用于临床和商业用途的干细胞的制作方法

专利名称：用于临床和商业用途的干细胞的制作方法
关于联邦政府支持的研究或开发项目的声明本申请部分由国立卫生研究院基金编号EB-00287资助。美国政府可享有本发明的某些权利。
本申请要求2003年5月29日提交的美国临时专利申请系列No.60/474,020的优先权。
背景技术：
本发明涉及细胞生理学的一般领域，更具体涉及开发和生产用于医疗应用如诊断、筛选、测试、治疗和康复的临床活干细胞与用于商业应用如筛选、测试和生物工程的细胞的组合物和方法。
由于它们的可塑性以及替换病变、损伤或衰老组织和器官的潜在用途，干细胞研究为患有癌症、脊髓损伤、中风、退行性疾病和其它疾病的患者提供一种新的万应药。已经建议，通过使用干细胞移植代替药物、生物制品和其它当前治疗法，干细胞能提供新疗法来预防和/或治疗多种人类疾病和病症。
多年来，科学家已经知道，干细胞可以来源于胚胎、成年骨髓和其它组织，或胎儿(如脐带血)。由于从胚胎组织回收干细胞的伦理问题，这个特殊研究领域最近明显很少被关注。研究改为集中于来源于成体和胎儿组织的干细胞的分离、增殖和组织/细胞移植。使用这些类型干细胞的一种限制是因为这些细胞能触发移植排斥，通常需要来自同一患者的干细胞。另一种限制是从任一种组织仅能回收少量成体或胎儿干细胞。这已经阻碍了干细胞用于广泛或节省成本的临床治疗。至今为止，成体干细胞的最丰富来源是骨髓。然而，当前从15ml骨髓液(从成年人回收的一般量)中能回收少于500,000个成体干细胞。此外，在产生用于如移植的适当数量细胞之前，这些干细胞需要几周或几个月的细胞培养。另外，人液体骨髓培养6-8周后经常不能产生大量的非贴壁造血前体细胞或可形成克隆的祖细胞。
另一种限制是仅几种类型的成体组织已经报道含有干细胞。这包括脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、心脏、皮肤和肝脏。更重要的，从成体组织回收的干细胞(本文也称成体干细胞)的分化能力经常受限制。成体干细胞经常只能分化成来源组织的细胞类型。如此，大多数成体干细胞不能真正认为是多能的。
使用当前技术，在使用成体干细胞方面有几种缺点。具体的，成体干细胞在成熟组织中很少，且回收和培养扩增方法一般无效，导致收率极低，并且在获得干细胞的过程中如果不是对全部来源组织造成破坏也是部分破坏了这些组织。这使得难以使用成体干细胞进行替代或增强疗法，其中需要大量细胞，和/或来源组织是必不可少的且不能被破坏。因此，需要改进当前的干细胞回收技术，以增加干细胞收率而不破坏来源组织。通过消除对组织的破坏，成年个体可以在贡献干细胞之后作为所述干细胞的受体。这样的方法将消除免疫系统排斥，并降低或消除终生使用免疫抑制药的需要。
本发明致力于上述很多需要以及本领域技术人员将能意识到的其它目的。

发明内容
本发明通过提供高收率获得干细胞且不破坏来源组织的新的改进方法以及使用这些干细胞的方法，解决了与当前干细胞收集和回收技术相关的问题。此外，本发明提供干细胞群体、干细胞系和干细胞组合物，用于临床、诊断、药物和商业用途。
根据本发明的一个方面，通过将外来物或植入物引入到哺乳动物的体腔间隙内并收集从移植获得的干细胞，提供一种获得干细胞新来源的方法。
还根据本发明，向需要这种治疗的对象(subject)提供一种或多种本发明干细胞的方法特征是在移植外来物以后从哺乳动物体腔间隙回收干细胞，操作所述干细胞并将所述干细胞引入需要这种治疗的对象。在引入治疗对象中之前，这些干细胞可以经遗传操作、允许与另一种组合物接触、指导特化成预期细胞类型和/或允许与三维支架接触。此外，治疗对象可以与干细胞来源相同或不同。
根据本发明回收的干细胞的优点是，它们可以低成本回收、产生高收率细胞、能分化、增殖和遗传修饰(体内和离体)、以生理方式起作用(如传导、生成、分泌、调节生物化合物等)、表现出真多能性，并可用于临床、诊断和商业用途，如细胞/组织移植(transplantation)、替换、植入、移植(grafting)、遗传或诊断筛选、产品开发，以及用于治疗性、预防性或其它治疗目的(作为实例如用于脊髓损伤、其它组织或器官损伤、烧伤、硬变、肝炎、帕金森病、阿尔茨海默病、中风、肌营养不良、糖尿病、关节炎、骨质疏松症、白血病、镰刀型细胞病和其它贫血病)。此外，本发明很好的适用于对其它治疗选择敏感的个体，如有癌症的人或处于疾病晚期的人，这时不能选择使用多数其它传统干细胞回收方法，如仅可在相对健康的患者中实施的骨髓收获。而且，本发明比当前传统方法如骨髓收获更安全，没有外加的并发症，并且甚至可重复使用于相同患者，而没有任何已知困难或副作用。
本发明致力于解决当前关于免疫系统对抑制物排斥的问题，并降低或消除移植时对使用免疫抑制性药物的需要。本发明提供经济的临床治疗选择，并满足研究人员、保健提供者和工业对募集和回收大量人干细胞用于临床程序的当前需要，所述临床程序包括移植、基因、蛋白质和细胞治疗。本发明的组合物和方法用作独特和强大的供应干细胞的工具，特别是向需要这种治疗的人。作为实例，本发明的定制设计产品包括用于医药、治疗、诊断、工程和生物技术应用的组合物。
通过阅读伴随附图的以下详细说明，本领域技术人员还将认识到本发明的上述优点和优越特征，以及其它重要方面。


为了更全面理解本发明的特征和优点，参考以下本发明的详细说明以及附图，其中不同附图中的相应数字表示相应部分，其中图1是说明本发明干细胞多能性的实例；图2表示回收并铺于基质上以后本发明细胞的光学显微镜视图；图3表示时间与根据本发明的干细胞产生之间的关系，显示暴露于植入物(菱形)和不暴露于植入物(方块)的细胞；图4表示根据本发明纤维细胞随时间的生长，显示有或没有灌洗液(分别是菱形或方块)时暴露于植入物的纤维细胞和不暴露于植入物的细胞(叉号或三角)；
图5表示本发明细胞的两个视图(A)诱导形成富含钙的成骨细胞聚集体和(B)显示随即分布的对照或未分化的细胞；图6表示本发明细胞被诱导变成特化神经细胞之后的视图；图7A和7B表示本发明干细胞进一步诱导变成具有典型神经元形态的特化神经细胞的视图；图8A和8B表示本发明干细胞诱导变成特化神经细胞的视图，显示典型神经元形态；图9A、9B和9C表示本发明干细胞诱导变成特化神经细胞的视图，NFM染色后阳性；图9D显示未诱导分化且显示无阳性NFM染色的干细胞；图10表示本发明干细胞诱导变成特化肌肉细胞的视图，所述特化肌肉细胞具有肌肉条纹(10A和10B)和线性生长模式(10C)以及形成肌管的能力(10D)，其中经长期培养后在肌管末端锚定物被加上条纹；图11表示根据本发明作为时间函数的细胞生长，显示暴露于GM-CSF和IL-4(菱形)并与无生长诱导信号(方块)作比较；图12表示加入一种或多种促进细胞特化成树突细胞的分化诱导信号之后本发明细胞的视图；图13表示本发明干细胞诱导分化成树突细胞之后进行免疫细胞化学分析的几个视图，其中图A和B中箭头显示一些CD11c阳性细胞，它是树突细胞的独特标志物，并与未诱导分化并且不显示CD11c(无阳性染色)的对照细胞比较；和图14表示加入一种或多种促进细胞特化成脂肪细胞的分化诱导信号之后本发明细胞的图像(图14A、14B和14C)，其中分化的干细胞是油红O(oil red o)阳性(深色区域)，而未诱导分化成脂肪细胞的细胞不是油红O阳性(无深色区域，图14D)。
具体实施例方式
尽管制造并使用本发明的各种实施方案将在下面详细讨论，应该理解本发明提供很多发明概念可以包含于广泛变化的情景中。本文讨论的具体方面和实施方案仅仅是以举例说明的方式制造并使用本发明，而不限制本发明的范围。
一般来说，干细胞是未特化(如未分化)状态的多能细胞，可以产生一种或多种未特化细胞。干细胞的一个关键识别特征是表现自我更新或产生更多自己的能力；因此，是一种能自我维持的细胞。此外，如本文所用，干细胞是未特化细胞，能够增殖(复制很多倍)、自我维持并产生大量特化功能后代，以及能再生损伤后组织。
干细胞的一种作用是替代因自然细胞死亡、衰老、损伤或病变而损失的细胞。组织中干细胞的存在通常与组织中细胞的高更新率相关，但也可以存在于缺乏高更新率的组织中。与不具有很多次复制能力(称为“复制”或“增殖”)的特化细胞不同，成体干细胞也能不分化而复制很多个月。然而，当前方法回收的成体干细胞在细胞启动分化(有时是自动的)之前仅具有有限生长/增殖的能力。其中，本发明的优点是提供回收干细胞的方法，所述干细胞具有复制很多个月(甚至超过1年)的能力而保持非特化，并因而提供获得用于长期自我更新的数百万细胞的方法。
干细胞的另一个有趣特性是它们通常产生与来源组织相同的细胞类型。例如来自骨髓的形成血的成体干细胞正常仅产生血细胞；间充质干细胞(血液骨髓基质细胞)正常仅产生特异性结缔组织细胞类型；造血干细胞正常产生所有类型的血细胞；脑中的神经干细胞产生神经细胞/神经元、星形细胞、少突胶质细胞；来自消化道内层的上皮干细胞正常产生消化道特异性细胞类型；从表皮基底层回收的皮肤干细胞产生角化细胞，而从表皮毛囊基底回收的毛囊干细胞正常产生毛囊细胞和表皮细胞。
本发明提供能分化成非来源组织(如与它们来源的组织不同的细胞类型)的干细胞。这种能力称为可塑性。因而，本发明干细胞能通过(a)产生遗传相同细胞的细胞系(如相同细胞或克隆)和(b)分化成多种特化细胞类型来行使功能。
本发明干细胞的鉴定可通过(1)用分子标志物标记活组织中的细胞以确定特化细胞类型；(2)从活组织(即供体、对象或患者)中取出细胞，培养细胞，随后体外操作(如引入一种或多种核酸序列或加入一种或多种分化诱导成分)，以确定细胞可以变成的特化细胞类型范围；和(3)从活组织(即相同或不同遗传背景的供体、对象或患者)中取出细胞，培养然后移植回宿主(如相同或不同遗传背景的供体、不同对象或患者)中之后标记细胞，以确定细胞是否使其来源组织种群恢复(repopulate)。用向每个新干细胞后代提供独特识别标志的病毒感染干细胞，证明干细胞克隆将在需要的患者(如供体或宿主)中一种或多种受损组织种群恢复。
如本文所述，本发明提供从成年哺乳动物宿主的体腔间隙中发育、募集和回收多能干细胞的方法。根据本发明，从成年哺乳动物宿主体腔间隙中回收的细胞能(a)创建干细胞克隆群体；(b)在体外或体内(如原位)增殖，而产生大量干细胞后代；(c)经体外(如证明可塑性)或体内操作分化成一种或多种特化细胞类型。也提供从哺乳动物宿主体腔间隙回收的干细胞的增殖、操作和分化方法。如本文所用，从哺乳动物宿主体腔间隙回收的干细胞的增殖、操作和分化一般在悬液中或细胞粘附基质(如单层、三维网络)上进行。可以使用基质或第二种细胞，即表面具有一种或多种粘附分子、化学或生物物质(如交联或非交联的氨基酸、核酸、聚合物、多糖等)的一种。作为替代方案，干细胞的增殖、操作和分化可以在回收前或不回收在宿主内进行。如本文所用，生物物质是可以影响细胞、组织或器官的有机化合物。
本发明干细胞的增殖和分化或离体或体内在适当条件下如下被诱导(a)体外增殖和分化，随后引入宿主；(b)体外增殖，随后引入宿主，随后继续体内增殖和/或分化；(c)引入宿主后增殖和分化(即体内)。如本文所用，体内增殖和/或分化(如宿主内)可以与外科操作、注射操作、非外科方法(如用药物操作诱导干细胞增殖的方法)或这些方法的组合一起组合发生。当可用时增殖和分化是在受控的刺激下。一般来说，体外细胞培养的条件接近生理条件。
培养干细胞时，培养基一般是在适于干细胞或细胞特化的标准条件下使用的培养基。本领域一般技术人员已知，可以添加生长促进信号或成分。如本文所用，术语“生长促进信号”、“生长促进成分”、“增殖诱导信号”、“增殖诱导成分”或“生长因子”一般指对细胞有生长、增殖和/或营养作用的化合物(如蛋白质、肽或其它分子)或刺激物。如本文所用，“分化诱导信号”、“分化诱导成分”一般指诱导细胞分化或特化的化合物或刺激物。这些化合物一般可以称为“信号”或“成分”。本领域普通技术人员将认识到可以组合使用一种或多种成分，促进生长、增殖和细胞类型特异性分化的组合在本领域已知，因此诱导生长、增殖和分化不需要过多的实验。作为实例，信号或成分的实例包括细胞因子、生长促进药剂、生长因子如表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(amphiregulin)、成纤维细胞生长因子(FGF，酸性或碱性)、神经生长因子(NGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、转化生长因子(TGF)和胰岛素样生长因子(IGF)。这些成分通常以约1fg/ml-1mg/ml的浓度加入培养基中。为优化培养条件，可以容易的进行简单滴定以确定最佳成分浓度。其它信号包括机械和/或电信号(如细胞-细胞接触、粘附、迁移、电刺激、物理压力、变形等)。
体腔间隙本发明使用将外来物引入或植入哺乳动物(如供体或宿主)的体腔间隙从而诱导在体腔间隙内形成、积累和募集干细胞。实例包括腹腔、皮下间隙、胸膜间隙、肺和/或脑间隙。这些区域一般较大(生物学上)，经常具有明显的周缘区域并且通常容易达到，尤其是与受保护和间隙限制的器官、血管或骨髓相比。如本文所用，体腔间隙也可以称为“腔”、“腹腔”、“皮下腔”、“肺腔”、“胸膜腔”、“脑间隙”和“腔间隙”。
如本文所用，“外来物”包括引入体腔间隙中并诱导干细胞形成的任何物体(固体、液体或凝胶)，其中形成包括在体腔间隙中迁移、募集和积累干细胞。实例包括可降解植入物、不可降解植入物、炎性剂(如疫苗佐剂、死菌片段)、促纤维化剂、药物组合物、注射物质(液体、凝胶或固体)、生物相容性组合物(蛋白质、核酸、聚合物、染料、塑料、合成或天然药物、化学同位素、金属复合材料等)、医用滴注溶液(如盐水、葡聚糖、水)以及用于外科操作的组合物或材料。生物材料可以是单组合物或聚合物或很多材料的成层或混合的复合混合物，可以包括认为促进生物生长的物质。在本发明一个实施方案中，本发明的植入物是可以使细胞生物锚定的生物相容性支持物。替代性的，通过使外来物物质如医用滴注液(如水、葡聚糖、盐水)进入体腔间隙而促进干细胞启动。
进入体腔间隙是通过外科方法、注射、灌注等。外科技术包括穿腹壁切入、腹腔镜外科技术(一个或多个小切口或用显微外科仪器进入腔中)、内窥镜检查(用柔性内窥镜进入)等。注射通常用针头和注射器。本领域技术人员熟悉使得体腔间隙可及或进入体腔间隙的方法和技术。
一般来说，体腔间隙(如腹腔、肺腔或胸膜腔)越大，多能干细胞的收率越高。这部分因为较大腔提供更多细胞迁移的通路，更大量液体能被注入和取出，因而可以从体腔间隙收获更大量细胞。需要时，可以进行几轮注入和取出，以从体腔间隙连续回收干细胞。在一个实施方案中，从腔中收集细胞就像将液体注入腹膜和抽取液体一样简单。如此，本发明已经发现只要将外来物引入体腔间隙之后液体中就会含有干细胞。例如，可以进行与腹膜透析相似的方法，其中用导管将多达3升溶液(如透析液)充入腹部，当从身体抽取时，液体与腹腔内其它颗粒物一起作为溶液从腹腔壁(即腹膜)返回(透析)。
干细胞回收本发明的干细胞通常从哺乳动物供体的腔中回收。具有体腔间隙和产生多能细胞能力的任何动物都可以用作干细胞供体，包括昆虫、鱼、爬行动物、鸟、两栖动物和哺乳动物作为实例。根据本发明，从供体回收的干细胞可用于多种应用，包括遗传操作、诊断、表型分析、筛选和/或移植到异体、自体或异种宿主中。
来自供体腔的干细胞通常通过收集用于洗涤体腔间隙的液体来回收。它们也可以从移植材料如包括带孔三维基质的材料的内部或其周围收集。如本文所用，洗涤可以包括灌洗、透析、医用滴注和洗涤、灌注、破裂或解离的其它方法，以从体腔间隙收集细胞。也可以通过从腔中的任何细胞外基质组织或植入物中解离(洗涤前或后)来收集细胞，通常在无菌操作下进行。在需要解离和/或破裂时，可使用本领域公知的常规方法，如用酶处理(例如胰酶、胶原酶)或用物理方法(如使用钝器)。用于洗涤/解离的液体可以是标准或改进的pH平衡(生理)溶液，如水、盐水、医用滴注液、葡聚糖或组织培养基(如HEH、DMEM、RPMI、F-12作为实例，单独或组合使用)。在一个实施方案中，培养之前可以低速离心细胞(如200-2000rpm)，然后将细胞重悬于新鲜培养基中，再进行培养，可以是在固定基质上或悬液中培养。替代性的，用液体收集细胞。用于洗涤/解离的液体也可以含有一种或多种信号、成分和/或添加剂，如生长、细胞代谢所需的那些(作为实例，如生长因子、氨基酸、维生素、矿物质和/或蛋白质)，以及用于预防酵母、细菌、真菌等感染或污染的那些(如抗微生物剂、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂)。洗涤和解离液体以及新鲜培养基可以含血清或不含血清(作为实例，如来自牛、马、鸡的血清)使用。本领域公知用于以下用途的常规培养基细胞收获、诱导生长、分化、去分化、细胞扩增、永生化、特化和移植。不需要为获得适于洗涤的液体而进行过多的试验。此外，优化细胞收集的方法对本领域普通技术人员是常规操作。在转移收集的细胞用于生长、分化或其它操作时，根据需要连续或定期更换或灌注适当培养基。用标准培养技术，回收/收集的细胞可进一步富集到任意期望的量(如用于细胞扩增)。可使用不同的已知方法来实现这种富集(如负选方法或正选方法)。经过本领域已知的这种或其它操作，可以浓缩干细胞和祖细胞到任意期望程度。替代性方法包括使用逆病毒感染的包装细胞系，或将从这种包装细胞系培养物获得的上清液加入到根据本发明回收的干细胞中，当与富集干细胞库(stem cell pool)一起实施时(甚至在存在其它分化或增殖诱导成分的条件下)提供非常有效的获得体外干细胞感染的方法。
作为实例，回收后的干细胞应用可以包括诱导增殖、细胞扩增、分化成一种或多种特化细胞类型、遗传修饰、短期或长期保存(如冷冻保存或本领域已知的任何方法)、筛选、诊断检测、表型分析和治疗介入，如移植、化学疗法、疾病治疗、疾病预防和细胞、器官或组织替换或增强。
加入一种或多种募集诱导成分到供体腔中可以增加从腔中回收的干细胞实际数量。如本文所用，“募集诱导成分”表示刺激细胞募集和/或增殖的成分，其实例包括抗有丝分裂剂、抗分化成分或增殖诱导信号。这种增强从对象或供体回收的干细胞募集和增殖的能力减少回收和治疗介入之间的时间，并提高本发明的功效，同时还是一种细胞富集形式。
增殖为诱导增殖，通常可以在培养基中添加至少一种增殖诱导成分或物质(即化学或生物因子，一般是营养性的，其中包括细胞分裂，如结合细胞表面受体并行使营养或生长诱导作用的分子)。增殖诱导性生长因子的实例包括EGF、两调蛋白、FGF、TGF作为实例，单独或组合使用。其它成分也可以加入培养基中，尤其是谱系特异性成分，如维生素、NGF、PDGF、TRH、TGF、BMP、GM-CSF或IGF作为实例。
本发明细胞的增殖可以在从体腔间隙收集之前或之后发生，其中可使用相似的增殖诱导信号。从体腔间隙回收的细胞增殖可以早在几小时开始或可以过数天。一般来说，当从体腔间隙回收的细胞放在基质上时，在几小时内变得贴壁。增殖以后，新的未分化细胞将出现在培养物中。这些增殖性细胞通常是克隆性的(即是单个干细胞的后代)。在连续存在增殖诱导信号的条件下，培养物中总细胞数将增加。此外，从腔回收的原始细胞可变大。如果连续提供如上述的适当培养基，增殖细胞将继续在悬液中增殖。培养物中的增殖细胞也可以传代并重新启动增殖。重要的是，传代和重启增殖可以连续重复(如每周)，导致每次传代后细胞数量的对数增加。增殖和/或传代后，可以用下述技术体外遗传修饰干细胞。
分化本发明细胞的分化可以用可激活导致生长的生物学事件级联的任何方法诱导，作为实例包括这样的事件，如释放肌醇三磷酸(ITP)、细胞内Ca2+、释放二酰基甘油和/或激活蛋白质激酶C(PKC)和其它细胞激酶。分化受外部信号调控，如其它细胞的化学物质分泌、与相邻细胞的物理接触和环境中的某些其它分子(如分子替代物)。诱导分化方法的其它实例包括用佛波酯、分化诱导生长因子和其它化学信号处理，以时间顺序单独处理，或与其它信号组合处理。此外，将细胞铺到固定基质(作为实例，如烧瓶、培养板或盖玻片，也可以包被离子带电的表面如聚-L-赖氨酸和聚-L-鸟氨酸)上也可以诱导分化。作为实例，可以诱导分化的其它基质包括与细胞外基质相似的物质，如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白，可以单独或组合使用。也可以在存在增殖诱导成分的条件下在悬液中诱导分化。
取决于所选谱系，本发明细胞的分化可以短在两小时或长达至少一周发生。向本发明方法回收的细胞中加入适当分化诱导剂之后，很多细胞将分化。可以根据形态、免疫细胞化学和/或免疫组织化学方法或细胞类型特异性RNA或DNA的表达来确定分化并检测特异性细胞类型或谱系。例如细胞类型特异性抗体、特异性基因的表达或特异性组织化学测试可以用于区分特化细胞的细胞特征或表型特征。本领域技术人员将能识别最佳表征特异性细胞类型的方法。取决于加入细胞培养基中的成分(或其时间顺序)，细胞可以特化成任意细胞类型中的一种。作为实例，细胞类型的实例包括神经细胞(如胶质细胞、树突细胞等)、非神经细胞(星形细胞、少突胶质细胞)、上皮细胞、造血细胞、肝细胞、心脏细胞、内皮细胞、肌肉细胞(平滑肌和骨骼肌)、表皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、基质细胞、脂肪细胞。
遗传修饰和操作尽管从腹膜腔或其它类似体腔间隙中回收的干细胞是非转化细胞，但它们具有连续细胞系的特征。在未特化状态，增殖诱导成分存在下，细胞连续分裂并因此是遗传修饰的优异目标。如本文所用，术语“遗传修饰”或“遗传操作”指通过有目的的导入外源核酸而稳定或短暂地改变从动物腔回收的细胞基因型。所述核酸可以是合成或天然来源的，可以含有基因、部分基因或其它有用的核酸序列。
用病毒载体(作为实例如逆病毒、修饰型疱疹病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒)或哺乳动物细胞特异性启动子或转染(作为实例，如脂质体、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔)可以将外源核酸导入本发明干细胞，从而指导一个或多个编码期望蛋白质的基因表达并可用于促进分化。如本文所用，所述蛋白质可以是感兴趣的任何蛋白质或蛋白质组合，并可以与选择性标志物连接用于检测。此外，所述载体包括药物选择标志物。(对于本领域已知技术的实例见Maniatis et al.，1982，in Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.)替代性方案是导入改变细胞遗传背景并因而诱导细胞无限增殖的癌基因，从而有目的的使干细胞永生化。此外，干细胞，尤其是诱导分化的干细胞通过给予Bcl-2或用bcl-2基因遗传修饰细胞而停止细胞死亡，bcl-2基因的产物已知防止程序性细胞死亡(凋亡)。
本发明的遗传修饰细胞具有另外的优点，它具有完全特化成细胞类型特异性细胞的能力。特化可以重现，可以用很多公知的分化方案操作。在一个实施方案中，从腔回收的遗传修饰的干细胞被植入一个或多个异体和/或自体宿主中用于细胞/基因治疗，所述宿主需要由遗传修饰细胞产生的一种或多种生物活性分子。下面将详细描述移植技术。作为替代方案，可以在植入之前对遗传修饰干细胞进行一种或多种分化操作。一旦细胞已经特化，可以分离并植入一个或多个宿主中，所述宿主需要由遗传修饰细胞表达的蛋白质或生物活性分子。
干细胞的移植、恢复(rehabilitation)和治疗性应用在本发明的一个实施方案中，移植本发明的一种或多种干细胞和/或组合物，以治疗或预防一种或多种病症、疾病或退行性病变，以修复或替换破坏的、功能差的或功能障碍的组织/器官，或增强细胞、组织或器官功能。这样的器官或组织损伤(也称受影响区域)可以缘自机械、化学、分子或电解损伤、改变或异常。如本领域技术人员认为必要，本发明组合物的移植可以伴随免疫抑制。在有些情况下，可以使用遗传修饰的干细胞，所述遗传修饰包括使用同源重组的基因替换或基因敲除。例如，去除主要组织相容性复合物(MHC)基因的技术在本领域公知(Zheng et al.，1991.PNAS，888067-8071)。缺失MHC表达的干细胞允许使用本发明细胞跨越异体和异种组织相容性障碍，而不需要免疫抑制。此外，用于移植的干细胞可以从改变或去除MHC抗原的转基因动物的腔回收。
本发明干细胞和组合物经移植递送到受影响神经区域或本领域普通技术人员认为适当的一个或多个特定部位。使用维持器官或组织完整性的任何已知方法施用细胞。在本发明一个实施方案中，移植的干细胞或细胞特异定成分已经被遗传修饰，以包括一种或多种示踪剂(作为实例，例如染料或标志物，如若丹明或荧光素标记的微球、或坚牢蓝、双苯甲酰胺(bisbenzamide)、或逆病毒导入的组织化学标志物、或同位素化合物、或光修饰化学制品或蛋白质如绿色荧光蛋白)。本文，干细胞可用作诊断标志物，用于探测、显示组织或器官重建变化，用于对一种或多种刺激(如机械或化学刺激，如电场、蛋白质、化学制品、药物等)应答的标志物或其它治疗目的。
本发明干细胞也用于生物工程目的。在一个实施方案中，干细胞被募集到代表感兴趣组织的三维基质(如支架)上。募集过程中，干细胞可以被或不被诱导分化。干细胞可保持在支架中，并在本文被遗传修饰或诱导分化或可以从支架上去除，在此在使用之前对它们进行进一步操作。重要的是，干细胞可以在体内感兴趣部位被募集并诱导分化，从而创建新器官和/或组织。作为替代方案，回收支架并移植到其它地方或捐献给受体。
使用干细胞进行筛选、诊断、测试和探测本发明中从腔回收、诱导分化或未诱导分化的干细胞对于筛选毒素和潜在治疗性组合物和药物制剂是关键的。将组合物以不同剂量、在增殖和或分化过程中的不同时间在体外应用于细胞，并使用本领域公知的技术监测随时间的细胞应答。用本领域公知的一种或多种方法(作为一般实例，如Western印迹、Southern印迹、Northern印迹基因筛选、免疫组化、蛋白质、受体和酶测试、酶联免疫吸附测试(ELISA)、电泳分析、HPLC、放射免疫测试、电生理测定)分析形态(物理)、遗传、分泌、传导性(如离子通道或神经传导)和其它类似应答。相似的，本发明的细胞类型特异性或增殖干细胞可以生长在饲养层(作为基质)上或三维网络中。因而，筛选之前，干细胞可以已经分化。
与体外筛选和测试相似，在缺少和存在一种或多种特定组合物或制剂条件下，观察本发明的移植干细胞(有或无诱导分化)的功效和安全性(如宿主存活、药理、生化和免疫学作用等)。此外，本发明的干细胞或类型特异性细胞可用于测定植入物或另一个移植物对细胞或宿主的作用。
术语“潜在的治疗性组合物”或“药物制剂”指任何物质，如化学制品、聚合物、放射性物质、病毒、蛋白质、肽、氨基酸、脂类、碳水化合物、核酸、核苷酸、药物、前药、植入物和装置作为实例。根据本发明，也筛选已经在筛选前被诱导特化的细胞。
用本发明干细胞的筛选(体外或者体内以及进行或不进行进一步诱导分化)提供测试和监测工业或生物化学制品和化合物的经济性方式。在一个实施方案中，细胞用于快速鉴定参与体外或宿主细胞(包括器官或组织)的增殖、分化和存活的物质(如经高通量筛选方法)。而且，可以使用本领域已知技术从本发明的干细胞或谱系特异性细胞构建cDNA文库。如此，可以分析参与细胞调节、功能障碍、修复、重建等的核酸或其因子，并可以设计工业组合物和/或药物制剂用于促进正性(positive)细胞特征并对抗负性(negative)特征。也可开发诊断探针，尤其是鉴定一种或多种遗传疾病或功能障碍的探针。此外，可以研究本发明细胞分泌或产生潜在治疗性或工业组合物的能力。
提供以下实施例以更全面说明本发明的多种实施方案。然而无论如何它们不应理解为限制所附权利要求定义的本发明范围。
积累和诱导形成多能干细胞的实施例对于本发明，随着从哺乳动物体腔间隙募集或回收干细胞而发生炎症反应。将外来物导入(外科或其它方式)体腔间隙一般诱导炎症反应。在一个实施方案中，将植入物通过手术放入小鼠腹腔，其中植入物包括聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)盘，将结果与接受伪手术的小鼠进行比较。早在将植入物导入腹腔后至少约两小时在体腔间隙中发生多能(如干)细胞的诱导(数据未给出)。在至少约14天和更长时间内，植入物将继续诱导多能细胞形成(数据未给出)。驻留并被募集到腔中的细胞经灌洗腔而被收集。收集的细胞放入培养中并允许贴附到基质(如培养板)上。培养中，发现贴壁细胞以指数速率扩增。开始，当观察贴壁细胞时，观察到如图2所示的几种不同形态特征。细胞在培养中生长数天、数周和/或数月后，干细胞诱导分化成不同细胞类型，包括成骨细胞、平滑肌、成纤维细胞、神经元和树突细胞，以下将讨论这些内容。
如同所示，炎症应答以及外来物对于从腹腔募集和回收干细胞(如从灌洗液中回收)是必要的。如此，干细胞出现在灌洗液中并在培养中增殖需要外来物(数据未给出)。
干细胞回收的实施例在一个实施方案中，通过将1.2cm直径PET盘经中线切割植入Swiss Webster小鼠腹腔而募集细胞。植入两个PET盘，腹腔每侧一个，之后用钢制伤口夹闭合伤口。导入植入物不同时间段之后处死小鼠，经灌洗收集小鼠腹腔内细胞。通过将至少约4-5mL DMEM培养基注射入小鼠腹腔，并在不同时间点之后用转移吸管小心取出灌洗液来进行灌洗。然后将取出的培养基(灌洗液)放入含至少约10％胎牛血清(FBS)和1-5％抗生素(如青霉素和链霉素)的组织培养瓶或细胞培养板中，以抵抗来自垂死巨噬细胞或肠中的可能细菌。贴壁细胞是多能干细胞。最重要的是，第一次灌洗之后，回收约500,000干细胞/克小鼠。可以在相同对象重复相同操作多次，以继续干细胞回收。例如，将在每次透析处理后从接受腹膜透析的对象回收干细胞，只要在腹腔中有诱导炎症反应的外来物。
然后在培养中传代贴壁干细胞以维持它们，可以诱导或不诱导增殖或分化。在存在正常培养基、抗生素和最少血清添加的条件下，干细胞继续生长(如分裂成祖细胞群体)至少约1年(数据未给出)。
干细胞生长的实施例灌洗液(用于灌洗腹腔)加到培养表面短时间以后，容易识别通常具有纺锤形态的贴壁细胞。充分铺板时间通常至少约24小时之后，除去不贴壁的细胞并加入新鲜培养基。通过在培养表面的随机区域进行细胞计数(一般在40×显微镜下观察)监测贴壁纺锤形细胞的生长。图3表示贴壁细胞以指数速率生长(菱形)。另一方面，缺乏植入物条件下(即灌洗前没有外来物引入腔中)从小鼠腹腔回收并以上述严格相同方式使得贴壁的细胞不生长且通常在至少约1周内最终死亡。一般来说，第一次传代后，只有干细胞保持在培养物中。为确保纯多能群体，可以用甲胎蛋白作为进一步“纯化”群体的标志物。
干细胞募集的实施例如前所述，诱导炎症或类似反应(如纤维化或伤口愈合反应)洗导干细胞积累和/或迁移到体腔间隙中。这伴随外来物发生，因为缺乏外来物条件下，液体及其炎性成分不能回收干细胞。在一个实例中，从16只小鼠的腹腔收集细胞，其中8只动物接受植入物而8只没有接受。通过灌洗并随后经另一步简单离心以分离灌洗液和所收集细胞，从腔中回收细胞。离心后保留灌洗液，然后在两组小鼠之间交换，4只接受植入物而4只不接受植入物。剩余8只动物(4只有植入物，4只没有植入物)保留自己的灌洗液。培养来自所有组的细胞，并持续多天计数纺锤形细胞。
图4表示这些培养细胞的生长曲线。从持续超过两周计数的细胞数可以看出，接受植入物小鼠的细胞以指数速率生长(菱形和方块)，而来自没有植入物小鼠的细胞死亡(三角和叉号)。甚至将有植入物小鼠的灌洗液(含有大量炎性蛋白和趋化因子)加入从无植入物小鼠回收的细胞中，细胞也不生长。而且，图4显示正是引入外来物而非灌洗液自身诱导干细胞形成、浸润和回收，因为引入植入物的细胞在缺乏(方块)或存在(菱形)灌洗液的条件下都生长。
干细胞可塑性的实施例引入外来物后从小鼠腹腔回收的细胞培养几周以及几个月并保持作为干细胞，而一些被诱导分化。对于正常干细胞，培养本发明干细胞几天或几周，以使细胞达到汇合可以促进分化以及细胞外基质产生。加入培养基添加剂和/或改变培养条件也可以诱导分化。与之相似，在适当条件下诱导细胞外基质形成。两种行为说明了本发明干细胞的可塑性。下面提供进一步的实施例。
特化为骨细胞的实施例除了引入本领域公知的诱导骨细胞形成的培养条件以外，本发明细胞向骨细胞分化也可以如下发生。在一个实施方案中，在存在DMEM、胎牛血清(FBS)和抗生素的条件下，在传代之前生长更长时间并达到高密度(如接近或达到汇合)的细胞中，发生细胞聚集并形成培养小骨。细胞也被如下诱导为骨细胞。灌洗后从有植入物的小鼠中收集本发明细胞。用DMEM、5％FBS和2％抗生素将细胞铺到24孔培养板中。三小时后，向每组加入新鲜培养基(以除去未贴壁细胞和灌洗液)。细胞在相同培养基中生长至大致密度达到至少约5×104细胞/cm2。然后如下向细胞中加入分化诱导添加剂(成分)(a)DMEM，5％FBS和1000ng/mL骨形态发生蛋白(BMP)-2；(b)DMEM，5％FBS和300ng/mL BMP-2；(c)DMEM，5％FBS，1％抗生素和2.5ng/mL TGF-β1；或(d)DMEM，5％FBS，1％抗生素(对照)。至少约1周后更换含相同添加剂的培养基。至少约第二周后，所有组接受含DMEM，5％FBS，1％PNC和4rnmol NaHPO4的新鲜培养基(以增强细胞外基质生成)。另外至少约3周含NaHPO4的培养基之后，使用混合于去离子水中的2％Alizarin Red S，用本领域公知的标准Alizarin Red S方案染色细胞，观察骨矿化。图5A表示用BMP-2诱导为骨细胞的实例。请注意富含钙的基质和用BMP-2处理细胞的周围节结，以及很多周缘也染成红色的单个细胞。图5B表示未经BMP预处理的干细胞不显示阳性红色染色(图像中的暗区)。
特化为神经细胞的实施例除了引入本领域公知的诱导神经细胞形成的培养条件以外，本发明细胞向神经细胞分化也可以如下发生。如图6所示，与β-巯基乙醇一起培养后，细胞能分化成神经样细胞，其具有从中央细胞体发出长的带分支的突起。在一个实施方案中，突起可以生长到跨越半个培养板的长度。本发明细胞在长时间培养后将形成突起(如存在血清和抗生素条件下至少约1个月)。
在另一个实施方案中，如下用DMEM、10％FBS培养之后，将经灌洗回收的干细胞诱导变成神经细胞。细胞生长到至少约50％汇合，此后向培养基中加入10mM β-巯基乙醇(BME)。加入BME后至少约24小时，细胞形态开始变化；细胞体缩回同时突起长出。加入BME后至少约48小时，细胞显示特化的多极形态。图7A和7B是加入分化诱导成分后至少约24小时分化的神经细胞的两个实例，加入分化诱导成分之前未观察到这种形态。经H&E染色(图8A和8B)以及神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝-M(NFM)的免疫组化染色(见图9A、9B和9C)，细胞被进一步鉴定为神经细胞。只有用神经特异性诱导成分诱导分化的神经细胞对NSE和NFM染色均为阳性。
特化成骨骼肌细胞的实施例通过实施本领域公知的诱导骨骼肌细胞形成的培养条件、以及通过实施以下条件，可以发生本发明细胞向骨骼肌细胞的分化。经灌洗从腹腔回收的干细胞引入到培养表面之后至少约几周，在存在DMEM、FBS、抗生素以及5-氮胞苷的条件下，骨骼肌细胞形态将开始。显示这些细胞形态的实例见图10。请注意图10A和10B中清晰可见的骨骼肌条纹，继续培养后肌管形成并可见，如图10C和10D。
特化成平滑肌细胞的实施例通过实施本领域公知的诱导平滑肌细胞形成的培养条件以及通过实施以下条件，可以诱导本发明细胞分化成平滑肌细胞。从腹腔回收细胞并在DMEM、FBS和抗生素中培养至少约2周以后，有时要两次亚培养，从干细胞提取的RNA证明与相似的形态和主要或特异性存在于增殖性平滑肌细胞中的特异性蛋白表达。例如，至少培养约两周以后，本发明的平滑肌细胞和干细胞都表达III型胶原和平滑肌肌动蛋白重链-5’。(数据未给出)特化成树突细胞的实施例通过实施本领域公知的诱导树突细胞形成的培养条件以及通过实施以下条件，可以发生本发明细胞向树突细胞分化。如前述经灌洗收集从有植入物小鼠腹腔中回收的本发明细胞。细胞悬于含至少约10％FBS和1％抗生素的DMEM中。然后细胞在24孔板上培养至少约3小时，之后丢弃非贴壁细胞并加入新鲜培养基(如上)到细胞中。将细胞分成对照组和诱导分化组。在一个实施方案中，分化诱导成分包括GM-CSF(20ng/mL)和IL-4(20ng/mL)。加入这些成分后，在包括每个细胞扩增的整个培养板上发生通常是均匀的形态变化(如比对照更长的形态)，并且还有更高生长速率，如图11所示。图11表示对照细胞(方块)以及接受GM-CSF和IL-4分化诱导成分的细胞(菱形)观察6天的生长曲线图。培养至少约1周后，加入新鲜培养基。此处对照细胞接受与上述相同的培养基(DMEM、FBS和抗生素)，而高增殖细胞接受添加GM-CSF(20ng/mL)和TNF-α(20ng/mL)的相同培养基，以诱导树突细胞成熟(培养树突细胞的实例见图12A)。然后培养细胞至少约24小时，然后在10％福尔马林中固定，以进行免疫染色确定树突细胞标志物的存在(见图12B和12C)。正如本领域已知，在标志物中，树突细胞表达MHC II、CD86和CD40。此外，最近的研究表明可以通过CD11c的表达选择树突细胞。因此用抗CD11c抗体(如与磁珠结合的抗体)免疫染色了的细胞被认为是树突细胞。图13A和13B表明如上述诱导分化成树突细胞的细胞也是CD11c阳性的细胞(用抗CD11-FIT-C的偶联抗体显示，见箭头)。细胞周缘的阳性荧光最值得注意。另一方面，如图13C和13D所示，CD11c抗体未在对照干细胞(无分化诱导信号)表面检测到。
特化成脂肪细胞的实施例通过实施本领域公知的诱导脂肪细胞(adipocyte和fat cell)形成的培养条件、以及通过实施以下条件，可以发生本发明细胞向脂肪细胞(adipocyte和fat cell)的分化。经灌洗从腹腔回收的细胞培养于含20％FBS的DMEM中并生长到≥90％汇合。然后培养基更换成α-MEM、10％FBS、10％兔血清、10％地塞米松、5μg/mL胰岛素和50μM5，8，11，14-二十碳四炔酸(5，8，11，14-eicosatetraynoic acid)。培养至少约2天后，将细胞培养于不含地塞米松的相同培养基中。然后保持细胞至少1周，在此期间通常发现开始诱导脂肪细胞。细胞具有脂肪细胞的指征，因为它们更大、更圆并显示在细胞膜内有非常大的黄色液囊。如图14A和14B所示，经油红O(Oil Red O)(与细胞基质或细胞体的其它部分相比更易溶于储脂库的染料)染色鉴定细胞为脂肪细胞。未诱导分化的干细胞不显示油红O染色阳性(图14D)。
用于诱导分化/细胞特化的几种方案的实施例神经细胞特化方案1.用20％FBS扩增到70％汇合2.用溶于DMEM、20％FBS中的1mMβ-巯基乙醇诱导至少约24小时3.用溶于DMEM、20％FBS中的1mMβ-巯基乙醇更新培养基神经细胞特化的替代方案1.与神经元、胶质、施旺或星形细胞细胞系共培养2.补充从神经元、胶质、施旺或星形细胞细胞系获得的条件培养基，或加入至少一种另外的细胞基质蛋白脂肪细胞特化方案
1.用DMEM、20％FBS扩增到≥90％汇合2.培养基更换成α-MEM、10％FBS、10％兔血清、10-8地塞米松、5μg/mL胰岛素和50μM5，8，11，14-二十碳四炔酸3.至少两天后，补充与2中相同但不含地塞米松的培养基4.分化可早在经几天或至少约1周开始树突细胞特化方案1.用DMEM、血清和GM-CSF并组合IL-4和/或SCF(干细胞因子)培养并生长细胞至少约或最多9天2.每3-5天更换新鲜培养基3.使用一年个2剂量的GM-CSF和TNF-α至少24小时肌肉细胞特化方案(包括成肌细胞、肌管和心肌细胞)1.在含10-20％FBS(任选的和5％马血清)的DMEM中生长细胞并且不允许细胞达到至少约＞90％汇合2.重新铺细胞达到至少约80％汇合3.补充含5-氮胞苷或5-氮杂-2’-脱氧胞苷的DMEM4.24小时后，去除含5-氮胞苷或5-氮杂-2’-脱氧胞苷的培养基并重新补充不含添加剂的相同培养基5.继续培养，肌管通常在至少约7天后出现肌肉细胞特化的替代性方案1.与成肌细胞或心肌细胞细胞系共培养2.补充成肌细胞调节的培养基或添加细胞外基质蛋白软骨细胞特化方案(包括软骨细胞和成软骨细胞)1.用DMEM、血清和抗生素培养细胞
2.加入含FGF和/或IGF-I和/或TGF-β1的培养基软骨细胞特化的替代性方案1.用DMEM、血清和抗生素培养细胞2.至少几周后，将细胞引入任何三维基质(作为实例，如基于生物材料的、基于聚合物的、或含透明质酸、蛋白聚糖、胶原和/或去矿化骨的)3.任选的将张力梯度引入培养条件(用本领域公知的方案)以增强细胞外基质产生骨细胞特化方案(包括成骨细胞和骨细胞)1.在含血清和抗生素的DMEM中生长细胞直到至少约≥90％汇合2.更换成含重组BMP-2(或另一种BMP)的相同培养基3.任选的至少约12-24小时后加入另一剂量的重组BMP-24.培养，节结将可以肉眼识别骨细胞特化的替代性方案1.用DMEM、血清和抗生素培养细胞2.至少一周后，将细胞引入任何三维基质(作为实例，如基于生物材料的、基于聚合物的、或含透明质酸、蛋白聚糖、胶原和/或去矿化骨的)中本发明通过将外来物植入哺乳动物体腔间隙并允许干细胞在体腔间隙中积累，提供产生大量未特化干细胞以及多种类型特化细胞的方式。如此，与当前使用的回收干细胞的方法(如从骨髓)相比，本发明方法可以回收大于200倍数量的干细胞。本发明积累的干细胞(特化和/或未特化)可用于体内或离体使用。因此，本发明干细胞可以在宿主哺乳动物中积累，并在宿主中保持为干细胞或者经诱导成特化细胞类型或者从宿主回收并用于需要它的另一个对象(如为生物工程目的)。相似的，本发明干细胞可用于多种商业用途，如用于细胞和产品筛选(如生物标志物)、作为诊断工具、用于预防和治疗性治疗涉及细胞功能障碍或异常的一种或多种病变，还可用于创建干细胞系、cDNA文库，以产生治疗剂和用于遗传工程。如此，本发明的细胞、细胞系和组合物可用于很多应用，包括移植、移入、恢复(rehabilitation)、细胞替代、诊断、化合物和药物筛选、生物工程等。
与使用以前建立方法回收的干细胞不同，本发明的干细胞表现出真正可塑性，因为它们可以被诱导分化成骨髓来源的造血干细胞、骨髓来源的间充质干细胞，以及脑和脊髓的神经元细胞。
根据本发明的另一方面，通过将外来物植入哺乳动物体腔间隙并允许干细胞积累，提供诱导形成具有分化和增殖能力的多能细胞的方法。而且，另一方面是通过在将外来物引入体腔间隙后用生理溶液洗涤体腔间隙，从哺乳动物体腔间隙回收具有增殖和分化能力的多能细胞的方法。重要的是，生理溶液可以包括其它成分，作为实例如肽、细胞因子、抗生素、抗炎剂和/或促炎剂、抗氧化剂、其它营养剂、生长诱导信号、增殖诱导信号、分化诱导信号和/或分化阻断信号。
根据本发明另一方面，通过将外来物引入哺乳动物体腔间隙至少约2小时，提供创建积累具有分化和增殖能力干细胞的环境的方法。
本发明的另一方面是用从哺乳动物体腔间隙回收的干细胞治疗宿主疾病的方法，这是通过在将外来物引入体腔间隙中之后回收在哺乳动物体腔间隙中积累的干细胞、然后将回收的细胞引入需要它们的患者。通常允许干细胞增殖(如扩增)并可以在引入患者之前被诱导分化。干细胞通常用于治疗有细胞异常的任何疾病，包括遗传病、衰老和衰老相关疾病、获得性疾病、肿瘤(如癌)，以及用于组织损伤(如破坏或炎症)和修复。在另一方面，一种或多种干细胞增殖、接受遗传操作(如加入一种或多种病毒、药物、或生物物质如蛋白质、基因、肽、标记物、细胞或化学保护剂等)和/或诱导分化。
本发明的另一方面是创建干细胞克隆群体的方法。如此，干细胞可以被诱导分化、增殖和/或引入对象，其中期望细胞类型的细胞典型的存在于对象中。此外，除了向治疗对象提供一种或多种多能干细胞的方法以外，还提供多能干细胞。进而，提供cDNA文库、构建这种文库的方法、从这种cDNA文库获得的诊断探针。如此，分析参与细胞调节、功能障碍、修复、重建等的核酸或其因子并设计组合物和/或药物制剂，以促进正性细胞特征并对抗负性特征。
根据本发明的另一方面，提供通过下述步骤使从哺乳动物体腔间隙回收的细胞永生化的方法将外来物引入体腔间隙，回收积累于体腔间隙中的细胞，并且在培养之后，在允许摄入永生化基因并允许细胞自我更新和特化的条件下将永生化基因导入细胞。
本发明的另一方面是从哺乳动物体腔间隙回收并用一种或多种能产生蛋白的基因永生化的干细胞(或其群体)，其中所述干细胞在用刺激产生所述蛋白的物质诱导时能表达所述蛋白。
本发明另一方面提供一种组合物，其包括从哺乳动物体腔间隙回收的干细胞和药学上可接受的载体，所述干细胞已经被诱导表达非体腔间隙来源细胞的至少一种特征，并且(a)其中至少一种非内源性核酸序列已经被引入细胞，(b)其中至少一种非内源性肽已经被引入细胞，和/或(c)其中至少一种单克隆抗体已经被引入细胞。作为实例，所述特征包括定义为以下类型的特征神经元的、星形胶质的、树突的、造血的、肝的、心脏的、骨骼的、上皮的、脂肪细胞的、肺泡/牙槽的(alveolar)、眼的、内皮的、成骨的、软骨的、表皮的、胰腺的、肾的、腱细胞的和生殖的。这些干细胞可以具有细胞功能(如肝细胞、肾细胞的功能)、物理结构(骨或脂肪细胞)或产生必要的蛋白质或生物物质(如胰岛素、生长因子)，用于治疗疾病如糖尿病、肝或肾衰、整形外科等。
本发明的另一方面，除了测试参与体外或宿主细胞生长的物质的方法以外，提供可鉴定这些物质的从体腔间隙回收的干细胞。作为实例，所述物质可以包括批准的和研究中的药物产品、农用物质、食品、用于工业目的化学产品和已知或怀疑的(suspected)毒素。
本发明也提供产生用于细胞基治疗的组合物和方法，其中将从哺乳动物体腔间隙回收的细胞指导分化成一种或多种特化细胞类型，并作为替代细胞的可更新来源引入患者而治疗人类疾病(如移植入破坏或病变组织或器官、使器官或组织种群恢复、移植后整合入周围组织)。根据需要，细胞可以作为主要或次要的细胞来源被引入并允许整合。
在以下说明中陈述的本发明其他目的、优点和新特性，在阅读前述详细说明之后对本领域技术人员将是显而易见的或经实施本发明可以被了解。依靠本文具体指出的仪器和组合，可以实现并达到本发明的目的和优点。
权利要求
1.收集多能干细胞的方法，包括以下步骤将外来物引入哺乳动物体腔间隙中；用生理溶液洗涤体腔间隙至少一次；和收集生理溶液以回收多能干细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述体腔间隙是选自腹腔、皮下间隙、胸膜间隙、肺间隙和脑间隙的一种或多种。
3.权利要求1的方法，其中所述生理溶液选自培养基、葡聚糖、盐水、血清、抗生素、医用滴注溶液及其组合。
4.权利要求1的方法，其中在将外来物引入体腔间隙至少约2小时后进行所述洗涤步骤，并且任选的至少约每2小时重复此步骤。
5.权利要求1的方法，其中所述洗涤步骤选自灌洗、透析和医学滴注。
6.权利要求1的方法，还包括遗传操作所述多能干细胞的步骤。
7.权利要求1的方法，其中所述多能干细胞重新引入需要它们的患者。
8.权利要求1的方法，其中多能干细胞通过下述步骤被诱导分化为树突细胞在还包含血清和GM-CSF的培养基中培养，和任选地将所述树突类型细胞重新铺于含血清和TNF-α的培养基中。
9.权利要求1的方法，其中多能干细胞通过下述步骤被诱导分化为骨细胞在还包含血清和选自骨形态发生蛋白和TGF-β1的骨特异性生长因子的培养基中培养。
10.权利要求1的方法，其中多能干细胞通过下述步骤被诱导分化为神经元细胞在还包含血清和β-巯基乙醇的培养基中培养。
11.权利要求1的方法，其中多能干细胞通过下述步骤被诱导分化为肌肉细胞在还包含血清和抗生素的培养基中培养，并使细胞在不达到完全汇合下生长几周。
12.权利要求1的方法，其中多能干细胞通过下列步骤被诱导分化为脂肪细胞在还包含血清、地塞米松、胰岛素和5，8，11，14-二十碳四炔酸的培养基中培养。
13.权利要求1的方法，其中多能干细胞通过下述步骤被诱导分化为软骨细胞在还包含血清和选自FGF、IGF-1和TGF-β1的一种或多种生长因子的培养基中培养。
14.治疗需要这种治疗的患者中疾病的方法，包括以下步骤从对象的体腔间隙中收集多能干细胞；培养所述多能干细胞；和将所述多能干细胞引入需要它们的患者。
15.权利要求14的方法，还包括在存在分化诱导信号的条件下诱导多能干细胞分化的步骤。
16.权利要求14的方法，其中通过在将外来物引入体腔间隙后至少约2洗涤体腔间隙来收集多能干细胞。
17.权利要求14的方法，其中所述对象是患者。
18.权利要求14的方法，还包括通过导入选自核酸序列、氨基酸、抗体、分化诱导信号、增殖诱导信号、生物化合物、化学制品、选择标志物、三维支架及其组合的一种或多种来操作所述多能干细胞的步骤。
19.权利要求14的方法，其中在体内操作所述多能干细胞。
20.经权利要求1方法获得的细胞群体，其中包括将外来物引入哺乳动物体腔间隙中；用生理溶液洗涤体腔间隙至少一次；和收集生理溶液以回收细胞群体。
21.干细胞，在将外来物引入体腔间隙后至少约2小时从体腔间隙中回收，并能创建干细胞的克隆群体。
22.权利要求20的干细胞，其中所述干细胞用于选自下组的一种或多种应用遗传操作、筛选、诊断、表型分析、异体移植、自体移植、移入、细胞和组织替换、细胞和组织增强、细胞异常的治疗及其组合。
23.形成干细胞的方法，包括以下步骤将三维物体植入对象的体腔间隙，其中所述三维物体作为积累和生长干细胞的支架起作用。
24.权利要求23的方法，其中通过选自遗传修饰、诱导募集、诱导分化、诱导生长、诱导增殖及其组合的操作在体内操作干细胞。
25.权利要求17的方法，其中干细胞用于治疗病变，其中所述病变选自肿瘤、疾病、癌症、组织损伤、细胞死亡。
26.细胞群体，从对象的体腔间隙中回收，被诱导表达非体腔间隙来源细胞的至少一种特征并适于植入宿主，其中在将三维外来物引入体腔间隙后至少约2小时回收所述细胞群体。
27.分离的干细胞，从对象的体腔间隙中回收，用一种或多种能产生化合物的基因永生化，其中经刺激其产生的信号诱导所分离干细胞能表达所述化合物，并且其中在将外来物引入体腔间隙后至少约2小时回收所述分离干细胞。
28.组合物，其包含从对象体腔间隙回收的干细胞，已被诱导表达非体腔来源细胞的至少一种特征，其中在将外来物引入体腔间隙后至少约2小时回收所述分离干细胞；和药学上可接受的载体。
29.权利要求28的组合物，其中所述特征选自神经元的、星形胶质的、树突的、造血的、肝的、心脏的、骨骼的、上皮的、脂肪细胞的、肺泡/牙槽的、眼的、内皮的、成骨的、软骨的、表皮的、胰腺的、淋巴的、表皮的、肾的、腱细胞的和生殖的。
30.组合物，其包含从对象体腔间隙回收的干细胞，已被诱导表达非体腔来源细胞的至少一种特征，其中至少一种非内源性核酸序列已被引入所述干细胞，并且其中在将外来物引入体腔间隙后至少约2小时回收所述干细胞；和药学上可接受的载体。
31.组合物，其包含从对象体腔间隙回收的干细胞，已被诱导表达非体腔来源细胞的至少一种特征，其中至少一种非内源性氨基酸序列已被引入所述干细胞，并且其中在将外来物引入体腔间隙后至少约2小时回收所述干细胞；和药学上可接受的载体。
32.组合物，其包含从对象体腔间隙回收的干细胞，已被诱导表达非体腔来源细胞的至少一种特征，其中至少一种单克隆抗体已被引入所述干细胞，并且其中在将外来物引入体腔间隙后至少约2小时回收所述干细胞；和药学上可接受的载体。
33.从哺乳动物体腔间隙回收的干细胞，可用于鉴定参与体外细胞或宿主细胞生长的物质，其中在将外来物引入体腔间隙后至少约2小时回收所述干细胞。
34.测试所制备组合物对从哺乳动物体腔回收的干细胞安全性的方法，包括以下步骤将外来物引入体腔间隙后至少约2小时用生理溶液洗涤所述体腔间隙，从哺乳动物体腔间隙收集干细胞；和在存在一种或多种所制备组合物下在适当培养基中培养所述干细胞。
35.权利要求34的方法，还包括在培养后多个不同时间检查干细胞以评价细胞变化的步骤。
36.通过权利要求1的方法获得的干细胞系，用于构建cDNA文库。
37.权利要求36的干细胞系，其中从所述cDNA文库获得一种或多种诊断探针。
38.权利要求36的干细胞系，其中所述干细胞产生一种或多种治疗性组合物。
39.收集多能干细胞的方法，包括以下步骤将外来物引入哺乳动物体腔间隙；和从所述体腔间隙回收多能干细胞。
全文摘要
从成年哺乳动物体腔间隙中积累、募集和回收干细胞的方法，以及根据本发明的组合物和干细胞。根据本发明的另一方面，通过将外来物移植到哺乳动物的体腔间隙内并收集从移植获得的干细胞，提供一种获得干细胞新来源的方法。还根据本发明，向需要这种治疗的对象提供一种或多种本发明干细胞的方法的特征是在移植外来物以后从哺乳动物体腔间隙回收干细胞、操作所述干细胞并将所述干细胞引入需要这种治疗的对象。
文档编号A61K35/12GK1860222SQ200480019015
公开日2006年11月8日 申请日期2004年5月28日 优先权日2003年5月29日
发明者唐力平, 罗伯特·H·汉森 申请人:得克萨斯大学体系董事会