专利名称：一种重组疫苗及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组疫苗，特别是一种以腺病毒为载体的疫苗。该疫苗的抗原来自于乙肝病毒抗原，丙肝病毒抗原，戊肝病毒抗原，人乳头瘤病毒抗原，禽流感病毒抗原；该疫苗能引起免疫动物的体液免疫和细胞免疫反应。也涉及该疫苗用于上述病毒感染引起的疾病的预防和治疗用途。
背景技术：
乙型肝炎是由人乙型肝炎病毒(Human Hepatitis B virus，HBV)引起的，HBV为DNA双链病毒，主要经血液、密切接触和母婴垂直传播。不同地区，HBV的感染几率及传播方式也不尽相同。感染HBV后，部分患者将发展成为慢性持续性感染状态，有的可能演变为肝硬化或原发性肝细胞癌。目前，据估计，全世界乙肝带毒者约3.5亿人，亚洲地区约2.2亿。我国约有1.3亿人是乙肝病毒携带者，每年用于治疗肝炎的医疗费用约300-500亿元，并且多数感染发生在新生儿或儿童期，由于这一阶段发生的感染早期多无症状，急性期极难被发现，因此90％以上将发展为慢性乙肝患者。目前，对于慢性乙肝患者和乙肝抗原表面携带者来说目前尚无有效的治疗方法。有限的化学疗法虽然能在一定程度上抑制HBV复制，但却不能彻底清除体内的感染病毒。研究发现，乙肝患者的急性和慢性肝病的不同结局很大程度上是由于机体对HBV感染的免疫反应不同所致。在急性乙肝患者体内，针对HBV的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)反应是很活跃的、是多位点和高度特异性的，可迅速清除感染病毒；而慢性乙肝患者和乙肝病毒健康携带者体内针对HBV的特异性CTL应答明显低下，致使病毒持续存在，因此目前学术界认为纠正和克服患者体内的CTL低反应状态可能是机体清除HBV，使患者得到彻底恢复的关键。
那么，CTL是通过什么机理来达到清除HBV的目的的呢？由于HBV cDNA结构特殊，又具有长期的稳定性，最初一直认为CTL只有通过破坏和杀伤感染的肝细胞才能达到清除病毒的作用。但近年来的研究发现事实并非如此。在HBV转基因鼠模型中，病毒特异性的CTL主要是通过非细胞致病性过程来清除病毒的，只有极小一部分残存病毒的清除是通过CTL介导的细胞凋亡和细胞毒性反应来实现的，整个病毒清除过程中受损肝细胞不足1％。Guidotti在HBV急性感染黑猩猩动物模型中也发现，在急性期，HBV DNA绝大部分被清除，而这个期间并没有肝损害、细胞凋亡及ALT升高。由此可见在HBV急性感染过程中，HBV主要是通过这种非细胞致病性机理清除的。其具体过程为HBV特异性的CTL识别感染肝细胞表面的病毒靶抗原，随即释放细胞因子，主要是IFN-γ和TNF-α，通过旁分泌机制直接作用于HBV感染肝细胞，激活肝细胞内的抗病毒分子机制。同时，这些细胞因子激活Kupffer细胞，并通过正反馈机制进一步产生更多的TNF-α。这种细胞因子的环境导致细胞内病毒颗粒和病毒RNA的降解。
目前市面上应用的乙肝疫苗是酵母重组乙肝疫苗，主要用于乙肝的预防，不能起到治疗乙肝的作用。
国外进入临床I期和国内外处于实验室阶段的的治疗性乙肝疫苗都属于DNA疫苗，DNA疫苗目前存在的问题是外源核酸是否会整合到染色体中引起癌变，能否引起免疫病理作用等问题尚未有确切结论，且疫苗诱发的免疫反应强度较弱。所以应用具宿主范围广、高效转导、稳定、安全、易操作等优点的腺病毒做为载体，则能避免上述缺点。
腺病毒在自然界分布广泛，在许多哺乳动物和畜类中都发现其存在。至今已分离到100种以上不同血清型的各种腺病毒。腺病毒是二十面体病毒壳体结构，其基因组为线性的双链DNA。由于腺病毒做为载体具有高的感染效率和高的外源基因表达水平、同时高滴度重组病毒的制备较简单、容量适合装载大多数外源基因、不整合入靶细胞基因组等等的优点，故腺病毒被广泛用于基因治疗的载体。目前应用最多的腺病毒是5型和2型，它们对啮齿动物无致瘤性。
为了更有效利用腺病毒载体，对腺病毒进行了一系列优化去除E1区和/或E3区，由于E1区的缺失，造成病毒复制缺陷，并且避免了E1基因对细胞的转化作用。E3区对于腺病毒在培养细胞中产生毒性复制是非必需的，故缺失此区可增加外源DNA容量。E2区和/或E4区的缺失也有利于增加外源DNA的容量。这样载体中就去除了大部分的病毒基因，同时可以接受大容量的外源DNA。2003年上市的世界上第一个基因治疗药物一今又生(重组人p53腺病毒注射液)，即是采用第一代腺病毒5型做为载体。
人乳头瘤病毒，丙型肝炎病毒，戊型肝炎病毒，禽流感病毒疫苗也存在与乙型肝炎病毒疫苗同样的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有治疗和预防由病毒感染引起的疾病的疫苗。该疫苗采用腺病毒做为载体，用病毒抗原做为目的基因。该疫苗能引起体液免疫和细胞免疫反应(CTL)，体液免疫反应产生抗体中和病毒抗原，起预防作用。细胞免疫反应(CTL)识别感染细胞表面的病毒靶抗原，随即释放细胞因子，主要是IFN-γ(具广谱抗病毒作用)和TNF-α(肿瘤坏死因子)，通过旁分泌机制直接作用于感染细胞，激活细胞内的抗病毒分子机制。同时，这些细胞因子激活Kupffer细胞，并通过正反馈机制进一步产生更多的TNF-α。这种细胞因子的环境导致细胞内病毒颗粒和病毒RNA的降解。从而达到治疗由病毒感染引起的疾病的目的。
为实现上述目的，本发明提供一种重组腺病毒载体，将病毒抗原基因导入腺病毒载体中，成为新的重组腺病毒载体。
为实现上述目的，本发明中的病毒可以是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒，人乳头瘤病毒，禽流感病毒。
为实现上述目的，本发明中的病毒可以是乙肝病毒，其抗原基因为乙肝表面抗原或核心抗原，优选为核心抗原。
为实现上述目的，本发明中的病毒可以是丙肝病毒，其抗原基因为丙肝抗原表面或者核心抗原，优选为丙肝病毒的NS3，NS4或NS5抗原为实现上述目的，本发明中的病毒可以是戊肝病毒，其抗原基因为戊肝抗原。
为实现上述目的，本发明中的病毒可以是人乳头瘤病毒，其抗原基因为人乳头瘤病毒HPV的E6和/或E7序列。
为实现上述目的，本发明中的病毒可以是禽流感病毒。其抗原基因为H5N1抗原。
为实现上述目的，本发明中的腺病毒载体可以是第一代的，也可以是第二代的，第三代的。可以是缺失E1区的，可以是缺失E1区和E3区的，可以是缺失缺失E1和E2区的，可以是缺失E1和E4区的，可以是缺失E1区、E2和E3区的，还可以是缺失E1区、E3和E4区的。
为实现上述目的，注射本发明的疫苗后，能使动物体内引起体液免疫反应和细胞免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。
图1图解了Ad/core重组乙肝核心抗原腺病毒载体的构建过程。通过PCR扩增得到乙肝核心抗原，与PDC315载体一起分别用BamHI+EcoRI双酶切后，连接成重组体PDC315/core。测序结果正确的重组体PDC315/core做为穿梭质粒与做为骨架腺病毒的PBHG共转染293细胞。通过在Cre-loxP重组酶的作用下产生重组腺病毒。得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺型腺病毒，即是本发明构建的重组腺病毒载体Ad/core。
图2图解了PCR方法检测重组腺病毒的电泳图片，其中第一泳道为core基因阴性对照，第二泳道为core基因检测重组腺病毒的结果，其有一条约567bp的条带，大小与core基因大小一致，表明重组腺病毒载体有core基因。其中第三泳道为腺病毒E2B基因阴性对照，第四泳道为腺病毒E2B基因检测重组腺病毒的结果，其有一条约880bp的条带，大小与腺病毒E2B基因大小一致，表明重组腺病毒载体有腺病毒E2B基因。第五泳道为DL2，000NA标准分子量(Taraka)。
图3图解了注射腺病毒疫苗Ad/core后4、5周CTL反应阳性率。小鼠注射腺病毒疫苗ad/core后，ELISPOT实验结果显示，PBS组均为阴性，4周时ad/core两个剂量组均为50％(n＝2)；5周时均为100％(Ad/core 5.7×105IU组n＝1；Ad/core5.7×106IU组n＝2)。
图4图解了小鼠注射腺病毒疫苗Ad/core后4、5周CTL反应强度表。两个剂量组在4周、5周时平均每50万个细胞中斑点数均显著高于PBS对照组，高剂量组高于低剂量组；同一剂量组，5周比4周有显著升高。
图5、图解了小鼠注射腺病毒疫苗Ad/core后4、5周CTL反应强度比值表(实验组多肽刺激孔斑点数平均值与对照组多肽刺激孔斑点数平均值之比)。4周时，低剂量组与PBS组比值为1.5，高剂量组为3.2；5周时两个剂量组均显著升高，低剂量组为5.4，高剂量组为8.0。
具体实施例方式
下面以实施例的方式对本发明进行说明，但是正如本技术领域的技术人员所理解的那样，这些实施例仅仅用于说明本发明而不是为了限定本发明。本发明仅仅受所附权利要求的限制。
实施例1.Ad/core重组乙肝核心抗原腺病毒载体的构建及疫苗的获得1、已发表的乙肝核心抗原基因cDNA全序列，设计合成两段引物5′-GGAATTCATGGACATTGACCCGTA 3′和5’CCGGATCCCTAACATTGAGAC-3′(华大基因上海鼎安合成)做为引物，两段分别引入BamHI和EcoRI(Takara公司)内切酶位点。以HBcAg DNA为模板，经PCR方法扩增得到人乙肝核心抗原基因。其中，反应条件为第一循环94℃变性5分钟，以后各循环94℃变性30秒，55℃退火20秒，72℃延伸40秒，共35个循环，之后72℃延伸7分钟。由此得到大量的人乙肝核心抗原基因(core)。用琼脂糖凝胶电泳分析，回收得到core基因，片段纯化后与PGEM-T easy载体(QIAGEN)连接，重组成含人乙肝核心抗原基因的PGEM-T easy重组载体PGEM-T easy/core重组载体。
2、用BamHI和EcoRI分别双酶切PGEM-T easy/core重组载体和PDC315载体，分别回收酶切的人乙肝核心抗原基因和PDC315载体基因。用T4 DNA连接酶将回收的片段连接。经PCR、酶切鉴定，筛选出PDC315/core重组载体，经测序(华大基因上海鼎安)结果表明，core的序列与GenBank AY057947(gi16751304)完全一致，命名为腺病毒穿梭载体PDC315/core。
3、同源重组与骨架载体PBHG利用Lipofectamine2000(invitrogen)共转染至293细胞，通过同源重组的方法获得病毒。共转染11-14天出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，得到表达乙肝核心抗原的重组腺病毒。提取重组腺病毒DNA，PCR方法(core基因检测用前面所术的一对引物；腺病毒载体的检测引物用腺病毒上的E2B区的引物，为5’-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3’和5’-CATCTGACTCAAAGCGTGG-3’华大基因上海鼎安)对重组腺病毒进行鉴定，同时进行测序(华大基因上海鼎安)，测序结果正确的腺病毒命名为腺病毒疫苗Ad/core。
4、疫苗检测用ELISA检测乙肝核心抗原试剂盒(北京美迪科公司)来检测疫苗的乙肝核心抗原的表达，结果表明我们构建的病毒疫苗Ad/core在293细胞中有蛋白表达。
5、疫苗扩增293细胞扩增，扩增方法为本技术领域已知的，可以参考《组织培养和分子细胞学技术》(鄂征北京出版社)6、疫苗纯化采用离子交换柱HPLC纯化系统对疫苗进行纯化。
7、活性测定TCID50方法测得病毒疫苗Ad/core滴度为1.33×1010Iu/ml。
实施例2.腺病毒疫苗Ad/core免疫小鼠实验整合了乙肝核心抗原基因的腺病毒疫苗ad/core在感染动物后会模拟正常腺病毒感染模式，诱导免疫系统产生针对乙肝核心抗原的特异性细胞免疫和体液免疫，当机体再次接触病原体时，通过多信号途径刺激特异性免疫记忆细胞分泌细胞因子γ-IFN，γ-IFN已经证实具有抗病毒效果。ELISPOT实验即通过检测γ-IFN的分泌从而间接检测特异性CTL反应。不同剂量的Ad/core免疫C57/BL小鼠，同时以PBS为对照，第4、5周时取其脾脏制备单个脾细胞悬液，以乙肝核心抗原多肽为体外刺激物，进行ELISPOT实验。相同条件下，看实验组分泌γ-IFN的鼠脾细胞是否比PBS组显著增多。
实验共分三组，每组动物注射4只C57/BL小鼠(雄性，5周龄，上海思莱克实验动物公司)，采取腹腔注射途径，对照组注射PBS(0.1ml/只)，低剂量组腺病毒疫苗注射5.7×106IU，高剂量组腺病毒疫苗注射5.7×106IU。注射后4、5周时，每组取两只动物处死。
体液免疫实验摘眼球取全血，5000rpm离心10分钟后吸出上层血清，1∶2稀释后进行ELISA实验(按北京美迪科公司试剂盒说明书进行)，测HBV核心抗体。结果显示，4、5周实验组小鼠血清抗HBV核心抗体均为阳性，而PBS组均为阴性。即腺病毒疫苗Ad/core注射后诱导了体液免疫反应，说明本发明的腺病毒疫苗具有预防乙肝的作用。
ELISPOT实验动物处死后无菌取脾脏研磨制成单个细胞悬液，进行稀释，将之加于预先包被并封闭好的ELISPOT板上96孔内，每孔5×105个脾细胞。加入乙肝核心抗原多肽(华大基因上海鼎安合成)作为刺激物。进行ELISPOT实验(见U-Cytech试剂盒说明书)。图3，4，5显示小鼠注射腺病毒疫苗ad/core后在体外经特异性多肽刺激后能释放γ-IFN，从而证明腺病毒疫苗ad/core可以诱导机体产生特异性细胞免疫反应，当激活的细胞再次遇到相同病原体时，就会释放γ-IFN等细胞因子发挥抗病毒作用。由实验结果还可以看出，腺病毒疫苗ad/core诱导小鼠特异性细胞免疫具有明显的剂量依赖性，实验中所用的两个高低剂量具有显著差异，5.7×106IU组诱导的CTL反应强度显著高于5.7×105IU组。4、5周的实验结果比较发现，ad/core在体内表达并诱导机体产生特异性免疫反应需要时间，5周CTL反应强度显著高于4周。
所以说本发明的腺病毒疫苗Ad/core可以诱导小鼠产生HBV核心抗原特异性CTL反应，从而提示ad/core对乙肝有治疗作用。
权利要求
1.一种重组疫苗，其特征在于该疫苗包括重组腺病毒载体和编码来自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，并能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应，从而产生预防和治疗由该致病病毒引起的疾病。
2.根据权利要求1所述的重组疫苗，其中所述腺病毒是5型腺病毒。
3.根据权利要求1所述的重组疫苗，其中所述抗原序列被定位于腺病毒的E1、E2、E3或E4区域。
4.根据权利要求1所述的重组疫苗，其中所述致病病毒是肝炎病毒。
5.根据权利要求4所述的重组疫苗，其中所述肝炎病毒是肝炎甲、乙、丙、丁或者戊病毒。
6.根据权利要求5所述的重组疫苗，其中所述病毒的抗原是乙型肝炎病毒的表面抗原或核心抗原。
7.根据权利要求5所述的重组疫苗，其中所述病毒的抗原是丙型肝炎病毒的表面抗原或者核心抗原。
8.根据权利要求7所述的重组疫苗，其中所述病毒的抗原是丙型肝炎病毒的NS3、NS4或NS5抗原。
9.根据权利要求5所述的重组疫苗，其中所述病毒的抗原是戊肝病毒抗原。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的重组疫苗，其中所述致病病毒是人乳头瘤病毒HPV。
11.根据权利要求10所述的重组疫苗，其中所述病毒的抗原是人乳头瘤病毒HPV的E6和/或E7。
12.根据权利要求1-9中任意一项所述的重组疫苗，其中所述致病病毒是禽流感病毒H5N1。
13.根据权利要求12所述的重组疫苗，其中所述致病病毒是禽流感病毒H5N1抗原。
14.一种含有权利要求1-9中任意一项所述的重组疫苗的制剂，其中所述重组疫苗的制剂包括常规制剂和纳米粒制剂。
全文摘要
本发明提供一种重组疫苗，特别是一种以腺病毒为载体的疫苗。该疫苗的抗原序列可以是乙肝病毒、丙肝病毒、人乳头瘤病毒、禽流感病毒的抗原序列，其抗原序列位于腺病毒的E1、E2、E3或E4区域。该疫苗用于上述病毒感染引起的疾病的预防和治疗用途。
文档编号A61K39/29GK1887350SQ200510080238
公开日2007年1月3日 申请日期2005年6月28日 优先权日2005年6月28日
发明者李进, 秦华, 徐向华, 周向军 申请人:深圳市清华源兴生物医药科技有限公司