专利名称：用作葡糖激酶激活剂的苯甲酰基氨基吡啶基羧酸衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组苯甲酰基氨基吡啶基羧酸化合物，所述化合物可用于治疗或预防通过葡糖激酶(GLK)介导的疾病或病症，并且导致胰岛素分泌的葡萄糖阈值降低。此外，预计所述化合物通过增加肝脏葡萄糖摄取来降低血液葡萄糖。这些化合物可用于治疗2型糖尿病和肥胖症。本发明还涉及含有所述化合物的药物组合物，和使用所述化合物来治疗由GLK介导的疾病的方法。
在胰腺β-细胞和肝脏实质细胞中主要的血浆膜葡萄糖转运蛋白是GLUT2。在生理葡萄糖浓度下，GLUT2转运葡萄糖穿过膜的速率不是葡萄糖摄取进入这些细胞的总速率的限制速率。葡萄糖摄取的速率是由葡萄糖成为葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)的磷酸化作用的速率限制的，该作用经葡糖激酶(GLK)催化[1]。GLK对于葡萄糖具有高(6-10mM)的Km且不被生理浓度的G-6-P抑制。GLK表达局限在少数组织和细胞类型，最常见的是胰腺β-细胞和肝脏细胞(肝细胞)[1]。在这些细胞中GLK活性是葡萄糖利用的限速作用且由此调控葡萄糖引起的胰岛素分泌的程度和肝糖原合成。这些过程在整体葡萄糖内稳态的维持中十分关键且两者在糖尿病中均功能不全[2]。
在一种亚型糖尿病，青年的2型发育期发作糖尿病(MODY-2)中，该糖尿病是由功能突变的GLK损失引起的[3，4]。在MODY-2患者中，高血糖源自胰腺和肝脏两者中的缺损性葡萄糖利用[5]。MODY-2患者的胰腺中缺损性葡萄糖利用导致葡萄糖刺激胰岛素分泌的阈值升高。相反，稀有的GLK的激活突变作用降低该阈值导致家族性胰岛素分泌过多[6，7]。除了在MODY-2糖尿病中观察到降低的GLK活性以外，肝脏葡糖激酶活性在2型糖尿病中也降低[8]。重要的是，GLK的全面或肝脏选择性过度表达阻止或逆转该疾病的饮食和遗传模型两者中糖尿病表型的恶化[9-12]。此外，用果糖对2型糖尿病的快速治疗通过刺激肝脏葡萄糖利用来提高葡萄糖耐受性[13]。据信这种效应是通过下列机理由[13]果糖诱发的肝细胞中胞质GLK活性增高来介导的。
通过与GLK调节蛋白(GLKRP)缔合可抑制肝脏GLK活性。GLK/GLKRP复合物通过果糖-6-磷酸(F6P)结合GLKRP稳定化且通过果糖-1-磷酸(F1P)置换这种糖磷酸去稳定化。在果糖激酶介导的食物果糖的磷酸化作用介导下生成F1P。所以，GLK/GLKRP复合物的完整性和肝脏GLK活性以营养依赖方式受到调节，因为F6P在吸收后状态升高而F1P在进餐后状态占优势。与肝细胞形成对照，胰腺β-细胞在GLKRP不存在的条件下表达GLK。所以，β-细胞GLK活性仅仅由其底物葡萄糖的可利用性来调节。小分子可以直接或者通过使GLK/GLKRP复合物去稳定化来激活GLK。前者种类的化合物预计可刺激肝脏和胰腺两者中的葡萄糖利用而后者预计仅仅在肝脏中起作用。然而，具有一种性能的化合物预计具有治疗2型糖尿病的治疗效益，因为这种疾病特征在于在上述两种组织中的缺损性葡萄糖利用。
GLK和GLKRP和KATP通道在下丘脑的神经元中表达，下丘脑是调节能量平衡和控制食物摄取非常重要的脑区域[14-18]。已经证实这些神经元表达开胃和厌食神经肽[15，19，20]，且被推断是下丘脑内的葡萄糖传感神经元，它们通过环境葡萄糖浓度的改变来抑制或兴奋[17，19，21，22]。这些神经元感觉葡萄糖水平变化的能力在多种遗传和试验诱导的肥胖模型中是缺损的[23-28]。葡萄糖类似物，也就是葡糖激酶的竞争性抑制剂的脑室内(icv)输注，刺激瘦弱大鼠的食物摄取[29，30]。相反，葡萄糖的icv输注抑制进食[31]。所以，GLK的小分子激活剂可以通过对GLK的中枢作用减少食物摄取和体重增加。所以，GLK激活剂可以治疗性应用于治疗除糖尿病以外的饮食性疾病，包括肥胖。下丘脑的作用将与这些化合物的作用加合或协同地在肝脏和/或胰腺中发挥使葡萄糖内稳态正常化的作用，例如治疗2型糖尿病。所以GLK/GLKRP系统可以描述成为潜在“糖尿病肥胖”靶向(在糖尿病和肥胖中都有益)。
在WO0058293和WO 01/44216(Roche)中，描述了一系列作为葡糖激酶激活剂的苄基氨基甲酰基化合物。此类化合物激活GLK的机理是通过测量这些化合物在其中GLK活性与NADH生成有关的试验中的直接作用来评估的，而NADH生成是通过光学方法测定的-参见实施例A中描述的体外试验详情。本发明化合物可直接激活GLK或者可以通过抑制GLKRP与GLK的相互作用来激活GLK。与GLK的直接激活剂相比，后一机制具有重要优点，因为它们不会引起在直接刺激之后所预测的严重的低血糖发作。与已知的GLK激活剂相比，很多本发明化合物可表现出有利的选择性。
WO9622282、WO9622293、WO9622294、WO9622295、WO9749707和WO9749708公开了多种用于制备可用作加压素剂的化合物的中间体，这些中间体与本发明公开的化合物在结构上类似。结构上类似的化合物还公开在WO9641795和JP8143565(加压素拮抗作用)以及JP8301760(预防皮肤损害)和EP619116(骨病)中。
WO01/12621描述了用作c-JUN N-末端激酶抑制剂的异恶唑基嘧啶以及相关化合物的制备，以及含有这样的化合物的药物组合物。
Cushman等人[Bioorg Med Chem Lett(1991)1(4)，211-14]描述了含有吡啶的均二苯代乙烯和酰胺化合物及其作为蛋白-酪氨酸激酶抑制剂的评估。Rogers等人[J Med Chem(1981)24(11)1284-7]描述了作为环-AMP磷酸二酯酶抑制剂的介离子6-羟基嘌呤类似物。
WO00/26202描述了用作抗肿瘤剂的2-氨基噻唑衍生物的制备。GB 2331748描述了具有杀虫作用的噻唑衍生物的制备。WO96/36619描述了用作消化道运动改善剂的氨基噻唑衍生物的制备。US 5466715和US 5258407描述了3，4-二取代的苯酚免疫刺激剂的制备。JP58069812描述了含有苯甲酰胺衍生物的降血压药物。US 3950351描述了2-苯甲酰氨基-5-硝基噻唑化合物，Cavier等人[Eur J Med Chem-Chim Ther(1978)13(6)，539-43]讨论了这些化合物的生物益处。
WO03/000262公开了用作GLK激活剂的乙烯基苯基衍生物，WO03/015774公开了用作GLK激活剂的苯甲酰胺化合物，WO03/066613公开了用作GLK激活剂的N-苯基-2-嘧啶胺衍生物。
未决国际申请PCT/GB02/02873(WO03/000267)描述了一组苯甲酰基氨基吡啶基羧酸化合物，所述化合物是葡糖激酶(GLK)的激活剂。我们惊奇地发现了一些从这些化合物当中选择的一小部分化合物，这些选择的一小部分化合物在口服给药后具有优良的血浆药物水平，这是由于提高的水溶解度以及降低的血浆结合水平的缘故，同时保持了对GLK酶的高效力。这使得该亚组化合物特别适于用来治疗或预防通过GLK介导的疾病或病症。
因此，根据本发明的第一个方面，本发明提供了式(I)化合物或其盐、前药或溶剂化物
式(I)其中R1-X-选自甲基、甲氧基甲基和 R2选自氢、甲基、氯和氟；n是1或2。
为了避免疑问，R2是一个基团，该基团可以是在2、3或6位上的取代基，所述2、3或6位是相对于两个苯基环之间的氧原子而言的。
式(I)化合物可以形成盐，其属于本发明的范围内。优选可药用盐，虽然其他盐可以用于例如分离或提纯化合物。
应当理解，由于一个或多个不对称碳原子，在某些如上所定义的式(I)化合物的范围内可以存在旋光或外消旋形式，本发明在其定义中包括任何这样的具有直接刺激GLK或抑制GLK/GLKRP相互作用的性质的任何这样的旋光或外消旋形式。旋光形式的合成可以通过所属领域众所周知的有机化学的标准技术来进行，例如通过由旋光原料合成或通过外消旋形式的拆分来进行。应当理解，一些化合物可以以互变异构形式存在，并且本发明还涉及能够激活GLK的本发明化合物的任何以及所有互变异构形式。
优选的式(I)化合物是其中适用任何一个或多个以下限定的那些(1)在式(I)的3-位的基团优选为
(2)R2是氢；(3)R2是氟或氯；(4)R2是甲基(5)R2是氟；(6)R2是氯；(7)n是1；(8)n是2；(9)R2连接在苯基环的3-位上，所述3-位是相对于氧原子而言的。
根据本发明的另一个特征，本发明提供了下列优选组的本发明化合物(I)式(Ia)化合物 式(Ia)其中n和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
(II)式(Ib)化合物 式(Ib)
其中n和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
(III)式(Ic)化合物 式(Ic)其中n和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
(IV)式(Id)化合物 式(Id)其中n和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
(V)式(Ie)化合物
式(Ie)其中n、X、R1和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
优选的本发明化合物包括一种或多种下列化合物6-{[(3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸和6-{[(3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸或其盐、溶剂化物或前药。
本发明化合物可以以前药的形式给药。前药是在机体内可降解以生成本发明化合物的生物前体或可药用化合物(例如本发明化合物的酯或酰胺，特别是体内可水解的酯)。多种不同形式的前药是本领域已知的。这样的前药衍生物的实例可参见a)Design of Prodrugs，H.Bundgaard编写，(Elsevier，1985)andMethods in Enzymology，Vol.42，p.309-396，K.Widder，等人编写(Academic Press，1985)；b)A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen编写；c)H.Bundgaard，Chapter 5“Design and Application of Prodrugs”，H.Bundgaard p.113-191(1991)；d)H.Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews，8，1-38(1992)；e)H.Bundgaard，等人，Journal of Pharmaceutical Sciences，77，285(1988)；和
f)N.Kakeya，等人，Chem Pharm Bull，32，692(1984)。
上述文件的内容引入本文以供参考。
前药的实例如下。含有羧基或羟基的本发明化合物的体内可水解酯，例如，在人或动物体内水解以生成母体酸或醇的可药用酯。对于羧基，适当可药用酯包括C1-C6烷氧基甲基酯，例如甲氧基甲基酯，C1-6烷酰氧基甲基酯，例如新戊酰氧基甲基酯，2-苯并[c]呋喃酮基酯，C3-C8环烷氧基羰基氧基C1-C6烷基酯，例如1-环己基羰氧基乙基酯；1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基酯，例如5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基酯；和C1-6烷氧基羰基氧基乙基酯。
含有羟基的本发明化合物的体内可水解酯包括无机酯例如磷酸酯(包括磷酰胺环酯(phosphoramidic cyclic esters))和α-酰氧基烷基醚和有关化合物，作为酯在体内水解的结果，它们断裂以产生母体羟基。α-酰氧基烷基醚的实例包括乙酰氧基甲氧基和2，2-二甲基丙酰氧基-甲氧基。用于与羟基形成体内可水解的酯的基团的选择包括烷酰基、苯甲酰基、苯基乙酰基和取代的苯甲酰基和苯基乙酰基、烷氧基羰基(以生成碳酸烷基酯)、二烷基氨基甲酰基和N-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(以生成氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。
本发明化合物的适当可药用盐是，例如，具有足够碱性的本发明化合物的酸加成盐，例如，与例如无机或有机酸形成的酸加成盐，所述酸是例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、柠檬酸或马来酸。此外，本发明的具有足够酸性的苯并嗪酮衍生物的适当可药用盐是碱金属盐，例如钠或钾盐，碱土金属盐，例如钙或镁盐，铵盐或与提供生理可接受阳离子的有机碱形成的盐，例如与甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟基乙基)胺形成的盐。
本发明的另一个特征是包含如上所定义的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其盐、溶剂化物或前药与可药用稀释剂或载体的药物组合物。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了用作药物的如上所定义的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物。
本发明还提供了用于制备用来治疗通过GLK介导的疾病，特别是2型糖尿病的药物的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物。
将本发明化合物适当地配制成用于以该方式使用的药物组合物。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了治疗GLK介导的疾病，尤其是糖尿病的方法，包括给需要这样的治疗的哺乳动物施用有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
可以用本发明化合物或组合物治疗的具体疾病包括在没有严重低血糖危险的情况下降低2型糖尿病中的血糖(并有效治疗1型)；异常脂血症；肥胖；胰岛素抗性；代谢综合征X；葡萄糖耐量减低。
如上所述，GLK/GLKRP系统可因此描述成为潜在的“糖尿病肥胖”靶向(在糖尿病和肥胖中都有益)。因此，根据本发明的另一个方面，本发明提供了式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其盐、溶剂化物或前药在制备用于联合治疗或预防糖尿病和肥胖的药物中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗或预防肥胖的药物中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于肥胖和糖尿病的联合治疗的方法，包括给需要这样的治疗的哺乳动物施用有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于治疗肥胖的方法，包括给需要这样的治疗的哺乳动物施用有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
本发明的组合物可以是适合口服使用的形式(例如片剂、锭剂、硬或软胶囊、水或油悬浮液、乳剂、可分散散剂或颗粒剂、糖浆剂或酏剂)，局部使用的形式(例如霜剂、膏剂、凝胶剂或水或油溶液或悬浮液)，吸入给药的形式(例如微粉散剂或液体气雾剂)，通过吹入给药的形式(例如微粉散剂)或非肠道给药的形式(例如用于静脉内、皮下、肌内或肌肉内给药的灭菌水或油溶液或用于直肠给药的栓剂)。
本发明的组合物可以通过常规方法利用该领域众所周知的常规药物赋形剂来获得。所以，用于口服使用的组合物可以含有，例如，一种或多种着色剂、甜味剂、矫味剂和/或防腐剂。
用于片剂制剂的合适的可药用赋形剂包括，例如，惰性稀释剂例如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙，制粒剂和崩解剂例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂例如淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉；防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯，和抗氧剂例如抗坏血酸。片剂制剂可以无包衣或有包衣来改变其崩解作用和随后活性成分在胃肠道内的吸收作用，或改进其稳定性和/或表观，在任意情况中，使用该领域众所周知的常规包衣剂和方法。
口服使用的组合物可以是硬明胶胶囊的形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或成为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水悬浮液一般含有微粉形式的活性成分和一种或多种悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂例如卵磷脂或氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七氧化乙烯鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七氧化乙烯鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。水悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯)、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、着色剂、矫味剂和/或甜味剂(例如蔗糖、糖精和天冬甜素)。
油悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油悬浮液也可以含有增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂例如上述那些，和矫味剂来提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧剂例如抗坏血酸来防腐。
适合通过加入水制成水悬浮液的可分散散剂和颗粒剂一般含有活性成分和分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂。适当的分散剂或湿润剂和悬浮剂例如上述那些。附加的赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂，也可以存在。
本发明的药物组合物也可以以水包油乳剂的形式存在。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡或任何这些的混合物。适当的乳化剂可以是，例如，天然树胶例如阿拉伯胶或黄芪胶，天然磷脂例如大豆卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖醇一油酸酯)和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧化乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。乳剂也可以含有甜味剂、矫味剂和防腐剂。
糖浆剂和酏剂可以与甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、天冬甜素或蔗糖配制，并且也可以含有缓和剂、防腐剂、矫味剂和/或着色剂。
所述的药物组合物还可以是灭菌可注射水或油悬浮液的形式，其可以按照已知方法利用一种或多种适当的分散或湿润剂和悬浮剂来配制，这些物质如上所述。灭菌可注射制剂也可以是存在于无毒胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的灭菌可注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。
用于吸入给药的组合物可以是设计为分配活性成分的常规加压气雾剂，其是含有微粉固体或液滴的气雾剂的形式。可以使用常规气雾剂推进剂例如挥发性氟化烃或烃，且气雾剂装置通常装配为分配计量量的活性成分。
有关制剂的其他信息可参见Comprehensive Medicinal Chemistry的第5卷，25.2章(Corwin Hanschl；Chairman of Editorial Board)，Pergamon Press 1990。
与一种或多种赋形剂合并以制备为单一剂型的活性成分的量必须根据被治疗宿主和具体给药途径来变化。例如，用于对人体口服给药的制剂一般含有，例如，0.5mg-2g的与适当和常规量的赋形剂混合的活性剂，其可以占该组合物总重量的约5-约98％。单位剂型一般含有约1mg-约500mg活性成分。有关给药途径和给药方案的进一步信息可参见Comprehensive Medicinal Chemistry的第5卷，25.3章(Corwin Hanschl；Chairman of Editorial Board)，Pergamon Press1990。
式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物出于治疗或预防目的的给药剂量自然应根据病症的性质和严重性、动物或患者的年龄和性别以及给药途径、按照药物的众所周知原则来改变。
在出于治疗或预防目的而使用式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物时一般是以日剂量在例如0.5mg-75mg/kg体重的范围内给药，如果需要可以分次给药。通常当采用非肠道途径时采用较低剂量。所以，例如，为了静脉内给药，一般采用例如0.5mg-30mg/kg体重范围内的剂量。同样地，为了吸入给药，采用例如0.5mg-25mg/kg体重范围内的剂量。然而优选口服给药。
本发明所述GLK活性的升高可以用作单独疗法或者可以与一种或多种用于所治疗的适应症的其它物质和/或治疗联合使用。这样的联合治疗可以通过各个治疗组分的同时、顺序或分开施用的方式来达到。同时治疗可以在单一片剂或在分开的片剂中。例如在糖尿病的治疗中，化疗可以包括下列主要类型的治疗1)胰岛素和胰岛素类似物；2)胰岛素促分泌剂，包括磺酰脲类(例如格列本脲，格列吡嗪)，饮食葡萄糖调节剂(例如瑞格列奈、那格列奈)；3)改善肠降血糖素作用的活性剂(例如二肽基肽酶IV抑制剂和GLP-1激动剂)；4)胰岛素敏化剂，包括PPARγ激动剂(例如吡格列酮和罗格列酮)，和具有组合的PPARα和γ活性的活性剂；5)调节肝脏葡萄糖平衡的活性剂(例如二甲双胍、果糖-1，6-二磷酸酶抑制剂、糖原磷酸化酶抑制剂、糖原合成酶激酶抑制剂)；6)减少从肠内吸收葡萄糖的活性剂(例如阿卡波糖)；7)阻止肾对葡萄糖的再吸收的活性剂(SGLT抑制剂)；8)治疗长期高血糖的并发症的活性剂(例如醛糖还原酶抑制剂)；9)抗肥胖剂(例如西布茶明和奥利司他)；10)抗异常脂血症，例如HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类(statins)，例如帕伐他汀)；PPARα激动剂(贝特类(fibrates)，例如吉非贝齐)；胆酸螯合剂(考来烯胺)；胆固醇吸收抑制剂(植物谷甾醇(stanol)，合成抑制剂)；胆酸吸收抑制剂(IBATi)和烟酸以及类似物(烟酸和缓释制剂)；11)抗高血压剂，例如β阻滞剂(例如阿替洛尔，普萘洛尔)；ACE抑制剂(例如赖诺普利)；钙拮抗剂(例如尼非地平)；血管紧张素受体拮抗剂(例如坎地沙坦)，α拮抗剂和利尿剂(例如呋塞米、苄噻嗪)；
12)止血调节剂，例如抗血栓形成剂，纤维蛋白溶解的激活剂和抗血小板剂；凝血酶拮抗剂；Xa因子抑制剂；VIIa因子抑制剂)；抗血小板剂(例如阿司匹林、氯吡格雷)；抗凝血剂(肝素和低分子量类似物，水蛭素)和华法令；13)拮抗胰高血糖素的作用的活性剂；和14)抗炎剂，例如非甾族抗炎药(例如阿司匹林)和甾族抗炎药(例如可的松)。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了在下面的实施例中作为终产物制得的各种化合物及其盐/溶剂化物和前药。
本发明化合物或其盐、前药或溶剂化物可以通过任何用于制备此类化合物或结构上相关化合物的已知方法来制备。官能团可以利用常规方法保护和脱保护。例如，保护基例如氨基和羧酸保护基(以及形成的方式和最后的脱保护)可参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“有机合成中的保护基”，第2版，John Wiley & Sons，New York，1991。
合成式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物的方法作为本发明另外的特征而提供。因此，根据本发明的另一个方面，本发明提供了制备式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物的方法，所述方法包括(a)将式(IIIa)的酸或其活化衍生物与式(IIIb)化合物反应 式(IIIa)式(IIIb)；其中P1是氢或保护基；或者(b)将式(IIIc)化合物脱保护，
式(IIIc)其中P2是保护基；或者(c)将式(IIId)化合物与式(IIIe)化合物反应， 式(IIId) 式(IIIe)其中X1是离去基团，且X2是羟基，或者X1是羟基，且X2是离去基团，并且P1是氢或保护基；或者(d)将式(IIIf)化合物与式(IIIg)化合物反应 式(IIIf) 式(IIIg)其中X3是离去基团或有机金属试剂，并且X4是羟基，或者X3是羟基，并且X4是离去基团或有机金属试剂，并且其中P1是氢或保护基；或者
(e)将式(IIIh)化合物与式(IIIi)化合物反应， 式(IIIh) 式(IIIi)；其中X5是离去基团，并且其中P1是氢或保护基；并且之后如果需要的话i)将一种式(I)化合物转化成另一种式(I)化合物；ii)除去任何保护基；iii)形成其盐、前药或溶剂化物。
对于方法a)-e)，合适的离去基团是本领域技术人员众所周知的，并且包括例如活化的羟基离去基团(例如甲磺酸酯和甲苯磺酸酯基团)，以及卤素离去基团例如氟、氯或溴。
式(IIIa)-(IIIi)化合物可商购获得，或者可以通过本领域已知的任何方便方法知道和/或如本发明实施例所述而知道。通常应该理解，任何芳基-O或烷基-O键可以任选在合适的碱存在下通过亲核取代或金属催化的方法来形成。
对于上述反应，具体的反应条件如下，其中当P1是保护基时，P1优选为C1-4烷基例如甲基或乙基方法a)-氨基与羧酸的偶联反应以形成酰胺是本领域众所周知的。例如，(i)使用合适的偶联反应，例如，于室温，在合适的溶剂例如DCM、氯仿或DMF中，在DMAP存在下，使用EDAC进行的碳二亚胺偶联反应；或者(ii)其中通过与草酰氯在合适的溶剂例如二氯甲烷存在下反应而将羧基活化成酰氯的反应。之后可于0℃-室温的温度下，在合适的溶剂例如氯仿或DCNM中，在碱例如三乙胺或吡啶存在下，将酰氯与式IIIb化合物反应。
方法b)-脱保护反应是本领域众所周知的。P1的实例包括C1-6烷基和苄基。当P1是C1-6烷基时，该反应可在合适的溶剂例如THF/水中，在氢氧化钠存在下进行。
方法c)-可将式(IIId)和(IIIe)化合物一起在合适的溶剂例如DMF或THF中，使用碱例如氢化钠或叔丁醇钾，于0-100℃温度下，任选使用金属催化剂例如乙酸钯(II)、披钯碳、乙酸铜(II)或碘化铜(I)来进行反应；或者，可将式(IIId)和(IIIe)化合物一起在合适的溶剂例如THF或DCM中，使用合适的膦例如三苯基膦和偶氮二甲酸酯例如偶氮二甲酸二乙酯来进行反应。
方法d)-可将式(IIId)和(IIIe)化合物一起在合适的溶剂例如DMF或THF中，使用碱例如氢化钠或叔丁醇钾，于0-100℃温度下，任选使用金属催化剂例如乙酸钯(II)、披钯碳、乙酸铜(II)或碘化铜(I)来进行反应；方法e)-式(IIIh)化合物与式(IIIi)化合物的反应可以在极性溶剂例如DMF或非极性溶剂例如THF中，使用强碱例如氢化钠例如氢化钠或叔丁醇钾，于0-100℃温度下，任选使用金属催化剂例如乙酸钯(II)、披钯碳、乙酸铜(II)或碘化铜(I)来进行。
在制备方法期间，使用用于分子内的官能团的保护基可能是有利的。保护基可以通过文献中描述的或化学领域技术人员已知的适于除去所关注的保护基的任何适宜方法来除去，方法的选择应实现保护基的除去并最小限度地干扰分子这的其他基团。
方便起见，下面给出保护基的具体实例，其中“低级”表示该基团优选具有1-4个碳原子。应理解这些实例不是穷举的。虽然下面给出除去保护基的方法的具体实例，但这些方法同样也不是穷举的。没有具体提及的保护基的使用和脱保护的方法显然属于本发明的范围内。
羧基保护基可以是成酯脂族或芳脂族醇的残基或成酯甲硅烷醇的残基(所述醇或甲硅烷基优选含有1-20个碳原子)。羧基保护基的实例包括直链和支链(C1-12)烷基(例如异丙基、叔丁基)；低级烷氧基低级烷基(例如甲氧基甲基、乙氧基甲基、异丁氧基甲基；低级脂族酰氧基低级烷基(例如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基)；低级烷氧基羰基氧基低级烷基(例如1-甲氧基羰基氧基乙基、1-乙氧基羰基氧基乙基)；芳基低级烷基(例如对甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、二苯甲基和2-苯并[c]呋喃酮基)；三(低级烷基)甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；三(低级烷基)甲硅烷基低级烷基(例如三甲基甲硅烷基乙基)；和(2-6C)链烯基(例如烯丙基和乙烯基乙基)。
特别适合除去羧基保护基的方法包括例如酸-、金属-或酶促-催化的水解。
羟基保护基的实例包括低级链烯基(例如烯丙基)；低级烷酰基(例如乙酰基)；低级烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低级链烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基低级烷氧基羰基(例如苯甲酰基氧基羰基、对甲氧基苄基氧基羰基、邻硝基苄基氧基羰基、对硝基苄基氧基羰基)；三低级烷基/芳基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基)；芳基低级烷基(例如苄基)；和三芳基低级烷基(例如三苯基甲基)。
氨基保护基的实例包括甲酰基、芳烷基(例如苄基和取代的苄基，例如对甲氧基苄基、硝基苄基和2，4-二甲氧基苄基，和三苯基甲基)；二对茴香基甲基和呋喃基甲基；低级烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低级链烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基低级烷氧基羰基(例如苄基氧基羰基、对甲氧基苄基氧基羰基、邻硝基苄基氧基羰基、对硝基苄基氧基羰基；三烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；亚烷基(例如亚甲基)；亚苄基和取代的亚苄基。
适合除去羟基和氨基保护基的方法包括例如酸-、碱、金属-或酶促-催化的水解，或对于基团例如邻硝基苄基氧基羰基，使用光解，或对于甲硅烷基，使用氟离子。
酰胺基的保护基的实例包括芳烷氧基甲基(例如苄基氧基甲基和取代的苄氧基甲基)；烷氧基甲基(例如甲氧基甲基和三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)；三烷基/芳基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基)；三烷基/芳基甲硅烷基氧基甲基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基、叔丁基二苯基甲硅烷基氧基甲基)；4-烷氧基苯基(例如4-甲氧基苯基)；2，4-二(烷氧基)苯基(例如2，4-二甲氧基苯基)；4-烷氧基苄基(例如4-甲氧基苄基)；2，4-二(烷氧基)苄基(例如2，4-二(甲氧基)苄基)；和链烯基(例如烯丙基、丁-1-烯基和取代的乙烯基，例如2-苯基乙烯基)。
芳烷氧基甲基，可以通过后者与适当芳烷氧基甲基氯反应引入到酰胺基上，并且通过催化氢化除去。烷氧基甲基、三烷基/芳基甲硅烷基和三烷基/甲硅烷基氧基甲基可以通过将酰胺与适当氯化物反应来引入并用酸除去；或在含有甲硅烷基基团的情况中，使用氟离子。所述烷氧基苯基和烷氧基苄基通过与适当卤化物芳基化或烷基化引入并通过用硝酸铈铵氧化来除去。最后，烷-1-烯基可以通过将酰胺与适当醛反应来引入并用酸除去。
下列实施例举例说明且不限定本申请的范围。各个例举的化合物代表本发明的具体和独立方面。在下列非限定实施例中，除非另外说明(i)蒸发是通过旋转蒸发在真空下进行且处理过程是在除去残留固体例如通过过滤除去干燥剂之后进行的；(ii)操纵是在室温下进行的，也就是在18-25℃的范围内并在惰性气体如氩气或氮气的气氛下进行；(iii)收率仅是举例说明且无需是最大收率；(iv)式(I)的终产物的结构是通过核(一般是质子)磁共振(NMR)和质谱技术来确定；质子磁共振化学位移值是在δ刻度上测量且峰的多重态显示如下s，单峰；d，二重峰；t，三重峰；m，多重峰；br，宽封；q，四重峰；quin，五重峰；(v)中间体一般没有完全定性，且纯度是通过薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、红外(IR)或NMR分析来评估的；(vi)Biotage筒是指预填充的硅胶筒(40g-400g)，用biotage泵和级份收集器系统洗脱；Biotage UK Ltd，Hertford，Herts，UK。
缩写DCM 二氯甲烷；DEAD偶氮二甲酸二乙酯；DIAD偶氮二甲酸二异丙酯；DMAP4-(N.N-二甲基氨基)吡啶DMSO二甲亚砜；DMF 二甲基甲酰胺；
EDAC1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；HPMC羟丙基甲基纤维素；LCMS液相色谱/质谱；RT室温；和THF四氢呋喃。
实施例16-{[(3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸 向6-{[(3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯(0.05mmol)在THF(4mL)内的溶液中加入氢氧化锂一水合物(2.5当量)在水(2mL)中的溶液。将该混合物在室温搅拌4小时。将该反应的pH调节至＜7.0，真空除去THF，用水(8mL)替换。将所得固体过滤，用水洗涤，干燥，获得了6-{[(3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸。
m/z481(M+H)+。
6-{[(3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基氧基)-5-｛[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯 将6-{[3-羟基-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯(0.75mmol)、1，4-苯并二氧杂环己烯-6-硼酸(0.75mmol)、乙酸铜(II)(0.75mmol)、三乙胺(3.75mmol)和新活化的4分子筛(1g)在DCM(10mL)中的溶液于室温和环境气氛下搅拌2天。将该反应混合物过滤，真空除去DCM，把残余油状物在乙酸乙酯与盐酸(1N)之间分配。分离出乙酸乙酯层，用碳酸氢钠水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，蒸发，获得了残余物，通过硅胶色谱纯化，用40％乙酸乙酯在异己烷中的混合物作为洗脱剂，获得了6-{[(3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯。
m/z495(M+H)+.1H NMR(CDCl3)1.3(d，3H)，3.4(s，3H)，3.5(m，2H)，4.0(s，3H)，4.3(s，4H)，4.6(m，1H)，6.6(m，2H)，6.75(m，1H)，6.85(dd，1H)，7.0(m，1H)，7.2(m，1H)，8.3(m，2H)，8.7(s，1H)，8.95(s，1H)。
实施例26-{[(3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸 6-{[(3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯的0.1M溶液中加入0.5N氢氧化钠溶液(5当量)。将该混合物在室温搅拌4小时。真空除去有机相，用水稀释残余物，用盐酸(2N)酸化。将所得沉淀过滤，用水洗涤，并真空干燥，获得了6-{[(3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸。
m/z 467(M+H)+，465(M-H)-；1H NMRδ(d6-DMSO)1.22(d，3H)，3.28(s，3H被溶剂峰遮蔽)，3.46(m，2H)，4.74(s，1H)，6.04(s，2H)，6.56(d，1H)，6.73(d，1H)，6.92(d，1H)，7.09(s，1H)，7.37(s，1H)，8.26(s，2H)，8.86(s，1H)，11.15(s，1H)，13.12(brs，1H)。
6-{[(3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯
将6-{[3-羟基-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯(0.5mmol)、1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基硼酸(1.0mmol)、乙酸铜(II)(0.5mmol)、三乙胺(2.5mmol)和新活化的4分子筛(500mg)在DCM(5mL)中的溶液于室温和环境气氛下搅拌2天，再加入溶剂、分子筛和硼酸(1当量)，将该反应再搅拌4天。将该反应混合物真空浓缩，把残余油状物用乙酸乙酯研制，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱纯化，用20％乙酸乙酯在异己烷中的混合物作为洗脱剂，获得了6-{[(3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯。
m/z 481(M+H)+。
硼酸化合物合成在实施例1和2中使用的硼酸化合物是商购获得的或者如下所述由市售原料合成的。在-78℃，向合适的溴化物(10mmol)在乙醚(25mL)内的溶液中加入1.6M正丁基锂在己烷中的溶液(11mmol)。将该反应混合物在-78℃搅拌10分钟，加入硼酸三异丙酯(11mmol)，将该反应混合物在-78℃搅拌30分钟。让该反应混合物达到室温，再搅拌30分钟，然后用水(20mL)中止反应。分离出水层，用乙醚(25mL)洗涤，用浓盐酸酸化至pH1。过滤出所得固体，用水洗涤，干燥，获得了所需的硼酸化合物。
6-{[(3-羟基-5-{(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸甲酯 向6-[({3-{[1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5-[(苯基甲基)氧基]苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯(0.038mol)在THF(85mL)内的搅拌着的溶液中加入甲醇(85mL)。在氩气氛下加入披钯碳催化剂(1.7g 10％w/w)，将所得悬浮液在室温于氢气氛下搅拌过夜。经由硅藻土过滤出催化剂，用THF洗涤，将所得滤液蒸发，获得了浅棕色固体。用乙醚研制，获得了所需的化合物(产率为72％)。
m/z 361(M+H)+，359(M-H)-；1H NMRδ(d6-DMSO)1.25(d，3H)，3.3(s，3H)，3.45(m，2H)，3.85(s，3H)，4.65(m，1H)，6.55(m，1H)，6.95(m，1H)，7.1(m，1H)，8.3(m，2H)，8.9(m，1H)，11.0，(s，1H)。
6-[({3-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5-[(苯基甲基)氧基]苯基}羰基)氨基]吡啶-3-甲酸甲酯 在氩气氛下向3-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸(75.9mmol)在含有DMF(1mL)的DCM(250mL)内的搅拌着的溶液中滴加草酰氯(151.7mmol)，将所得溶液搅拌4小时。然后将该溶液真空蒸发，再与DCM(3×100mL)共沸，将残余物在高度真空下干燥，获得了酰氯，其不用定性而直接使用。
将上面获得的酰氯(约75.9mmol)溶解在THF(100mL)中，在氩气氛下加到6-氨基烟酸甲酯(91.1mmol)在THF(100mL)与吡啶(100mL)的混合物内的搅拌着的溶液中。将该反应混合物搅拌过夜，然后真空除去大部分溶剂。将残余物置于乙酸乙酯(250mL)中，把悬浮液依次用1M柠檬酸(2部分，直至洗涤液呈酸性)和盐水洗涤；将所得溶液干燥(MgSO4)，蒸发，获得了粗产物，为棕色树胶状物。将其通过色谱法纯化(400g Biotage硅胶筒，用含有乙酸乙酯的己烷，20％v/v洗脱)，获得了所需的化合物(产率为50％)。
m/z 451.47(M+H)+，449.48(M-H)-；1H NMRδ(d6-DMSO)1.21(d，3H)，3.47(m，2H)，3.86(s，3H)，3.72(m，1H)，5.16(s，2H)，6.78(t，1H)，7.23(s，1H)，7.29(s，1H)，7.31-7.49(m，5H)，8.32(s，2H)，8.90(app t，1H)，11.15(s，1H)。
3-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸
将3-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯(77.4mmol)在THF(232mL)与甲醇(232mL)的混合物内的溶液用氢氧化钠溶液(2N)(232mmol)处理，将该反应混合物在室温搅拌4小时。将所得溶液用水(250mL)洗脱，真空除去大部分溶剂。将所得悬浮液用乙醚(3×200mL)洗涤，弃去洗涤液。将所得水溶液用盐酸(2M)酸化至pH 4，用乙酸乙酯(2×200mL)萃取；将萃取液合并，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发，获得了所需的化合物(产率为99％)。
1H NMRδ(d6-DMSO)1.20(d，3H)，3.46(m，2H)，4.64(m，1H)，5.15(s，2H)，6.83(app t，1H)，7.06(s，1H)，7.13(s，1H)，7.30-7.49(m，5H)，12.67(brs，1H)。
3-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯 向3-羟基-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯(77.4mmol)在THF内的溶液中加入聚合物负载的三苯基膦(51.7g 3mmol/g负载量，155mmol)和(R)-(-)-1-甲氧基-2-丙醇(102mmol)。将该搅拌着的溶液用氩气覆盖，在冰浴中冷却；通过注射器用10分钟滴加偶氮二甲酸二异丙酯(116mmol)。加入完成后，将该溶液搅拌20分钟，然后过滤，将残余物用THF(500mL)洗涤；将滤液和洗涤液合并，蒸发，获得了粗的所需的化合物，其不用进一步纯化直接用于下一步骤。
1H NMRδ(d6-DMSO)3.26(s，3H)，3.44(m，2H)，3.82(s，3H)，4.63(m，1H)，5.14(s，2H)，6.85(s，1H)，7.05(s，1H)，7.11(s，1H)，7.30-7.47(m，5H)；光谱还含有与少量二(1-甲基乙基)肼-1，2-二甲酸酯相一致的信号。
3-羟基-5-[(苯基甲基)氧基]苯甲酸甲酯 向3，5-二羟基苯甲酸甲酯(5.95mol)在DMF(6L)内的搅拌着的溶液中加入碳酸钾(9mol)，将该悬浮液在室温于氩气下搅拌。用1小时向该悬浮液中缓慢地加入苄基溴(8.42mol)，发生轻微的放热，将该反应混合物在室温搅拌过夜。将其小心地用氯化铵溶液(5L)处理，然后用水(35L)处理。将该水悬浮液用DCM(1×3L和2×5L)萃取。将合并的萃取液用水(10L)洗涤，干燥(MgSO4)过夜。将该溶液真空蒸发，把粗产物分三批进行色谱纯化(快速柱，3×2kg硅胶，用含有10％DCM的己烷，至纯DCM，至含有50％乙酸乙酯的DCM进行梯度洗脱)以除去原料；然后将所得粗的洗脱液以175g批量进行色谱纯化(Amicon HPLC，5kg正相硅胶，用含有20％v/v乙酸乙酯的异己烷进行洗脱)，获得了所需的化合物(产率为21％)。
1H NMRδ(d6-DMSO)3.8(s，3H)，5.1(s，2H)，6.65(m，1H)，7.0(m，1H)，7.05(m，1H)，7.3-7.5(m，5H)，9.85(brs，1H)。
生物学试验本发明的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物的生物作用可以在下列试验中测试(1)GLK的酶活性可以通过培养GLK、ATP和葡萄糖来测定。产物生成的速率可以通过将该试验与G-6-P脱氢酶、NADP/NADPH体系偶联并测定340nm下光密度的增加来测定(Matschinsky等人1993)。化合物对GLK的激活可以使用该试验，在或不在GLKRP(GLK调控蛋白)存在下来评估，如Brocklehurst等人所述(Diabetes 2004，53，535-541)。
(2)GLK/GLKRP结合试验用于测定GLK和GLKRP之间的结合作用。该方法可以用来鉴定通过调节GLK和GLKRP之间的相互作用来调节GLK的化合物。将GLKRP和GLK与抑制浓度的F-6-P、任选在试验化合物存在的条件下培养，并且测定GLK和GLKRP之间的相互作用。置换F-6-P或以某些其他方式减弱GLK/GLKRP之间相互作用的化合物将通过GLK/GLKRP复合物生成量的减少来检测。促进F-6-P结合或以某些其他方式提高GLK/GLKRP相互作用的化合物将通过GLK/GLKRP复合物生成量的增加来测定。此类结合试验的具体实例描述如下。
GLK/GLKRP闪烁计数近接试验如WO01/20327所述(其内容引入本文以供参考)，重组人GLK和GLKRP用来显色(develop)″混合和测定″96孔SPA(闪烁计数近接试验(scintillation proximity assay))。GLK(生物素化的)和GLKRP与链霉抗生物素蛋白连接的SPA珠(Amersham)在抑制浓度的放射性标记的[3H]F-6-P(Amersham Custom Synthesis TRQ8689)的存在下培养，得到信号。置换F-6-P或以某些其他方式打破GLK/GLKRP结合相互作用的化合物使该信号消失。
结合试验在室温下进行2小时。含有50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、2mM ATP、5mM MgCl2、0.5mM DTT、重组生物素化的GLK(0.1mg)、重组GLKRP(0.1mg)、0.05m Ci[3H]F-6-P(Amersham)的反应混合物给出100ml的终体积。随后培养，通过加入0.1mg/孔链霉抗生物素蛋白结合的SPA珠(Amersham)并在Packard TopCount NXT上闪烁计数来测定GLK/GLKRP复合物形成的程度。
(3)F-6-P/GLKRP结合试验用于测定GLKRP和F-6-P之间的相互作用。这种方法可以用来提供有关所述化合物的作用机理的信息。在GLK/GLKRP结合试验中鉴定的化合物可以通过置换F-6-P或通过以某些其他方式改变GLK/GLKRP相互作用来调节GLK和GLKRP的相互作用。例如，蛋白-蛋白的相互作用一般被认为是通过多个结合位点间的相互作用而发生。所以可能是改变GLK和GLKRP间相互作用的化合物可通过结合一个或多个若干不同结合位点发挥作用。
F-6-P/GLKRP结合试验鉴定出只有那些通过从GLKRP上其结合位点置换F-6-P来调节GLK和GLKRP间相互作用的化合物。
GLKRP与试验化合物和抑制浓度的F-6-P、在GLK不存在的条件下培养，并且测定F-6-P和GLKRP之间相互作用的程度。置换F-6-P结合GLKRP的化合物可以通过GLKRP/F-6-P复合物生成量的改变来测定。该结合试验的具体实例如下所述。F-6-P/GLKRP闪烁计数近接试验如WO01/20327所述(其内容引入本文以供参考)，重组人GLKRP用来显色″混合和测定″96孔闪烁计数近接试验。FLAG-标记的GLKRP与蛋白A涂层的SPA珠(Amersham)和抗FLAG抗体在抑制浓度的放射性标记的[3H]F-6-P的存在下培养。产生信号。置换F-6-P的化合物将使这个信号消失。本试验和所述GLK/GLKRP结合试验的联用将使观察者能够鉴定出通过置换F-6-P打破GLK/GLKRP结合作用的化合物。
结合试验是在室温下进行2小时。含有50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、2mM ATP、5mM MgCl2、0.5mM DTT、重组FLAG标记的GLKRP(0.1mg)，抗Flag M2抗体(0.2mg)(IBI Kodak)、0.05mCi[3H]F-6-P(Amersham)的反应混合物得到100ml的终体积。培养后，通过加入0.1mg/孔链霉抗生物素蛋白结合的SPA珠(Amersham)并在PackardTopCount NXT上闪烁计数来测定F-6-P/GLKRP复合物形成的程度。
重组GLK和GLKRP的制备mRNA的制备人肝脏全mRNA是通过在4M异硫氰酸胍、2.5mM柠檬酸盐、0.5％Sarkosyl、100mM β-巯基乙醇中polytron均化、随后经5.7MCsCl、25mM乙酸钠在135,000g(最大)离心、按照Sambrook J，FritschEF & Maniatis T，1989所述来制备。
Poly A+mRNA直接利用FastTrack″M mRNA分离试剂盒(Invitrogen)来制备。
GLK和GLKRP cDNA序列的PCR扩增人GLK和GLKRP cDNA通过PCR、由人肝脏mRNA、利用Sambrook，Fritsch & Maniatis，1989中所述的建立的技术来获得。按照Tanizawa等1991和Bonthron，D.T.等1994(后者在Warner，J.P.1995修正)中所述的GLK和GLKRP cDNA序列设计PCR引物。
在Bluescript II运载体中克隆使用pBluescript II(Short等人1998)将GLK和GLKRP cDNA克隆在大肠杆菌中，pBluescript II是类似于Yanisch-Perron C等(1985)所用的重组克隆载体体系，包含带有含多个独特限制位点的多连接体DNA片段的colEI-基复制子，侧面具有噬菌体T3和T7启动子序列；复制的丝状噬菌体源和氨苄青霉素耐药性标记基因。
转化大肠杆菌转化一般通过电穿孔来进行。菌株DH5a或BL21(DE3)的400ml培养物在L-肉汤中生长至OD 600为0.5且通过在2,000g下离心来收获。细胞用冰冷的去离子水洗涤2次，再次悬浮在1ml 10％甘油中并以等份试样保存在-70℃。连接混合物用Millipore V seriesTM膜(0.0025mm)孔径)脱盐。40ml的细胞与1ml的连接混合物或质粒DNA在冰上在0.2cm电穿孔比色杯中培养10分钟，并且随后利用GenePulserTM仪(BioRad)在0.5kVcm-1，250mF下加脉冲。在补充有10mg/ml四环素或100mg/ml氨苄青霉素的L-琼脂上选择转化体。
表达GLK由载体pTB375NBSE在大肠杆菌BL21细胞中表达，产生重组蛋白，该重组蛋白含有与N-末端蛋氨酸紧邻的6-His标记。或者，另一种适当的载体是pET21(+)DNA，Novagen，登记号697703。该6-His标记用于重组蛋白在填充有购自Qiagen(cat no 30250)的镍-次氮基三乙酸琼脂糖的柱上纯化。
GLKRP由载体pFLAG CTC(IBI Kodak)在大肠杆菌BL21细胞中表达，生成重组蛋白，该重组蛋白含有C-末端FLAG标记。该蛋白首先通过DEAE琼脂糖离子交换纯化，随后利用FLAG标记在购自Sigma-Aldrich(cat no.A1205)的M2抗-FLAG免疫亲和性柱上进行最后纯化。
GLK的生物素化GLK通过与购自Sigma-Aldrich(登记号B2643)的生物素酰氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素-NHS)反应来生物素化。简单来说，靶向蛋白(GLK)的游离氨基与生物素-NHS以指定摩尔比反应形成稳定的酰胺键，得到含有共价结合的生物素的产物。通过透析除去产物中的过量、未偶联的生物素-NHS。具体而言，将7.5mg的GLK加入到存在于4mL 25mM HEPES pH＝7.3，0.15M KCl，1mM二硫苏糖醇，1mMEDTA，1mM MgCl2(缓冲液A)中的0.31mg生物素-NHS。将该反应混合物相对于100mL的含有22mg生物素-NHS的缓冲液A透析。4小时后通过对缓冲液A的充分透析除去过量的生物素-NHS。
对大鼠口服给药后测定血浆水平和血浆蛋白结合化合物对大鼠给药以及取血样将行星式研磨的化合物[15分钟s，500rpm，5Zirconium Balls，在Puluerisette 7 Mill(Glen Creston Ltd，Stanmore，Middlesex，UK)中]悬浮在0.5％HPMC Tween中，以5ml/kg的速度和0.3-10mg/kg的剂量通过口服管饲法对高脂肪饮食(Research Diets，D12451，随意进食14天)雌性Alderley Park Zucker或Alderley Park Wistar大鼠进行给药。
如下所述通过意识清醒状态下的取血样或最终的取血样来获得血样意识清醒状态下的取血样(用于化合物水平或血液化学)-静脉内血样是使用600μl Starstedt Multivette(EDTA)和22G针头在所需时间点从尾巴抽取的。在取血样后的15-30分钟内，将血样在冰上保持，并且以3000rpm离心10分钟。抽吸出血浆，在-20℃贮存。
用于化合物水平或血液化学的最终的取血样-在试验结束时，通过暴露于而CO2/O2将动物安乐死。通过心脏穿刺来提取血样。在取血样后的15-30分钟内，将血样在冰上保持，并且以3000rpm离心10分钟。抽吸出血浆，在-20℃贮存。
测定大鼠血浆中的化合物水平将25μl大鼠血浆加到96孔蛋白沉淀板(Varian inc.Palo Alto，California，USA)的孔中。向每个孔中加到含有1ug/ml作为内标物的(3-异丙氧基-5-苄基氧基-苯甲酰基)氨基吡啶-3-甲酸的500μl乙腈中以沉淀出血浆蛋白。然后将血浆/溶剂混合物在真空下从沉淀板中洗脱出来，收集洗脱液。使用离心蒸发器将洗脱液蒸发至干，在200μl甲醇∶水∶甲酸(60∶40∶0.1)中重新构成。
然后高效液相色谱法分析重新构成的样本，该色谱具有串连的质谱检测(HPLC-MS-MS)″。该HPLC使用Phenomenex Prodigy C8，50×4.6，5μm.柱(Phenomenex，Macclesfield，UK)以1ml/分钟的流速，使用10μl的注射体积以及下列梯度洗脱来进行
流动相A0.1％甲酸水溶液流动相B0.1％甲酸在甲醇中的溶液流动相梯度 0分钟50％A0.5分钟5％A2.5分钟5％A2.6分钟50％A3.0分钟50％A.
质谱是用Applied Biosystems API3000质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，California，USA)进行的。在运转样本之前，将质谱仪进行关于试验化合物结构的优化。
试验样本的浓度是由试验样本的峰高度与内标物的峰高度的比例确定的。从关于浓度比例的标准曲线计算试验样本的浓度，所述标准曲线是用如上所述进行处理的加到大鼠血清样本中的已知浓度的试验样本，使用(3-异丙氧基-5-苄基氧基-苯甲酰基)氨基吡啶-3-甲酸作为内标物而制得的。
测定化合物与血浆蛋白的结合化合物与血浆蛋白的结合是用平衡透析技术(W.Lindner等人，J.Chromatography，1996，677，1-28)测定的。在37℃，使用血浆和等渗磷酸盐缓冲液pH7.4(在每个透析室中分别为1ml)将化合物以20μM的浓度透析18小时。使用Spectrum20-室平衡透析仪以及Teflon半微透析室和Spectra/Por2膜盘，其分子量截止为12-14000道尔顿，47mm(由PerBio Science UK Ltd，Tattenhall，Cheshire提供)。透析之后，取出血浆和缓冲液样本，使用HPLCUV/MS(具有UV和质谱检测的高效液相色谱)进行分析，获得了在血浆中的％游离水平。
评估血浆半衰期血浆半衰期是指化合物在血浆中的浓度降至其初始值的一半时的时间。这一般是通过如下方法测定的静脉内施用试验化合物，然后如上所述测定血浆样本中的化合物浓度。从半对数图中估测血浆半衰期，所述图是用血浆浓度的log值(lnCp)对着取样时间(t，直线)而绘制的。表观一级消除速度常数k等于直线的斜率，消除半衰期(t1/2)是速度常数的倒数(Gibaldi，M和Perrier，D，1975Pharmacokinetics，MarcelDekker，New York)
t1/2=1k]]>本发明化合物具有下列特征(i)对于葡糖激酶的激活活性，其EC50小于约00nM；(ii)在血浆中的百分比游离浓度为约0.04％-约1％；(iii)对于1mg化合物/kg大鼠体重的标准化剂量，峰值血液水平(包括结合和游离的)为约0.3μM-约10μM；和(iv)在血浆中的半衰期(t1/2)为至少约1小时。
例如，实施例1的化合物具有下列值
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权利要求
1.式(I)化合物或其盐、前药或溶剂化物 式(I)其中R1-X-选自甲基、甲氧基甲基和 R2选自氢、甲基、氯和氟；n是1或2。
2.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式(Ia)化合物 式(Ia)其中n和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
3.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式(Ib)化合物 式(Ib)其中n和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
4.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式(Ic)化合物 式(Ic)其中n和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
5.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式(Id)化合物 式(Id)其中n和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
6.权利要求1的化合物，其中所述化合物是式(Ie)化合物 式(Ie)其中n、X、R1和R2如上面式(I)化合物中所定义；或其盐、溶剂化物或前药。
7.选自下列的化合物6-{[(3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸和6-{[(3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基氧基)-5-{[(1S)-1-甲基-2-(甲基氧基)乙基]氧基}苯基)羰基]氨基}吡啶-3-甲酸或其盐、溶剂化物或前药。
8.药物组合物，所述组合物包含权利要求1-7任一项的式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药与可药用稀释剂或载体。
9.用作药物的权利要求1-7任一项的式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
10.用于制备用来治疗通过GLK介导的疾病，特别是2型糖尿病的药物的权利要求1-7任一项的式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
11.治疗GLK介导的疾病，尤其是糖尿病的方法，包括给需要这样的治疗的哺乳动物施用有效量的权利要求1-7任一项的式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
12.权利要求1-7任一项的式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药在制备用于糖尿病和肥胖的联合治疗或预防的药物中的应用。
13.权利要求1-7任一项的式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗或预防肥胖的药物中的应用。
14.用于肥胖和糖尿病的联合治疗的方法，包括给需要这样的治疗的哺乳动物施用有效量的权利要求1-7任一项的式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
15.用于治疗肥胖的方法，包括给需要这样的治疗的哺乳动物施用有效量的权利要求1-7任一项的式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
16.制备权利要求1的式(I)化合物或其盐、前药或溶剂化物的方法，所述方法包括(a)将式(IIIa)的酸或其活化衍生物与式(IIIb)化合物反应 式(IIIa) 式(IIIb)；其中P1是氢或保护基；或者(b)将式(IIIc)化合物脱保护， 式(IIIc)其中P2是保护基；或者(c)将式(IIId)化合物与式(IIIe)化合物反应， 式(IIId)式(IIIe)其中X1是离去基团，且X2是羟基，或者X1是羟基，且X2是离去基团，并且P1是氢或保护基；或者(d)将式(IIIf)化合物与式(IIIg)化合物反应 式(IIIf)式(IIIg)其中X3是离去基团或有机金属试剂，并且X4是羟基，或者X3是羟基，并且X4是离去基团或有机金属试剂，并且其中P1是氢或保护基；或者(e)将式(IIIh)化合物与式(IIIi)化合物反应， 式(IIIh)式(IIIi)；其中X5是离去基团，并且其中P1是氢或保护基；并且之后如果需要的话i)将一种式(I)化合物转化成另一种式(I)化合物；ii)除去任何保护基；iii)形成其盐、前药或溶剂化物。
全文摘要
本发明涉及式(I)化合物或其盐、前药或溶剂化物，其中R
文档编号A61K31/443GK1886401SQ200480035326
公开日2006年12月27日 申请日期2004年11月25日 优先权日2003年11月29日
发明者C·约翰斯通, D·麦克雷彻尔, K·G·派克 申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司