专利名称：利用微生物转化三七产生的抗菌活性物质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用微生物转化三七产生的抗菌活性物质及其应用，属微生物医药技术领域。
背景技术：
三七是中国传统的名贵中药材，三七的生理活性主要与其含有的皂甙、多糖、氨基酸、黄酮类化合物、甾醇及三萜等有关。近年来，尽管三七的研究有了长足的发展，但三七的利用仍主要停留在原料药的水平上，品种单一，附加值低，开发三七新品种已成为三七产业做强做大的瓶颈。
微生物转化技术是应用微生物具有的丰富酶系，对外源物质的结构进行修饰，从而产生多种转化产物的过程。目前，该技术被广泛地应用于医药、食品、精细化工等领域。因具有反应周期短、专一性强、易于工业化等特点而倍受关注。特别是随着现代分离提取手段的进步，该项技术广泛的应用于天然化合物的生物合成、药物前体化合物的转化、不对称合成、药物代谢和活性成分筛选及新药的开发等诸多领域。
利用微生物转化的方法，对三七进行二次开发，产生具有新活性的发酵物，是进一步利用中草药，实现中药现代化的有利手段之一。
国内外文献检索表明，未见有关利用微生物转化三七产生抗菌活性物质的公开文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微生物转化三七产生的抗菌活性物质及其应用。
本发明是这样实现的该活性物质由生产菌株经液体发酵或固体发酵的生产方法得到；具体步骤如下(1)生产菌株为(Aspergillus oryzae)1.1395，该菌株已于2005年10月31日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1520；米曲霉(Aspergillus oryzae 1.1395)隶属半知菌亚门，丝孢目，曲霉属。1.1395菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长良好，菌丝初为白色，老熟后变为米黄色，菌丝透明，有分枝和分隔，有分生孢子梗，能产生分生孢子。
本发明真菌Aspergillus oryzae 1.1395的培养方法为现有的常规方法。培养基配方为(以下为重量百分比)
液体培养基配方为0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的PDB培养基。PDB培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L。
固体培养基配方为0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的固体培养物，固体培养物为30％小麦、30％玉米粉、40％大米。
液体培养和固体培养基中的三七的乙醇提取物为三七须根粉末用95％乙醇在60℃下浸提2小时，重复两次，两次提取液合并，用常规的减压浓缩得到浸膏状三七的乙醇提取物。
(2)液体发酵生产方法a.将1.1395的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，25-29℃下培养5-7天，获得试管种；b.将试管种接种到250ml的三角瓶中，每瓶装50ml液体培养基，液体培养基配方为0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的PDB培养基；摇床培养温度为25-28℃，转速为150-220rpm，培养时间8-10天；c.将含菌丝的发酵液真空抽滤后得清亮溶液，该溶液在60-70℃采用常规方法减压浓缩或喷雾至干，即得活性物质；(3)固体发酵生产方法a.将1.1395的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，25-29℃下培养5-7天，获得试管种；b.将99％-99.5％的固体培养物与0.5％-1％三七的乙醇提取物混合，然后装入1000ml的三角瓶中，每瓶装300g，120℃灭菌40分钟后，接入试管种，于25-28℃，静置培养15-20天，直到菌丝长满，即形成固体发酵物；固体培养物为将小麦、大米用清水浸泡24小时后，分别于摄氏100℃的开水中煮浸3分钟过滤后加入玉米粉获得，固体培养物的配方为30％小麦、30％玉米粉、40％大米；c.将固体发酵物按常规方法冷冻干燥后，用95％乙醇室温浸提2天，按常规方法减压浓缩、蒸干溶剂后即得活性物质。
实验表明三七经米曲霉发酵生物转化后，产生了对人体大肠杆菌，绿脓杆菌，福氏痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用的功能，可应用于制备生物抗菌剂。
本发明与现有技术相比，采用新的菌种，利用其自身独特的代谢体系生产具有抗人体病原细菌活性的代谢物质。并通过人工培养技术实现生产控制。
实施例1三七液体发酵生产活性抗菌物质1、将斜面保藏的米曲霉接种1cm菌丝块于液体培养基中(50ml培养基/250ml三角瓶)，摇床培养温度为25-28℃，转速为150-220rpm，培养时间8-10天后获得发酵物；液体培养基配方为0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的PDB培养基；PDB培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L。其中条件1为摇床培养温度为25℃，转速为150rpm，培养时间8天，液体培养基配方为0.5％三七的乙醇提取物，99.5％的PDB培养基；条件2为摇床培养温度为27℃，转速为200rpm，培养时间9天，液体培养基配方为0.8％三七的乙醇提取物，99.2％的PDB培养基；条件3为摇床培养温度为28℃，转速为220rpm，培养时间10天，液体培养基配方为1％三七的乙醇提取物，99％的PDB培养基。
2、将培养好的发酵物用常规方法真空抽滤后得清亮溶液，溶液在60-70℃用常规方法减压浓缩或喷雾至干，即得活性物质。
3、将活性物质用5％甲醇水溶液溶解，配制为0.1mg/ml的浓度。
4、对照培养条件和培养基与发明内容所述液体发酵生产方法相同，不同之处是不接种米曲霉。
5、用牛津杯法做抑菌实验。在混有病原菌液的平板上放上牛津杯，在每一牛津杯内加入0.1ml样液，于37℃培养12hr。测量抑菌圈直径(牛津杯直径扣除，单位毫米)。每处理重复三次。结果见表1表1三七液体发酵物对人体病原细菌的抑制作用
实施例2三七固体发酵生产活性抗菌物质1、将99％-99.5％的固体培养物与0.5％-1％三七的乙醇提取物混合，然后装入1000ml的三角瓶中，每瓶装300g，120℃灭菌40分钟后，接入斜面保藏的1cm米曲霉菌丝块试管种，于25-28℃，静置培养15-20天，直到菌丝长满，即形成固体发酵物；固体培养物为将小麦、大米用清水浸泡24小时后，分别于摄氏100℃的开水中煮浸3分钟过滤后加入玉米粉获得，固体培养物的配方为30％小麦、30％玉米粉、40％大米。其中条件1为摇床培养温度为25℃，培养时间15天，固体培养基配方为99.5％的固体培养物与0.5％三七的乙醇提取物混合；条件2为摇床培养温度为27℃，培养时间18天，固体培养基配方为99.2％的固体培养物与0.8％三七的乙醇提取物混合；条件3为摇床培养温度为28℃，培养时间20天，固体培养基配方为99％的固体培养物与1％三七的乙醇提取物混合；2、将固体发酵物按常规方法冷冻干燥后，用95％乙醇室温浸提2天，按常规方法减压浓缩、蒸干溶剂后即得活性物质。
3、将活性物质用5％甲醇水溶液溶解，配制为0.1mg/ml的浓度。
4、对照培养条件和培养基与发明内容所述固体发酵生产方法相同，不同之处是不接种米曲霉。
5、用牛津杯法做抑菌实验。在混有病原菌液的平板上放上牛津杯，在每一牛津杯内加入0.1ml样液，于37℃培养12hr。测量抑菌圈直径(牛津杯直径扣除，单位毫米)。每处理重复三次。结果见表2表2三七固体发酵物对人体病原细菌的抑制作用
权利要求
1.一种利用微生物转化三七产生的抗菌活性物质，其特征在于该活性物质由生产菌株经液体或固体发酵生产方法得到；具体步骤如下(1)生产菌株为(Aspergillus oryzae)1.1395，该菌株已于2005年10月31日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1520；(2)液体发酵生产方法a.将1.1395的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，25-29℃下培养5-7天，获得试管种；b.将试管种接种到250ml的三角瓶中，每瓶装50ml液体培养基，液体培养基配方为0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的PDB培养基，PDB培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L；摇床培养温度为25-28℃，转速为150-220rpm，培养时间8-10天；c.将含菌丝的发酵液真空抽滤后，于60-70℃下减压浓缩或喷雾至干，获得活性物质；(3)固体发酵生产方法a.将1.1395的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，25-29℃下培养5-7天，获得试管种；b.将99％-99.5％的固体培养物与0.5％-1％三七的乙醇提取物混合，然后装入1000ml的三角瓶中，每瓶装300g，120℃灭菌40分钟后，接入试管种，于25-28℃，静置培养15-20天，直到菌丝长满即成固体发酵物；其中固体培养物由小麦、大米用清水浸泡24小时后用，分别于摄氏100℃的开水中煮浸3分钟并过滤加入玉米粉后得到固体培养物的配方为30％小麦、30％玉米粉、40％大米；c.将固体发酵物冷冻干燥，95％乙醇室温浸提2天，60-70℃下减压浓缩，蒸干溶剂后即得活性物质；(4)液体发酵生产和固体发酵生产中的三七的乙醇提取物为三七须根粉末用95％乙醇在60℃下浸提2小时，重复两次，两次提取液合并，减压浓缩得浸膏状三七的乙醇提取物。
2.权利要求1所说的利用微生物转化三七产生抗菌活性物质，其特征在于该活性物质对有拮抗人体病原细菌的作用，可作为制备抗菌制剂的应用。
全文摘要
本发明涉及利用微生物转化三七产生的抗菌活性物质及其应用，属微生物医药技术领域。用微生物转化三七产生的活性物质由生产菌株经液体发酵生产或固体发酵生产方法获得。生产菌株为(Aspergillus oryzae)1.1395，该菌株已于2005年10月31日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.1520。该活性物质有抑制大肠杆菌，绿脓杆菌，福氏痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌4种人体病原细菌的作用，可应用于制备生物抗菌制剂。本发明与现有技术相比，利用了微生物自身独特的代谢体系以三七为底物生产具有抗菌作用的代谢物质。并通过人工培养技术实现生产控制。
文档编号A61K36/25GK1800342SQ200510048709
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月20日 优先权日2005年12月20日
发明者刘亚君, 张克勤, 赵鹏, 周薇 申请人:云南大学