专利名称：抗HIV－1的Furin酶抑制剂及其制法的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学、药物学领域，涉及一种HIV抑制剂，更具体的讲，本发明涉及一种新的抗HIV-1的Furin酶抑制剂及其制法。
背景技术：
艾滋病全称为获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，该病由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV或艾滋病病毒)感染而引起，导致被感染者免疫功能的部份或完全丧失，CD4+细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度快、病死率高，且目前无法治愈，引起了各国政府和社会的关注。
HIV的感染是由外膜前体蛋白gp160的加工开始的，gp160经过前体加工酶(例如Furin酶)的加工后变为两个片段表面糖蛋白(surface glycoprotein，SU)gp120和跨膜蛋白(transmembrane protein，TM)gp41。HIV-1首先通过其囊膜糖蛋白复合物gp120-gp41中的gp120与靶细胞上的受体CD4结合，使得gp120的构象发生改变，并继而与靶细胞上的辅受体CXCR4或CCR5结合，导致gp41的构型改变，暴露出其融合肽并插入到宿主细胞膜，从而启动病毒膜与细胞膜的融合，完成病毒进入宿主细胞的感染过程。gp160前体的加工是入侵过程的第一步，若能抑制此步就可阻止病毒的入侵，是重要的药物作用靶点。gp160的加工主要是依赖Furin酶等前体加工酶的作用。在Thomas；Gary等人的专利(Thomas；Gary et al，UnitedStates Patent5604201，February 18，1997)中指出Furin对切割位点的要求是含有RXXR的序列(P1和P4位点为R，而P2和P3位点则为任意氨基酸)，而近年来的研究表明HIV-1外膜糖蛋白gp160中就含有这样的切割位点site 1Arg508-Glu-Lys-Arg511；site2Lys500-Ala-Lys-Arg503，证明了Furin对HIV-1病毒前体蛋白加工的重要意义，进一步说明抑制Furin酶的作用对抑制HIV-1病毒侵入人体宿主细胞的可行性。(McCune et al.，1988，Cell 5355-67；Hallenberger et al.，1992，Nature 360358-361；Etienne Decroly etal，1994，the journal of biological chemistry vol.269 No.16 pp12240-12247；RominaOliva et al，2002，Chem.Eur.J.，8，No.61467-1473；Ilia Tikhonov et al，2004，FEBS Letter56589-92)目前针对Furin酶的抑制剂抑制HIV的研究有一些的报道，主要有两种化学计量的肽基抑制剂(癸酰基-Arg Val-Lys-Arg-CH2Cl)和α1-抗胰蛋白酶Portland(α1-PDX)。其中癸酰基-Arg-Val-Lys-Arg-CH2Cl的烷基化属性限制了其应用，在抑制Furin酶时具有较低的活性。α1-PDX是通过对α1抗胰蛋白酶的反应活性位点进行突变使其包含普遍认为是最小的Furin切割位点-Arg-Ile-Pro-Arg-。α1-PDX在体外试验当中对Furin具有高选择性(Ki＝600pM)，但是当抑制剂浓度提高到高浓度时也将抑制其它的PCs。在细胞和动物研究当中，发现α1-PDX是有效的Furin酶抑制剂。(Komiyama，T.et al.，2000，Biochemistry 3915156-15165；Cameron.A.et al.，2000，J.Biol.Chem.27536741-36749；FeiHao et al.，2001，ActaBiochimica et Biophysica Sinica，33(6)591-599；Jean，F.et al.，1998，Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.957293-7298；Anderson，E.D.et al.，1993，J.Biol.Chem.26824887-24891；Molloy，S.S.et al.，Academic Press San Diego，CA，2001，The Enzymes199-235；Gary Thomas，Nat Rev Mol Cell Biol，2002 Oct；3(10)753-66；Pierre Cordelieret al.Jul 2003，Biochim Biophys Acta，1638(3)197-207；Bouchaib BAHBOUHI，2001，Biochem.J.360127-134)这些现有的Furin酶抑制剂一般都是天然大分子的基础上构建的，本领域迫切需要分子小且活性高的人工构建的Furin酶抑制剂，能成为更有效的抗HIV-1抑制剂。
发明内容
基于以上现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种分子量小，活性高的抗HIV-1抑制剂。
本发明的另一目的就是提供所述抗HIV-1抑制剂的序列设计、制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种新的Furin酶抑制剂片段，具有以下氨基酸序列 其中P1位点是R；P2位点是K；P4位点是R；P6位点为X1，可以是R或者K；P7位点是X2，可以为Ala等所有碱性氨基酸；C的配对情况为C4-19，C9-17；合成过程中所指出的C由乙酰胺甲基(Acm)保护基保护得到中间产物。
所述的氨基酸序列的结构如下 在本发明的第二方面，提供了一种抗HIV-1抑制剂，含有所述的Furin酶抑制剂，具有以下氨基酸序列 其中P1位点是R；P2位点是K；P4位点是R；P6位点为X1，可以是R或者K；P7位点是X2，可以为A等所有碱性氨基酸；C的配对情况为C4-19，C9-17。
在本发明的第三方面，提供了一种制备该抑制剂的方法，包括步骤A.利用多肽合成的方法，合成出所需要的Furin酶抑制剂片段，所合成的粗产物具有以下氨基酸序列 其中，P1位点是R，P2位点是K，P4位点是R，P6位点为R，P7位点是A，合成过程中所指出的C由Acm保护基保护得到中间产物；B.将合成粗产物还原，脱盐后得到还原形态的产物并用HPLC进行分离纯化；C.将纯化的还原形态的产物用2-PDS氧化3h后冻干，将氧化产物脱盐后进行HPLC纯化分离，得到较纯的氧化中间形态产物；D.将氧化中间形态的产物进行碘氧化，脱去C的Acm保护从而使C正确配对，经过脱盐和HPLC的纯化分离得到较纯的抗HIV-1抑制剂。
在本发明的第三方面，提供了所述的Furin酶抑制剂片段在制备治疗获得性免疫缺陷综合症的药物中的应用。
在本发明的第四方面，提供了一种对于HIV感染有效的药物组合物，含有权利要求1所述的Furin酶抑制剂片段以及药学可接受的载体或赋形剂。可将Furin酶抑制剂片段配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括但并不限于腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于获得性免疫缺陷综合症的治疗。此外，还可同时或结合使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的Furin酶抑制剂片段以及药学上可接受的载体或赋形剂，配制成适合给药于HIV感染患者的方式。所述载体包括但并不限于盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。
使用本发明的药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于人体，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
如本文所用，术语“M3”指本专利所述的抗HIV-1抑制剂。
如本发明所用，本领域的普通技术人员应该理解，在对本发明所涉及的氨基酸序列进行描述时，所述的E为谷氨酸(Glu)，所述的P为脯氨酸(Pro)，所述的S为丝氨酸(Ser)，所述的C为半胱氨酸(Cys)，所述的A为丙氨酸(Ala)，所述的R为精氨酸(Arg)，所述的K为赖氨酸(Lys)，所述的I为异亮氨酸(Ile)，所述的Q为谷氨酰胺(Gln)，所述的H为组氨酸(His)，所述的N为天冬氨酸(Asn)。
图1，纯化的M3的HPLC图谱，C18柱(Agilent，9.4×250mm)，流动相B为含0.08％TFA的70％乙腈，流动相A为含0.1％TFA的水，梯度(20-40％B/10-40min)。流速为2ml/min.主峰为M3还原形态肽。横坐标为流出时间，纵坐标为A230nm。
图2，纯化的M3的质谱图谱。
图3，M3对Furin的抑制常数Dixon作图；横坐标为M3浓度，纵坐标为荧光吸收；对Furin的抑制常数Ki＝3.26×10-9M。
图4，M3体外对HIV的抑制作用。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究发现，以绿豆胰蛋白酶抑制剂片段为支架，在活性功能区突变引入普遍认为是最小的Furin酶切割位点-Arg-X-X-Arg-(其中X代表任意的氨基酸)，同时在P6位点引入R/K(Arg/Lys)，P7位点引入中性氨基酸，以增强其抑制活性，并将其构建成为furin酶的抑制剂，达到抑制对HIV-1外膜糖蛋白gp160的加工，阻止HIV-1病毒的侵入。
如本文所用，术语“M3”指本专利所述的抗HIV-1抑制剂，其基本结构如下 其中，P1位点是R；P2位点是K；P4位点是R；P6位点为X1，可以是R或者K；P7位点是X2，可以为A等所有碱性氨基酸；K的配对情况如图所示C4-19，C9-17。
研究已表明，对于Furin的切割位点主要要求P1位点是R及P4位点是R，而对于P2位点可以是K或者R，P2位点是起到辅助作用的，而对于P3位点则可以是任意氨基酸。P2和P6碱性氨基酸起到了增强抑制活性的作用，而鉴于P6位点是R或者K，P7位点突变成碱性氨基酸对于P6位点起到稳定作用，同时也增强了M3的抑制活性。在本发明中考虑到支架绿豆胰蛋白酶抑制剂片段的结构，P3位点保持原有的C来稳定蛋白的构象。
如本文所用，“本发明的多肽”是指M3及其制备过程中的中间产物。
本发明的多肽是合成多肽。本发明的多肽是用化学合成的方法得到的产物。
本发明所采用的还原方法是采用2mg/ml粗肽、8M尿素、10mg/ml的体系进行反应的，所用的还原缓冲液可以是酸性的1‰TFA体系，也可以是碱性的缓冲液(50mM Tris、1mM EDTA，pH 8.0)。
本发明所采用的氧化方法是以2-PDS氧化使二硫键形成配对的方法，所采用具体方法是将1.5mg2-PDS溶解于1ml甲醇中，逐滴加入100ml的包含经HPLC纯化的还原肽的0.1％TFA体系中，在室温下氧化3小时。2-PDS的作用是加快氧化反应的进行，但不影响氧化的效果。在本发明的实践过程中，采用2-PDS氧化的方法效果佳。
本发明所采用的脱Acm碘氧化的方法是19mgI2/mg氧化所得肽溶解于5ml/mg氧化所得肽的80％醋酸中，溶解后直接加入氧化所得多肽中，同时加入4倍体积的80％醋酸，反应1小时左右为最佳。反应的终止是依靠维生素C的添加来完成的。所得溶液用旋转蒸发的方式浓干，过柱脱盐后冻干，用HPLC进行纯化。
本发明中过柱脱盐所采用的是分子筛Sephadex G-15的填料填充的脱盐柱。
本发明中脱盐后的肽段纯化工作采用的是HPLC纯化技术。
本发明的主要优点在于(1)本发明的肽段具有分子量小，结构相对简单，较易进行实际操作的优点(2)本发明的肽段是在绿豆胰蛋白酶抑制剂片段的基础上加工形成的，具有很好的生物活性，含有很高的生物利用度。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 本发明的抗HIV-1抑制剂的制备1 M3肽段的合成取BOC-Asn-OCH2-Pam树脂(0.742mmol/g)，按肽的序列由C端逐个向N端延伸。每轮循环开始以50％TFA去除BOC，再以10％DIEA中和，一轮循环结束以茚三酮反应检测监控合成质量。侧链保护基为Asp(OCHex)、Ser(Bzl)、Cys(4-Meb，Acm)、Lys(ClZ)、Arg(Tos)。肽合成完成后先以50％TFA/DCM去除N端BOC保护基，肽树脂真空干燥除去水份。
2 树脂的切割与M3粗肽的制备取100mg肽树脂加入0.5ml对甲苯酚，少许苯酚和Thioanisole，于0℃干燥氟化氢(HF)中处理1.5小时，将多肽链从树脂上酸解下来，并去除各种侧链保护基。裂解完成后以5×20ml干燥的乙酸乙酯(含10mg/100ml的DTT)洗涤，用40+40+20ml的1N的醋酸含20％乙腈溶液(含10mg/100ml的DTT)抽提粗肽，合并抽提液并冷冻干燥。得M3粗肽。
3 M3还原形态的制备在7ml的反应管中，以2mg/ml M3粗肽、8M尿素、10mg/ml DTT的比例进行反应。在本发明中实际的操作是加入12mg粗肽、2.88g尿素、60mg DTT溶解于6ml的1‰TFA溶液中，在37℃水浴中保温反应3小时，经Sephadex G15脱盐后冻干，得到M3还原态。
4 M3氧化中间形态的制备将冻干的还原态M3溶解于100ml的1％TFA溶液中，同时将1.5mg 2-PDS溶解于1ml甲醇中，将2-PDS溶液逐滴加入100ml的包含经HPLC纯化的还原肽的1‰TFA体系中，在室温下氧化3小时，经Sephadex G15脱盐后冻干，再经过HPLC纯化得到较纯的M3氧化中间态。
5 M3最终氧化形态的制备冻干的M3氧化中间态，用碘氧化的方法脱去最后一对Cys上的Acm的保护基。将19mg碘溶于5ml 80％的醋酸当中，然后加入到冻干的M3氧化中间体当中，另外加入20ml 80％的醋酸，反应1小时，然后逐滴加入预先配好的维生素C的饱和溶液直到反应液的红棕色安全退去，即反应完全终止。将反应液通过旋转蒸发的方式进行浓缩。待浓干以后，加入1ml 1N的醋酸进行溶解，经Sephadex G15脱盐后冻干，再经过HPLC纯化得到较纯的M3最终氧化态(图1)。
图2显示了纯化的M3的质谱图谱。经质谱鉴定，主峰分子量为2339.5Da，符合M3 final的理论分子量2339.71Da，确认为M3的final。
实施例2本发明的抗HIV-1抑制剂的抑制活性的测定1.酶活力的测定Furin对荧光底物pGlu-Arg-Thr-Lys-Arg-MCA的水解活力通过荧光分光光度仪实时测定。将适量的furin加入1ml测活缓冲液(100mM Hepes，pH 7.5，1mM CaCl2，0.5％Triton X-100，1mM β-巯基乙醇)，37℃保温3分钟后，再加入适量荧光底物(50-80μM)。测活时荧光仪的激发波长和发射波长分别为370nm和460nm，狭缝宽度均为10nm。
2.抑制剂动力学常数的测定使用dixon作图(1/V对I)(Dixon.1953)得到不同突变体的Ki常数。针对furin的测定中，使用的底物浓度分别为50，80μM。IC50的测定则用软件对抑制曲线进行双倒数拟合的方法确定。从得到的IC50，也可按下列公式推出Ki常数Ki=IC501+[s]Km]]>s为荧光底物浓度，Km为米氏常数(pERTKR-MCA对furin为2.7μM)。
图3显示了M3对Furin的抑制常数Dixon作图；横坐标为M3浓度，纵坐标为荧光吸收；对Furin的抑制常数Ki＝3.26×10-9M。
3.HIV的抑制活性Ficoll-Paque密度梯度离心制备新鲜的外周血单核细胞(PBMC)，用RPMI 1640培液(含10％热灭活胎牛血清，100μg/ml链霉素，100U/ml青霉素)培养。经1μg/ml的植物凝集素和10ng/ml IL-2活化3天后，37℃以1000 TCID50的HIV比1×10-5个PBMC的比例用HIV感染PBMC1小时。PBS洗两次除掉未感染的HIV，细胞重悬于RPMI 1640培液(含10ng/ml IL-2)中，以1×10-5个/孔加入含有不同浓度抑制剂的96孔板中，补充总体积为200μl。48小时后，吸取20μl培液，补加20μl抑制剂，使培液保持相同浓度的抑制剂。HIV感染5天后，用ELISA检查HIV p24抗原的量，只加培液一组做对照。HIV的感染率为样品孔和对照孔HIV p24抗原释放量的比值，M350％抑制HIV感染PBMC的浓度为20μM。
图4显示了M3体外对HIV的抑制作用，横坐标为肽浓度(μg/ml)，纵坐标为抑制率(％)，说明随着肽浓度的升高，抑制率也升高。
本领域普通技术人员应理解，与本发明等同的技术路线也可用于类似的蛋白酶抑制剂的构建与开发。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种新的Furin酶抑制剂片段，其特征在于，具有以下氨基酸序列 其中，P1位点是R；P2位点是K；P4位点是R；P6位点为X1，可以是R或者K；P7位点是X2，可以为A等所有碱性氨基酸；C的配对情况为C4-19，C9-17；合成过程中C由乙酰胺甲基保护基保护得到中间产物。
2.一种抗HIV-1的抑制剂，其特征在于，含有权利1所述的Furin酶抑制剂。
3.一种制备HIV-1抑制剂的方法，其特征在于，包括步骤A.利用多肽合成的方法，合成出所需要的Furin酶抑制剂片段，所合成的粗产物具有以下氨基酸序列 其中，P1位点是R，P2位点是K，P4位点是R，P6位点为R，P7位点是A，合成过程中所指出的C由乙酰胺甲基保护基保护得到中间产物；B.将合成粗产物还原，脱盐后得到还原形态的产物并用HPLC进行分离纯化；C.将纯化的还原形态的产物用2-PDS氧化3h后冻干，将氧化产物脱盐后进行HPLC纯化分离，得到较纯的氧化中间形态产物；D.将氧化中间形态的产物进行碘氧化，脱去C的Acm保护从而使C正确配对，经过脱盐和HPLC的纯化分离得到较纯的抗HIV-1抑制剂。
4.权利要求1所述的Furin酶抑制剂片段在制备治疗获得性免疫缺陷综合症的药物中的应用。
5.一种对于HIV感染有效的药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的Furin酶抑制剂片段以及药学可接受的载体或赋形剂。
全文摘要
本发明属于生物化学、药物学领域，提供了一种新的抗HIV－1的Furin酶抑制剂及其制法。本发明在原有的绿豆胰蛋白酶抑制剂片段的基础上，改变某些特征位点的氨基酸，用合成的方法得到所需的粗肽样品，并用逐步还原－氧化的手段最终得到高纯度的样品，并证明其具有Furin酶抑制剂的效果(对Furin酶抑制活力的Ki值达到了10
文档编号A61K38/55GK1908010SQ200510028550
公开日2007年2月7日 申请日期2005年8月5日 优先权日2005年8月5日
发明者戚正武, 张友尚, 崔大傅, 陶虎, 石嘉浩, 汪世龙, 张震, 邵晓霞 申请人:同济大学, 中国科学院上海生命科学研究院