禽传染性支气管炎三基因组合dna疫苗及应用的制作方法

专利名称：禽传染性支气管炎三基因组合dna疫苗及应用的制作方法
专利说明禽传染性支气管炎三基因组合DNA疫苗及应用 本发明涉及动物医药生物工程领域，是一种禽传染性支气管炎三基因组合DNA疫苗及应用。禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是冠状病毒科冠状病毒属的禽传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性、高度接触性的传染病，其特征为病鸡出现呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等。禽传染性支气管炎病毒可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低；还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆菌病等继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡生产带来巨大损失。目前，该病呈世界广泛流行，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。
禽传染性支气管炎病毒是冠状病毒科冠状病毒属的代表种，其抗原性异常复杂，目前世界上分离的临床毒株已超过100多株，分属30种以上血清型。禽传染性支气管炎病毒属于单股正链的RNA病毒，基因组全长27.6kb，主要编码三种结构蛋白纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核蛋白(N)。许多研究表明，S蛋白裂解为S1和S2两个亚单位，其中S1蛋白可诱导产生中和抗体和血凝抑制抗体，为IBV的主要免疫原。N蛋白携带着T细胞表位，在免疫和保护上可能发挥作用。M蛋白的免疫原性较低，也有报道M蛋白上可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇，能诱导细胞介导的免疫反应(参见殷震，刘景华等。动物病毒学(第二版)。北京科学出版社，1997)。
禽传染性支气管炎病毒不同毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，不同血清型毒株之间交叉保护力弱。在防制上，常规单一毒株疫苗常有免疫失败的报道，多价疫苗可较好解决防治问题。灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应。其不足之处是使用剂量大，需要配合佐剂，制备比较复杂，因而成本较高。加之灭活疫苗不能诱发机体产生细胞免疫，而一系列的研究证实在IBV的免疫保护中，体液免疫和细胞免疫占有重要地位(参见王红宁主编。禽呼吸系统疾病。北京农业科技出版社，2002；B W卡尔尼克主编。禽病学(第九版)。北京北京农业大学出版社，1991，407-418；Kusters J G，Niesters，H G M，et al.Virology，1989，169217-221；AvellanedaG E，Villeges P，Jackwood M W，et al.Avian Dis，1994，38589-597)。随着禽传染性支气管炎病毒流行病学调查、分子生物学研究、免疫机制等研究的逐步深入，构建该病毒的主要结构蛋白基因的真核表达载体，研制DNA疫苗用于该病预防具有重要意义。
近年来许多研究者试图研究禽传染性支气管炎病毒的DNA疫苗，并取得了一定的进展。步志高等(参见步志高，江国托等。中国兽医学报，1998，18(6)527-530)以国内类M41地方流行株IBV纤突糖蛋白S1基因为免疫原基因，构建了DNA免疫表达质粒，并对其免疫原性进行了初步分析。结果表明该表达质粒可同时诱导机体形成针对IBV的细胞免疫和体液免疫反应。陈洪岩等(参见陈洪岩，江国托，杨奇伟等。中国预防兽医学报，1999，21(4)250-253)将鸡传染性支气管炎病毒肾型T株S1基因cDNA连接于pcDNA3构建了真核表达质粒，经肌肉注射免疫SPF鸡后血清IgG抗体逐渐升高，至35日龄左右达到高峰，但血清IgG抗体升高幅度不及IB油苗。免疫攻毒后有40％的鸡可耐过强毒的攻击。刘思国等(参见刘思国，康丽鹃，江国托等。中国兽医学报，2001，21(1)14-16)将鸡传染性支气管炎HB株的N基因亚克隆到pcDNA3，构建了真核表达质粒pcDNA-N。用该质粒两次免疫SPF雏鸡一周后进行攻毒试验，结果保护率为40％，表明N蛋白介导的细胞免疫在抗感染中发挥了作用。
王红宁等(参见Wang H N，Wu Q Z，Huang Y，et al.Avian Disease，1997，41(2)279-282)完成了我国主要养鸡地区禽传染性支气管炎冠状病毒流行病学调查，探明了禽传染性支气管炎冠状病毒主要流行株类型及其分布分离，并用RT-PCR对多株国内分离株的S1、M、N基因进行扩增、克隆和序列测定分析，在国际基因库Genbank中注册禽传染性支气管炎病毒中国株的3个S1基因序列(AY397527～AY397529)、8个M基因序列(AY302742～AY302749)和3个N基因序列(AY167729～AY167731)。本发明的目的是将由本实验室构建并保存的禽传染性支气管炎病毒中国分离株的S1、M、N结构基因的真核表达质粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照一定的比例进行组合，研制成禽传染性支气管炎三基因组合的DNA疫苗。
本发明进行了禽传染性支气管炎三基因组合的DNA疫苗的大规模生产工艺研究，对生产真核表达质粒的培养基和培养条件进行了筛选，确定出含有质粒IBS1、pIBM和pIBN的工程菌的最优化培养基和培养条件。
本发明对禽传染性支气管炎三基因组合的DNA疫苗的免疫原性进行了研究，结果表明三基因组合的DNA疫苗的免疫保护率达到90％。
本发明的优点和积极效果在于将禽传染性支气管炎病毒中国分离株的S1、M、N结构基因的真核表达质粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照一定的比例进行组合，使DNA疫苗的免疫保护率达到90％。1.本发明所使用的真核表达质粒pIBS1、pIBM和pIBN由本实验室构建并提供；宿主大肠杆菌JM109由本实验室保存；禽传染性支气管炎病毒攻毒用毒株SAIBk株由实验室鉴定并保存。
2.本发明种子培养基选用LB培养基，主要成分胰蛋白胨10g/L，母提取物5g/L，NaCl 10g/L，5mol/L NaOH调pH值至7.0。基础培养基M96g/L Na2HPO4，g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，2g/L NH4Cl，0g/L酵母提取物，2g/L葡萄糖。以上均以115℃高压蒸汽灭菌20min。
3.对培养基和培养条件进行了优化从LB固体培养基中挑取单菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养。在100ml的三角瓶中加入10ml的发酵培养基，接入500μl的菌种，37℃，200rpm/min，培养20h。
菌量的测定菌体浓度测定采用比色法，将培养液稀释到一定程度，在752型分光光度计于波长600nm处测定光吸收值，光程为1cm。
质粒的制备和纯化质粒制备和纯化(参见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著。分子克隆实验指南(第三版)。科学出版社，2000)，并加以优化。
质粒稳定性测定取一接种环菌液接入3ml LB培养基，搅匀后取1ml稀释3倍，根据菌液浓度取20-40μl涂板，37℃培养过夜，检查长出的菌落个数。为验证质粒的存在与大小，再从平板上刮取适量菌落对其进行质粒的快速抽提、电泳，并对其进行酶切以检验结构稳定性。
质粒浓度分析取1.5ml菌液，离心后以优化的碱裂解法提质粒，采用比色法，将质粒稀释到一定程度，在752型分光光度计于波长260nm处测定光吸收值，光程为1cm，即为质粒DNA含量，D260为10时质粒DNA含量为50μg/ml。
研究结果表明，培养基的碳源、氮源和它们不同的组合及接种量、装液量、培养温度对质粒的产量有很大的影响。通过单因子分析和正交实验，确定出含有质粒pcDNA-S1、pcDNA-M、pcDNA-N的工程菌的最优化培养基组成为5g/L葡萄糖，6ml/L甘油，12g/L胰蛋白胨，15g/L酵母提取物，3.0g/L氯化氨，6g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl。而适合工程菌生长的最佳条件是接种量2％，装液量10ml/100ml，培养温度37℃。
4.真核表达质粒的大量提取及纯化采用优化的培养基和培养条件，对真核表达质粒pIBS1、pIBM和pIBN进行了大量提取及纯化。质粒的提取及纯化方法(参见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著.分子克隆实验指南(第三版).科学出版社，2000)。
将纯化后的质粒用PBS稀释，在紫外分光光度计测定OD260和OD280，并计算质粒DNA的浓度，最后将纯化的质粒按1μg/μl溶于PBS溶液中备用。将pIBS1、pIBM和pIBN按照1∶1∶1的比例混合，研制成禽传染性支气管炎S1、M、N三基因组合的DNA疫苗。
5.免疫保护实验对试验雏鸡进行随机分组，7日龄时腿部肌肉分点注射研制成禽传染性支气管炎S1、M、N三基因组合的DNA疫苗(质粒含量200μg)。并设立空白对照组，肌注生理盐水0.5ml/只。免疫后第4周用强毒株SAIBk株对试验鸡进行攻毒，观察统计发病及死亡鸡只，同时做病理剖检观察，直至攻毒后4周。结果表明三基因组合的DNA疫苗的免疫保护率达到90％。
权利要求
1.禽传染性支气管炎三基因组合DNA疫苗及应用，其特征在于将禽传染性支气管炎病毒中国分离株的S1、M、N结构基因的真核表达质粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照一定的比例进行组合，研制成禽传染性支气管炎三基因组合的DNA疫苗，并对其免疫原性和生产真核表达质粒的培养基和培养条件进行了筛选。
2.权利要求1禽传染性支气管炎三基因组合DNA疫苗，其特征在于将S1、M、N结构基因的真核表达质粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照1∶1∶1的比例，研制成禽传染性支气管炎三基因组合的DNA疫苗，其免疫保护率达到90％，可用于禽传染性支气管炎的预防。
3.权利要求1生产真核表达质粒的工程菌的培养基和培养条件，其特征在于工程菌的最优化培养基组成为5g/L葡萄糖，6ml/L甘油，12g/L胰蛋白胨，15g/L酵母提取物，3.0g/L氯化氨，6g/L Na2HPO4，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl。而适合工程菌生长的最佳条件是接种量2％，装液量10ml/100ml，培养温度37℃。
全文摘要
本发明涉及动物医药生物工程研究领域，是一种禽传染性支气管炎三基因组合DNA疫苗及应用。本发明的目的是将构建并保存的禽传染性支气管炎病毒中国分离株的S1、M、N结构基因的真核表达质粒pIBS1、pIBM和pIBN，按照一定的比例进行组合，研制成禽传染性支气管炎三基因组合的DNA疫苗，并对其免疫原性进行了研究。本发明进行了真核表达质粒生产的培养基和培养条件筛选，确定出含有质粒IBS1、pIBM和pIBN的工程菌的最优化培养基和培养条件。
文档编号A61P31/00GK1903372SQ20051002135
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月29日 优先权日2005年7月29日
发明者王红宁, 周生, 唐梦君, 黄勇, 吴琦, 陈惠 , 柳萍, 胡慧琼, 李晓英, 陈萍, 余祖华, 汪洋, 白天, 潘胜 申请人:四川农业大学, 王红宁, 周生