专利名称：抗肿瘤免疫反应中的重要调控基因pix的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种细胞通道，更具体的，本发明涉及SAP-PIX-Cdc42途径对于免疫调节化合物筛选方面的应用以及SAP-PIX-Cdc42途径调节剂在制备免疫调节药物方面的用途。
背景技术：
一系列的胞外信号都能引起细胞行为的改变，如细胞黏附，细胞分裂，细胞移动，细胞吞噬等。在这个过程中，Rho家族的小分子GTP酶起着重要的作用。小分子GTP酶不断的在与GTP结合的活化状态和与GDP结合的非活化状态两种形式间循环转换，鸟苷转换因子(GEF)催化它们进入活化状态。各种小分子GTP酶对细胞骨架结构有着不同的影响，如活化的RhoA促进压力纤维的形成，而活化的Cdc42和Rac1则促进丝状和片状突触的形成。具体细胞骨架的改变是由小分子GTP酶下游的信号通路决定的。
有些小分子GTP酶下游的信号通路已经被很好的研究了。比如，在由RhoA-GTP促进的压力纤维形成中，需要Rho激酶(ROK)的参与。ROK能磷酸化肌球蛋白轻连磷酸酶(MLC)的肌球蛋白结合亚基，使其失去活性。磷酸化状态的MLC，积累增加了肌动蛋白的聚合，从而增加了压力纤维的形成。在片状突触形成过程中，Rac1下游的作用蛋白还不明确，虽然有研究表明POR1可能在其中有作用。在肌动蛋白的极化过程中，N-Wasp起了Cdc42和Arp2/3间的相互作用，可能促进了丝状突出的形成。
β-PIX(PAK-interacting exchange factor，中文名PAK相互作用交换因子，PAKp21活化激酶)或p85 Cool-1(cloned out of library，文库克隆基因)在1997年由多个实验室克隆得到。作为PAK(P21活化激酶)相关的交换因子，β-PIX是小分子G蛋白Rho家族成员特异的鸟苷转换因子，由Src相似功能域3(SH3，一个或数个)，Dbl相似功能域(DH)，Pleckstrin相似功能域(PH)，脯氨酸富集区(PXXP)，Git-1结合区(GBD)，亮氨酸拉链区(LZ)组成。通过SH3功能域，β-PIX与PAK相互作用，刺激PAK的激酶活性，而β-PIX的鸟苷转换活性也会由于PAK的结合而大大增加。Seung-Hye Lee等人经过研究，发现β-PIX通过Cdc42/Rac/PAK/MEK3/6介导的通路，能刺激p38活性，形成膜突触，引起细胞迁移细胞吞噬等一系列行为。
另有研究表明，通过与PAK相互作用，PIX将PAK募集到Focal Adhesion(细胞骨架支持点)，通过催化形成GTP结合状态的Cdc42/Rac和直接与PAK结合，PIX参与PAK的活性调节。在PIX存在的情况下，PAK更易被活化，直接影响到细胞骨架变化和细胞的极化。此外，PAK参与调节MAP激酶途径，引起细胞周期的阻滞。
此外还有研究表明PAK还可以通过Ras-Raf-MeK-Erk通路影响细胞进程。但胞外的一系列信号是怎样传递引起细胞行为的改变，其机制还不明了。
最新的研究进展表明，β-PIX在其它一系列信号通路中都有重要作用。2003年，Wen Jin Wu及其同事经过研究，发现EGF(表皮生长因子)能够激活β-PIX与Cdc42。活化的Cdc42与β-PIX结合，抑制EGF受体的泛素化降解，使EGF受体大量积累，由EGF刺激的信号通路持续处于活化状态，最后导致细胞的转移病症(Cell 114715)。与此同时，Zhong Li等发现由G蛋白介导的Cdc42的激活是依赖与PIX和PAK的。这个由PIX、Cdc42、PAK参与的信号通路在免疫细胞的趋化性中有重要的作用(Cell 114215)。一些重要的细胞外信号，如表皮生长因子，神经生长因子，血小板来源的生长因子等能活化这类的Rho蛋白。Eun-Young Shin及其同事对PIX在由神经生长因子引起的信号传导中的作用进行了研究，发现β-PIX的突变明显抑制了PAK和Cdc42、Rac1的活性，表明β-PIX在这些蛋白的上游起作用。
SAP，即SH2D1A基因的克隆，将导致X染色体连锁的淋巴细胞增生综合症的基因突变进行了定位，对其蛋白产物SAP(SH2D1A)的研究揭示了XLP的病原学。X染色体连锁的淋巴增生综合症(XLP)是一种家族性的、致死的感染性单核细胞增多症，早在30多年前就被发现。在受EB(Epstein Barr)病毒感染前，XLP患者没有特别的异常；但一旦感染EB病毒，患者立即出现爆发性的感染性单核细胞增多症。导致死亡的主要原因是肝坏死，过量的细胞毒T细胞渗透和细胞因子分泌，严重贫血或全血细胞减少症，在有些情况下是因为进一步受细菌和真菌感染而导致死亡。
SAP是一个含128氨基酸的蛋白，由N端的一个SH2功能域和C端的26个氨基酸组成。SAP在T细胞，NK细胞(自然杀伤细胞)中表达，在淋巴细胞活化后表达有显著升高。SAP与一系列的信号分子作用，其中研究最多的是在活化的B细胞和T细胞(包括分泌伽马干扰素的T辅助细胞Th1)中表达的SLAM(淋巴细胞活化信号分子，即CD150)。SAP与SLAM结合，激活的信号传导，调控T细胞的活化。在NK细胞中， SAP与2B4结合，调节NK细胞的细胞毒作用。已知XLP患者的细胞毒作用有明显的减弱。SAP与一系列的信号分子作用，其中研究最多的是在活化的B细胞和T细胞(包括分泌伽马干扰素的T辅助细胞Th1)中表达的SLAM(淋巴细胞活化信号分子，即CD150)。SAP与SLAM结合，激活的信号传导，调控T细胞的活化。在NK细胞中，SAP与2B4结合，调节NK细胞的细胞毒作用。
Sylvain Latour及其同事对SAP在免疫调节中的作用进行了研究，发现SAP与多种免疫细胞受体蛋白如SLAM，2B4，Ly-9，CD48，NTB-A结合，参与细胞内信号传导过程。在T细胞中，SAP的SH2功能域与免疫细胞受体SLAM家族成员胞质部分的酪氨酸结合，使受体活化。同时，SAP与Fyn T(一种Src相关的蛋白酪氨酸激酶)的SH3功能与结合，募集并活化FynT，激活SAP介导的T细胞信号通路，调节免疫细胞的反应。但其在NK细胞(自然杀伤细胞)中的作用仍未得到解释。
2B4是在NK细胞中发现的一类新的CD2受体家族成员，在所有NK细胞，一部分CD8+T细胞，嗜碱性粒细胞和单核细胞中表达。其胞内部分通过TxYxxV/I的酪氨酸模式与SAP相互作用。在XLP患者中，由2B4介导的NK细胞信号通路存在缺陷。除了调节溶细胞作用，通过2B4活化的NK细胞的细胞因子分泌和侵入性也受到诱导。据有关文献报道，2B4可能通过两种信号途径调节自然杀伤细胞的杀伤作用，与SAP结合，激活NK细胞的细胞毒作用；与SHP-2结合，抑制NK细胞的细胞毒作用。Samuel S.Chuang等人的研究发现2B4介导的细胞毒作用是Ras/Raf依赖，并通过p38 MAPK(有丝分裂原活化蛋白)信号途径的。NK细胞受到细胞外信号刺激，通过2B4使NK细胞活化，p38和ERK MAPK通路得到激活，引起一系列的细胞学事件，如IFN-γ(干扰素-γ)分泌增加等。但在p38信号传导上游起作用的分子机制却不得而知。
因此，本领域迫切需要开发与免疫调节有关的途径，尤其是涉及SAP、2B4、或Cdc42等蛋白的途径。
发明内容
本发明的目的就是提供一种SAP、2B4和Cdc42等蛋白的，与免疫调节有关的途径，即SAP-PIX-Cdc42途径。
本发明的另一目的是筛选通过该SAP-PIX-Cdc42途径调节免疫水平的化合物。
在本发明的一个方面，提供了一种筛选通过SAP-PIX-Cdc42途径进行免疫调节的化合物的方法，包括步骤(a)在测试组中，向第一NK细胞培养物中添加待筛选的候选物，并检测培养物中IFN-γ分泌的表达情况，其中所述的第一NK细胞中表达SAP、PIX和Cdc42；(b)将步骤(a)测试组中IFN-γ分泌的表达情况与二个对照组中IFN-γ分泌的表达情况进行比较，其中所述的对照组包括(i)未添加候选物的第一NK细胞培养物和(ii)添加了候选物的第二NK细胞培养物，其中所述的第二NK细胞中表达SAP和Cdc42但不表达PIX，如果测试组中的IFN-γ分泌的表达水平在统计学上高于(优选显著高于)二个对照组，就表明该候选物是通过SAP-PIX-Cdc42途径进行免疫调节的化合物。
在本发明的一个优选例中，所述的免疫调节通过调节NK细胞的活性来实现。
在本发明的一个优选例中，所述的第二NK细胞是剔除PIX基因的NK细胞。
在本发明的一个优选例中，所述的免疫调节包括抑制淋巴增生、抑制肿瘤生长、增强自然杀伤细胞细胞毒作用。
在本发明的第二方面，提供了一种调节SAP-PIX-Cdc42途径的化合物的用途，用于制备免疫调节的药物。
在本发明的一个优选例中，所述的免疫调节包括抑制淋巴增生、抑制肿瘤生长、增强自然杀伤细胞细胞毒作用。
在本发明的第三方面，提供了一种调节SAP-PIX-Cdc42途径的化合物的用途，用于制备治疗淋巴增生的药物。
在本发明的第四方面，提供了一种用所述的方法获得的调节SAP-PIX-Cdc42途径的化合物。
图1显示了SAP和EAT2与β-PIX的相互作用。
图2显示了β-PIX通过其SH3区域与SAP相互作用。
图3显示了β-PIX的SH3功能域内点突变阻断了β-PIX与SAP的相互作用。
图4显示了β-PIX和FynT都与SAP相互作用。
图5显示了β-PIX结合到Cdc42上。
图6显示了β-PIX与Cdc42的相互作用减弱了其与SAP的相互作用。
图7显示了2B4、FynT、SAP、PIX、Cdc42、PAK、p38在信号通路中的相互关系。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现PIX同时与SAP和Cdc42存在较强的相互作用，从而证实了2B4-FynT-SAP通路与PIX-Cdc42通路是一个大通路中的两个部分(图7)，这两个亚通路通过SAP-PIX-Cdc42途径而构成了一个“有不同的免疫细胞受体起始的，通过SAP介导的，有不同下游分子参与的信号转到通路。”具体地，在一个实例中，以SAP(淋巴细胞信号活化分子相关蛋白)为诱饵，用酵母双杂交系统筛选B淋巴细胞、T淋巴细胞cDNA文库。得到了β-PIX的多个克隆，其中有的β-PIX克隆是C端缺失的，指示SAP与PIX的作用在N端，特别是其SH3功能域。随后，本发明人用免疫共沉淀方法验证了SAP和β-PIX的相互作用，并且确定两者通过β-PIX的SH3功能域与SAP中的SH2功能域相互作用。
NK细胞受到细胞外信号刺激，通过2B4使NK细胞活化，p38和ERK MAPK通路得到激活，引起一系列的细胞事件，如IFN-γ(干扰素-γ)分泌增加等。但在p38信号传导上游起作用的分子机制目前却不得而知。而SAP与PIX的相互作用为解释这个分子机制提供了线索。本发明人发现，胞外信号通过2B4使细胞活化，一系列膜受体如2B4，SLAM，NTB-A等磷酸化，此时，小分子接头蛋白SAP与磷酸化的受体结合，并将下游分子β-PIX募集，而β-PIX通过Cdc42/PAK/P38通路影响细胞的行为(见图7)。
基于本发明的新发现，SAP-PIX-Cdc42途径有着多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)筛选通过调节SAP-PIX-Cdc42途径进而调节NK细胞活性，从而促进免疫调节的物质(如促进剂、抑制剂或拮抗剂)。
这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出有效的相关药物。
SAP-PIX-Cdc42途径的调节剂，可以施用于个体，以调节免疫力水平(如增加NK细胞的细胞毒活性，促进TH2细胞的分化激活等。)。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或皮下给药。
本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量的(a)SAP-PIX-Cdc42途径的调节剂，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这些组合物可以调节免疫力。
通常，这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。
本发明的主要优点在于首次证实了细胞上的SAP-PIX-Cdc42途径，从而提供了通过调节该途径，进而调节NK细胞活性的方法，促进免疫调节。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1酵母双杂交筛选及验证根据已知的SAP基因序列(GenBank登录号AL023657)，以淋巴细胞cDNA文库为模板，用引物5’ATGGACGCAGTGGCTGTGTATC(SEQ ID NO1)，3’TCATGGGGCTTTCAGGCAGAC(SEQ ID NO2)，通过PCR技术获得SAP基因全长，将其与含有BD功能域(结合域)的载体pGB(Clonetech公司)相连得到质粒pGB-SAP作为诱饵，通过酵母双杂交系统(Clonetechyeast-two-hybridsystem2)筛选B淋巴细胞、T淋巴细胞cDNA文库，得到的克隆经测序鉴定，分别是SLAM，2B4，α-PIX，β-PIX(P21蛋白活化激酶相关的交换因子)的多个克隆。酵母双杂交系统筛选结果见表1。
以上述pGB-SAP野生型为模板，用点突变构建试剂盒QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司)，构建关键氨基酸点突变型(SH2功能域点突变)pGB-SAPR32Q，pGB-SAPR78A。
根据已知的β-PIX基因序列(GenBank序列号NM_003899.2)，以cDNA文库为模板，用引物5’ATGACCGATAATAGCAACAATCAACTG(SEQ ID NO3)，3’TTATAGATTGGTCTCATCCCAGGCAG(SEQ ID NO4)，通过PCR技术获得β-PIX基因全长，与酵母双杂交系统中含有AD功能域(活化域)的载体pACT2载体(clonetech公司)连接，得到pACT2-β-PIX。同时以此为模板，通过PCR方法构建β-PIX关键氨基酸点突变型，β-PIXW43G，W44P(构建方法同SAP点突变构建)；以β-PIX基因全长为模板，用引物5’ATGGTAAGAGCAAAGTTTAACTTCCAGCAG(SEQ ID NO5)，3’TTACTCGCGCACGTAGTTGCTGG(SEQID NO6)，通过PCR技术获得β-PIX-SH3功能域片断，与pACT2载体连接，得到pACT2-β-PIX-SH3，然后将pGB系统的质粒与pACT2系统的质粒分别共转染酵母细胞Y190(Clonetech公司)，确定它们有否相互作用。
表1酵母双杂交系统筛选结果
通过酵母双杂交系统，本发明人筛选到SAP与β-PIX的多个克隆相互作用，并对此一一进行了验证。其中SAP与SLAM，2B4的相互作用已有实验室报道(Sayos J等，The X-linked lymphoproliferativedisease gene product SAPregulates signals induced through the co-receptor SLAM，NATURE，395，462-469，1998；Tangye，S.G.，Human 2B4，an activating NK cell receptorrecruits the protein tyrosine phosphatase SHP-2 and the adaptorsignaling protein SAP.J.Immunol.162，6981-6985，1999)，证明了本发明人的酵母双杂交系统是稳定可信的。在筛选到的β-PIX多个克隆中，有些是C端缺失的，因而指示SAP与PIX的作用在N端，特别是其SH3功能域。
实施例2在哺乳动物细胞中验证SAP与β-PIX的相互作用1.在哺乳动物细胞中，SAP，EAT2与β-PIX存在相互作用将上述酵母质粒pGB-SAP和pACT2-β-PIX中的SAP，β-PIX基因片断克隆到含Flag、HA tag的真核表达载体pCDEF(参见美国专利US20020076415A1)中，构成pCDEF-HA-SAP和pCDEF-Flag-β-PIX。同时根据已知的EAT2基因序列(GenBank登录号AF256653)，以淋巴细胞cDNA文库为模板，用引物5’ATGGATCTGCCTTACTACCATGGAC(SEQ ID NO7)，3’TCAAGGCAAGACATCCACATAATCGC(SEQ ID NO8)，通过PCR技术获得EAT2(SAP在B淋巴细胞中的类似物)基因全长，将其克隆到pCDEF-HA载体上，得到pCDEF-HA-EAT2质粒。得到的质粒共转染哺乳动物细胞293T(ATCC)，培养24小时后，破碎细胞，收集裂解液上清，通过免疫共沉淀技术检验SAP与β-PIX在哺乳动物细胞中是否存在相互作用。具体实验方法简述如下将共转染有pCDEF-HA空载体，pCDEF-HA-SAP或pCDEF-HA-EAT2和pCDEF-Flag-β-PIX的细胞裂解液与抗HA-tag的抗体(Roche公司)和连有proteinG的琼脂糖(SantaCruz公司)在4度孵育4小时，共沉淀的蛋白样品用抗Flag的抗体(Roche公司)，通过Western blot方法，检测Flag-β-PIX是否被共沉淀下来。
结果见图1，共转染后的细胞HA-SAP，HA-EAT2和Flag-β-PIX的表达量都与预期的一致。抗HA的抗体能有效的将HA-SAP和HA-EAT2沉淀出来。当免疫共沉淀物用抗Flag的抗体检测时，Flag-β-PIX也被共沉淀出来，但共转染HA空载体的细胞裂解液中Flag-β-PIX不能被共沉淀出来。可见只有HA-SAP和HA-EAT2的存在，才能让β-PIX共沉淀，证明SAP与β-PIX之间确实存在相互作用。同时，SAP在B淋巴细胞中的同源类似物EAT2也与β-PIX存在相互作用。
本发明人通过免疫共沉淀(IP)技术在哺乳动物细胞中验证了SAP与β-PIX的相互作用。此外，作为SAP在B淋巴细胞中的类似物EAT2也与β-PIX相互作用，说明了β-PIX在B淋巴细胞中也有重要作用。
2.β-PIX通过其SH3功能域与SAP相互作用将上述酵母质粒pACT2-β-PIX-SH3中的基因片断克隆到含GST tag的真核表达载体pCDEF(参见美国专利US20020076415A1)中，构成pCDEF-GST-β-PIX-SH3质粒。将pCDEF-HA-SAP和pCDEF-GST空载体或pCDEF-GST-β-PIX-SH3共转染哺乳动物细胞293T，24小时后，破碎细胞，收集裂解液上清，将裂解液上清与连有谷胱甘肽的琼脂糖共孵育，得到的免疫沉淀物通过Western blot，用抗GST(Roche公司)，HA的抗体检测它们是有否共沉淀。
结果见图2。共转染后的细胞HA-SAP，GST-β-PIX-SH3的表达量都与预期的一致。连有谷胱甘肽的琼脂糖能有效的将GST-β-PIX-SH3沉淀出来。当免疫共沉淀物用抗HA的抗体检测时，HA-SAP也被共沉淀出来，但共转染pCDEF-GST空载体的细胞裂解液中HA-SAP不能被共沉淀出来。可见只有GST-β-PIX-SH3的存在，才能让HA-SAP共沉淀，证明β-PIX-SH3功能域足够与SAP相互作用，而且SAP与β-PIX-SH3功能域之间的相互作用特异的。
将上述酵母质粒pACT2-β-PIXW43G，W44P中的基因片断克隆到含Flag tag的真核表达载体pCDEF(参见美国专利US20020076415A1)中，构成pCDEF-Flag-β-PIXW43G，W44P质粒。将pCDEF-HA-SAP和pCDEF-Flag空载体，pCDEF-Flag-β-PIX或pCDEF-Flag-β-PIXW43G，W44P共转染哺乳动物细胞293T，24小时后，破碎细胞，收集裂解液上清，将裂解液上清与抗Flag的抗体和连有protein G的琼脂糖共孵育，得到的免疫沉淀物通过Western blot，用抗Flag，HA的抗体检测它们是有否共沉淀。
结果见图3。共转染后的细胞中HA-SAP，Flag-β-PIX，Flag-β-PIXW43G，W44P的表达量都与预期的一致。抗HA的抗体能有效的将HA-SAP沉淀出来。当免疫共沉淀物用抗Flag的抗体检测时，Flag-β-PIX被共沉淀出来，但β-PIX中SH3功能域关键氨基酸点突变β-PIXW43P，W44P不能被共沉淀出来。由此可见，β-PIX的SH3功能域中有特定的氨基酸介导SAP与β-PIX的特异性相互作用。
通过免疫共沉淀，本发明人确定了β-PIX通过其SH3功能域与SAP相互作用，这与酵母双杂交筛选得到的结果是相吻合的。β-PIX单独的SH3功能域能与SAP相互作用，而其SH3功能域内点突变W43GW44P阻断两者的相互作用。在以前的研究中，有实验室检验了许多蛋白如Fyn T，Lck，Yes，Vav等的SH3功能域是否能与SAP作用，结果表明，除Fyn T外，其它的SH3功能域与SAP没有相互作用(Sylvain Latour等，Binding of SAP SH2 domain to FynT SH3 domainreveals a novel mechanism of receptor signalling in immune regulation，NATURE CELL BIOLOGY，Advance Online Publication，149-154，2003)。在此本发明人得到了另一个与SAP相互作用的SH3功能域。
3.SAP通过其SH2功能域与β-PIX相互作用以野生型pCDEF-HA-SAP为模板，用点突变PCR技术获得SAP关键点氨基酸突变型R32Q和R78A质粒pCDEF-HA-SAPR32K，pCDEF-HA-SAPR78A(同实施例1中SAP点突变构建)。将pCDEF-HA空载体，pCDEF-HA-SAP，pCDEF-HA-SAPR32K或pCDEF-HA-SAPR78A和pCDEF-Flag-β-PIX共转染哺乳动物细胞293T，24小时后，破碎细胞，收集裂解液上清，将裂解液上清与抗HA的抗体和连有protein G的琼脂糖共孵育，得到的免疫沉淀物通过Western blot，用抗Flag，HA的抗体检测它们是有否共沉淀。
结果见图4。共转染后的细胞中HA-SAP，HA-SAPR32K， HA-SAPR78A和Flag-β-PIX的表达量都与预期的一致。抗HA的抗体能有效的将等量的HA-SAP，HA-SAPR32K，HA-SAPR78A沉淀出来。当免疫共沉淀物用抗Flag的抗体检测时，与HA-SAP，HA-SAPR32K共转染的细胞中Flag-β-PIX被共沉淀出来，但与HA-SAPR78A共转染的细胞中，β-PIX未能共沉淀出来。由此可见，SAP通过其SH2功能域与β-PIX相互作用，其中78位的精氨酸是必须的，而32位的精氨酸不是必须的。
在以前的研究中，人们发现，SAP的主要结构是一个SH2功能域，在三维结构中，这个功能域会形成两个面，一面介导SAP与膜上受体的结合，另一面介导SAP与下游效应分子如FynT的结合(Sylvain Latour等，Binding of SAPSH2 domain to FynT SH3 domain reveals a novel mechanism of receptorsignalling in immune regulation，NATURE CELL BIOLOGY，Advance OnlinePublication，149-154，2003)。在SAP的立体结构中，有两个关键的氨基酸R32和R78起重要作用。R32K这个突变型能阻断SAP与膜上受体如SLAM的结合，R78A则阻断SAP与下游分子如FynT的结合。在SAP与β-PIX的相互作用中，同样如此，R78A突变型阻断了两者的相互作用，而R32K这个突变型对两者的作用并无影响。由此说明，Fyn T和β-PIX通过与SAP结合，介导了不同的信号通路。
至此，本发明人确定了SAP与β-PIX的相互作用，并确定了两者相互作用的功能域。
实施例3用免疫共沉淀技术技术研究SAP与β-PIX及Cdc42的相互作用1.用免疫共沉淀技术验证β-PIX与Cdc42的相互作用根据已知的Cdc42(Homo sapiens cell division cycle 42)基因序列(GenBank登录号NM_001791)，以淋巴细胞cDNA文库为模板，用引物5’ATGCAGACAATTAAGTGTGTTGTTGTG(SEQ ID NO9)；3’TCATAGCAGCACACACCTGCGG(SEQ ID NO10)，通过PCR技术获得Cdc42基因全长，连接到pCDEF-GST载体上，得到pCDEF-GST-Cdc42。以此为模板，通过点突变方法(同实施例1中SAP点突变构建)，构建活化状态的Cdc42突变pCDEF-GST-Cdc42F28L和失活状态的Cdc42突变pCDEF-GST-Cdc42T17N。将pCDEF-GST空载体，pCDEF-GST-Cdc42，pCDEF-GST-Cdc42F28L，或pCDEF-GST-Cdc42T17N和pCDEF-Flag-β-PIX共转染哺乳动物细胞293T，24小时后，破碎细胞，收集裂解液上清，将裂解液上清与连有谷胱甘肽的琼脂糖共孵育，得到的免疫沉淀物通过Western blot，用抗GST，Flag的抗体检测它们是有否共沉淀。
结果见图5。共转染后的细胞GST-Cdc42，GST-Cdc42F28L，GST-Cdc42T17N和Flag-β-PIX的表达量都与预期的一致。连有谷胱甘肽的琼脂糖能有效的将GST-Cdc42，pCDEF-GST-Cdc42F28L和pCDEF-GST-Cdc42T17N沉淀出来。当沉淀复合物用抗Flag的抗体检测时，Flag-β-PIX能与野生型GST-Cdc42和活化状态的GST-Cdc42F28L一起共沉淀出来，但GST空载和GST-Cdc42T17N不能与Flag-β-PIX共沉淀出来。可见只有野生型和活化状态的Cdc42与β-PIX结合，而失活的Cdc42与β-PIX间没有相互作用。
此外，通过免疫共沉淀技术，本发明人发现，阻断与SAP相互作用的β-PIX关键点突变型(W43GW44P)β-PIXW43G，W44P仍与Cdc42相互作用，结果见图5。所以，β-PIX并不通过其SH3功能域与Cdc42相互作用，说明三者可形成复合物在信号通路中起作用。
2.β-PIX与Cdc42的作用对与SAP的相互作用的影响将pCDEF-GST空载体，pCDEF-GST-Cdc42，pCDEF-GST-Cdc42F28L，或pCDEF-GST-Cdc42T17N和pCDEF-Flag-β-PIX及pCDEF-HA-SAP三者共转染哺乳动物细胞293T，24小时后，破碎细胞，收集裂解液上清，将裂解液上清与连有谷胱甘肽的琼脂糖共孵育，得到的免疫沉淀物通过Western blot，用抗GST，Flag，HA的抗体检测是有否共沉淀。
结果见图6。共转染后的细胞GST-Cdc42，GST-Cdc42F28L，GST-Cdc42T17N和Flag-β-PIX，HA-SAP的表达量都与预期的一致。将细胞裂解液分为两份，一半与连有谷胱甘肽的琼脂糖孵育，将GST-Cdc42，pCDEF-GST-Cdc42F28L和pCDEF-GST-Cdc42T17N沉淀出来。当沉淀复合物用抗Flag的抗体检测时，Flag-β-PIX能与GST-Cdc42和活化状态的GST-Cdc42F28L一起共沉淀出来，但GST空载和GST-Cdc42T17N不能与Flag-β-PIX共沉淀出来。这与图5中的实验结果一致。但沉淀复合物用抗HA的抗体检测时，未能检测到HA-SAP的存在，所以没能检测到Cdc42，β-PIX与SAP的三聚体复合物。同时，另一半的细胞裂解液与抗HA抗体孵育，将HA-SAP沉淀出来。当沉淀复合物用抗Flag的抗体检测被共沉淀出来的β-PIX的量，结果发现，有Cdc42与Cdc42F28L的存在减弱了SAP与β-PIX的结合。该结果提示，三者的结合是有条件的，比如需要外界因子的刺激。
从过量表达后免疫共沉淀的结果看，β-PIX与Cdc42的作用减弱了其与SAP的相互作用，提示了SAP与β-PIX的相互作用在信号通路中可能有其它的重要意义。鉴于X染色体连锁的淋巴细胞增生综合症的复杂性和SAP基因在免疫信号通路中的作用，SAP可能通过与不同的下游分子结合，如β-PIX和FynT，参与了不同的调节途径。
实施例4用IFN-γ分泌实验研究SAP和β-PIX介导的信号通路对免疫系统调节的影响将野生型SAP，SAPR32Q，SAPR78A，β-PIX，β-PIXW43G，W44P，基因构建到逆转录病毒载体pMX(获自Lewis.L.Lanier，University of California)上，得到pMX-SAP，pMX-SAPR32Q，pMX-SAPR78A，pMX-β-PIX，pMX-β-PIXW43G，W44P，将这些质粒分别转染293T细胞，同时共转染pCI-PG8和Pci-VSV这两种逆转录病毒包装载体，培养48小时后收病毒上清，用病毒上清感染自然杀伤类似细胞NKL(来自ATCC)，培养三天后观察感染情况。当细胞长到一定数量后用流式细胞仪筛选感染阳性的细胞，得到相应基因稳定表达阳性的细胞群。分别测定这些细胞群IFN-γ分泌情况，IFN-γ分泌的测定用Human IFN-γImmunoassay(RnD公司)试剂盒。在相应的细胞群中加入被测的免疫调节化合物，培养一定时间后测定IFN-γ分泌情况。
如果在稳定表达β-PIX和β-PIXW43G，W44P中的细胞中分泌量不同，则提示该化合物可能通过影响SAP-β-PIX的作用而影响细胞的免疫调节。对于粗筛的化合物，可以进一步通过其他试验进一步验证。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海睿星基因技术有限公司<120>抗肿瘤免疫反应中的重要调控基因PIX<130>053602<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>引物<400>1atggacgcag tggctgtgta tc22<210>2<211>21<212>DNA<213>引物<400>2tcatggggct ttcaggcaga c 21<210>3
<211>27<212>DNA<213>引物<400>3atgaccgata atagcaacaa tcaactg 27<210>4<211>26<212>DNA<213>引物<400>4ttatagattg gtctcatccc aggcag26<210>5<211>30<212>DNA<213>引物<400>5atggtaagag caaagtttaa cttccagcag 30<210>6<211>23<212>DNA<213>引物
<400>6ttactcgcgc acgtagttgc tgg 23<210>7<211>25<212>DNA<213>引物<400>7atggatctgc cttactacca tggac 25<210>8<211>26<212>DNA<213>引物<400>8tcaaggcaag acatccacat aatcgc2权利要求
1.一种筛选通过SAP-PIX-Cdc42途径进行免疫调节的化合物的方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向第一NK细胞培养物中添加待筛选的候选物，并检测培养物中IFN-γ分泌的表达情况，其中所述的第一NK细胞中表达SAP、PIX和Cdc42；(b)将步骤(a)测试组中IFN-γ分泌的表达情况与二个对照组中IFN-γ分泌的表达情况进行比较，其中所述的对照组包括(i)未添加候选物的第一NK细胞培养物和(ii)添加了候选物的第二NK细胞培养物，其中所述的第二NK细胞中表达SAP和Cdc42但不表达PIX，如果测试组中的IFN-γ分泌的表达水平在统计学上高于二个对照组，就表明该候选物是通过SAP-PIX-Cdc42途径进行免疫调节的化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的免疫调节通过调节NK细胞的活性来实现。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二NK细胞是剔除PIX基因的NK细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的免疫调节包括抑制淋巴增生、抑制肿瘤生长、增强自然杀伤细胞细胞毒作用。
5.一种调节SAP-PIX-Cdc42途径的化合物的用途，其特征在于，用于制备免疫调节的药物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的免疫调节包括抑制淋巴增生、抑制肿瘤生长、增强自然杀伤细胞细胞毒作用。
7.一种调节SAP-PIX-Cdc42途径的化合物的用途，其特征在于，用于制备治疗淋巴增生的药物。
8.一种用权利要求1所述的方法获得的调节SAP-PIX-Cdc42途径的化合物。
全文摘要
本发明公开了一种筛选通过SAP－PIX－Cdc42途径进行免疫调节的化合物的方法。本发明还公开了SAP－PIX－Cdc42途径调节剂在制备免疫调节药物方面的用途。本发明首次证实了细胞上的SAP－PIX－Cdc42途径，从而可通过调节该途径促进免疫力。
文档编号A61P35/00GK1952166SQ20051003103
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者吴骏, 顾翠萍 申请人:上海睿星基因技术有限公司