专利名称：人溶菌酶散剂、制法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药，特别是人溶菌酶药物。
背景技术：
抗生素创造了许多医学奇迹，使许多疾病消失无踪，如肺炎、脑膜炎、产褥热、败血症、结核等。21世纪的今天，耐药菌的发展令人触目惊心。如耐青霉素的肺炎链球菌，过去对青霉素、红霉素、磺胺等药品都很敏感，现在几乎“刀枪不入”。从细菌的耐药发展史可以看出，在某种新的抗生素出现以后，就有一批耐药菌株出现。开发一种新的抗生素一般需要10年左右时间，而一代耐药菌的产生只要2年的时间，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的发展速度。目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于临床治疗。
痱子也称为栗粒疹、汗疹，是由于在温热环境中汗液分泌多，不易蒸发，汗液使表皮角质层浸渍，致使汗液导管口闭塞，导管内汗液潴留，压力增高而导管破裂，汗液渗入周围组织，引起刺激和炎症，汗口处发生小疱和丘疹。此外，皮肤表面温暖湿潤可促进表皮葡萄球菌繁殖，葡萄球菌可堵塞汗孔或沿汗管感染，形成痱子皮肤病，痱子严重细菌感染形成间檫疹。根据汗腺导管堵塞部位的深浅及疱液内容，临床分为以下几种1、晶形栗粒疹2、红色栗粒疹3、脓疱性栗粒疹4、深部栗粒疹。此病在温暖潮湿地区及夏季多见，多急性发病，好发于手背、颈、躯干、乳房下、腋下及皮肤皱褶处，肥胖、产妇及婴幼儿受害最大。目前治疗痱子、间檫疹多是用上述抗菌素，病症消除慢，容易反复发作。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足，提供一种重组人溶菌酶散剂，剂型合理，特别是针对皮肤病，效果特别佳。另外还提供散剂的制法及其应用范围。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是人溶菌酶散剂，含有人溶菌酶活性1500U～300万U/ml/g。
所述人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶或者基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或者基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
本发明人溶菌酶散剂含有下述重量份比原料，纯度95％～99％人溶菌酶1500U～30万U/ml/g，滑石粉4～780。
较好的配方为下述三种配方一由下述各原料按所述重量份比配制而成纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶1500U～30万U/ml/g，香料10～30，薄荷脑10～100，硼酸粉10～50，樟脑1～10，冰片5～30，滑石粉64～780。
制备方法是(1)用适量酒精把香料和冰片溶解备用，(2)将薄荷脑、樟脑、硼酸研细，研匀，过100～120目筛备用，将(1)和(2)与滑石粉等各种粉料混合混匀，最后将人溶菌酶加入充分混匀，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，即得成品散剂。
配方二由下述各原料按所述重量份比配制而成纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶1500U～30万U/ml/g，滑石粉74～780，硼酸粉4～40，桉叶油2～20，香料5～30，薄荷脑10～100，冰片5～30。
制备方法是(1)用适量酒精把香料、桉叶油和冰片溶解备用，(2)将薄荷脑、硼酸研细，研匀，过100～120目筛备用，将(1)和(2)与滑石粉等各种粉料混合，充分混匀，最后将人溶菌酶加入充分混匀，在符合GMP要求的制药工厂按制药规程完成制成散剂。
配方三由下述各原料按所述重量份比配制而成纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g，麝香草脑6～60，樟脑1～10，吡咯烷酮羧铝10～100，薄荷脑10～100，滑石粉52～550，高岭土15～150，香料3～30，冰片3～30。
制备方法是(1)用适量酒精把香料和冰片溶解备用，(2)将薄荷脑、麝香草脑、樟脑、吡咯烷酮羧铝研溶过100～120目筛备用，(3)将滑石粉、高岭土粉碎研匀(滑石粉、高岭土宜于150℃干热灭菌1h后在进行配方)过100～120目筛备用，将(1)、(2)和(3)等各种粉料混合，充分混匀，最后将人溶菌酶加入充分混匀，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，即得成品散剂。
所述人溶菌酶散剂在治疗痱子、间檫疹的皮肤病中的应用。
所述人溶菌酶散剂在治疗由汗液导管口闭塞、导管内汗液潴留、葡萄球菌堵塞汗孔或沿汗管感染引起的炎症形成痱子、间檫疹皮肤病中的应用。
本发明对基因重组人溶菌酶药物开拓了一个新应用剂型，散剂亦可称为撒布剂或撒粉，与现有治疗痱子的药物相比，采有人溶菌酶为原料具有显著的优点人溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、痰、鼻涕、白细胞和血清中，对多种革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌有杀菌作用，基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme)主要切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1、4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，引起细菌裂解。基因重组人溶菌酶不过敏、不产生耐药菌、安全无毒副作用，有很好的药用前景。基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，并且做成散剂(撒布剂或撒粉)，散剂在药物应用领域有药物粒子细，比表面积大，直接作用于患处，药物溶解速度快、吸收快、起效快等特点，并且散剂(撒布剂或撒粉)与喷雾剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂相比，散剂(撒布剂或撒粉)在制备治疗痱子、间檫疹的药物中的滑石粉和高岭土能够将汗液吸释干，使皮肤干燥，有利于患处恢复。综上本发明不仅使用方便，治疗效果显著、不过敏、不产生耐药菌、安全无副作用。
为了更好地理解本发明的实质和效果，下面将用基因重组人溶菌酶的药效试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为基准，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和重组人溶菌酶活性(30000U/mg)保存备用。
一、对动物的模型实验A、基因重组人溶菌酶(HLZ)体外抗菌作用评价受试药品及试剂；1、基因重组人溶菌酶浓缩液(Human Lysozyme HLZ)活性单位30000单位/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供，2、对照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性单位50000单位/mg，美国SIGMA公司产品，批号L6876。
3、克拉霉素效价948μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号4、罗红霉素效价878μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号5、注射用阿莫西林哈尔滨制药厂产品，批号030504。
6、琼脂糖(B10WEST AGAROSE)7、三羟甲基氨基甲烷(Tris)成都化学试验厂，批号030211试验菌株所用菌株均为2003.2～2004.3月于四川、北京地区收集的临床分离致病菌。经本室用API方法重新鉴定后用于试验。
质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923大肠埃希菌ATCC25922铜绿假单孢菌ATCC27853培养基1、Tris-HCl缓冲液0.1M Tris 100ml，0.1M HCl 70ml，HighWater 800ml，测PH值，用HCl溶液调至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl脂琼养基在Tris-Cl缓冲液中加入脂琼糖116℃无菌后使用。
3、M-H培养基中国药品生物制品检定所产品，M-H肉汤培养基称取25g加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116℃20分钟。M-H固体培养基称取36g，加1000ml蒸馏水，高压灭菌，116℃20分钟，用于革兰阳性、阴性需氧菌的药敏试验。
试验方法体外抗菌活性(MIC)测定采用琼脂二倍稀释法测定受试药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)。将受试药物用灭菌蒸馏水溶解，适当稀释。分别取1ml药液加9ml融化的Tris-HCl琼脂糖固体培养基混匀，以二倍稀释，制备系列含药平皿。每皿所含药物终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多点接种仪(Denley A400，England)将稀释至105CFU/ml的试验菌液接种于各含药平皿表面，置于37℃培养8-10小时，取出分别吸取6ml融化的M-H培养基(50℃)覆盖上述系列平皿表面，再置于37℃培养10小时取出，观察结果，以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
试验结果人溶菌酶对临床分离菌株的体外抗菌活性见表1，人溶菌酶对临床分离致病菌的MIC50见表2、3。根据试验结果表明人溶菌酶体外具有一定抗菌作用，对耐药菌株的抗菌活性也有很好的作用。
表1人溶菌酶、鸡溶菌酶、克拉霉素和罗红霉素体外抗菌活性
表2
表3
注HLZ指人溶菌酶，CLZ指对照溶菌酶(鸡溶菌酶)，CLA指克拉霉素，RO红霉素B重组人溶菌酶(HLZ)抗白色念珠菌作用评价受试药品及试剂(1)基因重组人溶菌酶浓缩液(Human Lysozyme HLZ)活性单位30000单位/mg，由大连奇龙生物技术研究所提供，
(2)对照药物，氟康唑批号031029971西安杨森制药有限公司产品。酮康唑批号031026573西安杨森制药有限公司产品。以上受试药物均以无菌水溶解稀释至所需浓度。药物终浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.008mg/l。
(3)葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、琼脂，成都化学试验厂。三羟甲基氨基甲烷(Tris)成都化学试验厂，批号010211。对照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性单位50000单位/mg，美国SIGMA公司产品，批号L6876。
试验白色念珠菌真菌实验所用16株白色念珠菌均为2002.12～2004.2年从四川、重庆、北京等地医院的住院病人收集的临床分离致病菌，所用菌种在收集分离的单位(华西医科大学检验科、重庆医科大学传染科及北京医院细菌室)均经自动细菌检测仪鉴定后，再经本室用API系统重新鉴定后使用。
培养基沙氏(Subourand)培养基实验前新鲜配制葡萄糖40克，蛋白胨10克，琼脂20克，水1000ml。将上述成分溶于水，加热溶化，校正pH6.9-7.0.118℃高压灭菌15分钟。用于真菌药敏实验。
RPMI medium 1640培养基Life Technologies.Inc.GrandIsland，N.Y.14072U.S.A真菌培养用液体培养基。
试验方法1、最低抑菌浓度(Minimal inhibition concentration，MIC)测定采用琼脂二倍稀释法测定LJG-9.98等药物对所试菌株的最低抑菌浓度(MIC)。采用多点接种仪(Denley A400)将细菌接种于含不同药物浓度的琼脂平皿表面，每点接种菌量约为106CFU/ml，真菌28℃孵育24-48小时观察结果，以无菌生长的平皿培养基中所含药物最低浓度为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC值)。
2、最低杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration，MBC)测定先用液体二倍稀释法测定MIC值，再将未见细菌生长管培养液转种于沙氏(Subourand)固体培养基表面，真菌28℃继续孵育24-48小时观查结果，以人仍无菌生长的平皿培养基中所含药物最低浓度为药物对该菌的最低杀菌浓度(MBC值)。
试验结果重组人溶菌酶杀灭白色念珠菌作用见表4和附图，图1为白色念珠菌对照组照片；图2为白色念珠菌用药组杀菌照片。试验结果表明重组人溶菌酶对临床分离的白色念珠菌的体外试验有很好的杀灭作用，MIC值在0.05mg～4mg。由大连奇龙生物技术研究所研制的基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme)作用机制；主要切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1、4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，引起细菌裂解。
表4
注HLZ指重组人溶菌酶，CLZ指对照溶菌酶(鸡溶菌酶)C、重组人溶菌酶对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响(1)受试药物重组人溶菌酶白色粉末，批号020110，3万单位/毫克，由大连奇龙生物技术研究所提供。临用时用无菌双蒸水配成所需浓度。
(2)对照品鸡溶菌酶白色粉末，2万单位/毫克，Lysozyine Sigma L6878。临用时用无菌双蒸水配制。
(3)试剂角叉菜胶，浅黄白色粉末，批号21HO340，Sigam Chemical CO生产。临用时用无菌生理盐水配成1％的浓度。
实验方法选用体重130-150克的健康雄性SD大鼠50只，由四川抗菌素工业研究所动物中心提供。合格证川实动管第99-32号。每笼5只。动物自由饮水，试验室温度控制在22~28℃左右，动物喂饲大鼠标准饲料。随机分成5组，每组10只。测量各鼠正常左后足跖容积。第1组为空白对照组，外涂等容积无菌双蒸水；第2、3、4组为人溶菌酶，剂量分别为120、60、30IU/只；第5组为鸡溶菌酶，剂量为30IU/只。每鼠外涂各组药物(20μl/只)一次后1小时，给大鼠左后足跖皮下注射1％的角叉菜胶0.1ml。致炎后半小时再涂一次药。致炎前和致炎后1、2、4、6小时按微量吸管测量法测定致炎前后大鼠左后足容积。致炎前后足容积差为肿胀度。试验重复一次。
数据处理和统计分析对计量资料，把原始数据按组分别输入Microsoft Excel中，各组结果以算术平均数±标准差表示。根据《新药西药临床前研究指导原则汇编》中的有关新药药效研究中统计处理的指导原则，选择Student t检验进行各用药组均数与模型对照组均数、相同剂量的受试药组与对照品组的差异显著性检验。
试验结果见表5，大鼠外涂人溶菌酶30、60、120IU/只，在致炎后1-4小时内，使由1％角叉菜胶诱发的左后足跖肿胀度明显减轻。说明人溶菌酶具有抗炎作用，重组人溶菌酶不但有杀菌作用，而且有很好的抗炎作用。
表5(1)人溶菌酶对大鼠由角叉菜胶所致足跖肿胀的影响(第一次试验结果)
注经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表5(2)人溶菌酶对大鼠由角叉菜胶所致足跖肿胀的影响(第二次试验结果)
注经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05。
二、用法与用量1、散剂(撒布剂或撒粉)直接作用于病灶局部给药，每日2～3次，每次1500u～30000u/g，每次按病灶部位大小给药。
图1为白色念珠菌对照组照片；图2为白色念珠菌用药组杀菌照片。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述实施例1基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的基因重组人溶菌酶浓缩液进行测蛋白、测活性(30000U/ml/mg)保存备用。
将纯度99％的基因重组人溶菌酶制得1500U/ml/g，香料20g，薄荷脑80g，硼酸粉30g，樟脑5g，冰片10，滑石粉780g。
制备方法是(1)用适量酒精把香料和冰片溶解备用，(2)将薄荷脑、樟脑、硼酸研细，研匀，过100～120目筛备用，将(1)和(2)与滑石粉等各种粉料混合混匀，最后将人溶菌酶加入充分混匀，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，即得成品散剂(撒布剂或撒粉)。
实施例2按照实施例1所述方法制备重组人溶菌酶，将纯度97％的基因重组人溶菌酶制得30000U/ml/g备用；其它原料量如下香料10g，薄荷脑100g，硼酸粉50g，樟脑2g，冰片20g，滑石粉700g；按实施例1所述方法制得成品散剂(撒布剂或撒粉)。
实施例3按照实施例1所述方法制备重组人溶菌酶，将纯度98％的基因重组人溶菌酶制得10万U/ml/g备用；其它原料量如下香料29g，薄荷脑50g，硼酸粉20g，樟脑9g，冰片25g，滑石粉750g；按实施例1所述方法制得成品散剂(撒布剂或撒粉)。
实施例4按照实施例1所述方法制备重组人溶菌酶，将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得20万U/ml/g备用；其它原料量如下滑石粉680g，硼酸粉20g，桉叶油10g，香料20g，薄荷脑75g，冰片30g。
制备方法是(1)用适量酒精把香料、桉叶油和冰片溶解备用，(2)将薄荷脑、硼酸研细，研匀，过100～120目筛备用，将(1)和(2)与滑石粉等各种粉料混合，充分混匀，最后将人溶菌酶加入充分混匀，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，即得成品散剂(撒布剂或撒粉)。
实施例5按照实施例1所述方法制备重组人溶菌酶，将纯度96％的基因重组人溶菌酶制得30万U/ml/g备用；其它原料量如下滑石粉660g，硼酸粉35g，桉叶油18g，香料10g，薄荷脑55g，冰片15g，按实施例4所述方法制得成品散剂(撒布剂或撒粉)。
实施例6按照实施例1所述方法制备重组人溶菌酶，将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g，麝香草脑6～60，樟脑1～10，吡咯烷酮羧铝10～100，薄荷脑10～100，滑石粉52～550，高岭土15～150香料3～30，冰片3～30。
制备方法是(1)用适量酒精把香料和冰片溶解备用，(2)将薄荷脑、麝香草脑、樟脑、吡咯烷酮羧铝研溶过100～120目筛备用，(3)将滑石粉、高岭土粉碎研匀(滑石粉、高岭土宜于150C干热灭菌1h后在进行配方)过100～120目筛备用，将(1)、(2)和(3)等各种粉料混合，充分混匀，最后将人溶菌酶加入充分混匀，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，即得成品散剂(撒布剂或撒粉)。
权利要求
1.人溶菌酶散剂，其特征是含有人溶菌酶活性1500U～300万U/ml/g。
2.根据权利要求1所述的人溶菌酶散剂，其特征是人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶或者基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或者基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
3.根据权利要求1所述的人溶菌酶散剂，其特征是含有下述重量份比原料，纯度95％～99％人溶菌酶1500U～30万U/ml/g，滑石粉4～780。
4.根据权利要求3所述的人溶菌酶散剂，其特征是由下述各原料按所述重量份比配制而成纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶1500U～30万U/ml/g，香料10～30，薄荷脑10～100，硼酸粉10～50，樟脑1～10，冰片5～30，滑石粉64～780。
5.根据权利要求3所述的人溶菌酶散剂，其特征是由下述各原料按所述重量份比配制而成纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶1500U～30万U/ml/g，滑石粉74～780，硼酸粉4～40，桉叶油2～20，香料5～30，薄荷脑10～100，冰片5～30。
6.根据权利要求3所述的人溶菌酶散剂，其特征是由下述各原料按所述重量份比配制而成纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g，麝香草脑6～60，樟脑1～10，吡咯烷酮羧铝10～100，薄荷脑10～100，滑石粉52～550，高岭土15～150，香料3～30，冰片3～30。
7.根据权利要求4或5所述的人溶菌酶散剂的制备方法，其特征是(1)用适量酒精把香料和冰片及桉叶油溶解备用，(2)将薄荷脑、樟脑、硼酸研细，研匀，过100～120目筛备用，将(1)和(2)与滑石粉等各种粉料混合混匀，最后将人溶菌酶加入充分混匀，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，即得成品散剂。
8.根据权利要求6所述的人溶菌酶散剂的制备方法，其特征是(1)用适量酒精把香料和冰片溶解备用，(2)将薄荷脑、麝香草脑、樟脑、吡咯烷酮羧铝研溶过100～120目筛备用，(3)将滑石粉、高岭土粉碎研匀(滑石粉、高岭土宜于150℃干热灭菌1h后在进行配方)过100～120目筛备用，将(1)、(2)和(3)等各种粉料混合，充分混匀，最后将人溶菌酶加入充分混匀，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，即得成品散剂。
9.根据权利要求1-6任一所述的人溶菌酶散剂在治疗痱子、间檫疹的皮肤病中的应用。
10.根据权利要求1-6任一所述人溶菌酶散剂在治疗由汗液导管口闭塞、导管内汗液潴留、葡萄球菌堵塞汗孔或沿汗管感染引起的炎症形成痱子、间檫疹皮肤病中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，人溶菌酶散剂(撒布剂或撤粉)含有人溶菌酶纯度95％～99％，1500U～30万U/ml/g。另外还提供其制法及应用。本发明对基因重组人溶菌酶药物开拓了一个新应用剂型，散剂亦可称为撒布剂或撒粉，与现有治疗痱子的药物相比，采有人溶菌酶为原料不过敏、不产生耐药菌、安全无毒副作用，并且做成散剂药物溶解速度快、吸收快、起效快等特点，并且散剂(撒布剂或撒粉)与喷雾剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂相比，散剂(撒布剂或撒粉)在制备治疗痱子、间檫疹的药物中的滑石粉和高岭土能够将汗液吸释干，使皮肤干燥，有利于患处恢复。
文档编号A61K38/48GK1698890SQ200510046499
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月20日 优先权日2005年5月20日
发明者张华 申请人:张华