专利名称：热致相分离制备有机和无机纳米复合组织工程支架材料的方法
技术领域：
本发明属于组织工程用多孔支架材料技术领域，具体涉及一种热致相分离制备有机/无机纳米复合组织工程支架材料的方法。
背景技术：
骨组织工程支架不仅为特定细胞提供结构支撑作用，而且还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。因此，在组织工程中，必须考虑多孔三维细胞支架的结构，如孔隙形态、大小、连通性、孔隙率等，以利于细胞的黏附、渗透和营养物质的传送及代谢产物的交换，而支架的结构取决于三维多孔支架制备方法。
现行的三维多孔支架的制备方法主要有溶剂浇铸/颗粒滤沥法、气体发泡法、超临界CO2发泡法和热致相分离法。
溶剂浇铸/粉体沥滤是组织工程支架材料制孔方法中最简便和研究最广泛的技术之一。该技术通过控制致孔剂的形态、颗粒大小以及致孔剂与可降解材料的比例，能够方便地控制三维支架的孔隙率、孔隙尺寸和形态，因而受到广泛的关注。但这种方法不适合用于制备大体积三维支架，因为在致孔剂与高分子聚合物形成的混合物中，被聚合物包裹致孔剂颗粒间连通性差，造成支架的孔隙间连通性差；当致孔剂与聚合物基体形成的混合物体积增大时，溶剂不能有效地将致孔剂从混合物中浸取出来。
气体发泡技术采用气体作为致孔剂，在制孔过程中不使用有机溶剂。这种利用CO2热不稳定性制成的聚合物泡沫，避免了有机溶剂的细胞毒作用和高温处理的影响，是一种较理想的细胞种植载体，尤其有利于负载生长因子作用于种植细胞。但该方法对设备要求高，微孔结构不易控制且常形成封闭气孔。
超临界CO2发泡法是利用超临界CO2在多种聚合物中具有很好的渗透性的特点，以之为致孔剂进行制孔。而且超临界CO2化学性质稳定、无毒性、无腐蚀性、难燃难爆，临界状态容易实现(临界温度31.1℃，临界压力7.4Mpa)，临界温度接近常温，对生理活性物质、酶及蛋白质等热敏性物质无破坏作用，可用于制备大体积组织工程支架材料。但因为超临界CO2流体在聚合物基体中的渗透运动无规律，所以制备的材料孔径、孔隙率及连通性很难控制。
热致相分离法(Thermally Induced Phase Separation，TIPS)可以应用于许多由于溶解度差而不能用湿、干相分离方法解决微孔成型的聚合物中。从实质上讲，TIPS过程就是利用了一种潜在溶剂，其在高温时是溶剂而低温时又是非溶剂，失去溶剂能力的不相溶性是因为失去了热能(即热作为相分离的驱动力)。因为潜在溶剂是非挥发性的，需要用对于潜在溶剂是溶剂、对于聚合物是非溶剂的一种液体将其从成品中萃取出来，从而形成微孔结构。该方法是所有相分离方法中最普遍适用的方法，既可用于极性聚合物，也可用于非极性聚合物；该方法在成型过程中需要控制的参数较少，过程容易实现稳定和连续；而且根据现有的材料，TIPS过程所形成的微观结构却多种多样，更容易满足微孔材料的特殊要求；另外有热致相分离法能产生厚截面上各向相同的微孔结构，这一特性使得TIPS法在制备大体积组织工程支架材料方面具有独特的优势。
Nam等[1]利用热致相分离法制备了PLGA、PLLA、PDLLA多孔支架，溶剂为水和二氧六环的混合物，溶剂的除去采用冷冻干燥的方法，通过控制降温条件可获得不同孔径和孔形态的多孔材料。Peter等[2]利用热致相分离法，采用四氢呋喃作为溶剂制备了PLLA多孔支架，四氢呋喃的去除采用水抽提的方法，最后利用冷冻干燥的方法除去水。通过控制相分离温度可以获得片状或纤维壮的多孔支架。Whang[3]等将PLGA的二氯甲烷溶液与水混合迅速搅拌为乳液，然后在液氮中淬冷，冷冻干燥后得到了PLGA多孔支架材料。
1.Nam Y.S.，Park T.G.，Biodegradable polymeric microcellular foams bymodified thermally induced phase separation method.Biomaterials，1999，201783-17902.Peter X.Ma，Ruiyun Zhang.Synthetic nano-scale fibrous extracellularmatrix.Journal of Biomedical Materials Research.，1999，4660-723.Wang K.，Tomas C.H.，Healy K.E..A novel method to fabricate bioabsorbablescaffolds.Polymer，1995，36837-842发明内容本发明的目的在于提出一种制备亲水性好、强度高、孔径合适、孔隙率高和孔连通性好的有机和无机纳米复合组合工程支架材料的方法。
本发明提出的制备有机和无纳米复合组合工程支架材料的方法，其具体步骤如下(1)将无机纳米粉体置于有机溶剂和去离子水的溶液中，于30-70℃水溶液中超声振荡至分散均匀；(2)在超声振荡的同时向其中加入可降解聚合物，直至聚合物全部溶解，无机纳米粉体均匀分散在溶液中，形成均一的混合体系；(3)将混合体系降至混合体系浊点温度下10-20℃，静置一段时间，使之发生相分离；
(4)将上述混合物于-10--196℃下速冻成型，并保温0.5-24小时，使其固化彻底；(5)将上述产物置于冷冻干燥机中，-20--60℃冷冻干燥24-30小时，以彻底脱除稀释；(6)将上述产物置于烘箱中，升温至聚合物Tg以上5-20℃，保温6-24小时，然后自然冷却至室温，得到所述组织工程多孔支架材料。
本发明中步骤(1)所采用的无机粉体为羟基磷灰石(HA)、β-磷酸三钙或羟基磷灰石/β-磷酸三钙双相钙磷陶瓷等无机生物陶瓷的纳米粉体。
本发明中步骤(1)所采用的有机溶剂为四氢呋喃、1，4-二氧六环或二氯甲烷，有机溶剂和去离子水溶液中有机溶剂与去离子水的体积比为95∶5到85∶15。
本发明中步骤(2)所采用的可降解聚合物为聚乙醇酸、乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚羟基丁酸酯及其共聚物、胶原、壳聚糖等之一种，或者为上述聚合物的混合物，以及它们之间的共聚物，还包括上述聚合物的不同空间结构的产物，如左旋聚乳酸(PLLA)、右旋聚乳酸(PDLA)和内消旋聚乳酸(PDLLA)本发明中步骤(2)的聚合物溶液浓度为4-15％(w/v)，所采用的聚合物与无机粉体的质量比为70∶30-100∶0。当无机粉体掺量为0时，所制备的多孔支架为纯聚合物组织工程支架材料。通常，聚合物与无机粉体的质量比为70∶30-95∶5。
本发明充分结合无机生物陶瓷和可降解聚合物的性能特点，将无机纳米生物陶瓷粉体均匀分散在聚合物基体中，使之互相取长补短，得到了强度高，亲水性好，具有合适孔径、高度孔隙率、良好孔连通性和生物相容性的组织工程用多孔有机/无机纳米复合支架材料。支架材料的孔径、孔隙率由热致相分离工艺中的温度、时间等参数决定，强度、连通性和亲水性受无机纳米粉体掺量影响，因此本方法可用于制备孔径、孔隙率、强度、连通性及亲水性可控的多孔组织工程支架材料，且简便易行。
图1是本发明工艺流程图。
图2是不同分辨率下纳米羟基磷灰石/左旋聚乳酸复合多孔支架材料的扫描电镜照片。其中(a)为较高分辨率，(b)为较低分辨率。其中，羟基磷灰石∶左旋聚乳酸＝10∶90(w∶w)，聚乳酸浓度＝10％(w/v)，1，4-二氧六环∶去离子水＝87∶13(v/v)，粗化温度9℃，粗化时间6小时。
图3是不同浓度HA/PLGA(HA∶PLGA＝5∶95)的1，4-二氧六环/水(87/13)溶液5℃下粗化6小时所得支架的扫描电镜照片。其中(a)、(b)、(c)为8％(w/v)，(d)、(e)、(f)为10％(w/v)。
图4是10％(w/v)HA/PLGA(HA∶PLGA＝5∶95)的1，4-二氧六环/水(87/13)溶液在不同粗化温度下粗化6小时所得支架的扫描电镜照片。其中(a)、(e)、(c)为9℃，(d)、(b)、(f)为5℃。
图5是8％(w/v)PLGA的1，4-二氧六环/水(87/13)溶液经不同粗化时间下所得支架的扫描电镜照片。其中，(a)、(b)为2h；(c)、(d)为4h；(e)、(f)为8h。
图6是不同HA掺量10％(w/v)HA/PLGA的二氧六环/水(87/13)溶液9℃下粗化6小时所得支架的扫描电镜照片。其中，(a)、(b)为5wt％；(c)、(d)为10wt％；(e)、(f)为20wt％。
图7为不同HA含量的HA/PLGA支架吸水率随浸泡时间变化的曲线。
图8为HA掺量对HA/PLGA支架掺量抗压强度的影响曲线。
具体实施例方式
实施例1.有机/无机纳米复合组织工程支架材料的制备称取0.1克纳米羟基磷灰石置于9ml的1，4-二氧六环/去离子水(87/13)溶液中，于50℃水溶液中超声振荡至分散均匀。在超声振荡的同时向其中加入0.9克左旋聚乳酸(PLLA)，直至聚合物全部溶解，纳米羟基磷灰石粉体均匀分散在溶液中，形成均一的混合体系。将混合体系降至混合体系浊点温度下15℃(9℃)静置6小时，使之发生相分离。将样品于零下50℃下速冻成型，并保温12小时使其固化彻底。将样品置于冷冻干燥机中，零下40℃冷冻干燥36小时以彻底脱除稀释剂。将样品置于烘箱中，升温至65℃，保温12小时，然后自然冷却至室温，得到多孔支架材料。图2为所得支架材料的扫描电镜照片。
实施例2.通过聚合物浓度控制多孔支架材料的结构和性能按照应用实例1中的方法制备纳米羟基磷灰石/乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)多孔支架，改变共聚物PLGA浓度，得到不同浓度HA/PLGA(HA∶PLGA＝5∶95)的1，4-二氧六环/水(87/13)溶液5℃下粗化6小时所得支架。图3中(a)，(b)，(c)为8％(w/v)聚合物浓度下所得支架材料扫描电镜照片，(d)，(e)，(f)为10％(w/v)聚合物浓度下所得支架材料扫描电镜照片。由图3可见多孔支架的孔径可通过调节聚合物浓度进行控制。通过聚合物浓度还可以控制支架材料的孔隙率，见表1。
实施例3.通过粗化温度控制多孔支架材料的结构按照应用实例1中的方法制备纳米羟基磷灰石/乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)多孔支架，在不同的粗化温度下制备多孔支架，得到10％(w/v)HA/PLGA(HA∶PLGA＝5∶95)的二氧六环/水(87/13)溶液不同粗化温度下粗化6小时所得支架。图4中(a)、(e)、(c)为9℃粗化温度下所得支架材料的扫描电镜照片；(d)、(b)、(f)为为5℃粗化温度下所得支架材料的扫描电镜照片。由图4可见多孔支架的孔径可通过调节粗化温度进行控制。
实例4.通过粗化时间控制多孔支架材料的结构和性能按照应用实施例1中的方法制备纯乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)多孔支架，经不同的粗化时间制备多孔支架，得到8％(w/v)PLGA的二氧六环/水(87/13)溶液不同粗化时间下所得支架.所得支架。图5(a)、(b)为经过2h粗化后所得支架材料的扫描电镜照片，(c)、(d)为为经过4h粗化后所得支架材料的扫描电镜照片4h，(e)、(f)为8h。为经过8h粗化后所得支架材料的扫描电镜照片。由图5可见多孔支架的孔径可通过调节粗化时间进行控制。
实施例5.通过无机粉体掺量控制多孔支架材料的结构和性能按照应用实施例1中的方法制备纳米羟基磷灰石/乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)多孔支架，加入不同掺量的纳米羟基磷灰石粉体，得到不同HA掺量10％(w/v)HA/PLGA的二氧六环/水(87/13)溶液9℃下粗化6小时所得支架。图6(a)、(b)为纳米羟基磷灰石粉体掺量为(HA∶PLGA＝5∶95w∶w)时所得支架材料的扫描电镜照片；(c)、(d)为纳米羟基磷灰石粉体掺量为(HA∶PLGA＝10∶90w∶w)时所得支架材料的扫描电镜照片；(e)、(f)为纳米羟基磷灰石粉体掺量为(HA∶PLGA＝20∶80w∶w)时所得支架材料的扫描电镜照片。由图6可见多孔支架的孔径可通过调节无机粉体掺量进行控制。
通过改变无机粉体掺量可以控制多孔支架材料的孔隙率。表2为不同HA掺量10％(w/v)HA/PLGA的二氧六环/水(87/13)溶液9℃下粗化6小时所得支架孔隙率，从中可见多孔支架的孔隙率可通过调节无机粉体掺量进行控制。
通过改变无机粉体掺量也可以提高多孔支架材料的亲水性。图7为不同HA含量的HA/PLGA支架吸水率随浸泡时间变化的曲线，从中可见多孔支架的亲水性随无机粉体掺量提高而得到明显改善。
通过改变无机粉体掺量还可以提高多孔支架材料的强度。图8为HA掺量对HA/PLGA支架掺量抗压强度的影响曲线，从中可见多孔支架的强度随无机粉体掺量提高而提高。
实施例6.β-TCP/PLGA纳米复合组织工程支架材料的制备称取0.1克纳米β-TCP置于9ml的1，4-二氧六环/去离子水(87/13)溶液中，于50℃水溶液中超声振荡至分散均匀。在超声振荡的同时向其中加入0.9克PLGA，直至聚合物全部溶解，β-TCP粉体均匀分散在溶液中，形成均一的混合体系。将混合体系降至混合体系浊点温度下15℃(7℃)静置8小时，使之发生相分离。将样品于零下50℃下速冻成型，并保温20小时使其固化彻底。将样品置于冷冻干燥机中，零下40℃冷冻干燥50小时以彻底脱除稀释剂。将样品置于烘箱中，升温至65℃，保温12小时，然后自然冷却至室温，得到多孔支架材料。
实施例7.β-TCP/PCL纳米复合组织工程支架材料的制备称取0.1克纳米β-TCP置于9ml的1，4-二氧六环/去离子水(87/13)溶液中，于50℃水溶液中超声振荡至分散均匀。在超声振荡的同时向其中加入0.9克PCL，直至聚合物全部溶解，β-TCP粉体均匀分散在溶液中，形成均一的混合体系。将混合体系降至混合体系浊点温度下15℃(12℃)静置5小时，使之发生相分离。将样品于零下50℃下速冻成型，并保温10小时使其固化彻底。将样品置于冷冻干燥机中，零下40℃冷冻干燥40小时以彻底脱除稀释剂。将样品置于烘箱中，升温至65℃，保温12小时，然后自然冷却至室温，得到多孔支架材料。
实施例8.HA/PCL纳米复合组织工程支架材料的制备称取0.1克纳米羟基磷灰石置于9ml的1，4-二氧六环/去离子水(87/13)溶液中，于50℃水溶液中超声振荡至分散均匀。在超声振荡的同时向其中加入0.9克PCL，直至聚合物全部溶解，纳米羟基磷灰石粉体均匀分散在溶液中，形成均一的混合体系。将混合体系降至混合体系浊点温度下15℃(12℃)静置5小时，使之发生相分离。将样品于零下50℃下速冻成型，并保温10小时使其固化彻底。将样品置于冷冻干燥机中，零下40℃冷冻干燥40小时以彻底脱除稀释剂。将样品置于烘箱中，升温至65℃，保温12小时，然后自然冷却至室温，得到多孔支架材料。
实施例9.HA/PU纳米复合组织工程支架材料的制备称取0.1克纳米羟基磷灰石置于9ml的1，4-二氧六环/去离子水(87/13)溶液中，于50℃水溶液中超声振荡至分散均匀。在超声振荡的同时向其中加入0.9克PU，直至聚合物全部溶解，纳米羟基磷灰石粉体均匀分散在溶液中，形成均一的混合体系。将混合体系降至混合体系浊点温度下15℃(5℃)静置10小时，使之发生相分离。将样品于零下50℃下速冻成型，并保温20小时使其固化彻底。将样品置于冷冻干燥机中，零下40℃冷冻干燥54小时以彻底脱除稀释剂。将样品置于烘箱中，升温至65℃，保温12小时，然后自然冷却至室温，得到多孔支架材料。
表1不同PLGA浓度、粗化时间下所得HA/PLGA(HA/PLGA∶5∶95)支架孔隙率
表2不同HA掺量10％(w/v)HA/PLGA的二氧六环/水(87/13)溶液9℃下粗化6小时所得支架孔隙率
权利要求
1.一种热致相分离制备有机和无机纳米复合组织工程支架材料的方法，其特征在于具体步骤如下(1)将无机纳米粉体置于有机溶剂和去离子水的溶液中，于30-70℃水溶液中超声振荡至分散均匀；(2)在超声振荡的同时向其中加入可降解聚合物，直至聚合物全部溶解，无机纳米粉体均匀分散在溶液中，形成均一的混合体系；(3)将混合体系降至混合体系浊点温度下10-20℃，静置一段时间，使之发生相分离；(4)将上述混合物于-10--196℃下速冻成型，并保温0.5-24小时，使其固化彻底；(5)将上述产物置于冷冻干燥机中，-20--60℃冷冻干燥24-30小时，以彻底脱除稀释；(6)将上述产物置于烘箱中，升温至聚合物Tg以上5-20℃，保温6-24小时，然后自然冷却至室温，得到所述组织工程多孔支架材料。
2.按权利要求1所述的热致相分离制备有机和无机纳米复合组织工程支架材料的方法，其特征在于所采用的无机纳米粉体为羟基磷灰石、β-磷酸三钙或羟基磷灰石与β-磷酸三钙双相钙磷陶瓷。
3.按权利要求1所述的热致相分离制备有机和无机纳米复合组织工程支架材料的方法，其特征在于所采用的有机溶剂为四氢呋喃、1，4-二氧六环或二氯甲烷，有机溶剂与去离子水的体积比为95∶5到85∶15。
4.按权利要求1所述的热致相分离制备有机和无机纳米复合组织工程支架材料的方法，其特征在于所采用的可降解聚合物为聚乙醇酸、乳酸一乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚羟基丁酸酯及其共聚物、胶原、壳聚糖之一种，或者为上述聚合物的混合物和它们之间的共聚物，或者为上述聚合物的不同空间结构的产物。
5.按权利要求1所述的热致相分离制备有机和无机纳米复合组织工程支架材料的方法，其特征在于所制备的聚合物溶液浓度为4-15％(w/v)。
6.按权利要求1所述的热致相分离制备有机和无机纳米复合组织工程支架材料的方法，其特征在于所采用的可降解聚合物与无机纳米粉体的质量比为70/30到100/0。
全文摘要
本发明涉及一种热致相分离制备有机和无机纳米复合组织工程支架材料的方法。其步骤为首先将无机纳米粉体超声分散在聚合物溶液中，形成均一的混合体系，然后降低温度，使混合体系在一定温度下粗化一段时间，使聚合物溶液发生相分离，再采用冷冻干燥法去除溶剂，得到多孔的组织工程支架材料，并对支架进行退火处理以提高其强度，最终得到有机/无机纳米复合组织工程支架材料。该方法操作过程简单，所得多孔支架材料连通性较好，材料内部均匀分布着相互连通的大小不同的孔洞，孔径和孔隙率由制备工艺决定，连通性、亲水性和强度受无机粉体掺量影响。同时本方法还具有成本低，工艺简单，应用前景广阔。
文档编号A61L33/00GK1792379SQ20051003099
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月3日 优先权日2005年11月3日
发明者任杰, 周新宇 申请人:同济大学