专利名称：治疗肿瘤的中药复方制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及中药复方制剂及其制备方法，特别涉及一种治疗肿瘤的中药复方制剂及其制备方法。
背景技术：
中医是我国的国粹，传统中医的理论、临床与现代研究均表明中医药治疗肿瘤是中医的一大特色，且具有显著的疗效。目前已有该领域相关的发明创造申请专利，如ZL 90106365.7、ZL 91110970.6、200410004442.X等。有关肿瘤发生的机理，多数医家从气阴虚损、热毒与瘀血入手，投以益气养阴、清热解毒与活血化瘀之品，如200410063012.5，200410027218.2，200310103214.3等专利申请。尽管现有制剂的选材组方各不相同，但运用治法基本一致，没有突破性的进展。大量研究表明不恰当的使用清热解毒非但可损伤机体的阳气，而且部分清热解毒药物还有明显的免疫抑制作用，有的活血化瘀药物还可能促使肿瘤的转移。同时现有的多数体外实验的复方制剂用药量过大，假阳性多，因此可靠性欠佳。
我们根据多年的临床实践发现很多晚期肿瘤患者具有畏寒乏力、舌淡苔白、脉沉迟无力等临床表现，进而根据《灵枢·百病始生》篇关于“积之始生，得寒乃成，厥乃成积”的论述提出阳虚寒凝是肿瘤发生的根本原因。阳虚寒凝是怎样导致肿瘤发生的呢？《灵枢·百病始生》篇明确指出“温气不行，凝血蕴里而不散，津液涩渗，著而不去，而积皆成矣”。可见肿瘤是在阳虚寒凝的基础上寒痰凝结而成的。
发明内容
本发明的目的旨在克服上述不足之处，特别针对现有中药复方制剂在治疗寒痰凝结的晚期肿瘤上的缺陷，根据多年的临床实践与民间秘方，反复临床验证拆方组方，提供一种有效治疗肿瘤的中药复方制剂及其制备方法，应用于肿瘤的的治疗。
为实现上述目的本发明的实施方式如下一种治疗肿瘤的中药复方制剂，其特征在于该制剂采用经常规炮制的生药，组方配比如下(重量％)附片1.2-30.5％；商陆1.0-30.3％；田七1.5-28.9％；土贝母1.9-28.3％；守宫3.6-33.1％。
一种实现权利要求1所述的治疗肿瘤的中药复方制剂的制备方法，包括备料、粉碎等常规基础步骤，其特征在于还包括依次进行的如下步骤醇提守宫在水浸提取前用甲醇抽提，将守宫粉以1-8倍甲醇30-80℃水浴浸提2-6小时、1-3小时各1次，提取液过滤，并挥发掉甲醇；水提将甲醇抽提后的守宫与附片、商陆、田七、土贝母混合，加1-8倍的水，在60-120℃条件下浸提1-3小时，并可多次水浸提，将所得水浸提液合并使用；除杂提取物可采用过滤、离心方法除杂；干燥将醇提物与水提物干燥，合并使用。
可将治疗肿瘤的中药复方制剂制成符合药剂学要求的口服剂型。
该治疗肿瘤的中药复方制剂及其制备方法与现有的药物相比，其科学价值和应用的意义在于1、对恶性肿瘤具有较高的疗效。例如原发性肝癌俗称“癌王”，为我国常见恶性肿瘤之一，我国每年约有11万人死于肝癌，占全球肝癌死亡数的45％。肝移植虽然对早期肝癌有较好的疗效，但高昂的手术及维持药费致使大多患者无法行肝移植术且全球供肝来源严重不足。大多数肝癌一经发现即属晚期，而中晚期患者无论是手术、放疗、化疗、介入治疗疗效均不理想。目前仅少数几种化疗药如阿霉素、顺铂、替加氟对肝癌有明确的疗效，但因其抑癌率较低而毒性反应较大，用于全身化疗多无确切疗效。相比之下该制剂对Bel-7402细胞的增殖具有很强的抑制作用。该制剂对Bel-7402细胞还有较强的细胞毒作用。该制剂也可显著抑制人白血病HL-60细胞的存活，
并对HL-60细胞有很强的细胞毒作用。
2、根据肿瘤寒痰凝结的病机，从温化寒痰立法，研制了该制剂，与目前常规的从气阴虚损、热毒与瘀血入手，投以益气养阴、清热解毒与活血化瘀药物的研究有很大的不同。有研究表明不恰当的使用清热解毒非但可损伤机体的阳气，而且部分清热解毒药物有明显的免疫抑制作用，活血化瘀药物尚可促进肿瘤的转移。
3、多数体外实验的复方制剂用药量过大，假阳性多，可靠性欠佳。而该制剂体外实验最低浓度仅75μg/ml，作为天然药复方提取物，其体外研究的用药量很小(通常单一天然药的粗提物体外研究可从250μg/ml起逐步稀释)，研究结果较为可靠。
4、现代医学认为肿瘤细胞是由机体正常细胞突变而来，其显著的生物学行为改变就在于肿瘤的恶性生长(包括肿瘤细胞的增殖旺盛与凋亡受阻)与分化低下。肿瘤本质上是一种遗传性细胞周期病，即细胞周期驱动机制与监测机制异常导致的细胞周期界面机制异常，如增殖旺盛、分化低下与凋亡受阻。目前尚缺少中药逆转肿瘤生长、分化、凋亡与细胞周期等肿瘤细胞生物学行为异常的系统研究。该制剂可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化与凋亡，逆转肿瘤细胞的生物学行为改变。该制剂还可调节肿瘤细胞周期，使G0期细胞显著减少，S期细胞增加。并可通过对肿瘤细胞的细胞毒作用直接杀伤肿瘤细胞。
图1为该制剂作用于Bel-7402细胞的生长曲线示意图；图2为该制剂作用于Bel-7402细胞的存活率曲线示意图；图3为未添加该制剂时肝癌Bel-7402细胞显微镜下检测图像；图4为该制剂作用于肝癌Bel-7402细胞的细胞毒显微镜下检测效果图像；图5为未添加该制剂时肝癌Bel-7402细胞凋亡的流式细胞仪检测图；图6为三氧化二砷对肝癌Bel-7402细胞凋亡的影响流式细胞仪检测图；图7为该制剂对肝癌Bel-7402细胞凋亡的影响流式细胞仪检测图；
图8为未添加该制剂时肝癌Bel-7402细胞周期的流式细胞仪检测图；图9为三氧化二砷对肝癌Bel-7402细胞周期的影响流式细胞仪检测图；图10为该制剂对肝癌Bel-7402细胞周期的影响流式细胞仪检测图；图11为未添加该制剂时肝癌Bel-7402细胞显微镜下检测图像；图12为ATRA诱导肝癌Bel-7402细胞分化显微镜下检测效果图像；图13为该制剂诱导肝癌Bel-7402细胞分化显微镜下检测效果图像；图14为该制剂作用于HL-60细胞的生长曲线示意图；图15为该制剂作用于HL-60细胞的存活率曲线示意图。
具体实施例方式
以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式
详述如下实施例1实施步骤是采用经常规炮制的生药，称取附片4％、商陆30.3％、田七16％、土贝母21.7％、守宫28％分别粉碎为粗末，过1号筛，将守宫粉以1-8倍甲醇30-80℃水浴浸提2-6小时、1-3小时各1次，可用4层纱布过滤，榨尽药汁，药汁挥去甲醇，干燥；将甲醇抽提后的守宫与附片、商陆、田七、土贝母混合，加1-8倍的水，在60-120℃条件下浸提1-3小时，并可多次水浸提，将所得水浸提液合并使用；水提液可过滤、滤液经1200-12000转/分钟离心5-30分钟，也可选择其它方法除杂，真空干燥，合并水提取物与甲醇提取物。
实施例2采用经常规炮制的生药，称取附片30.5％、商陆23％、田七9％、土贝母22％、守宫15.5％分别粉碎为粗末，过1号筛，将守宫粉以1-8倍甲醇30-80℃水浴浸提2-6小时、1-3小时各1次，可用多层纱布过滤，榨尽药汁，药汁挥去甲醇，干燥；将甲醇抽提后的守宫与附片、商陆、田七、土贝母混合，加1-8倍的水，在60-120℃条件下浸提1-3小时，并可多次水浸提，将所得水浸提液合并使用；水提液可过滤、滤液经1200-12000转/分钟离心5-30分钟，也可选择其它方法除杂，真空干燥，合并水提取物与甲醇提取物。
实施例3采用经常规炮制的生药，称取附片8％、商陆24.7％、田七10％、土贝母28.3％、守宫29％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
实施例4采用经常规炮制的生药，称取附片10％、商陆25％、田七15％、土贝母28％、守宫22％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
实施例5采用经常规炮制的生药，称取附片26％、商陆14％、田七28.9％、土贝母22％、守宫9.1％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
实施例6采用经常规炮制的生药，称取附片30.5％、商陆29.5％、田七1.5％、土贝母5.5％、守宫33％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
实施例7采用经常规炮制的生药，称取附片20％、商陆30％、田七15％、土贝母25％、守宫10％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
实施例8采用经常规炮制的生药，称取附片27.4％、商陆29％、田七23％、土贝母17％、守宫3.6％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
实施例9采用经常规炮制的生药，称取附片27％、商陆30％、田七15.1％、土贝母1.9％、守宫26％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
实施例10采用经常规炮制的生药，称取附片29％、商陆1.0％、田七28％、土贝母21％、守宫21％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
实施例11采用经常规炮制的生药，称取附片18％、商陆12％、田七9％、土贝母27.9％、守宫33.1％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
实施例12采用经常规炮制的生药，称取附片1.2％、商陆9.8％、田七28％、土贝母28％、守宫33％分别粉碎为粗末，按实施例1所述步骤将真空干燥后的水提取物与甲醇提取物合并。
应用该制剂制成符合药剂学要求的口服剂型应用实施例1制备口服液该制剂提取物，超滤除杂、除菌、除热原、无菌分装为10ml/支。
应用实施例2制备胶囊该制剂提取物，装入空心胶囊，每粒50mg，封口、除粉、装瓶。
应用实施例3制备片剂该制剂提取物，加糊精2份、淀粉2份、糖粉1份，氢氧化凝胶达总量的3％，压片为50mg/片，装瓶。
应用实施例4制备丸剂该制剂提取物，用蜜或水糊丸、干燥、装瓶。
实验效果举例1该制剂对人肝癌Bel-7402细胞增殖与细胞存活的影响。
1材料与方法材料Bel-7402细胞购自四川大学分子生物学开放实验室；RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司产品；该制剂用双蒸水溶解，超滤除杂，配制成150mg/ml的储备液，临用前以RPMI-1640培养液配制成所需浓度。
方法Bel-7402细胞在5％CO2孵箱中培养，培养基为含10％灭活小牛血清的RPMI-1640，含1％双抗(青霉素和链霉素)。每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.3×104/ml个细胞，接种后24小时加药培养，分设该制剂高剂量组(750μg/ml)、中剂量组(250μg/ml)、低剂量组(75μg/ml)与PBS阴性对照组。分别于加药后30分钟、1-6天分别收集细胞，台盼蓝染色，计数活细胞，分别计数活细胞与死细胞，作生长曲线，计算抑癌率与细胞存活率。统计方法采用多重比较，全部统计由统计软件包SPSS(version11.0，Chicago，USA)完成。
2结果该制剂高剂量组与中剂量组分别在加药后2天与4天Bel-7402细胞全部死亡，台盼蓝染色镜下无活细胞。低剂量组在加药后24小时就可显著抑制Bel-7402细胞的生长与存活，抑癌率最高达58.33％，表明该制剂对Bel-7402细胞的增殖与存活具有很强的抑制作用，参见图1、图2。
实验效果举例2该制剂对Bel-7402细胞的细胞毒作用。
1材料与方法材料Bel-7402细胞购自四川大学分子生物学开放实验室；RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司产品；该制剂用双蒸水溶解，超滤除杂，配制成150mg/ml的储备液，临用前以RPMI-1640培养液配制成所需浓度。
方法Bel-7402细胞在5％CO2孵箱中培养，培养基为含10％灭活小牛血清的RPMI-1640。每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。6孔板每孔接种0.5×104/ml个细胞，接种后24小时换液加药培养，分设该制剂高剂量组(250μg/ml)、低剂量组(75μg/ml)与生理盐水阴性对照组。于加药后4天，弃去培养液，PBS洗2次，镜下观察细胞形态。
2结果肝癌细胞对细胞毒药物有很强的耐受性，目前仅少数几种化疗药如阿霉素、顺铂、替加氟等对肝癌有一定疗效，但因其抑癌率较低而毒性反应很大，用于全身化疗多无确切疗效。该制剂作用后的Bel-7402细胞大量变圆，不贴壁。弃去培养液，PBS洗2次后镜下存活细胞变大，胞浆有较多空泡，提示该制剂对肝癌细胞有较强的细胞毒作用，参见图4并与图3未添加该制剂的对照组比较，效果显而易见。
实验效果举例3该制剂对Bel-7402细胞凋亡与细胞周期的影响。
1材料与方法材料Bel-7402细胞购自四川大学分子生物学开放实验室；RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司产品；三氧化二砷(AS2O3)购自Sigma公司、应用PBS配制成10mmol/L的储备液，于4℃保存；该制剂用双蒸水溶解，超滤除杂，配制成150mg/ml的储备液，临用前以RPMI-1640培养液配制成所需浓度。
方法Bel-7402细胞在5％CO2孵箱中培养，培养基为含10％灭活小牛血清的RPMI-1640。每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。6孔板每孔接种0.5×104/ml个细胞，接种后24小、时换液加药培养，分设该制剂高剂量组(250μg/ml)、低剂量组(75μg/ml)、生理盐水阴性对照组、AS2O3阳性对照组。于加药后4天收集细胞，流式细胞仪分析细胞凋亡与细胞周期。
2结果该制剂高、低剂量组均显著诱导Bel-7402细胞凋亡，高剂量组凋亡率为35.9％，优于AS2O3，低剂量组凋亡率为19.9％，AS2O3组凋亡率为22.5％，其对比效果参见图5-图7。研究结果表明该制剂能显著诱导人肝癌Bel-7402细胞的凋亡，细胞周期分析该制剂使G0/G1期细胞减少，S期细胞增加，细胞被阻滞于S期，其对比效果参见图8-图10。该制剂对肿瘤细胞周期的调节作用将影响肿瘤细胞的如下生物学行为①影响细胞DNA复制进而抑制细胞增殖。②肝癌细胞对细胞毒药物有很强的耐受性，目前仅少数几种化疗药对肝癌有一定疗效，但因其抑癌率较低而毒性反应很大，用于全身化疗多无确切疗效。每个疗程的细胞毒治疗可以杀死一定比例的分裂期细胞而不是恒定数量的细胞，G0期细胞对细胞毒药物不敏感。该制剂使G0/G1期细胞显著减少，S期细胞增加，从而增加了肿瘤细胞对其细胞毒作用的敏感性，提示该制剂提高肿瘤细胞对其自身的药物敏感性。该制剂使细胞周期同步化，因而与S期特异性的细胞毒药物联合应用可能会进一步提高肝癌的疗效。③AS2O3使细胞周期阻滞于G2/M期，阻止细胞分裂并诱导细胞凋亡。该制剂使细胞阻滞于S期并诱导细胞凋亡，显示了不同于AS2O3的作用机理。④ATRA使G1增加，G2减少，阻止细胞进入S期进而诱导细胞分化。该制剂使G0/G1期细胞减少，S期细胞增加，并诱导细胞分化，显示了不同于ATRA的作用机理。
实验效果举例4该制剂对Bel-7402细胞的诱导分化作用。
1材料与方法材料Bel-7402细胞购自四川大学分子生物学开放实验室；RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司产品；全反式维甲酸(ATRA)购自Sigma公司、应用PBS配制成10mmol/L的储备液，于4℃保存；该制剂用双蒸水溶解，超滤除杂，配制成150mg/ml的储备液，临用前以RPMI-1640培养液配制成所需浓度。
方法将肝癌细胞株Bel-7402培养于含10％新生小牛血清的RPMI-I640培养基，1×105/ml接种于20ml培养瓶中，于37℃、体积为5％CO2、饱和湿度的恒温孵箱中培养。接种24小时后换液，分别用含该制剂250μg/ml、75μg/ml、ATRA 3μg/ml与等体积NS的PRMI1640培养基培养4天。观察细胞形态，检测甲胎球蛋白(AFP)与白蛋白(ALB)。
2结果ATRA可诱导Bel-7402细胞分化为多边形细胞，而该制剂作用后的7402细胞形态明显改变，呈纺锤状，并可见细胞周围有大量分泌物存在。
该制剂作用后的Bel-7402细胞ALP下降，ALB分泌上升，提示该制剂可诱导Bel-7402细胞往成熟的肝细胞方向分化，对比效果参见图11-图13。
实验效果举例5该制剂对人早幼粒白血病HL-60细胞增殖与存活的影响。
1材料与方法材料HL-60细胞购自四川大学分子生物学开放实验室；RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司产品；该制剂用双蒸水溶解，超滤除杂，配制成150mg/ml的储备液，临用前以RPMI-1640培养液配制成所需浓度。
方法HL-60细胞在5％CO2孵箱中培养，培养基为含1O％灭活小牛血清的RPMI-1640。每4-6天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.5×104/ml个细胞，接种后24小时加药培养，分设该制剂高剂量组(7.5mg/ml)、中剂量组(750μg/ml)、低剂量组(75μg/ml)与PBS阴性对照组。分别于加药后30分钟、1-6天分别收集细胞，台盼蓝染色，分别计数活细胞与死细胞，作生长曲线、抑癌率与细胞存活率计算。统计方法采用多重比较，全部统计由统计软件包SPSS完成。
2结果该制剂高剂量组在加药后半小时HL-60细胞已全部死亡，台盼蓝染色镜下无活细胞。中剂量与低剂量组在加药后24小时就可显著抑制HL-60细胞的生长与存活，抑癌率最高达70.8％，表明该制剂对HL-60细胞的增殖与存活具有很强的抑制作用，参见图14、图15。
综上所述，本发明根据“寒痰凝结”是肿瘤产生的根源这一理论与实践的探索，研制出有效治疗肿瘤的中药复方制剂，给广大肿瘤患者战胜病魔带来福音。
权利要求
1.一种治疗肿瘤的中药复方制剂，其特征在于该制剂采用经常规炮制的生药，组方配比如下(重量％)附片1.2-30.5％；商陆1.0-30.3％；田七1.5-28.9％；土贝母 1.9-28.3％；守宫3.6-33.1％。
2.一种实现权利要求1所述的治疗肿瘤的中药复方制剂的制备方法，包括备料、粉碎等常规基础步骤，其特征在于还包括依次进行的如下步骤醇提守宫在水浸提取前用甲醇抽提，将守宫粉以1-8倍甲醇30-80℃水浴浸提2-6小时、1-3小时各1次，提取液过滤，并挥发掉甲醇；水提将甲醇抽提后的守宫与附片、商陆、田七、土贝母混合，加1-8倍的水，在60-120℃条件下浸提1-3小时，并可多次水浸提，将所得水浸提液合并使用；除杂提取物可采用过滤、离心方法除杂；干燥将醇提物与水提物干燥，合并使用。
3.根据权利要求2所述的治疗肿瘤的中药复方制剂的制备方法，其特征在于将其制成符合药剂学要求的口服剂型。
全文摘要
本发明涉及一种治疗肿瘤的中药复方制剂及其制备方法。该制剂组方配比如下(重量％)附片1.2－30.5％、商陆1.0－30.3％、田七1.5－28.9％、土贝母1.9－28.3％、守宫3.6－33.1％。将上述组分按比例配制，经粉碎，守宫先用甲醇提取，挥去甲醇，药渣与其它组分用水浸、煎煮、过滤、离心、干燥，制成胶囊、口服液、片剂等剂型。该复方制剂可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化与凋亡，逆转肿瘤细胞的生物学行为改变；同时调节肿瘤细胞周期，使G
文档编号A61P35/00GK1733196SQ20051001477
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月19日 优先权日2005年8月19日
发明者吴雄志, 陈丹 申请人:吴雄志