专利名称：丹酚酸b盐及丹参总酚酸医学用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及丹参中提取有效成份，更具体指丹酚酸B盐及丹参总酚酸的抑制肾纤维化的用途。
背景技术：
丹酚酸B及它的镁盐理化数据为分子式C36H28MgO16；分子量740.9154；[α]D20+126.7(C0.73，H2O)；Uvλmax210(ε1.92×104)，286(ε1.35×104)，306(ε1.20×104)；IR3400；1700nm；1608，1519；1363；1288cm-1均有吸收峰通过MS NMR.U.V IR证明其结构为
1、丹酚酸B鎂盐(MTB)在高血脂动物模型主动脉条上，通过肉眼，光镜，电镜观察到有明显的抗AS作用，肉眼可见明显减少黄色斑块隆起，粥样硬化程度分级明显降低，光镜观察到内膜下泡沫细胞层数较少，平滑肌细胞增殖较轻，电镜下示内皮细胞改变较轻，泡沫细胞较少，收缩型平滑肌细胞所占比例较大，干滑肌细胞内内质网，高尔基体，线粒体较少，究肌丝含量较多，细胞分化程度较好；2、MTB可调节血脂，降低TC，TG，LDL，LP(a)，升高HDL；抗脂质过氧化，提高SOD活性；3、MTB可提高NO，减低内皮素血浆水平，保护内皮细胞，并通过抑制动脉粥样硬化组织Bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)在动脉壁的表达，调控平滑肌细胞的迁移与增殖，干预AS的进程。
以上实验均是硝苯地平作阳性对照性，作用于优于硝苯地平。
1、MTB对CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤及肝纤维化形成有良好的抑制作用。
(1)有效抑制肝脏结缔组织增生，降低肝脏胶原含量，其效果优于秋水仙碱及原生药丹参；(2)抗肝细胞损伤，MTB各剂量组均能显著降低模型大鼠较大幅度增高的血清ALT、AST活性及总胆红素含量，高剂量组显著提高血清Alb含量。综合作用于对照药物(丹参组对降总胆红素的作用于不明显，秋水仙碱对降AST的作用不明显)。(3)MTB量效结果显示以中剂量(12.5mg/Kg鼠重)为佳。
2、MTB对已形成的DMN诱导的大鼠肝纤维化有良好的治疗效果。
(1)显著促进肝内胶原的重吸收，降低肝组织Hyp含量及I型胶原的沉积；(2)促进损伤肝细胞的修复，提高血清Alb含量，降低血清ALT、AST活性；(3)显著降低大鼠腹水出现率；(4)作用优于秋水仙碱及原生药丹参；(5)具一定的量效关系，有效剂量区间为12.5mg/kg/d～25mg/kg/d。
3、MTB有一定的促进机体体液免疫功能与细胞免疫功能作用。能促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，提高小鼠血清中的溶血素含量，抑制小鼠的白细胞移动。增加小鼠抗体生成细胞的数量。
4、对体外肝星状细胞功能的影响。能显著抑制HSC的增殖，抑制活化HSC的TGFβ1自分泌及活化；降低I型前肢原mRNA表达与胶原蛋白的生成，抑制TGFβ1信号转导通路中MAPK的活化。
5、MTB通过体外、体内的试验，证明丹酚酸B及它的盐具有对肺纤维化抑制作用。
6、一般药理研究本品剂量为3.8、7.5和15mg/kg灌胃对麻醉Beagle犬的呼吸和循环系统的功能无明显的影响；本品剂量15、30和60/kg灌胃对小鼠爬杆试验和Iruin行为分级试验均无影响。
发明内容
本发明的目的是提供一类具有对肾纤维化抑制作用的药物(化合物)，本发明涉及的化合物为丹酚酸B及其中包括它的镁、铵、钾盐(DS-1)盐和丹参总酚酸，包括紫草酸、迷迭香酸、丹参素、丹酚酸A等的医学用途。
丹酚酸B及镁盐对心血管的作用及对肝损伤，肝纤维化的作用已作了大量试验。本发明对丹酚酸B及它的盐和丹参总酚酸，包括紫草酸、迷迭香酸、丹参素、丹酚酸A等进行肾纤维化抑制作用的试验，通过体外、体内的试验，证明丹酚酸B及它的盐具有对肾纤维化抑制作用。
本发明是这样实施的本发明涉及的化合物为丹酚酸B盐及其它的盐包括它的镁、铵、钾盐(DS-1)等盐和丹参总酚酸及它的盐(DS-2)。
药理试验一、体外试验DS对人肾成纤维细胞293增殖的影响1.实验目的评价DS体外对293细胞增殖的影响2.材料和方法2.1受试药物及试剂DS由中国科学院上海药物研究所天然药物化学研究室提供血管紧张素II购自Sigma公司2.2细胞培养人胚肾纤维细胞293，培养条件为DMEM培养液(含10％小牛血清)，37℃，5％CO2孵箱培养，待细胞长至70％融合时，用0.25％的胰酶消化2min左右，吸出一定体积的细胞移至新的培养瓶中，加入有血清培养基继续培养。
用DMEM培养液制成2×105cell/ml的细胞悬液，按每孔100μl加入96孔板中，用于细胞增殖率测定。
2.3细胞增殖测定融合的293细胞用胰酶消化，离心后用DMEM培养液(含10％小牛血清)制成2×105cell/ml的细胞悬液，按每孔100μl加入96孔板中，在37℃，5％CO2培养24小时，除正常对照组，每组均加入10-7mol.L-1血管紧张素II(AngII)，样品组同时加入不同浓度的DS，继续培养24小时，，每孔加入用无血清培养基配成的MTT溶液，37℃温浴4小时，使MTT还原为甲替，吸出上清液，加入150μl二甲亚砜使甲替溶解，在550nm测定光吸收值。
2.4数据分析及统计方法结果用mean±SD表示，卞方检验进行比较。
3.结果DS对血管紧张素II孵育的人胚肾成纤维细胞293增殖的影响，具体结果见表1，当培养基中加入10-7mol.L-1AngII24小时后，吸光度明显增加，同时DS浓度为500mg/ml时，对293细胞的增殖有明显抑制作用(p＜0.05)，但当DS浓度为250mg/ml时，对增殖无明显的抑制作用表1 DS对Ang II诱导的293细胞增殖的影响(X±9，n＝10)
**p＜0.01，*p＜0.05 VS Ang II组4.小结实验结果表明DS体外可以抑制由Ang II刺激的人胚肾成纤维细胞293的增殖作用。
二.体内实验1.实验目的观察DS对单侧输尿管结扎的大鼠肾纤维化是否具有抑制作用。
2.实验动物SD大鼠由必凯实验动物有限公司提供，实验前经第二军医大学动物所1周适应性饲养。
3.实验方法SD大鼠随机分为4组，每组10只，包括假手术组、模型组、DS组和阳性对照氯沙坦组，采用乙醚麻醉，腹部切开，分离左侧输尿管，结扎近端后缝合腹部，假手术组不结扎输尿管，手术前1日DS组以10mg/kg灌胃，氯沙坦组以1mg/kg灌胃，模型组给予相同体积生理盐水，术后7天内各组每天都灌胃一次，全程自由进食及饮水，手术后第7天再次麻醉，摘取左侧肾脏，10％福尔马林固定，石蜡包埋，切成2mm切片。2mm厚石蜡切片作HE.Massn染色，然后在光镜下观察肾间质病变。
4.实验结果1、大鼠左侧输尿管结扎后病理组织学检查，从染色切片可以看出，模型组大鼠结扎侧肾脏肿大，颜色变浅，有囊性感，光镜下出现弥漫性肾间质类细胞浸润，间质水肿，且伴有不同程度的肾小管上皮细胞肿胀、变性及部分肾小管呈灶状萎缩，小管管腔闭塞和/或扩张，肾间质出现多灶纤维化，范围大于50％，假手术组肾脏大小形态正常，颜色暗红。DS组和阳性对照组肾脏形态与模型组无明显区别，但光镜下DS组和阳性对照氯沙坦组肾小管上皮细胞肿胀程度减轻，仅少数肾小管上皮细胞发生空泡性变性，肾间质病变呈片状分布，范围＜25％，与模型组比较，差异显著(P＜0.05)5.结论DS对梗阻性大鼠肾间质纤维化有保护作用
图1体内实验大鼠病理组织学检查所见，其中A.假手术组B.模型组肾小管上皮细胞肿胀，肾间质出现多灶纤维化C.丹酚酸B盐组(口服给药，10mg/kg)肾纤维化病灶明显减少，减轻D.氯沙坦组(口服给药，1mg/kg)肾纤维化病灶明显减少，减轻结论丹酚酸B盐组和氯沙坦组口服给药对单侧输尿管结扎的大鼠肾纤维化具有明显的抑制作用。
具体实施例方式
实施例丹酚酸B盐口服给药对单侧输尿管结扎的大鼠肾纤维化的抑制作用昆明系小鼠40只，雄性，体重约20克左右，购自二军大实验动物中心。到实验室后将购得小鼠随机分为4组，包括假手术组、模型组、丹酚酸B盐组和阳性对照氯沙坦组，采用乙醚麻醉，腹部切开，分离左侧输尿管，结扎近端后缝合腹部，假手术组不结扎输尿管，手术前1日丹酚酸B盐组以10mg/kg灌胃，氯沙坦组以1mg/kg灌胃，模型组给予相同体积生理盐水，术后7天内各组每天都灌胃一次，全程自由进食及饮水，手术后第7天再次麻醉，摘取左侧肾脏，10％福尔马林固定，石蜡包埋，切成2mm切片。2mm厚石蜡切片作HE.Massn染色，然后在光镜下观察肾间质病变。
结果从染色切片可以看出(图1)，模型组大鼠结扎侧肾脏肿大，颜色变浅，有囊性感，光镜下出现弥漫性肾间质类细胞浸润，间质水肿，且伴有不同程度的肾小管上皮细胞肿胀、变性及部分肾小管呈灶状萎缩，小管管腔闭塞和/或扩张，肾间质出现多灶纤维化，范围大于50％，假手术组肾脏大小形态正常，颜色暗红。丹酚酸B盐组和阳性对照组肾脏形态与模型组无明显区别，但光镜下丹酚酸B盐组和阳性对照氯沙坦组肾小管上皮细胞肿胀程度减轻，仅少数肾小管上皮细胞发生空泡性变性，肾间质病变呈片状分布，范围＜25％，与模型组比较，差异显著(P＜0.05)。
权利要求
1.丹酚酸B盐及丹参总酚酸的医学用途在制备预防。治疗由肾纤维化引起的疾病的药物中应用。
2.根据权利要求1所述的丹酚酸B盐及丹参总酚酸的医学用途，其特征在于丹酚酸B盐在制备预防、治疗由肾纤维化引起的疾病的药物中应用。
3.根据权利要求1所述的丹酚酸B盐及丹参总酚酸的医学用途，其特征在于丹酚酸B盐包括镁、铵、钾盐(DS-1)盐制备预防、治疗由肾纤维化引起的疾病的药物中应用。
4.根据权利要求1所述的丹酚酸B盐及丹参总酚酸的医学用途，其特征在于丹参总酚酸在制备预防、治疗由肾纤维化引起的疾病的药物中应用。
5.根据权利要求1所述的丹酚酸B盐及丹参总酚酸的医学用途途，其特征在于丹参总酚酸包括紫草酸、迷迭香酸、丹参素、丹酚酸A在制备预防、治疗由肾纤维化引起的疾病包括它的的药物中应用。
全文摘要
体内试验采用单侧输尿管结扎造成大鼠肾纤维化模型，观察灌胃给予DS的防治作用，SD大鼠随机分为4组假手术组，模型组，DS组和阳性对照氯沙坦组，造模后连续给药7天后，大鼠处死取出肾脏，做石蜡切片，并用HE染色，光镜下观察，结果表明DS组和阳性对照组肾脏形态与模型组无明显区别，但光镜下DS组和阳性对照氯沙坦组肾小管上皮细胞肿胀程度减轻，仅少数肾小管上皮细胞发生空泡性变性，肾间质病变呈片状分布，范围＜25％，与模型组比较，差异显著(P＜0.05)体外用293细胞检测DS对人胚肾成纤维细胞增殖的影响，结果表明，当DS浓度为500mg/ml时，明显抑制血管紧张素II引起的293细胞的增殖，此结果与体内试验的组织病理学检查所观察到的DS对大鼠肾纤维化的抑制作用相一致。
文档编号A61P13/12GK1951380SQ20051003104
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者朱大元, 王才国, 蒋山好, 尚雁君 申请人:中国科学院上海药物研究所, 中国人民解放军第二军医大学