鼠淋巴细胞分离液分离得脾细胞，然后用1640基础培养基洗涤3次，制成单细胞悬液，活细胞计数，约1×108～2×108用于细胞融合。
5)饲养细胞的制备于融合前2天取小鼠一只，眼球放血致死，浸泡于75％乙醇5min，取出后置无菌操作台，用一次性注射器吸取10mL 1640基础培养基，注入腹腔，注射器置于肝上，轻轻按压腹腔3～5次，重新吸出注入的液体，用1640基础培养基洗涤3次，计数，用含15％犊牛血清的HAT培养基稀释至1×105～2×105个细胞/mL，每孔0.1mL接种于96孔微量培养板。
6)细胞融合与克隆以3∶1的比例将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合于50mL刻度离心管，用20～30m LRPMI1640基础培养基洗涤2次，用手掌轻击管底，使沉淀细胞松散的基础培养基滴加到融合管中，先慢后快，5min内加完，边加边轻轻转动离心管，37℃静置10min，1000rpm离心5min，弃上清，加入50宾mL HAT培养基，每孔0.1mL接种于培养有饲养细胞的96孔微量培养板，置37℃、5％的CO2培养箱中培养，5天后用新鲜的HAT培养基换出组织培养板孔中1/2培养基，10天后用HT培养基换出HAT培养基；观察杂交瘤细胞生长情况，待其分布至孔底面积1/10以上时，吸出上清液作抗体检测。
7)阳性细胞株的筛选(间接ELISA)取聚苯乙烯平底微孔板，用包被缓冲液将经梯度离心纯化所得的抗原稀释至最适浓度，每孔100μL，振荡器振匀，4℃过夜；将板孔内液体甩掉，用洗涤液洗涤3次，甩干；每孔加待检杂交瘤上清100μL，37℃温箱孵育30min，同前洗涤；每孔加100μL 1∶1000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃温箱孵育30min，同前洗涤；每孔加OPD底物100μL，室温避光静置15min；每孔加终止液100μL，轻轻振摇；酶标读数仪测OD492值，S/N≥2.5者判为阳性。
8)针对保护性抗原的单克隆抗体的确定经过鸡胚成纤维细胞的保护性实验初步筛选和2周龄SPF雏鸡的保护性实验确定针对三种病毒的保护性单克隆抗体。
2.用噬菌展示技术确定编码新城疫、法氏囊炎和禽流感病毒保护性抗原表位的核苷酸序列。
1)扩增肽库肽库(噬菌体表面蛋白展示的7肽库(肽库的滴度2.8×1014pfu/ml，随机多样性2.7×109)，New England Biolabs公司)80μL预先接种200μLER2738感染5min，加入40ml低盐LB培养基中，37□ 200rpm振摇4.5小时；将培养物转入50ml离心管中，4□ 6800rpm 15min离心；上清吸入另一个大离心管中，加入3.4mlPEG/NaCl沉淀4□过夜；4□ 6800rpm 15min离心，弃上清；用1mL TBS溶沉淀，转到1.5ml离心管，离心1分钟，4500rpm，吸取上清；上清加入1/6体积PEG/NaCl(167ul)，-20□沉淀5min，冰上沉淀最多30min，4□12000rpm离心12min；沉淀溶于TBS(含0.02％NaN3)。
2)包被用包被液配制成100ug/ml的抗体溶液；用75％酒精浸泡聚苯乙烯板后，再用包被液洗板，加入包被的靶蛋白溶液，每孔100μL。对照孔不包被。4C湿盒包被过夜。
3)封闭吸尽包被液，加封闭液300ul/孔，室温放置1小时；吸尽封闭液，用0.1％TBS-T(TBS+0.1％(V/V)Tween-20)洗6次。
4)生物淘筛取扩增的噬菌体7肽库5ul，加95μL 0.1％ TBS-T，放置30min。倒出未结合的噬菌体，吸尽或排去残液，用0.1％ TBS-T每孔洗6遍，吸尽残液，每孔加入(0.2M甘氨酸-HCl，pH2.2，1mg/ml BSA)100μL，室温轻摇9min30s。立即用移液枪吸出洗脱液移至已经预先加入15μL 1M Tris-HCl pH9.1的离心管中，混匀。
5)扩增洗脱的噬菌体洗脱的噬菌体80ul加入20ml低盐LB培养基中，加入500ul ER2738菌(E.Coli ER2738的基因型为F□lacq□(lacZ)M15 proA+B+zzf∷Tn10(TetR)/fhuA2 supE thi□(lac-proAB)□(hsdMS-mcrB)5(rk-mk-McrBC-))。37℃200rpm振摇4.5小时。重复1)扩增库肽。
6)噬菌体克隆和抗体的ELISA分析以100μg/ml浓度的抗体包被ELISA板，4□过夜，加入10％脱脂奶粉或5％BSA室温封闭1小时。加入滴度为1012pfu/L的噬菌体克隆，室温结合1小时。用PBS-T(0.1％Tween-20)洗涤后，加入抗M13的单抗(1∶2000)室温孵育60min。再用PBS-T洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG室温孵育60min。PBS-T洗涤后，加入底物TMB，避光反应10min，加入终止液(1mol/LH2SO4)，于波长450nm测定光吸收A值。
7)噬菌体单链DNA的制备将ER2738按1∶100接种于低盐LB培养基中，挑取噬菌斑加入其中，于37□振摇培养4.5小时，以10000rpm离心10min。取上清，加入200μL PEG/NaCl，混匀，室温放置10min。再以10000rpm离心10min。弃上清，用碘缓冲液充分重悬沉淀，加入无水乙醇室温放置10min。再以10000rpm离心10min。弃上清，用70％乙醇清洗，室温放置10min后，用30ulTE溶解沉淀，进行琼脂糖凝胶电泳分析并测序。
3.构建含3种抗原表位核苷酸序列的重组真核质粒并用特定引物经PCR获得连接它们的核苷酸链并插入真核表达质粒内。
1)引物设计设计3对引物P1/P2；P3/P4和P5/P6(见图1)P1从5’端起，含保护碱基、HindIII酶切位点和编码新城疫病毒保护性抗原核苷酸序列的起始区；P2的3’和5’端分别含编码新城疫病毒和法氏囊炎病毒保护性抗原核苷酸序列的终止区和起始区，其间有连接臂碱基组成P3的5’和3’端分别含编码新城疫病毒和法氏囊炎病毒保护性抗原核苷酸序列的终止区和起始区，其间有连接臂碱基组成P4的3’和5’端分别含编码法氏囊炎病毒和禽流感病毒保护性抗原核苷酸序列的终止区和起始区，其间有连接臂碱基组成；P5的5’和3’端分别含编码法氏囊炎病毒和禽流感病毒保护性抗原核苷酸序列的终止区和起始区，其间有连接臂碱基组成；P6的3’和5’端含保护碱基、BamHI酶切位点和禽流感病毒保护性抗原核苷酸序列的终止区。
2)第一次PCR扩增3种病毒特异性保护性抗原核苷酸片段分别以3种病毒的cDNA为模板与相应的3对引物(P1/P2；P3/P4和P5/P6)扩增出编码3种病毒特异性保护性抗原的核苷酸片段。
3)第二次PCR扩增1条含3种病毒特异性保护性抗原核苷酸片段以P1/P6为引物和上述3种PCR产物为模板，扩增获得连接编码3种病毒特异性保护性抗原的核苷酸片段(见图2)。
4)定向插入真核表达质粒pcDNA3以3∶1摩尔比加入经HindIII和BamHI双酶切的第二次扩增产物与pcDNA3(见图3)的回收产物，用于两者的连接；分别加入适量的T4连接酶及相应的缓冲液，16℃下连接过夜。制得的多价核酸疫苗的重组真核表达质粒内，含有编码上述3种病毒特异性抗原表位基因片段21均为21个核苷酸，不同片段之间由9个核苷酸的连接臂序列相连。
5)重组质粒的转化取感受态细胞，放置冰浴内10min，加入7.5μL连接产物，继续冰浴30min，42℃水浴热冲击90s，迅速冰浴2min，每管加入900μL培养基，37℃，160rpm，振荡培养45min，5000rpm离心3min，弃去上清，将剩余的转化菌菌液涂布于含60μg/mL Amp的固体LB琼脂板上，37℃培养12～16h，至出现转化菌落。
权利要求
1.一种含多种病毒抗原表位的禽多价核酸疫苗制备方法，包括针对新城疫、禽流感和法氏囊炎等多种病毒的单克隆抗体的制备和该多种病毒保护性抗原表位核苷酸序列的确定和构建重组真核质粒，其特征在于对上述多种病毒的单克隆抗体应用噬菌展示技术确定编码该多种病毒保护性抗原表位的核苷酸序列，最后用特定引物经PCR获得连接它们的核苷酸链并插入真核表达质粒内。
2.根据权利要求1所述的一种多价禽核酸疫苗制备方法，其特征在于所述的多种病毒的单克隆抗体应用噬菌展示技术确定编码该多种病毒保护性抗原表位的核苷酸序列，每个序列片段由21个核苷酸组成。
3.根据权利要求1所述的一种多价禽核酸疫苗制备方法，其特征在于所述的特定引物为P1/P2、P3/P4和P5/P6，多种病毒抗原表位基因片段的连接通过上述多对特定引物先分别PCR扩增，再经P1/P6PCR扩增；其中引物P1和P6含有不同酶切位点、起始区(P1)和终止区(P6)序列，P2、P4和P3、P5分别含有3种病毒保护性抗原表位基因终止区、起始区序列和起始区和终止区序列，之间有连接臂序列。
全文摘要
一种含多种病毒抗原表位的禽多价核酸疫苗制备方法，属疫苗制备技术领域。其所要解决的技术问题是提供一种安全、高效，且只进行一次免疫，就能使动物同时获得抗多种病毒的特异性免疫能力的疫苗的制备方法。其技术要点分离获得多种病毒毒株，提取其蛋白抗原，用杂交瘤细胞技术制备和克隆相应特异性抗体，经组织细胞培养和动物实验确定获得保护性单克隆抗体。经噬菌体展示技术筛选并测定与相应抗体结合的病毒保护性抗原表位和编码抗原表位的核苷酸序列；经过分子操作将编码多种病毒保护性抗原表位的核苷酸片段插入真核表达质粒。该重组真核表达载体于鸡体内，可诱导产生针对该多种病毒抗原的特异性免疫反应，达到免疫保护的作用。
文档编号A61K48/00GK1640494SQ20041009459
公开日2005年7月20日 申请日期2004年11月18日 优先权日2004年7月28日
发明者余为一, 仲大莲, 李槿年 申请人:安徽农业大学