专利名称：一种用于防治创面感染的溶葡萄球菌酶冻干粉剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及冻干生物制剂，具体涉及溶葡萄球菌酶冻干粉剂。
背景技术：
早在20世纪30年代抗生素被广泛地使用之前，金黄色葡萄球菌感染了多数接触到它的人们。1929年发现了青霉素用于对付金黄色葡萄球菌感染，在50年代后期产生了耐药性菌株；1956年发明了对耐青霉素葡萄球菌具有良好效果的万古霉素，其后，由于毒性较大，应用受到了限制；到60年代毒性较小的甲氧西林和先锋霉素抗生素相继上市，然而1961年就在欧洲发现了第一例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株。
近年来MRSA感染率比过去有明显增高。美国1986年为2.4％，1991年升至29％，近年来又有上升趋势；欧洲和日本医院感染中MRSA占60％；国内报告均在40％以上，个别达到80％，烧伤住院患者的MRSA发生率已经超过90％。
金黄色葡萄球菌感染可造成多种感染疾病，主要有肺炎、支气管炎、尿路感染、褥疮感染、皮肤感染、心内膜炎、败血症及手术后感染等。金黄色葡萄球菌是导致烧伤感染主要的病原菌之一，在烧伤病区，金黄色葡萄球菌占全部病原菌的构成比例已经超过30％，上升至第一位。而在感染的金黄色葡萄球菌中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)占90％以上，大部分MRSA对除万古霉素以外的几乎所有抗生素都产生抗性，难于治疗，已经严重威胁着烧伤患者的生命。在长期医治烧伤病人的医疗单位，病人和医务人员的鼻孔或手上都携带有这种耐药菌。
一般烧伤患者都使用3-9种抗生素，最多用了12种之多，种类以第三代头孢类和喹诺酮类药物为主。由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的感染增多，使得万古霉素的应用又日渐增多，九十年代以来一直被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。但近年来已有在万古霉素选择性压力下MRSA对万古霉素敏感性降低的报道。而且万古霉素有很强的毒副作用，对病人肝肾毒性大，另外，万古霉素不能外用。目前烧伤、烫伤、创伤创面常用SD-Ag、磺胺米隆和洗必泰，这些药物对破损皮肤刺激性强，对MRSA基本无作用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一提供一种治疗创面感染的溶葡萄球菌酶冻干粉剂，以克服现有技术的不足。
本发明需要解决的另一个技术问题是提供该冻干粉剂的制备方法，以克服本发明的发明构思如下溶葡萄球菌酶是一种革兰氏阳性菌的溶菌素。组成该类革兰氏阳性菌(例如金黄色葡萄球菌)细胞壁肽聚糖的四肽侧链的氨基酸，依次为L-丙氨酸，D-谷氨酸，L-赖氨酸，D-丙氨酸而首位的L-丙氨酸通过一个酰胺键与胞壁酸相连，该聚糖链四肽侧链第3位的L-赖氨酸，通过五肽(五个甘氨酸)交联桥联结到相邻聚糖链四肽侧链D-丙氨酸羧基上。由此纵横交叉，左右联结构成十分坚韧的三维立体多孔结构，并聚合成较厚的肽聚糖层。
溶葡萄球菌酶可切断肽聚糖中的GIy-GIy键，由于溶葡萄球菌酶独特的杀菌机理，使其不同于一般的抗生素。抗生素的作用一般是抑制细菌生长，促使细菌产生新的耐药质粒或新酶来阻止抗菌素的作用。而该酶则是迅速裂解细菌杀死细菌，作用时间短，细菌不容易产生耐药性，同时杀菌效果好，对耐甲氧苯青霉素(MRSA)的金黄色葡萄球菌同样有较强的杀菌能力。
因而将溶葡萄球菌酶开发成用于治疗临床上棘手的耐药性金黄色葡萄球菌感染，特别是大面积烧伤、创伤所引发的感染，是非常有价值的。
我们发现溶葡萄球菌酶在溶液状态时或者在有大量游离水存在下，该酶稳定性较差，难以长期稳定保存。相反，如果将该酶冷冻干燥后密封低温可以长期保存而不损失生物活性，因此，我们选择该酶为冻干剂型，这也是生物技术产品常用的剂型。
本发明的技术方案如下本发明提供一种种溶葡萄球菌酶冻干粉剂，组成及重量百分含量为溶葡萄球菌酶0.1％～10％；人血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20；磷酸盐1％～50％。
其中所述及的磷酸盐为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钠。
一种溶葡萄球菌酶冻干粉剂，其组成及重量百分含量为溶葡萄球菌酶0.1％～10％；人血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20；磷酸二氢钾1％～30％；磷酸氢二钠1％～50％。
本发明还提供溶葡萄球菌酶冻干粉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)称取固体磷酸盐，配制磷酸盐缓冲液A；(2)称取甘氨酸、甘露醇，量取人血清白蛋白，加入部分的溶液A中，溶解，得到溶液B；(3)量取溶葡萄球菌酶原液，加到溶液B中，补加溶液A至终体积，得到溶葡萄球菌酶的半成品溶液；(4)无菌操作，用微孔滤膜正压过滤已经配制好的溶葡萄球菌酶半成品溶液，贮存于2～8℃；(5)将微滤完的溶液分装到容器中，同时加半塞，冻干。
本发明提供的溶葡萄球菌酶冻干粉剂可用于烧伤、烫伤、创伤、褥疮等病人创面皮肤葡萄球菌感染的防治，以及眼部、鼻部等皮肤粘膜葡萄球菌感染的防治，特别是耐药性金黄色葡萄球菌引起的感染。
本品为外用药品。使用前用灭菌注射器取无菌生理盐水注入西林瓶中，使本品充分溶解后，用注射器抽取药液，直接均匀滴加于伤患处。或在伤患处覆盖适当大小的消毒纱布，均匀滴加充分润湿纱布(以药液不溢出为准)，适当包扎即可。按体表面积计算，一次4.0U/cm2，1次/日，连用7日，或遵医嘱。
图1为临床分离的158株金黄色葡萄球菌对溶葡萄球菌酶及对照药物的敏感性分布；其中1为溶葡萄球菌酶，2为磺胺嘧啶银(SD-Ag)，3为头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)，4为去甲万古霉素(Norvancomycin orDemethylvancomycin，NVAN or DVAN)，5为哌拉西林(Piperacillin，PIP)，6为克拉霉素(Clarithromycin，CLM)，7为环丙沙星(Ciprofloxacin，CPFX)；
图2为临床分离的103株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)对溶葡萄球菌酶及对照药物的敏感性分布；其中1为溶葡萄球菌酶，2为磺胺嘧啶银(SD-Ag)，3为头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)，4为去甲万古霉素(Norvancomycin orDemethylvancomycin，NVAN or DVAN)，5为哌拉西林(Piperacillin，PIP)，6为克拉霉素(Clarithromycin，CLM)，7为环丙沙星(Ciprofloxacin，CPFX)；图3为临床分离的55株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对溶葡萄球菌酶及对照药物的敏感性分布其中1为溶葡萄球菌酶，2为磺胺嘧啶银(SD-Ag)，3为头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)，4为去甲万古霉素(Norvancomycin orDemethylvancomycin，NVAN or DVAN)，5为哌拉西林(Piperacillin，PIP)，6为克拉霉素(Clarithromycin，CLM)，7为环丙沙星(Ciprofloxacin，CPFX)；图4为临床分离的125株产酶金黄色葡萄球菌对溶葡萄球菌酶及对照药物的敏感性分布其中1为溶葡萄球菌酶，2为磺胺嘧啶银(SD-Ag)，3为头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)，4为去甲万古霉素(Norvancomycin orDemethylvancomycin，NVAN or DVAN)，5为哌拉西林(Piperacillin，PIP)，6为克拉霉素(Clarithromycin，CLM)，7为环丙沙星(Ciprofloxacin，CPFX)；图5为临床分离的31株不产酶金黄色葡萄球菌对溶葡萄球菌酶及对照药物的敏感性分布其中1为溶葡萄球菌酶，2为磺胺嘧啶银(SD-Ag)，3为头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)，4为去甲万古霉素(Norvancomycin orDemethylvancomycin，NVAN or DVAN)，5为哌拉西林(Piperacillin，PIP)，6为克拉霉素(Clarithromycin，CLM)，7为环丙沙星(Ciprofloxacin，CPFX)；
具体实施例方式
实施例1 溶葡萄球菌酶冻干粉的制备1、组成和配比溶葡萄球菌酶0.4％；人血清白蛋白10％；甘氨酸30％；甘露醇10％；磷酸二氢钾15％；磷酸氢二钠30％。
2、配制半成品称取固体KH2PO4和Na2HPO4.12H2O，配制0.2mol/L磷酸盐缓冲液A(pH值6.5磷酸盐缓冲液，浓度为0.2M)。按照制剂处方，称取所需的甘氨酸、甘露醇，量取所需体积的人血清白蛋白，加入到部分A溶液中，搅拌并使溶解，得到溶液B。量取重组溶葡萄球菌酶原液，加到溶液B中，使最终溶液中重组溶葡萄球菌酶生物活性为400U/ml，补加A溶液至终体积，此时得到的是重组溶葡萄球菌酶的半成品溶液。
3、微滤除菌无菌操作，用孔径为0.22um的微孔滤膜(PALL公司)正压过滤已经配制好的重组溶葡萄球菌酶半成品溶液，贮存于2～8℃。
4、分装用液体灌装机将微滤完的半成品溶液分装到容量为15ml的管制西林瓶中，每瓶分装溶液1.0±0.1ml，同时加半塞。
5、冻干分装完毕后，将西林瓶送入冷冻干燥机进行冻干。冻干过程分为预冻阶段、主干燥阶段、最后干燥阶段。
实施例2 兔皮下注射外用重组溶葡萄球菌酶重复给药毒性试验1、实验目的本实验目的是通过兔皮下注射外用重组溶葡萄球菌酶，观察兔出现毒性反应性质、程度、发展和恢复情况，为临床安全用药的剂量设计和临床毒副反应监测提供参考资料。
2、实验方法新西兰白兔24只，体重2.5～3.0kg。外用重组溶葡萄球菌酶设3个剂量组，给药剂量分别为100、20及4ml.kg-1(相当于241936、48387和9677U·m-2)，溶剂对照组(0.9％氯化钠注射液)，皮下注射量为1ml.kg-1。每周连续给药7天，共给药4周。
3、实验结果给药后各组动物的一般行为活动和食量正常。体重、心电图及食物消耗量与溶剂对照组比较无显著差别。给药第14天100mg.kg-1组血清中抗体与溶剂对照组相比有明显增高(p＜0.01)。第28天时各剂量组与溶剂对照组相比较，血清中抗体含量均显著增高(P＜0.01、P＜0.05)。与溶剂对照组相比较有非常显著性差异(p＜0.01)。恢复期结束时，各剂量组家兔血清中抗体水平有下降趋势。13项血液学指标、4项凝血指标、18项血液生化指标、10项尿液指标中的个别项目与溶剂对照组相比较有统计学差异，但无特殊的毒理学意义。组织病理学检查未见与给药有关的毒性病理改变。
4、实验结论综上所述，在本次试验条件下，外用重组溶葡萄球菌酶给药剂量为241936、48387和9677U·m-2剂量组时，对新西兰兔无给药有关的毒性表现。在相当于人拟用剂量4～100倍时对新西兰兔无毒性作用。安全剂量大于241936U·m-2。
实施例3 家兔经皮给予外用重组溶葡萄球菌酶皮肤刺激试验1、实验目的观察兔完整皮肤和破损皮肤接触外用重组溶葡萄球菌酶后所产生的局部刺激反应，为其临床用药的安全性评价提供实验资料。
2、实验方法试验设完整皮肤(I组)和破损皮肽(II组)2个试验组，每组4只动物，雌雄各半，每只动物背部用电动去毛剪各备出10×6cm2无毛区，用药期间隔天备1次皮肤，破损皮肤用消毒针头在去毛区按“井”字形(间隔1cm)划破皮肤表皮层，使其渗血。用药浓度按本药最大稀释浓度(100g.L-1，相当于18000IU.L-1)，是临床使用浓度的3倍，每只动物用药量为2ml，每只动物实际用药量为360IU，给药剂量为200mg/0.186m2(1075.3mg/m2)，相当于193.6mg蛋白/m2。左侧为外用重组溶葡萄球菌酶用药区，右侧为生理盐水对照区。将2ml外用重组溶葡萄球菌酶水溶液均匀涂于7.5×5.5cm2两层厚的无菌医用纱布上，覆盖于皮肤受试物区(左侧)，每块纱布用粘胶带固定，之后，用医用纱布缠绕每只动物的躯体并用粘胶带固定，为防止敷料脱落，每只兔穿上背心，生理盐水涂于对侧皮肤，连续给药7天。
3、实验结果动物给药前7d检疫、7d给药时间及给药结束后7d内，每日观察皮肤给药部位。结果表明，所有完整皮肤组和破损皮肤组动物，无论是外用重组溶葡萄球菌酶给药部位皮肤(左侧)，还是生理盐水基质对照部位(右侧)，均未发现有红斑和水肿形成，按规定评分标准均为0分，亦未发现色素沉着，药源性出血及皮肤粗糙等异常反应。动物的活动饮食、大小便、体重及外观等亦未出现异常。
实施例4 溶葡萄球菌酶冻干粉剂体外药效学试验1、药物及其配制重组溶葡萄球菌酶(Recombinant Lysostaphin，rLspn)冻干粉按实施例1的方法进行配制，活性单位为62.5U/mg，固重。
对照药物为磺胺嘧啶银(SD-Ag)、头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)含量90.6％；环丙沙星(Ciprofloxacin，CPFX)含量84.2％；去甲万古霉素(Norvancomycin orDemethylvancomycin，NVAN or DVAN)含量81％；哌拉西林(Piperacillin，PIP)含量91.3％；克拉霉素(Clarithromycin，CLM)效价972U/mg；环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)含量84.2％；药物配制时按实际活性药物计算。
2、培养基和试剂MH肉汤(Mueller-Hinton Broth)培养基、脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基均为美国DIFCO公司产品；MH琼脂培养基、营养肉汤和小牛血清由中国药品生物制品检定所购进；高活性干酵母为广东东莞糖厂酵母分厂产品。HTM培养基(Haemophilus Test Medium)按照NCCLS规定方法配制[2]，即在MH琼脂培养基基础上，加入15μg/mL辅酶I、15μg/mL牛血红素和5mg/mL酵母粉，pH7.4。
3、细菌试验菌株金黄色葡萄球菌为实验室保存典型菌种及2000-2001年从北京地区各医院收集临床分离菌，选用金葡菌ATCC29213、作为质控菌。质控菌MIC均在NCCLS规定范围内。
4、最低抑菌浓度(MIC)测定参照NCCLS标准，采用平皿二倍稀释法和Denlay多点接种器进行药敏实验，试验菌用营养肉汤及脑心浸液增菌；药物用MH肉汤二倍稀释成各种所需浓度，分别加适量到平皿中，MH琼脂培养基溶化后定量注入含药液平皿内混匀，药物的终浓度分别为0.0075，0.015，0.03……128μg/mL，，无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为最低抑菌浓度(MIC)。
5、试验结果重组溶葡萄球菌酶对158株金葡菌具有较强抗菌活性，MIC50、MIC90分别为0.25、0.5U/mL，抗菌活性稍强于去甲万古霉素和环丙沙星，强于磺胺嘧啶银、头孢噻肟、哌拉西林和克拉霉素。详细结果见表1和附图1。
重组溶葡萄球菌酶对103株甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)和55株耐甲氧西林金葡菌(MRSA)均有较强抗菌作用，且抗菌活性相近，MIC50、MIC90均为0.25、0.5U/mL，抗菌活性稍强于去甲万古霉素和环丙沙星，明显强于磺胺嘧啶银、头孢噻肟、哌拉西林和克拉霉素。(见表1和附图2，3)。
重组溶葡萄球菌酶对125株产β-内酰胺酶金葡菌和31株不产酶金葡菌的抗菌活性相近，MIC50、MIC90均为0.25、0.5U/mL，抗菌活性稍强于去甲万古霉素和环丙沙星，明显强于磺胺嘧啶银、头孢噻肟、哌拉西林和克拉霉素。(见表1和附图4，5)。
表1重组溶葡萄球菌酶及其对照药对金黄色葡萄球菌的MIC测定(μg/mL)*
*溶葡萄球菌酶U/mL。
实施例5溶葡萄球菌酶对小鼠烧伤创面金黄色葡萄球菌杀灭效果的研究1、烧伤感染模型动物为昆明种小白鼠，雌雄各半，体重25-30g。动物随机分为三组，以直径2.6cm圆形烙铁造成小鼠背部皮肤III度烧伤(75℃，15秒)，烧伤面积(约5cm2)约占小鼠体表面积的6-7％，伤后30分钟，创面接种浓度为109cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌液0.1ml，菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923。
2、试验方法在烧伤创面接种金黄色葡萄球菌后3-4小时，用无菌棉拭子沾取含0.02％十二烷基硫酸钠的生理盐水，涂擦创面采样，然后将酶活浓度为20u/ml的溶葡萄球菌酶，敷贴烧伤创面(1ml/只，即每平方厘米4个u的酶)。作用30分钟，再采样。经振荡洗涤，取样液0.1ml作涂抹琼脂平板接种，每一样液接种2个平板，于37℃温箱内培养48小时，观察最终结果。
3、试验结果结果证明，经溶葡萄球菌酶作用后24小时，只有2只有金黄色葡萄球菌检出，而对照组19只小鼠则全部有金黄色葡萄球菌检出见表2。
表2溶葡萄球菌酶对烧伤创面金黄色葡萄球菌杀灭效果
。
经溶葡萄球菌酶作用后2只检测阳性小鼠，其金黄色葡萄球菌菌数分别为2.2×104cfu/cm2和9.8×103cfu/cm2。，而对照组小鼠金黄色葡萄球菌数在0.98×105cfu/cm2-1.82cfu/cm2之间，远高于使用溶葡萄球菌酶处理组。
经24只人工烧伤小鼠模拟试验证明，溶葡萄球菌酶对人工污染烧伤创面的金黄色葡萄球菌有较好的杀灭作用。
实施例6重组溶葡萄球菌酶药代动力学研究猪皮肤烧伤创面外敷125I-rLysostaphin 1000U/猪与静脉推注给予125I-rLysostaphin 1000U/猪后血清总放射性峰浓度分别为1797.2±376.2和50.6±17.7ng.equ/mL(P＜0.05)；TCA沉淀放射性峰浓度分别为17333±362.2和33.2±4.3ng.equ/mL(P＜0.05)；血清总放射性AUC(0-8h)和AUC(0∞)生物利用度分别为6.7±5.3％和15.4±13.8％，其中TCA沉淀放射性浓度代表的原形125I-rLysostaphin的相对吸收率AUC(0-8h)和AUC(0∞)分别为6.7±2.2％和17.3±8.2％。但药物的吸收程度表现出与烧伤面积和药物浓度成正比的关系。
静脉注射本品后，在动物主要器官均能检测到125I-rLysostaphin活性，其放射性分布按AUC排序由大到小依次为肾、肺、骨髓、血清、肝、脾、膀胱、肾上腺、颌下腺、心脏、淋巴结、小肠、胰腺、生殖腺、肠内容、肌肉、脂肪、胸腺、肠内粪、眼球和脑。其中肾脏浓度最高，肺和骨髓浓度高于血清，其它组织均低于血清，肝脏浓度较高仅次于血清，脑浓度最低，说明该药物不易透过血脑屏障。
静脉注射125I-rLysostaphin后，8h胆汁中累积排出注入放射性的2.8％±1.1％，72h尿、粪分别排出86.2％±8.9％和4.8％±2.3％，表明肾脏为本品的主要清除途径，而胆汁分泌是次要的。
权利要求
1.一种溶葡萄球菌酶冻干粉剂，其特征在于，组成及重量百分含量为溶葡萄球菌酶0.1％～10％；人血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20；磷酸盐1％～50％。
2.根据权利要求1所述的冻干粉剂，其特征在于，所述及的磷酸盐为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钠。
3.一种溶葡萄球菌酶冻干粉剂，其特征在于，组成及重量百分含量为溶葡萄球菌酶0.1％～10％；人血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20；磷酸二氢钾1％～30％；磷酸氢二钠1％～50％。
4.一种如权利要求1至3任一所述的溶葡萄球菌酶冻干粉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)称取固体磷酸盐，配制磷酸盐缓冲液A；(2)称取甘氨酸、甘露醇，量取人血清白蛋白，加入部分的溶液A中，溶解，得到溶液B；(3)量取溶葡萄球菌酶原液，加到溶液B中，补加溶液A至终体积，得到溶葡萄球菌酶的半成品溶液；(4)无菌操作，用微孔滤膜正压过滤已经配制好的溶葡萄球菌酶半成品溶液，贮存于2～8℃；(5)将微滤完的溶液分装到容器中，同时加半塞，冻干。
全文摘要
本发明公开了一种溶葡萄球菌酶冻干粉剂的配方和组成，该冻干粉剂由溶葡萄球菌酶、人血清白蛋白、甘氨酸、甘露醇、磷酸盐所组成。本发明还公开了这种溶葡萄球菌酶冻干粉的制备方法。本发明提供的溶葡萄球菌酶冻干粉剂可用于烧伤、烫伤、创伤、褥疮等病人创面皮肤葡萄球菌感染的防治，以及眼部、鼻部等皮肤粘膜葡萄球菌感染的防治，特别是耐药性金黄色葡萄球菌引起的感染。
文档编号A61P31/04GK1911442SQ200510028618
公开日2007年2月14日 申请日期2005年8月9日 优先权日2005年8月9日
发明者黄青山, 莫云杰 申请人:上海高科联合生物技术研发有限公司