专利名称：含视黄酸的糖尿病治疗药的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防和/或治疗糖尿病或其相关疾病的药物，所述药物含有视黄酸作为活性成分。更特别地，本发明涉及一种抗糖尿病药，其不但控制血糖水平而且直接作用于胰脏的β细胞。
背景技术：
据说，目前在我国大约有6,000,000糖尿病患者，还有统计数据表明，特别是，十分之一的大于40岁的人患有糖尿病。糖尿病被定义为“一组具有胰岛素功能缺乏导致的慢性高血糖的主要症状的代谢病”(日本糖尿病协会，关于糖尿病的分类和诊断标准的委员会报告，1999)。糖尿病主要分为两种类型，I型糖尿病是由于一些原因分泌胰岛素的胰脏的β细胞的破坏造成的胰岛素的不足引起的，II型糖尿病是由于胰脏的胰岛素分泌减少的状态和胰岛素作用不足的状态(胰岛素耐受性的状态)引起的。当持续高血糖状态时，可以引起严重的疾病如视网膜病变、肾病和神经病变，它们被称为糖尿病的三大并发症，还有中风和心肌梗死。
在近年来，正在阐明高血糖的发病机理。除了主要采用口服药(如磺酰脲类(SU)药物和胰岛素药物制剂)的常规糖尿病治疗外，基于新的功能机理，已经利用抑制肝脏中的葡萄糖再生或释放或促进在骨骼肌或脂肪细胞中的葡萄糖的利用或贮藏的缩二胍(BG)药、减少肠内的葡萄糖吸收的α-葡糖苷酶抑制剂、直接增强胰岛素活性而并不促进胰岛素的分泌的胰岛素活性促进剂(胰岛素耐受性改良剂)等(非专利文献1)。作为直接作用于胰脏的β细胞的药物NN-623、AY 4166等等，是除了已知的SU药之外的新的胰岛素分泌促进剂(非专利文献1)。
这些口服药对于保持胰岛素分泌的患者是有效的，但是对于患有I型糖尿病的患者是无效的，I型糖尿病患者胰岛素分泌不足而且抑制血糖水平的胰岛素注射对于这样的患者是必不可少的。甚至患有II型糖尿病的患者有时也需要胰岛素注射通过食疗和运动以及口服药不能充分地控制血糖水平、严重的传染病(如并发的严重的肺炎)、患者正在手术、并发的严重肾脏病或严重肝病或患者处于糖尿病昏迷。
非专利文献1Ohta Masao，Journal of Nippon Medical School，1999，第66卷第3期，39-42页。
发明内容
本发明要解决的问题如上所述，普通的抗糖尿病药主要旨在控制血糖水平，而经受β细胞破坏的I型糖尿病患者和经受胰岛素分泌功能障碍的II型糖尿病患者目前除了依赖复杂的胰岛素注射外没有任何选择。因此，需要通过直接作用于经受破坏或功能障碍的胰脏而从根本上治疗糖尿病的医用药物。
解决问题的手段本发明人迄今为止独立地研究视黄酸，并第一次发现视黄酸在体内给药时恢复胰脏的功能。这个发现使本发明得以完成。
因此，本发明提供了一种治疗和/或预防糖尿病的药物，其含有视黄酸作为活性成分，借此解决了上述问题。
本发明的效果本发明的治疗和/或预防糖尿病的药物被认为是通过直接作用于胰脏来恢复胰脏(β细胞)的功能。因此，本发明的药物不但对于控制患有胰岛素耐受的II型糖尿病患者的血糖水平是有效的，而且对于遭受β细胞破坏的I型糖尿病患者也是有效的。
进一步地，由于该药物通过作用于含有β细胞的胰脏可以维持血糖水平在合适的范围内来改善胰岛素分泌的功能，其对于预防和治疗伴随高血糖等疾病的各种并发症也是有效的。
该图表示了给予或没有给予视黄酸的患糖尿病的大鼠的体重的变化。(A)给予视黄酸(6mg)的大鼠；(B)给予视黄酸-无机物质(CaCO3)复合粒子(6mg)的大鼠；(C)给予视黄酸-有机物质(PLGA)复合粒子(6mg)的大鼠；(D)对照大鼠(没有给予视黄酸)。
照片表示了给予视黄酸-无机物质复合粒子(LA/CaCO3)(6mg)的患糖尿病的大鼠和对照大鼠(没有给予LA)在100天时的外观，[图3]该图表示了给予和没有给予视黄酸的患糖尿病大鼠的(a)体重的变化，(b)血浆胰岛素浓度的变化，以及(c)血糖浓度的变化。●给予视黄酸-有机物质(PLGA)复合粒子(6mg)的大鼠；■对照大鼠(没有给予视黄酸)。
该图表示了给予和没有给予视黄酸的患糖尿病大鼠的血浆胰岛素浓度的变化。RA给予视黄酸的大鼠；Ra-Ca给予视黄酸-无机物质(CaCO3)复合粒子的大鼠；RA-PLGA给予视黄酸-有机物质(PLGA)复合粒子的大鼠；对照没有给予视黄酸的大鼠。括号中的值表示剂量。
实施本发明的最佳方式本发明的药物的特征在于含有视黄酸作为活性成分。视黄酸是衍生自维生素A的脂溶性的小分子，而且已知全反式视黄酸和9-顺式-视黄酸是主要的异构体。在本发明的药物中，优选使用下式(I)表示的全反式视黄酸。
视黄酸具有诱导未分化细胞分化的功能，且认为视黄酸在形态发生中表现出形态发生素样功能。在诱导分化的这个功能的基础上，视黄酸在临床上用作急性早幼粒细胞性白血病(APL)的治疗药。此外，在再生治疗药的最近的调查研究中，提出了一种方法，在体外，用视黄酸处理非洲蟾蜍的初期原肠胚的胚孔的上唇部分，再培养诱导分化成胰脏(JP-A-2001-299335的公报)。
也就是说，通过控制高等生物的未分化细胞的分化，在胚胎发生期间视黄酸在体外使胰脏再生。然而，到目前为止所研究的是针对有可能分化成所有组织(器官)的全能胚胎干细胞。还没有获得关于视黄酸在体内对从整个器官衍生的体细胞的干细胞表现出什么功能的知识。本发明是以新知识为基础，所述新知识是视黄酸在体内作用于胰脏从而能恢复β细胞的胰岛素分泌功能并改善血糖水平控制功能。
用作本发明药物的活性成分的视黄酸优选上式(I)表示的全反式视黄酸。其异构体、衍生物如酯类、盐类或前药也是有用的。
在本发明的药物中，可以加入视黄酸本身。也可以制备合适的有机或无机物质与视黄酸的复合粒子，而且将所述视黄酸复合粒子作为活性成分加入。
视黄酸复合粒子的实例包括用无机物质(诸如钙或锌的碳酸盐或磷酸盐)和有机物质(诸如生物降解聚合物)进行表面修饰的视黄酸粒子、用这种物质整合起来的固体粒子等等。这些视黄酸复合粒子可以是视黄酸表面的全部或部分用无机或有机物质包衣的形式，或者是视黄酸分散于无机或有机物质构成的固体粒子中的形式。然而，这些形式不是关键。通过粒子所含的活性物质视黄酸的皮下注射和安全地控制释放，这样的复合粒子的用途是减轻视黄酸自身的刺激，甚至降低肿瘤形成的危险。
例如，视黄酸-无机物质复合粒子可以采用视黄酸的两性分子的性质来制备。特别地，例如，选用碳酸钙作为无机物质。首先，把视黄酸分散在含少量极性有机溶剂的碱性的水介质中形成球状的微团(spherical micell)，其表面被负电荷覆盖。此时，加入非离子表面活性剂形成视黄酸和非离子表面活性剂的混合的微团，由此可以阻止微团的聚集和沉淀。进一步地，加入氯化钙吸收微团的负电荷表面上的钙离子(Ca2+)形成球形或椭圆形的微团，其表面被钙离子包被。此外，加入碳酸钠吸收(结合)微团表面的钙离子上的无机酸根离子如碳酸根离子(CO32-)，从而中和微团表面的电荷。因此，在视黄酸粒子的表面上形成碳酸钙的膜，获得了用无机物质修饰表面的视黄酸复合粒子。
分散视黄酸所用的极性溶剂的实例包括乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二甲亚砜等。在经皮给药中，具有较少刺激的乙醇或甲醇是优选的。
作为无机物质使用的是多价金属尤其是二价金属(如钙、镁和锌)的无机酸盐(如碳酸盐和磷酸盐)。有生物相容性的多价金属无机酸盐是优选的。
多价金属以氯化物、醋酸盐、卤化物等形式加入，例如氯化钙、氯化镁和醋酸锌。无机酸以碱金属盐的形式加入，例如碳酸钠和磷酸钠。
上述制备方法中所用的非离子表面活性剂的实例包括聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯(8)辛基苯基醚(octylphenyl ether)、聚氧乙烯(20)胆甾醇酯、聚氧乙烯(30)胆甾醇酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油等等。作为商购的产品，可以提及的是吐温80和类似物。
当加入的多价金属(氯化物等)和无机酸(钠盐等)重量比是1∶0.05-1∶0.33，优选1∶约0.2时，可以获得具有约5-1,000nm粒径的视黄酸-无机物质复合粒子的透明的水悬浮液。
而且，本发明人还发现，在视黄酸微团的表面形成多价金属无机盐的膜的过程中，加入的多价金属盐(如氯化钙)和无机酸(如碳酸或磷酸)的碱金属盐的摩尔比调节为约1∶0-1∶1.0的范围，借此可以制得具有约5-300nm的平均粒径的复合粒子(毫微粒)。当视黄酸皮下或静脉内给药或通过皮肤给药经皮吸收(包衣给药等)时，具有这样毫微米级小粒径的复合粒子是特别优选的。
上述方法中在微团表面形成的多价金属无机酸盐(如碳酸钙)具有无定形，就是所谓的玻璃体形式或半稳定相六方碳钙石(vaterite)结构。因此，薄膜在水中的溶解度高，改善生物降解性使容易分解。从而，已经确认，当将得到的视黄酸-碳酸钙复合粒子向活体给药时，微团表面的碳酸钙膜层容易分解释放出其中包含的视黄酸，产生结果是以受控制的方式展现药效。
在实践中，当将视黄酸-碳酸钙复合粒子的含水悬浮液皮下注射进大鼠时，或复合粒子连同凡士林基质一起涂在皮肤表面时，与单独使用视黄酸的情况相比，表现出了非常好的吸收率而且没有引起给药位点的肿瘤发生。
同时，有机物质和视黄酸的复合粒子可以通过使用生物可降解聚合物(如乳酸/羟乙酸共聚物(PLGA)或聚乳酸(PGA))的一般粒子形成方法(液中干燥法)制备。特别地，通过以下步骤制备粒子，把视黄酸分散在生物可降解聚合物多价金属盐的卤代烃溶液中，再把所得的分散液分散于聚乙烯醇水溶液等中，挥发卤代烃形成粒子并用蒸馏水等洗涤得到的粒子。
作为生物可降解聚合物使用的乳酸/羟乙酸共聚物，可以采用D-异构体、L-异构体或它们的混合物，外消旋化合物是优选采用的。乳酸/羟乙酸共聚物的共聚比(乳酸/羟乙酸；mol％)优选为95/5至45/55。更优选的是90/10至45/55。其重均分子量优选是约3,000-20,000，更优选是3,000至15,000。乳酸/羟乙酸共聚物的分散度(重均分子量/数均分子量)是1.2-4.0，优选是约1.2-2.5。这些共聚物由本身已知的方法合成。当然，由非催化脱水缩合方法制得的共聚物是优选的。
在本发明中，在共聚比和重均分子量上不相同的两个或多个乳酸/羟乙酸共聚物可以以任选比例混合使用。例如，使用具有50/50的共聚比和约6,000的重均分子量的共聚物和具有50/50的共聚比和约3,000的重均分子量的共聚物的混合物。混合时大约的重量比是75/25至25/75。在本说明书中的重均分子量和数均分子量指得是根据使用聚苯乙烯作为标准品的凝胶渗透色谱法测量的值。
在上述制备方法中，对连同生物可降解聚合物一起使用的多价金属盐或氧化物没有特别限制，只要金属盐或氧化物对活体没有副作用。使用碱土金属(钙、镁等)、锌、铁、铜、锡、铝等与无机酸或有机酸的盐，或这些金属的氧化物。金属优选是碱土金属、锌、铁和铝，锌和钙是特别优选的。无机酸的实例包括盐酸、硫酸、硝酸、硫氰酸等。作为有机酸，可使用脂肪族的羧酸和芳香族的羧酸。
作为溶剂的卤代烃，优选使用有1或2个碳原子的氯代饱和烃和有1或2个碳原子的氟代饱和烃。其具体的实例包括氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、1，1-二氯乙烷、单氟甲烷、二氟甲烷等。基于生物可降解的聚合物、多价金属盐或氧化物和卤代烃的总量计，溶液含有生物可降解的聚合物和多价金属盐或氧化物的量优选分别为10-90％重量和0.01-3％重量，更优选为30-80％重量和0.01-2％重量。
在上述的液中干燥法中，与水混溶的另一种有机溶剂(如具有1-3个羟基的脂肪族的有机化合物)可以用于代替聚乙烯醇。这样的化合物的实例包括甘油、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、异丙醇、苯甲醇等。
本发明的药物通常以视黄酸或者视黄酸与无机或有机物质的视黄酸复合粒子和药理学可接受的载体相混合得到的组合物的形式提供。作为在此涉及的药理学可按受的载体，可以使用在药物制剂领域常规使用的各种有机或无机载体物质。
当制备液体药物制剂(如注射液)时，将视黄酸或视黄酸复合粒子分散或溶解于介质中，如注射用水、生理盐水溶液、林格溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄榄油或棉籽油。特别地，将视黄酸分散于水性介质中获得含水的悬浮液是优选的。液体药物制剂除了上述介质，可以包含另外的组分如增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、防腐剂和抗氧化剂。
本发明的药物可以由以上液体药物制剂冻干获得的药物制剂或固化活性成分得到固体药物制剂的形式提供。使用时可以将其分散或溶解于合适的溶剂中形成注射液。在固体药物制剂的情况下，可以掺入另外的组分如赋形剂、粘合剂或崩解剂。
本发明药物的剂型适用于液体药物制剂如注射液。然而，胃肠外药物如外用制剂(软膏剂等)、栓剂、丸剂、经鼻的药物和吸入或口服药物(如胶囊)也是可利用的。
本发明如此制备的药物是对预防和/或治疗糖尿病(包括I型糖尿病和II型糖尿病)有效的，而且对预防和/或治疗伴随高血糖的各种疾病也是有效的。
本发明药物的剂量随给药的患者、给药的途径、疾病的症状等而变化。例如，当药物口服给予成人糖尿病患者时，在一次给药中作为活性成分的视黄酸的剂量是约0.01-100mg/kg，优选0.05-30mg，更优选0.1-10mg每千克体重，优选以这个剂量给予该药物每日一至三次。
本发明药物的特征在于直接作用于胰脏的β细胞改善糖尿病和使血糖水平回到正常水平，而且由普通血糖控制药引起的高血糖症状发作的风险被认为是降低了。因此，其可以和用于控制血糖水平的常规药物联合使用，如胰岛素药物制剂，胰岛素耐受性改良剂、a-葡糖苷酶抑制药、缩二胍药物或胰岛素分泌促进剂(SU药)。
具体实施例方式
实施例1视黄酸药物制剂的制备作为视黄酸，按其原样使用商购的视黄酸(固体粒子)。
(1)视黄酸-无机物质复合粒子的制备将13.6mg的视黄酸溶解于900μL乙醇(或甲醇)中，向该溶液中加入100μL的0.5N的NaOH水溶液。此时，pH值是7-7.5。作为母液，收集100μL该溶液，将其加入100μL含吐温80(商品名)的蒸馏水，并充分搅拌混合物。大约30分钟后，加入含5M的氯化钙的水溶液，搅拌混合物。30分钟后，加入含1M的碳酸钠的水溶液，进一步搅拌混合物。连续搅拌24小时后，所得的溶液冷冻干燥过夜制得所需的视黄酸-碳酸钙复合粒子。
(2)视黄酸-有机物质复合粒子的制备将PLGA(7.16g)、ZnO(40mg)和视黄酸(800mg)倒入二氯甲烷，用涡流混合器均匀地分散。随后，得到的溶液倾注进管形瓶，瓶中含有已溶解了16g的聚乙烯醇(分子量45,000)和11.2g的醋酸锌的蒸馏水(1,600mL)，搅拌混合物约3小时，蒸发掉二氯甲烷。蒸发掉二氯甲烷形成的粒子用离心分离器从蒸馏水中分离。作为沉淀分离的粒子用蒸馏水洗几次，再进行采用125μm筛的湿法过滤使粒径均匀。最后，用冷冻干燥器干燥粒子约24小时。
以上制备的视黄酸和无机或有机物质的视黄酸复合粒子，以预定的浓度(3-12mg/mL)分散于生理盐水中，制得注射液。
实施例2通过配备18-21号针头的注射器，把实施例1中制得的注射液(含6mg的视黄酸)以1mL的剂量皮下注射入每只患糖尿病大鼠的背部。当使用18号针头时，注射后将注射点用手术用Aron Alpha(商品名)封闭，防止药液泄漏。
随后，观测每只大鼠体重的变化，结果如图1所示。从图1中看出，没有给予视黄酸的对照大鼠(D)体重逐渐减少。同时，在给予视黄酸的大鼠(A)至(C)中，在初期观察到体重的减少，但是之后观察到体重增加的趋势。特别地，给予视黄酸-有机物质复合粒子的药物制剂的大鼠(C)，其体重在很短的时间周期内减少了，从那以后增加了。
展示在开始测量后100天的视黄酸(无机物质复合粒子)给药大鼠和对照大鼠(没有给予视黄酸)的外观的照片如图2所示。已经发现，对照大鼠因为体重的减少变瘦，而给予视黄酸的大鼠通过抑制体重的减少而得以恢复。
当视黄酸的剂量从3mg到12mg变化时，观察到相同的趋势。
实施例3
给予视黄酸-有机物质(PLGA)复合粒子(6mg)的糖尿病大鼠和对照的糖尿病大鼠(没有给予视黄酸)直到约40天时的体重变化如图3(a)所示，在相同阶段的大鼠的血浆胰岛素浓度的变化和血糖浓度的变化如图3(b)和3(c)所示。在图中，●表示给予视黄酸-有机物质(PLGA)复合粒子(6mg)的大鼠，■表示对照大鼠(没有给予视黄酸)。
在没有给予视黄酸的对照大鼠中，观察到一个趋向，血浆胰岛素浓度无变化或逐渐降低，而在给予视黄酸-有机物质复合粒子(LA/PLGA)的大鼠中，血浆胰岛素浓度大约在15天最低，然后增加(图.3(b))。
进一步地，图3(c)显示了血糖浓度的改变，因为数据是在大鼠没有被禁食的情况下测量的，所以数据很没有规律。同时，图3(c)与图3(a)和图3(b)相比较时，观察到一个趋向，血糖浓度(血糖水平)根据血浆中胰岛素浓度的变化而增加或降低。可以说，这些结果证明了图1所示体重的变化是取决于糖尿病(对照大鼠)的发展和糖尿病的恢复(给药的大鼠)。
视黄酸没有直接刺激胰岛素分泌的功能。因此认为通过给予视黄酸改善了胰岛素的分泌活性，恢复了胰脏β细胞的功能，同时抑制了血糖浓度而减轻了糖尿病症状。
实施例4图4显示了比较在给予视黄酸之前或之后的不同情况下血浆胰岛素浓度变化的结果。通过比较给药之前的值和给药后42天的值，发现与给药前的胰岛素水平相比，在任何情况下，未给予视黄酸的对照大鼠中的胰岛素浓度保持不变，而在给予视黄酸的大鼠中的胰岛素水平增加了。还在给药后的141天发现，与对照大鼠相比，给药大鼠的胰岛素水平趋向于高值。
权利要求
1.一种治疗或预防糖尿病的药物，所述药物中含有视黄酸作为活性成分。
2.如权利要求1所述的药物，其中视黄酸是下式(I)表示的全反式视黄酸。
3.如权利要求1所述的药物，其是视黄酸的水性悬浮液的形式。
4.如权利要求1所述的药物，其中视黄酸为视黄酸与无机或有机物质的复合粒子的形式。
5.如权利要求4所述的药物，其中无机物质是多价金属无机酸盐。
6.如权利要求4所述的药物，其中有机物质是生物可降解的聚合物。
7.如权利要求4所述的药物，其中复合粒子是毫微粒，具有5-300nm的平均粒径。
8.一种激活胰脏的β细胞的药物，所述药物含有视黄酸作为活性成分。
全文摘要
本发明旨在提供一种新的治疗和/或预防糖尿病的药物，其不但可以控制血糖水平，而且可以从根本上治疗经受β细胞破坏的Ⅰ型糖尿病患者和胰岛素分泌存在功能障碍的Ⅱ型糖尿病患者。本发明提供一种治疗和/或预防糖尿病的药物，药物包含视黄酸作为活性成分。作为活性成分使用的视黄酸可以是全反式视黄酸，其异构体、衍生物、盐或者其前药。视黄酸可以单独地使用。选择性地，可以采用由视黄酸与合适的有机或无机物质制备的复合粒子。
文档编号A61P9/00GK1921843SQ20058000543
公开日2007年2月28日 申请日期2005年1月21日 优先权日2004年1月23日
发明者山口叶子, 五十岚理慧 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构