专利名称：：使用包含glp－1的运铁蛋白融合蛋白的组合治疗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包含促胰岛肽(insulinotropicpeptide)的运铁蛋白融合蛋白，其有效治疗活性的体内半衰期延长。本发明还涉及使用DPP-IV抑制剂和/或神经内肽酶抑制剂(NEP)以及促胰岛肽的组合治疗。
背景技术：
：蛋白酶蛋白水解酶通过调节蛋白质转换和加工，在调控生理过程中起重要作用，这些生理过程如细胞增殖、分化，以及信号处理。蛋白水解酶通过蛋白水解降解，控制重要的结构蛋白、酶和调节蛋白的水平。失控的蛋白水解酶活性，无论是升高还是降低，都与多种疾病状态相关，包括炎症、癌症、动脉硬化和退行性疾病。国际生物化学会分子生物学联合会(IUBMB)推荐使用术语“肽酶”来指肽键水解酶子集(亚类E.C3.4.)。广为使用的术语蛋白酶与肽酶具有相同的含义。肽酶包括两组酶内肽酶和外肽酶，其裂解蛋白质中的肽键，以及顺序地分别从N-末端或者C-末端去除氨基酸。术语蛋白酶与内肽酶具有相同含义。蛋白水解酶是按照其催化机制分类的。IUBMB已经认可了四种机制类型丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶是蛋白水解酶的一个大家族，在蛋白质裂解的活性酶促位点上含有丝氨酸残基。它们普遍存在于病毒、细菌和真核生物中。丝氨酸蛋白酶具有广泛的底物特异性，基于这些特异性可以再细分为亚家族。有20多个丝氨酸蛋白酶亚家族，被划分为6个分支(SA、SB、SC、SE、SF和SG)。脯氨酰寡肽酶是划分在SC分支的一种丝氨酸蛋白酶。其在脯氨酸残基的羧基侧水解含脯氨酸的肽。其可能与肽激素和神经肽的成熟和降解相关(Wilk等人，1983LifeSci.33，2149-2157)。脯氨酰寡肽酶的例子包括二肽基肽酶IV(DPP-IV)、二肽基肽酶II(DPP-II)、成纤维细胞活化蛋白以及脯氨酰寡肽酶。这些酶具有截然不同的特异性。脯氨酸存在于大量肽激素中。其决定了这些肽的某些结构特性，例如这些肽的构象和稳定性，防止被非特异性蛋白酶降解。存在大量攻击脯氨酸肽键的肽酶。这些肽酶不仅与X-Pro或Pro-X键的断裂相关，而且参与相应的丙氨酰键的降解，但具有下降的活性。由于一些对含有脯氨酸的序列具有高度特异活性的肽酶已经与调节天然的肽底物的生物学活性相关，这些肽酶成为了医学化学领域具有吸引力的研究对象。例如，DPP-IV与通过调节胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的水平与治疗糖尿病联系起来。在多种疾病中，例如类风湿性关节炎、多发性硬化、格雷夫斯病(Grave’sdisease)以及Hashimoto氏甲状腺炎、肉状瘤病(sarcoidosis)以及癌症，DPP-IV活性升高。在AIDS、唐氏综合症(Down’ssyndrome)、厌食/易饿病(anorexia/bulimia)、怀孕和低丙种球蛋白血症中，DPP-IV活性也升高。包括DPP-IV的二肽基肽酶二肽基氨基肽酶活性是催化从肽、多肽或和蛋白质的N-末端去除二肽的肽酶活性。通常，二肽基氨基肽酶能够从肽、多肽和蛋白质的未被取代的N-末端氨基上裂解二肽XY，其中X和Y代表任何氨基酸残基。二肽基肽酶(DPPs)的例子包括二肽基肽酶I(DPP-I)、二肽基肽酶II(DPP-II)、二肽基肽酶III(DPP-III)和二肽基肽酶(DPP-IV)。DPP-I也被称作为组织蛋白酶C，是一种在大多数组织中表达的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。DPP-I与粒酶的加工相关，粒酶是在被活化的细胞毒淋巴细胞颗粒中专门表达的中性丝氨酸蛋白酶。DPP-II是一种存在于溶酶体中的丝氨酸蛋白酶。与DPP-IV相同，DPP-II裂解含有脯氨酸的肽键。事实上，DPP-II具有与DPP-IV相似的底物特异性，但仅在酸性pH下起作用。二肽基肽酶III(DPP-III)是一种金属蛋白酶。DPP-IV是一种丝氨酸蛋白酶，包含丝氨酸蛋白酶基序GWSYG，并且具有广泛的底物特异性。其从氨基末端顺序水解肽，释放氨基酸。然而，当到达脯氨酸之前的氨基酸残基时，水解终止。结果，具有键X-Pro-Y-(X和Y是任选的氨基酸)的肽被裂解，获得X-Pro和Y-。DPP-IV还会断裂在倒数第二个位置上具有丙氨酸的二肽，虽然其效率低于具有脯氨酸的二肽(Yaron等人，1993Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.2831-81)。该酶还能够裂解其它序列，但是效率仍然较低。已经证明，在从生物活性肽的N-末端释放二肽时，DPP-IV具有高特异性，所述活性肽在肽底物的N-末端的倒数第二个位置上具有脯氨酸或丙氨酸。DPP-IV的大量可能的肽底物已经被鉴定。DPP-IV底物包括肽激素和细胞因子。某些肽激素的例子为内啡素-2(endomorphin-2)、GLP-1、GLP-2、肠抑胃肽(GIP)、神经肽Y、生长激素释放激素(GHRH)和P物质，某些细胞因子的例子是RANTES、GCP-2、SDF-1α、SDF-2β、MDC、MCP-1、MCP-2和MCP-3。DPP-II具有与DPP-IV几乎相同的底物特异性。DPP-IV与糖尿病胰岛素依赖的糖尿病(IDDM或者I型糖尿病)目前是通过给患者施用胰岛素来治疗。非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM或者II型糖尿病)是通过饮食、施用磺酰脲类药物(sulphonylureas)刺激胰岛素分泌或者施用双胍增加葡萄糖摄取来治疗。具有抗性的个体需要胰岛素治疗。标准治疗要求需要每日静脉注射胰岛素，这可以治疗急性症状，但是治疗期延长会引起血管疾病和神经损害。现代的方法十分昂贵，如移植，并且需要进行具有风险的手术干涉。因此，需要开发一种高效、低成本的糖尿病治疗替代方案。近些年来，人们对将DPP-IV作为降低血糖水平的靶点日益感兴趣。使用抑制剂来阻断患者血液中的DPP-IV酶或者DPP-IV样酶的活性会导致降低对内源性的或者体外施用的促胰岛肽的降解，这些促胰岛肽如GIP、GLP-1或其类似物。GIP和GLP-1是刺激胰腺葡萄糖诱导式地分泌胰岛素的激素，是DPP-IV的底物。特别地，由于DPP-IV去除GLP-1的氨基末端的His-Ala二肽，生成GLP-1-(9-36)-酰胺，GLP-1-(9-36)-酰胺不能引起胰岛的葡萄糖依赖式地分泌胰岛素，这种DPP-IV或DPP-IV样酶的体内活性的抑制将有效地在哺乳动物生物体内抑制病理状况下的不期望的酶活性。PCT/DE97/00820公开了DPP-IV或DPP-IV样酶活性的抑制剂，丙氨酰吡咯烷盐(alanylpyrrolidide)和异亮氨酰噻唑啉盐(isoleucylthiazolidide)。DD296075公开了吡咯烷盐(pyrrolidide)和异亮氨酰噻唑啉盐酸盐。美国专利US6,548,481公开了与二肽化合物类似的由氨基酸和噻唑啉盐或者吡咯烷盐基团形成的抑制剂，及其盐。虽然这些化合物是DPP-IV活性的功能性抑制剂，但是在某些患者或者特定类型疾病中，使用这些抑制剂是有问题的，这是由于这些酶负责激活或者灭活如此大范围的生物活性肽，也就是说，DPP-IV抑制剂对期望靶点GIP和GLP-1不具有特异性。通过修饰保护治疗性肽防止治疗性蛋白质和肽如GIP或GLP-1被蛋白水解酶裂解的一种可替代方法是对蛋白质和肽本身进行修饰，以阻碍其暴露于蛋白水解酶。已经证明，蛋白质修饰会提高治疗性多肽的稳定性、循环时间和生物学活性。一些修饰氨基酸和肽的常用方法公开在ChemistryandBiochemistryofAminoAcid，PeptideandProteins--ASurveyofRecentDevelopments(Weinstein，B.编辑，MarcelDekker，Inc.出版，纽约1983)，其在此引入作为参考。此外，Francis的综述文章(1992FocusonGrowthFactors34-10，(Mediscript，伦敦))公开了蛋白质修饰和融合蛋白，其在此引入作为参考。随着DNA重组技术和自动化技术的发展，现在可以容易地制备大量经过修饰的多肽，这些肽可以是短的、中等长度或者长的。可以使用肽自动合成仪、固相树脂技术或者重组技术，合成大量经过修饰的小的多肽激素。例如，二肽基肽酶的大量修饰的底物可以用肽自动合成仪制备，例如，DPP-IV的底物如GLP-1、GIP、神经肽Y以及缓激肽。发明概述本发明提供运铁蛋白融合蛋白，其包含对蛋白酶裂解敏感的治疗性肽或蛋白质。本发明还提供运铁蛋白融合蛋白，其包含对蛋白酶裂解敏感、具有抗性或者具有部分抗性的治疗性肽或蛋白质。所述蛋白酶可以是DPP-IV或者神经内肽酶(NEP)。然而，本发明提供包含运铁蛋白融合蛋白和第二试剂的组合物，所述第二试剂例如但是不限于，DPP-IV的抑制剂和/或NEP的抑制剂。此外，该组合物可以是用于治疗各种疾病的药物组合物。本发明提供用组合治疗，包括在治疗各种疾病时，施用运铁蛋白融合蛋白和至少一种第二试剂。运铁蛋白融合蛋白可以与一种或多种第二试剂同时施用。可替代地，在施用第二试剂之前或者之后，顺序施用运铁蛋白融合蛋白。优选地，第二试剂是DPP-IV的抑制剂或NEP的抑制剂。修饰本发明的GLP-1肽部分来包含一个或多个突变，使得它们部分或者完全地抵抗蛋白酶的裂解，例如DPP-IV的裂解。GLP-1肽可以是GLP-1(7-37)(SEQIDNO32)或者GLP-1(7-36)(SEQIDNO2的氨基酸1-30)。例如，通过将A8突变为G和/或K34A来修饰这些肽。附图简介图1显示pREX0094的限制性酶图谱。图2显示质粒pREX0198的限制性酶图谱。图3显示pSAC35的限制性酶图谱。图4显示质粒pREX0240的限制性酶图谱。图5显示pREX0052的限制性酶图谱。图6显示pREX0367的限制性酶图谱。图7显示pREX0368的限制性酶图谱。图8显示GLP-1和H-GLP-1与DPP-IV温育的时程。该图表显示活性的全长肽的剩余含量，通过特异于活性GLP-1的ELISA检测。发明详述1.一般描述本发明部分基于需要开发一种更加有效的、低成本的糖尿病治疗的替代方案。促胰岛肽，如GLP-1，是十分有前景的用于治疗非胰岛素依赖性2型糖尿病以及相关的代谢异常如前驱糖尿病(pre-diabetes)、代谢综合症和肥胖的治疗剂。其它有用的促胰岛肽(insulinotropicpeptide)包括毒蜥激动肽(exendin)3和毒蜥激动肽4。然而，这些促胰岛肽的体内血浆半衰期短，主要是由于被快速地从血清中清除以及被蛋白质水解降解。还进行了大量工作来抑制负责降解GLP-1的酶DPP-IV，或者修饰GLP-1来减缓其降解速度并仍保留其生物学活性。尽管进行这些大量努力，但是还没有制备得到持久的活性GLP-1。因此，需要对GLP-1、毒蜥激动肽3、毒蜥激动肽4和其它促胰岛肽进行修饰，以产生更长的体内活性持续时间，并且仍保留其低毒性和治疗优点。2.定义如在此所用，术语“衍生”是指使用或者不使用酶，借助化学手段对肽的一个或多个氨基酸残基进行的修饰，例如，通过烷基化、酰化、形成酯或者形成酰胺。如在此所用，术语“来源于”是指从特定来源获得一种分子，例如从亲本分子获得一种分子。如在此所用，术语“二肽基氨基肽酶活性(dipeptidylaminopeptidaseactivity)”是指从肽、多肽或者蛋白质的N-末端裂解二肽的肽酶活性。通常，二肽基氨基肽酶能够从肽、多肽或蛋白质的未被取代的N-末端氨基上裂解二肽XY，其中X和Y代表选自由Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val组成的组的任何氨基酸残基，但是至少为Ala、Arg、Asp和/或Gly。优选地，Y是Pro或Ala。所有的X和Y可以是不同的或者相同的。二肽基氨基肽酶的例子包括但是不限于DPP-I、DPP-II、DPP-III和DPP-IV。如在此所用，术语“胰高血糖素样肽-1(GLP-1)”和“GLP-1衍生物”是指肠激素，其通常在高血糖过程中刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，刺激胰岛素生物合成，并减缓胃排空和酸分泌。如美国专利US5,574,008中所公开，某些GLP-1和GLP-1衍生物促进细胞摄取葡萄糖，但是不刺激胰岛素表达，该专利在此引入作为参考。如在此所用，术语“促胰岛肽”是指具有促胰岛活性的肽。促胰岛肽刺激或者导致刺激激素胰岛素的合成或者表达。这种肽包括肽的前体、类似物、片段，如胰高血糖素样肽1、毒蜥激动肽3和毒蜥激动肽4以及其它具有促胰岛活性的肽。如在此所用，“药学上可接受的”是指生理上耐受的并且被施用给人时通常不会产生过敏的或者类似的不良反应如反胃、头昏等的材料和组合物。通常，如在此所用，术语“药学上可接受的”是指为联邦或州政府的管理机构批准或者列举在美国药典或者其它通常被认可的用于动物特别是人的药典中的。如在此所用，术语“药物组合物”是指包含药物以及需要时加上药学上可接受的载体或者稀释剂的组合物。选择药学上可接受的载体和添加剂，使得药物化合物的副作用被最小化而该化合物的性能不会被消除或者抑制到使治疗无效的程度。如在此所用，“生理有效量”是被呈递给患者来产生期望的减缓或者治愈效果的量。该量特异于各种药物及其最终的被认可的剂量水平。如在此所用，“治疗有效量”是指当被施用给需要的患者时足以实现治疗的经过修饰的治疗性多肽或肽的量。构成“治疗有效量”的经过修饰的治疗性多肽或者肽的量是变化的，其依赖于所用的治疗性蛋白质，状况或疾病的严重程度，所治疗的患者的年龄和体重，可由本领域普通技术人员依照其自身知识和本文公开内容常规地确定。如在此所用，“治疗性蛋白质”是指具有一种或者多种治疗活性和/或生物学活性的蛋白质、多肽、抗体，或其肽片段或变体。本发明所包括的治疗性蛋白质包括但是不限于蛋白质、多肽、肽、抗体和生物产品(biologics)。术语肽、蛋白质和多肽在此被互换使用。可替代地，术语“治疗性蛋白质”是指治疗性蛋白质的内源性的或者天然存在的相关物。具有“治疗活性”的多肽或肽或者“治疗活性的”蛋白质是指这样多肽、肽或者蛋白质，其具有一种或多种已知的生物学活性和/或治疗活性，该活性与治疗性蛋白质如一种或多种在此公开的或者本领域已知的其它治疗性蛋白质相关。作为一个非限制性例子，“治疗性蛋白质”是这样蛋白质、多肽或者肽，其可用于治疗、预防或者改善疾病、状况或者异常。这种疾病、状况或者异常存在于人或者非人动物中，例如兽医用途。如在此所用，术语“处理”或“治疗”是指本发明的化合物的任何施用，并且包括(1)防止疾病在动物身上发生，该动物倾向于患病但是还没患有或者没有表现出该疾病的病理或者症状；(2)抑制动物体内的疾病，该动物正患有或者表现出患病的病理学或者症状(即，使病理学和/或症状的进一步发展停止)；或者(3)改善动物体内的疾病，该动物正患有或者表现出患病的病理学或者症状(即，使病理学和/或症状逆转)。如在此所用，术语“生物学活性”是指调节生物学功能的能力。“生物学活性”包括功能活性以及结构活性。如在此所用，术语“减缓的”是指减轻或者缓和疾病或者异常的症状而没有实现治愈的能力。例如，减轻疼痛而没有治愈该状况或疾病的制剂是一种减缓制剂。如在此所用，术语“预防的”是指具有保护作用，例如起作用来抵御或者阻止某事，特别是疾病或者状况。如在此所用，“被纯化的”蛋白质或者核酸是指从细胞成分中分离得到的蛋白质或者核酸。“被纯化的”蛋白质或者核酸已经被纯化到在自然界中不存在的纯度水平。如在此所用，术语“基本上纯的(substantiallypure)”蛋白质或者核酸是指一种蛋白质或核酸，其不具有所有其它的细胞成分。如在此所用，术语“治疗性的”是指具有治愈、恢复或者补救作用。例如，“治疗性制剂”或者“治疗性组合物”具有治愈作用。3.具体实施方式二肽基肽酶二肽基肽酶是水解酶，其从肽、多肽或者蛋白质的未被取代的N-末端氨基基团上去除二肽。二肽基肽酶(DPP)的例子包括但是不限于DPP-I、DPP-II、DPP-III、DPP-IV、诱蛋白(attractin)和成纤维细胞活化蛋白质(FAP)。该家族或者具有类似功能而结构不同的新酶正被逐渐发现。二肽基肽酶I(DPP-I)也被称作为组织蛋白酶C，是一种属于木瓜蛋白酶家族的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。DPP-I能够依次从各种肽和蛋白质底物的游离氨基末端去除二肽，因而以外肽酶(特别是二肽基肽酶)的模式起作用。如果被切断的键位于脯氨酸残基的任一侧，或者N-末端残基是赖氨酸或者精氨酸，裂解不能有效地发生。DPP-II是一种存在于溶酶体中、功能未知的丝氨酸蛋白酶。与DPP-IV相同，其主要裂解含有脯氨酸的肽键。事实上，DPP-II具有与DPP-IV类似的底物特异性，但是其仅在酸性pH起作用。哺乳动物的DPP-II和DPP-IV可以用抑制剂嘌呤霉素和杆菌肽(bacitracin)区分开；嘌呤霉素仅抑制DPP-II，而杆菌肽仅抑制DPP-IV(1988J.Biol.Chem.263，6613-6618)。二肽基肽酶III(DPP-III)是一种金属蛋白酶。DPP-V释放N-末端的X-Ala、His-Ser和Ser-Tyr二肽。DPP-VII也被称作为休眠细胞脯氨酸二肽酶，是一种脯氨酸特异的二肽酶。基于人DPP-VII和大鼠DPP-II的序列比较(78％同一性)(Araki等人，2001J.Biochem.129，279-288)，一般认为DPP-VII和DPP-II是相同的蛋白酶。DPP-VIII是人的后脯氨酸(postproline)二肽基氨基肽酶，与DPP-IV和FAP同源(Abbott，CA.等人，2000EuropeanJournalofBiochemistry267，6140)。与DPP-IV类似，DPP-VIII是普遍存在的。全长的DPP-VIIIcDNA编码882个氨基酸的蛋白质，其与DPP-IV具有约27％的同一性，与FAP具有约51％的相似性，但是没有跨膜结构域，也未发生N-连接的糖基化和O-连接的糖基化。被纯化的重组DPP-VIII水解DPP-IV底物Ala-Pro、Arg-Pro和Gly-Pro。因此，重组DPP-VIII与DPP-IV和FAP都具有后脯氨酸二肽基氨基肽酶活性。DPP-VIII酶活性具有与非溶酶体相一致的中性pH最佳活性。DPP-VIII和DPP-IV之间在组织表达模式和底物上的相似性表明DPP-VIII在T细胞活化和免疫功能上的潜在作用与DPP-IV类似。OlsenC.等人(2002Gene299，185-93)报道他们鉴定并表征了新的DPP-IV样分子，该分子称为二肽基肽酶样蛋白质DPP-IX。与DPP-IV类似，DPP-IX包含丝氨酸蛋白酶基序GWSYG(SEQIDNO110)。在DPP-IX中存在该基序以及构成DPP-IV中的催化三组合(triad)氨基酸Ser、Asp和His残基的保守顺序和间隔，使得DPP-IX应归于DPP-IV基因家族。诱蛋白(DPPT-L)是一种175kDa的可溶糖蛋白，其被报道能够水解Gly-Pro。诱蛋白含有kelch重复结构域，与DPP-IV或任何其它肽酶不具有显著的序列同一性。成纤维细胞活化蛋白(FAP)是在组织重建部位表达的脯氨酰寡肽酶基因家族的细胞表面结合蛋白酶。脯氨酰内肽酶(PEP)也被称作为脯氨酸寡肽酶(PO)，首先被Walter及其同事发现，是人子宫中的一种降解催产素的酶(Walter等人，Science173，827-829(1971))。该酶断裂含有X-Pro-Y序列的肽中的脯氨酸的羧基侧的肽键，其中X是一种肽或者N-末端的被取代的氨基酸，而Y是一种肽、氨基酸、酰胺或者醇(Yoshimoto等人，J.Biol.Chem.253，3708-3716(1979))。该酶对脯氨酸的亚氨基侧的肽键的构象转化(trans-conformation)具有高度特异性(Lin&Brandts，Biochemistry22，4480-4485(1983))。脯氨酰寡肽酶水解血管紧张素I和血管紧张素II，这引起血管紧张素(1-7)释放。血管紧张素(1-7)具有血管扩张活性，并调节抗利尿激素释放，影响记忆过程，这已通过给大鼠注射特定的PEP-抑制剂所证实。该注射能够逆转由东莨菪碱引起的健忘症。该实验不仅是一个证明该酶的可能具有生理功能的例子，而且其引起一种假设，即PEP的抑制剂会影响记忆过程并且能够抗痴呆(Yoshimoto等人，1987J.Pharmacobio-Dyn.10，730-735)。二肽基肽酶(DPP-IV)和底物DPP-IV是一种被广泛表达的分子，其与多种肽和激素的降解相关。已经纯化了各种类型的DPP-IV，并且已经揭示其酶学特性。例如，已经从大鼠肝脏(Hopsu-HavuV.K.等人，1966Histochem.，7197-201)、猪肾脏(BarthA.等人，1974Biol.Med.Chem.，32157-174)、猪小肠(SvenssonB.1978Eur.J.Biochem.，90489-498)、猪肝脏(FukasawaK.M.等人1981Biochim.Biophys.Acta，657179-189)、人颌下腺(OyaH.等人，1972Biochim.Biophys.Acta，258591-599)、绵羊肾脏(YoshimotoT.等人，1977Biochim.Biophys.Acta，485391-401；YoshimotoT.等人，1978J.Biol.Chem.，2533708-3716)或者微生物(FukusawaK.M.1981Biochem.Biophys.，210230-237；YoshimotoT.1982J.Biochem.，911899-1906(1982))中分离得到DPP-IV。在人免疫系统中，DPP-IV与T细胞表面抗原CD26是相同的，CD26由被活化的淋巴细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞和天然杀伤细胞)所表达。CD26/DPP-IV是II型糖蛋白，具有内在的二肽基肽酶IV活性，并能够结合I型腺苷脱氨酶(ADA-1)。它在上皮细胞中组成型地表达，但是在T淋巴细胞中，其仅在严格细胞调控下表达，并且在细胞活化时其表达被上调。已经证明，CD26/DPP-IV的胞外结构域具有二肽基肽酶IV活性(Hegen等人，1990J.Immunol1442908-2914；Ulmer等人，1990Scand.J.Immunol.31429-435)，并且共刺激活性似乎部分地依赖于该酶的活性(Tanaka等人，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA904586-4590)。DPP-IV与细胞因子功能调控相关，可能在HIV感染中起重要作用。美国专利US6,265,551公开了一种循环的、可溶形式的DPP-IV/CD26，其分离自人血清。该血清形式的DPP-IV/CD26与普遍存在的膜形式的DPP-IV/CD26具有相似的酶学特性和抗原特性；但是在多个生物化学方面截然不同。特别地，循环血清形式的DPP-IV/CD26的分子量为175kDa，不同于膜形式的105kDa的分子量，其不结合ADA-1。然而，循环形式的DPP-IV/CD26显示功能性的二肽基肽酶IV活性，并且保留共刺激T淋巴细胞反应回忆抗原(recallantigen)的能力。DPP-IV的蛋白水解活性位于该蛋白C-末端的约200个氨基酸的片段上。催化残基(Ser-629、Asp-708、His-740)以不同于传统丝氨酸蛋白酶如胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的独特顺序排列。脯氨酸特异的二肽基肽酶活性改变大量生物活性蛋白质和多肽的生物学活性，其中，这些蛋白质和多肽包括GLP-1、神经递质P物质、人生长激素释放因子、促红细胞生成素、白介素2等等。可能的DPP-IV底物列举在表1、表2和表3中。调节这些肽来影响DPP-IV裂解可用于治疗临床病症，包括但是不限于糖尿病、炎症、血管病、自体免疫性疾病、多发性硬化、关节病以及与良性和恶性细胞转化相关的疾病表1具有倒数第二位脯氨酸的人细胞因子、生长因子、神经肽和血管活性肽，它们是DPP-IV的推定底物。表2具有倒数第二位丙氨酸的人类肽和蛋白质，它们是DPP-IV的推定底物。本发明可利用经过修饰的DPP底物，在底物的N-末端包含一个或多个附加的氨基酸，以保护底物免受DPP活性的作用。用于按照本发明的修饰的优选底物被公开在表3中。表3DPP-IV(CD26)裂解的底物用于修饰的底物包括氨基末端的X-Pro-Y、X-Ala-Y、X-Ser-Y或者X-Gly-Y。优选地，用于修饰的底物是GLP-1。免受DPP活性作用的被修饰多肽本发明提供经过修饰的多肽，例如DPP的经过修饰的多肽底物，在底物的N-末端包含一个或多个附加的氨基酸，以保护该多肽底物免受DPP活性的作用。在一个实施方案中，与野生型多肽相比，经过修饰的多肽在其N-末端具有一个附加的氨基酸。在另一个实施方案中，经过修饰的多肽在其N-末端具有5个附加的氨基酸。可替代地，经过修饰的多肽在其N-末端具有1-5个附加的氨基酸。20种氨基酸的任何一种可被添加到多肽底物的N-末端，或者添加非天然的氨基酸。可以预期，由于本发明提供了免受DPP裂解的保护，在施用之后会在体循环或者在体内的任何部位被裂解的任何具有肽键的药物多肽都会从按照本发明的修饰中获益。按照本发明的这个方面，有可能去除至少约30％、优选至少约50％、更优选至少约70％、甚至更优选至少约90％、和最优选至少约99％二肽基肽酶活性。采用本发明的方法，还可能完全去除二肽基氨基肽酶活性。同样，可能降低至少约30％、优选至少约50％、更优选至少约70％、甚至更优选至少约90％、和最优选至少约99％的底物的二肽基肽酶敏感性。采用本发明的方法，还可能完全去除二肽基氨基肽酶敏感性。尽管本发明的经过修饰的多肽或者肽底物部分地或基本上免受DPP活性的作用，但是经过修饰的多肽底物仍保留至少约10％、优选至少约30％、更优选至少约50％、更优选至少约70％，甚至更优选至少约90％，和最优选至少约99％的功能活性和功效。在某些情形下，功能活性和功效下降的经过修饰的多肽或肽底物是有用的。例如，当经过修饰的多肽或肽与其它多肽如运铁蛋白融合，形成血清稳定性提高和体内循环半衰期延长的融合蛋白时，功能活性或功效下降的经过修饰的多肽或肽底物是有用的。在其它情形下，与未经过修饰的多肽或肽相比，经过修饰的多肽或肽的功效升高。与未被修饰形式的相同多肽比较，本发明的经过修饰的多肽分子基本上免受二肽基肽酶裂解的作用。对这种实质的保护作用进行的鉴定会因用于比较经过修饰的多肽与未经过修饰的多肽的分析而不同。然而，为了展示实质的保护作用，在该分析中，经过修饰的多肽对二肽基肽酶裂解具有可检测的抗性水平。这种分析包括但是不限于在Doyle等人(2002Endocrinology142，4462-4468)，O′Harte等人(1999Diabetes48，758-765)和Siegel等人(1999RegulatoryPeptide79，93-102)中公开的那些方法。与未被稳定的多肽底物相比，本发明的DPP稳定多肽底物在体内存在DPP时更加稳定。与序列相同的未被稳定的多肽相比，DPP稳定的治疗性多肽底物通常具有更长的活性半衰期。通过将未经过修饰的多肽底物在血清或者血液中的半衰期与经过修饰的对应治疗性肽在血清或血液中的半衰期比较，确定肽酶的稳定性。通过在施用经过修饰的肽和未经过修饰的肽后采集血清或血液样本，并确定该肽的活性，来确定半衰期。除了确定活性，还通过HPLC或者质谱分析来测定多肽底物的长度。本发明还提供经过修饰的多肽或肽，其具有按照本发明的被改变的氨基末端以免受DPP裂解的作用，并且具有不影响多肽的功能活性或功效的内部和/或C-末端的氨基酸改变。这些经过修饰的多肽具有较少的氨基酸改变，虽然这些氨基酸改变也包括非保守的取代，但通常是保持的氨基酸取代。本发明的经过修饰的多肽或肽还具有改变的功能活性。例如，功能活性升高的经过修饰的多肽或肽是有用的。可替代地，可以使用功能活性下降的经过修饰的多肽或肽。因此，本发明的经过修饰的多肽或肽还含有不影响功能活性或功效的氨基酸改变。例如，对功能活性改变的GLP-1类似物的氨基末端进行修饰，使其免受DPP裂解的作用。保守氨基酸取代的例子是在相同组中进行的取代，例如在碱性氨基酸组(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸组(例如谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸组(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸组(例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，芳香氨基酸组(例如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸组(例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)。非保守性取代包括一个组中的氨基酸被另一个组的氨基酸取代。例如，非保守性取代包括用极性氨基酸取代疏水性氨基酸。对核苷酸取代的一般性描述参见例如Ford等人(1991)，Prot.Exp.Pur.295-107。本发明提供经过修饰的多肽和肽的氨基酸序列的显然变体，例如天然存在的成熟形式的多肽或肽、多肽的等位基因变体/序列变体、肽的非天然存在的重组来源的变体，以及多肽或肽的直向同源物和种内同源物。使用核酸重组技术和蛋白质生物化学领域的已知技术，可以很容易地制备这种变体。使用分子技术和序列信息，能够容易地鉴定/制备这种变体。此外，根据其与本发明的经过修饰的多肽或肽的序列和/或结构的同源性，很容易将这种变体与其它肽区分开。优选地，本发明的经过修饰的肽是在N-末端包含一个或多个附加的氨基酸的GLP-1及其类似物。在某些情形下，DPP例如DPP-IV可以激活肽，而不是通过裂解灭活该肽。在这种情形下，对肽的修饰能够基本上减少、延缓或者阻止肽活化。编码经过修饰的多肽的核酸本发明提供编码经过修饰的多肽和肽的核酸分子，这些多肽和肽部分地或者基本上免受DPP裂解的作用并具有功能活性和功效。在一个实施方案中，本发明所提供的核酸分子编码经过修饰的多肽和肽，与其野生型的未经过修饰的多肽相比，经过修饰的多肽和肽在其N-末端具有至少一个附加的氨基酸。在另一个实施方案中，核酸分子编码在其N-末端具有5个附加的氨基酸的经过修饰的多肽和肽。可替代地，核酸分子编码在其N-末端具有1-5个的附加的氨基酸的经过修饰的多肽和肽。优选地，编码修饰的GLP-1的核酸分子包含编码在其N-末端具有一个或多个附加氨基酸的序列。本发明的核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNAs)，单链的和双链的脱氧核糖核酸。然而，还可以是核糖核酸(RNAs)，以及杂合的RNADNA双链分子。被包括的核酸分子还包括基因组DNA、cDNA、mRNA，以及反义分子。本发明的核酸分子还包括编码经过修饰的多肽的天然的或合成的RNA、DNA或cDNA，或其互补链。为了构建经过修饰的多肽，其与野生型的未经过修饰的多肽相比部分地或基本上免受DPP活性的作用并且具有功能活性和/或功效，编码野生型的未经过修饰的多肽的核酸可被用作起始点，并被修饰来编码期望的经过修饰的多肽。已知有许多方法用于添加序列或者用于突变编码多肽的核酸序列，并确定由这些经过修饰的序列所编码的多肽的功能。本发明还提供编码多肽和肽的核酸，该多肽具有免受DPP裂解作用的经过修饰的氨基末端以及基本上不影响多肽的功能活性或功效的内部的和C-末端的氨基酸改变。这些经过修饰的多肽具有较少的氨基酸改变，虽然这些氨基酸改变也可以是非保守取代，但是它们通常是保守氨基酸取代。用于实现位点特异性诱变的技术的核苷酸取代在本领域是熟知的。优选地，核酸编码在N-末端具有一个或多个附加氨基酸的GLP-1类似物。如本领域所知，两条多核苷酸或多肽之间的“相似性”，是通过将一条多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列及其保守性核苷酸或氨基酸取代物与第二条多核苷酸或多肽的序列比较来确定。如本领域所知，“同一性”是指两条多肽或两条多核苷酸序列之间的序列相关程度，通过鉴定这种序列两条链之间的匹配程度来确定。同一性和相似性都很容易计算(ComputationalMolecularBiology，Lesk，A.M.编辑，OxfordUniversityPress，NewYork，1988；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects，Smith，D.W.编辑，AcademicPress，NewYork，1993；ComputerAnalysisofSequenceData，PartI，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，HumanaPress，NewJersey，1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology，vonHeinje，G.，AcademicPress，1987和SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，MStocktonPress，NewYork，1991)。在存在大量测定两条多核苷酸或多肽序列之间的同一性和相似性的方法同时，术语“同一性”和“相似性”也是技术人员所熟知的(SequenceAnalysisinMolecularBiology，vonHeinje，G.，AcademicPress，1987；SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M.以及Devereux，J.编辑，MStocktonPress，NewYork，1991；以及Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAMJ.AppliedMath.，481073(1988)。通常用于测定两条序列之间的同一性或相似性的方法包括，但是不限于在GuidetoHugeComputers，MartinJ.Bishop编辑，AcademicPress，SanDiego，1994，以及Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAMJ.AppliedMath.481073(1988)中公开的那些方法。设计确定同一性的优选方法，以在所检测的两条序列之间产生最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编写成计算机程序。确定两条序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括，但是不限于GCG程序包(Devereux等人，NucleicacidResearch12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，J.Molec.Biol.215403(1990))。上面所提及的相似性或同一性的大小被确定为两条序列之间的相同程度，表示第一条序列衍生于第二条序列。两条核酸序列之间的相同程度可以通过本领域知晓的计算机程序来确定，例如在GCG程序软件包中提供的GAP(Needleman和Wunsch(1970)JournalofMolecularBiology48443-453)。为了确定本发明的两条核酸序列之间的相同程度，使用GAP，具有如下设定5.0的GAP产生(creation)罚分和0.3的GAP延长(extension)罚分。密码子优化遗传密码的简并性使得可以改变多肽的核苷酸序列，而仍然生成包含与第一DNA序列所编码的多肽相同的氨基酸序列的修饰多肽。该操作称作“密码子优化”(描述在美国专利US5,547,871中，其在此全文引入作为参考)，提供设计这种被改变的DNA序列的方法。密码子优化的基因的设计应当考虑各种因素，包括生物体中密码子利用的频率、最接近的邻近者频率、RNA稳定性、二级结构形成的可能性、合成路径以及意欲对该基因进行的本来DNA操作。特别地，当采用酵母表达系统时，采用可获得的方法来用那些最容易被酵母识别的密码子改变编码特定融合蛋白的密码子。遗传密码的简并性使得相同的氨基酸序列可以用多种不同方式来编码和翻译。例如，亮氨酸、丝氨酸和精氨酸分别由六种不同的密码子编码，而缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和甘氨酸分别由四种不同密码子编码。但是，在真核细胞和原核细胞中，这种同义密码子的使用频率在基因组之间是不同的。例如，同义密码子的选择模式在哺乳动物之间十分类似，而在进化距离远的生物体例如酵母(例如酿酒酵母)、细菌(例如大肠杆菌)和昆虫(例如D.Melanogaster)中，则表现出明显不同的基因组密码利用频率模式(Grantham，R.等人，Nucl.AcidRes.，8，49-62(1980)；Grantham，R.等人，Nucl.AcidRes.，9，43-74(1981)；Maroyama，T.等人，Nucl.AcidRes.，14，151-197(1986)；Aota，S.等，Nucl.AcidRes.，16，315-402(1988)；Wada，K.等人，Nucl.AcidRes.，19Supp.，1981-1985(1991)；Kurland，C.G.，FEBSLetters，285，165-169(1991))。密码子选择模式的这些差别似乎通过调节肽伸长比例来影响各个基因的整体表达水平。(Kurland，C.G.，FEBSLetters，285，165-169(1991)；Pedersen，S.，EMBOJ.，3，2895-2898(1984)；Sorensen，M.A.，J.Mol.Biol.，207，365-377(1989)；Randall，L.L.等人，Eur.J.Biochem.，107，375-379(1980)；Curran，J.F.和Yarus，M.，J.Mol.Biol.，209，65-77(1989)；Varenne，S.等人，J.Mol.Biol.，180，549-576(1984)，Varenne，S.等人，J.Mol，Biol.，180，549-576(1984)；Garel，J.-P.，J.Theor.Biol.，43，211-225(1974)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，146，1-21(1981)；Ikemura，T.，J.Mol.Biol.，151，389-409(1981))。合成基因的优选密码子利用频率应当反映来源于精确的(或者尽可能密切相关)细胞/生物体的基因组的核基因的密码子利用，该细胞/生物体将被用于重组蛋白的表达，特别是酵母属的细胞/生物体。如上所讨论，在一个优选实施方案中，在在此所描述的修饰之前或之后，经过修饰的多肽已经过密码子优化以用于酵母表达。载体用于本发明的表达单位通常包含如下元件，以5′到3′方向被可操作地连接转录启动子、分泌信号序列、编码经过修饰的多肽的DNA序列，以及转录终止子。如上所讨论，经过修饰的多肽和肽的任何排列可以被用于本发明的载体中。对合适的启动子、信号序列和终止子的选择将通过所选择的宿主细胞来确定，对于本领域的技术人员来说是显然的，将在下文中更加具体地讨论。用于本发明中的合适酵母载体描述在美国专利US6,291,212中，包括YRp7(Struhl等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA761035-1039，1978)、YEpl3(Broach等人，Gene8121-133，1979)、pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature275104-108，1978)、pPPC0005、pSeCHSA、pScNHSA、pC4及其衍生物。有用的酵母质粒载体还包括pRS403-406、pRS413-416和得自StratageneCloningSystems，LaJolla，CA92037，USA的毕赤氏酵母(Pichia)载体。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406都是酵母整合型质粒(YIps)并且纳入了酵母可选择标记HIS3、TUPI、LEU2和URA3。质粒pRS413-41.6是酵母着丝粒质粒(YCps)。这种载体通常包括可选择的标记，可以是任意大量具有显性表型的基因之一，由此，可以进行表型分析来选择转化体。优选的可选择标记是那些弥补宿主细胞营养缺陷的标记，产生抗生素抗性或使细胞能够利用特定的碳源的标志，包括LEU2(Broach等人，同前)、URA3(Botstein等人，Gene817，1979)、HIS3(Struhl等人，同前)或POT1(Kawasaki和Bell，EP171，142)。其它合适的选择性标记包括CAT基因，其赋予酵母细胞氯霉素抗性。用于酵母中的优选启动子包括来自酵母糖酵解基因的启动子(Hitzeman等人，JBiol.Chem.22512073-12080，1980；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982；Kawasaki，美国专利US4,599,311)或醇脱氢酶基因的启动子(Young等人，载于GeneticEngineeringofMicroorganismsforChemicals，Hollaender等人(编辑)，355，Plenum，纽约，1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983)。从这一点看，特别优选的启动子是TPI1启动子(Kawasaki，美国专利US4,599,311)和ADH2-4C(参见美国专利US6,291,212)启动子(Russell等人，Nature304652-654，1983)。表达单位可能还包括转录终止子。优选的转录终止子为TPI1终止子(Alber和Kawasaki，同前)。更优选地，启动子是EP431880中公开的PRB1启动子，而终止子是EP60057中公开的ADH1终止子，这两份专利在此完全引入作为参考。除了酵母，本发明的经过修饰的多肽和肽可以在丝状真菌中表达，例如，在曲霉菌属各菌种中。有用的启动子的例子包括那些来源于构巢曲霉(Aspergillusnidulans)糖酵解基因的启动子，例如ADH3启动子(McKnight等人，EMBOJ.42093-2099，1985)和tpiA启动子。合适的终止子的例子为ADH3终止子(McKnight等人，同前)。利用这些元件的表达单位可以克隆到能够插入到例如曲霉菌属的染色体DNA中的载体中。用于实现本发明的哺乳动物表达载体将包括能够引导经过修饰的多肽和肽转录的启动子。优选启动子包括病毒启动子和细胞启动子。优选的病毒启动子包括来自腺病毒2的主要晚期启动子(Kaufman和Sharp，Mol.Cell.Biol.21304-13199，1982)和SV40启动子(Subramani等人，Mol.Cell.Biol.1854-864，1981)。优选的细胞启动子包括小鼠金属硫蛋白-1启动子(Palmiter等人，Science222809-814，1983)和小鼠Vκ(参见美国专利US6,291,212)启动子(Grant等人，Nuc.AcidsRes.155496，1987)。特别优选的启动子是小鼠VH(参见美国专利US6,291,212)启动子。这些表达载体还可以含有位于启动子下游和编码经过修饰的多肽或肽的DNA序列上游的一套RNA剪切位点。优选的RNA剪切位点可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因中获得。在表达载体中还含有位于感兴趣的编码序列下游的聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，同前)，来自腺病毒5E1B区以及人生长激素基因终止子的聚腺苷酸化信号(DeNoto等人，Nucl.AcidRes.93719-3730，1981)。特别优选的聚腺苷酸化信号为VH(参见美国专利US6,291,212)基因终止子。表达载体可以包括非编码的病毒前导序列，例如腺病毒2的三联前导序列，位于启动子和RNA剪切位点之间。优选的载体还可以包括增强子序列，例如SV40增强子和小鼠μ(参见美国专利US6,291,212)增强子(Gillies，Cell33717-728，1983)。表达载体还可以包括编码腺病毒VARNA的序列。如下文所述，表达载体还用于表达融合蛋白，该融合蛋白包括被融合到第二种多肽或肽例如运铁蛋白上的本发明的经过修饰的多肽或肽，用于延长经过修饰的多肽或肽的半衰期。此外，将经过修饰的多肽或肽融合到用于表达和释放经过修饰的多肽或肽的标记(tag)和/或裂解位点上。转化用于转化真菌的技术在本领域是已知的，被描述在例如Beggs(同前)、Hinnen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA751929-1933，1978)、Yelton等人，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA811740-1747，1984)和Russell(Nature301167-169，1983)中。宿主细胞的基因型通常具有遗传缺陷，该缺陷由存在表达载体上的选择标记来弥补。选择特定宿主和可选择的标记在本领域普通技术人员的能力之内。可以通过例如磷酸钙介导的转染，将包含本发明的经过修饰的多肽和肽的克隆的DNA序列导入到被培养的哺乳动物细胞中(Wigler等人，Cell14725，1978；Corsaro和Pearson，SomaticCellGenetics7603，1981；Graham和VanderEb，Virology52456，1973)。还可以采用将克隆DNA序列导入哺乳动物细胞中的其它技术，例如电穿孔(Neumann等人，EMBOJ.1841-845，1982)或脂转染。为了鉴定已经整合了克隆的DNA的细胞，通常将可选择标记以及感兴趣的基因或cDNA插入到细胞中。用于培养哺乳动物细胞中的优选可选择标记包括赋予对药物的抗性的基因，这些药物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤。可选择标记可以是可扩增的选择标记。优选的可扩增的选择标记为DHFR基因。特别优选的可扩增标记为DHFRr(参见美国专利US6,291,212)cDNA(Simonsen和Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA802495-2499，1983)。可选择标记在Thilly(MammalianCellTechnology，ButterworthPublishers，Stoneham，Mass.)中评述，并且选择可选择的标记在本领域普通技术人员的能力内。宿主细胞本发明还包括被转化来表达本发明的经过修饰的多肽或肽的细胞，优选为酵母细胞。除了被转化的宿主细胞本身，本发明还包括这些细胞在营养培养基中的培养物，优选单克隆(克隆均一的)培养物或者来源于单克隆培养物的培养物。如果多肽被分泌，则培养液中含有该多肽和细胞，或者如果细胞被过滤或离心掉，则不含细胞。用于实现本发明的宿主细胞包括真核细胞，有时为原核细胞，能够用外源DNA转化或转染，并在培养液中生长，例如培养的哺乳动物、昆虫、真菌、植物和细菌细胞。将包含本发明的核酸序列的载体导入到宿主细胞中，使得该载体被保持为一种染色体整合体或者自我复制的染色体外载体。由于核酸序列更可能被稳定地维持在细胞中，整合通常被认为是一种优点。通过同源重组或非同源重组来将载体整合到宿主染色体中。对宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是单细胞的微生物，例如原核细胞，或者非单细胞的微生物，例如真核细胞。原核细胞或者真核细胞都是可使用的。当为原核宿主细胞时，可以使用通常被使用的细胞如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌。当用原核细胞作为宿主细胞时，使用在宿主细胞中可复制的载体。优选使用表达质粒，其在本发明的基因上游的载体中提供起始蛋白质合成所需的启动子、SD序列(Shine-Dalgarno序列)和起始密码子(例如ATG)，以促使基因的表达。上述载体的例子包括来源于大肠杆菌的通常被使用的质粒如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等。然而，可应用的载体不限于这些例子和还可以使用各种已知载体。可用于使用大肠杆菌的表达系统中的商业上可获得到载体的例子包括pGEX-4T(AmershamPharmaciaBiotech)、pMAL-C2、pMAl-P2(NewEnglandBiolabs)、pET21/lacq(Invitrogen)、pBAD/His(Invitrogen)等。真核宿主细胞的例子包括酵母细胞等。优选使用的有头类动物细胞的例子包括COS细胞(来自猴子的细胞)(1981Cell，23，175)，中国仓鼠卵巢细胞及其来源的二氢叶酸还原酶缺陷细胞株(1980Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，77，4216)等等，优选使用的酵母细胞的例子包括酿酒酵母等。然而，所用的细胞不限于这些例子。优选地，酵母细胞被用于表达经过修饰的多肽或肽。真菌细胞包括酵母种类(例如酵母属，裂殖酵母属，毕赤氏酵母属)，可以被用作本发明中的宿主细胞。包括被期望用于实现本发明、在本发明中作为表达本发明的经过修饰的多肽或肽的宿主的包括酵母的真菌的例子是毕氏酵母属(包括以前被分类为汉逊酵母属(Hansenula)的种类)、酵母属、克鲁维酵母菌属、曲霉菌属、假丝酵母属、念珠菌属、球拟酵母属(Torulopsis)、孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖酵母属、固囊酵母属(Citeromyces)、Pachysolen、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、木霉属(Trichoderma)、头孢霉属、腐质霉属(Humicola)、毛霉菌属、脉孢菌属、耶氏酵母属(Yarrowia)、Metschunikowia、Rhodosporidium、担子菌白冬孢酵母属(Leucosporidium)、Botryoascus、锁掷孢酵母属(Sporidiobolus)、拟内孢霉(Endomycopsis)等。酵母菌属的例子为酿酒酵母、S.italicus和鲁氏酵母(S.Rouxii)。克鲁维酵母菌属的例子为K..fragilis、K..lactis和K..marxianus。合适的孢圆酵母属种类为T.delbrueckii。毕赤氏酵母菌属的例子为P.angusta(以前称作H.polymorpha)、P.anomala(以前称作H.anomala)和巴氏毕赤酵母(P.pastoris)。用于制备本发明的经过修饰的多肽或肽的特别有用的宿主细胞为甲醇营养型(methanoltrophic)巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)(Steinlein等人(1995)ProteinExpress.Purif6619-624)。自从巴氏毕赤酵母的醇氧化酶启动子被分离和克隆以来，巴氏毕赤酵母已经被开发作为制备外源蛋白的重要宿主；其转化首次在1985年被报导。在缺乏葡萄糖时，巴氏毕赤酵母能够利用甲醇作为碳源。巴氏毕赤酵母表达系统能够利用甲醇诱导的醇氧化酶(alcoholoxidase)(AOX1)启动子，该启动子控制编码用于醇氧化酶的表达的基因，醇氧化酶催化甲醇代谢的第一个步骤。该启动子已被表征，并且插入到一系列巴氏毕赤酵母表达载体中。由于在巴氏毕赤酵母中生成的蛋白质通常能够正确地折叠，并被分泌到培养液中，遗传工程化的巴氏毕赤酵母的发酵提供了一种作为大肠杆菌表达系统的优良替代。酿酒酵母菌株是另一种优选宿主。在一个优选实施方案中，使用酵母细胞，或者更具体是在糖蛋白的天冬酰胺连接的糖基化所需的基因中具有遗传缺陷的酿酒酵母宿主细胞。具有这种缺陷的酿酒酵母宿主细胞通过常规的突变和选择技术来制备，尽管许多可以获得的酵母菌株已经被修饰来防止或减少糖基化或超甘露糖基化。为了优化异源蛋白的制备，优选宿主菌株具有突变，例如酿酒酵母的pep4突变(Jones，Genetics8523-33，1977)，导致蛋白质水解活性下降。特别有利地使用在编码天冬氨酰蛋白酶酵母天冬酶1(YAP3)的基因或者编码酵母天冬酶(yapsin)2的基因(MKC7)或者两者(Copley等人1998Biochem.J.330，1333-1340)中具有突变的宿主，使得定向于碱性残基的蛋白水解活性被降低或消除。在其它的蛋白酶编码区含有突变的宿主菌株被特别地用于制备大量本发明的经过修饰的治疗性多肽或肽。含有本发明的DNA构建体的宿主细胞在适当生长培养液中生长。如在此所用，术语“适当的生长培养液”是指含有细胞生长所需营养的培养液。细胞生长所需营养包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子。生长培养液通常用于筛选含有DNA构建体的细胞，通过例如药物选择或缺乏关键营养，营养缺乏通过DNA构建体上的可选择标记来弥补，或者用DNA构建体共转染。酵母细胞，例如，优选在化学成分确定的培养液中生长，培养液中含有非氨基酸的氮源、无机盐、维生素和必需氨基酸添加剂。培养液的pH优选维持在大于2并小于8的pH，优选为pH5.5-6.5。维持稳定的pH的方法包括进行缓冲和持续的pH控制，优选通过添加氨水、氢氧化铵或者氢氧化钠来实现pH控制。优选的缓冲试剂包括柠檬酸、磷酸、琥珀酸和Bis-Tris(SigmaChemicalCo.，St.Louis，Mo.)。缺失天冬酰胺连接的糖基化所需基因的酵母细胞优选在含有渗透稳定剂的培养液中生长。优选的渗透稳定剂是被添加到培养液中的山梨醇，其浓度在0.1M和1.5M之间，优选为0.5M或1.0M。被培养的哺乳动物细胞一般在商业上可获得的含血清或无血清的培养液中生长。选择适合于特定细胞系的培养液在本领域普通技术人员的能力内。被转染的哺乳动物细胞生长一段时间，通常为1-2天，开始表达感兴趣的DNA序列。然后进行药物选择，选择以稳定的方式表达可选择标记的生长细胞。对于已经用可扩增的选择标记转染的细胞来说，可以逐步提高药物浓度来选择拷贝数增加的克隆序列，从而提高表达水平。杆状病毒/昆虫细胞表达系统也可以用于制备本发明的经过修饰的治疗性多肽或肽。BacPAKTM杆状病毒表达表达系统(BDBiosciences(Clontech))在昆虫宿主细胞中高水平地表达重组蛋白。目标基因被插入到转化载体中，该载体与线性化的BacPAK6病毒DNA一起被共转染到昆虫宿主细胞中。BacPAK6DNA缺失杆状病毒基因组的关键部分。当DNA与载体重组时，该关键元件被恢复，而目标基因被转移到杆状病毒的基因组中。重组后，少数病毒斑被挑取和纯化，验证重组表型。然后，扩增新分离的重组病毒，并用于感染昆虫细胞培养物来制备大量的期望蛋白质。分泌信号序列术语“分泌信号序列”或者“信号序列”或者“分泌前导序列”可以相互交换使用，被描述在例如美国专利US6,291,212和美国专利US5,547,871中，这两份专利在此完全引入作为参考。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列编码分泌肽。分泌肽是引导成熟多肽或蛋白质从细胞中分泌出来的氨基酸序列。通常，分泌肽的特征在于具有疏水氨基酸核心，并且典型地(但是不是绝对地)存在于新合成的蛋白质的氨基末端。在分泌过程中，分泌肽通常从成熟蛋白质上被裂解下来。分泌肽可能含有加工位点，使得在经过分泌路径时，信号肽从成熟蛋白质上裂解下来。加工位点被编码在信号肽中，或者例如通过体外诱变被添加到信号肽中。分泌肽可以用于引导本发明的经过修饰的多肽和肽的分泌。可用于与其它分泌肽结合的一种这样的分泌肽是酵母屏障蛋白(Barrierprotein)的第三个结构域。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列是一系列复杂的翻译后加工步骤所需的，这些步骤引起蛋白质的分泌。如果存在完整的信号序列，被表达的蛋白质进入粗面内质网的内腔，然后通过高尔基体转运到分泌小泡中，最后被转运到细胞外。通常，信号序列紧跟在起始密码子后面，并且编码被分泌的蛋白质的氨基末端的信号肽。在大多数情况下，信号序列被称作信号肽酶的特定蛋白酶裂解掉。优选的信号序列提高由病毒、哺乳动物或酵母病毒载体所表达的重组蛋白质的加工和外排效率。优选的信号序列是哺乳动物或人的运铁蛋白信号序列。在有些情况下，天然的底物信号序列可用于表达和分泌本发明的经过修饰的多肽或肽。为了确保有效地去除信号序列，在某些情形下，优选在信号序列和成熟蛋白之间包括短的前肽(pro-peptide)序列，其中前肽的C-末端部分包括蛋白酶识别位点，例如酵母kex2p蛋白酶。优选地，前肽序列长约2-12个氨基酸，更优选长约4-8个氨基酸。这种前肽的例子为Arg-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg、Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg、Arg-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg和Arg-Ser-Leu-Glu-Arg-Arg(分别为SEQIDNO111-114)。免受DPP裂解作用的经过修饰的多肽底物的制备通过标准的合成方法、DNA重组技术或者任何其它制备肽和融合蛋白的方法制备本发明的经过修饰的多肽，其部分地或者基本上抵抗DPP活性。在如下参考文献中一般性地描述固相肽合成方法Merrifield，J.Am.Chem.Soc，8882149，1963；Barany和Merrifield，InthePeptides，E.Gross和J.Meinenhofer编辑，AcademicPress，NewYork，3285(1980)；S.B.H.Kent.Annu.Rev.Biochem.，57957(1988)。采用固相肽合成方法，可以通过逐步将氨基酸添加到共价连接到固体树脂颗粒上的逐渐伸长的肽链上，制备具有期望长度和序列的肽。自动合成可被用于该方法中。如上所述，也可以用分子生物学技术，使用编码这些多肽的核酸序列，来获得本发明的经过修饰的多肽。这些序列可以是RNA或DNA，并与控制序列相连和/或插入到载体中。然后将载体转染到宿主细胞如细菌中。该载体的制备及其在宿主中生产或表达通过常规的分子生物学和遗传工程技术来实现。此外，可以使用容易合成的DNA序列，在商业上可获得的表达系统中通过重组技术制备本发明的经过修饰的多肽。通过重组方法获得本发明的经过修饰的多肽，该重组方法包括(a)在有益于生产多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收该多肽。使用本领域已知的方法，在适合生产多肽的营养培养液中培养宿主细胞。例如，通过在实验室或工业的发酵罐中摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、补料分批的或固相的发酵)培养细胞，在合适的培养液中和允许多肽表达和/或分离的条件下进行。采用本领域知晓的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养培养液中进行培养(参见例如，细菌和酵母的参考文献；Bennett，J.W.和LaSure，L.编辑，MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress，加利福尼亚，1991)。合适的培养液可以从供应商获得或者按照公布的组成制备(例如，美国典型培养物保藏目录)。如果经过修饰的多肽被分泌到营养培养液中，可以从培养液中直接回收多肽。如果经过修饰的多肽未被分泌，从细胞裂解产物中回收多肽。作为一个例子，包括经过修饰的多肽或肽融合蛋白的本发明的经过修饰的多肽或肽通过在WO0044772中公开的发酵方法来制备，该专利在此完全引入作为参考。经过修饰的多肽用本领域知晓的方法来检测，该方法特异于该多肽。这些检测方法包括特异性抗体的使用，酶产物的形成或者酶底物的消失，结合特异的受体，或者通过在细胞分析中检测特异受体的活化。例如，用酶分析来确定经过修饰的多肽的活性。通过常规程序，包括但是不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或者沉淀，从营养培养液中回收所生成的经过修饰的多肽。本发明的多肽通过多种本领域知晓的方法来纯化，包括但是不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦、大小排阻层析)，电泳方法(例如，制备等电子聚焦、示差溶解性(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，ProteinPurification，J.C.Janson和LarsRyden编辑，VCHPublishers，NewYork，1989)。融合蛋白和蛋白偶联物本发明提供经过修饰的多肽或肽，其通过重组方法或者共价连接附着到异源分子上。连接到异源分子如血浆蛋白上，会使得经过修饰的多肽或肽的活性延长数天到数周。在某些情形下，在该时期仅需要施用一次这种经过修饰的治疗性多肽或肽。由于活性化合物将主要结合大分子，而该大分子被摄入细胞内干扰其它生理过程的可能性较小，因而可以获得较大的特异性。在另一个实施方案中，本发明的经过修饰的多肽或肽通过重组方式附着到异源序列上，形成嵌合蛋白或融合蛋白。这种嵌合蛋白或融合蛋白包含可操作地连接到异源蛋白质上的经过修饰的多肽或肽，经过修饰的多肽或肽部分地或者基本上免受DPP裂解的作用，而所述异源蛋白质具有基本上不与经过修饰的多肽或肽同源的氨基酸序列。“可操作地连接”是指经过修饰的多肽或肽与异源蛋白质在读框内融合。异源蛋白质融合到经过修饰的多肽或肽的N-末端或C-末端。在一个实施方案中，融合蛋白不影响本发明的经过修饰的多肽本身的活性。例如，融合蛋白包括，但不限于，酶促的融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合物、酵母双杂合GAL融合物、多聚His融合物、MYC-标记融合物、HI-标记融合物以及Ig融合物。这种融合蛋白，特别是多聚-His融合物，便于重组的经过修饰的多肽的纯化。在另一个例子中，融合蛋白包含本发明的被修饰肽和其它部分(moiety)之间的氨基酸序列，所述氨基酸序列提供识别序列，使得在化学或者酶促裂解后能够释放本发明的经过修饰的肽。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，蛋白的表达和/或分泌可以通过使用异源信号序列来增加。在另一个实施方案中，将经过修饰的多肽或肽融合到将能够延长其血清稳定性或血清半衰期的分子上，例如血浆蛋白上。优选地，将经过修饰的多肽或蛋白融合到血清白蛋白、免疫球蛋白或其部分如Fc结构域上。更优选地，将经过修饰的多肽或肽融合到运铁蛋白、乳运铁蛋白、黑素运铁蛋白或其杂合物上。美国专利申请10/231,494和US10/378,094以及国际专利申请PCT/US03/26818中提供了制备这种融合蛋白的方法，这些专利申请在此完全引入作为参考。如这些专利申请中所讨论，可以修饰与经过修饰的多肽或肽连接的运铁蛋白。其可呈现糖基化程度降低。经过修饰的运铁蛋白多肽可选自如下的一种或多种单个运铁蛋白N结构域、单个运铁蛋白C结构域、运铁蛋白N和C结构域、两种运铁蛋白N结构域以及两种运铁蛋白C结构域。当Tf的C结构域作为融合蛋白的一部分时，对应于N413和N611的氨基酸残基(PCT/US03/26818的SEQIDNO3，其在此完全引入作为参考)的两个N-连接的糖基化位点被突变，以在酵母系统中进行表达，避免发生糖基化或者超甘露糖基化，并延长融合蛋白和/或治疗性蛋白的血清半衰期(制备唾液酰(asialo)Tf，或某些情形下，单唾液酰(monosialo)-Tf或双唾液酰(disialo)-Tf)。除了对应于N413和N611的Tf氨基酸之外，还可以对N-X-S/T糖基化位点内的邻近残基进行突变，以防止或者基本上减少糖基化。参见Funk等人的美国专利US5,986,067。已经报道，在巴氏毕赤酵母中表达的Tf的N结构域在S32处被单个己糖O-连接的糖基化，位点S32也可以被突变或者修饰来防止这种糖基化。因此，在本发明的一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白包括经过修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白的糖基化程度降低，包括但是不限于唾液酰、单唾液酰和双唾液酰形式的Tf。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组的运铁蛋白突变体，其被突变以防止糖基化。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括被完全糖基化的重组运铁蛋白突变体。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组的人血清运铁蛋白突变体，其被突变以防止糖基化，其中至少Asn413和Asn611(PCT/US03/26818的SEQIDNO3，其在此完全引入作为参考)之一被突变为不能进行糖基化的氨基酸。在另一个实施方案中，运铁蛋白融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组的人血清运铁蛋白突变体，其被突变来防止或者基本上减少糖基化，其中可以对N-X-S/T糖基化位点内的邻近残基进行突变。而且，通过突变丝氨酸或苏氨酸残基来减少或者防止糖基化。此外，已知将X变为脯氨酸能够抑制糖基化。可以通过标准的DNA重组技术来制备嵌合蛋白或融合蛋白。例如，编码不同蛋白质的DNA片段按照常规方法在读框内连接在一起。在另一个实施方案中，融合基因通过常规技术合成，包括DNA自动合成仪。可替代地，用锚定引物来进行基因片段的PCR扩增，该锚定引物使得生成两个连续的基因片段之间的互补突出端，接着退火和再扩增，生成嵌合的基因序列(参见Ausubel1992CurrentProtocolsinMolecularBiology)。而且，许多表达载体是商业上可获得的，这些载体已经编码一种融合部分(fusionmoiety)(例如，GST蛋白)。将编码经过修饰的多肽或肽的核酸克隆到这种表达载体中，使得融合部分以读框内的方式被连接到经过修饰的多肽或肽上。在另一个实施方案中，经过修饰的治疗性多肽或肽通过共价键偶联到异源分子上，提高其稳定性并免受DPP活性的作用。作为一个例子，经过修饰的多肽或肽通过经过修饰的肽的反应基团与血液成分之间形成的共价键偶联到血液成分上，所述血液成分可有可无连接基团。血液成分可以是固定的或者可移动的。固定的血液成分的例子为不可移动的血液成分，包括组织、膜受体、间质蛋白(interstitialprotein)、纤维蛋白、胶原蛋白、血小板、内皮细胞、上皮细胞及其相关的膜和膜受体、体细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞、神经元成分、骨细胞和破骨细胞，以及所有机体组织，特别是那些与循环系统和淋巴系统相关的组织。可移动的血液成分的例子是在任何延长的时间段内不具有固定位置的血液成分，所述延长时间段通常不超过5分钟，更通常不超过1分钟。这些血液成分不是膜相关的，并且在血液中存在延长的时间，并且以至少0.1μg/ml的最小浓度存在。可移动的血液成分包括血清白蛋白、运铁蛋白、免疫球蛋白如IgM和IgG、α1蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III和α2-抗纤溶酶。可移动的血液成分的半衰期通常至少约12小时。在血液成分与经过修饰的治疗性多肽或肽之间的共价键可能在体内(invivo)或离体(exvivo)形成。对于离体形成共价键，将经过修饰的多肽或肽添加到血液、血清或者含有如人血清白蛋白或者IgG的血液成分的生理盐水溶液中，以在经过修饰的多肽或肽和血液成分之间形成共价键。此外，经过修饰的多肽或肽用马来酰亚胺或者类似的反应化学基团修饰，并在生理盐水溶液中与血液成分反应。一旦经过修饰的治疗性多肽或肽与血液成分反应，形成经过修饰的多肽或肽偶联物时，将该偶联物施用给患者。可替代地，可以将经过修饰的治疗性多肽或肽直接施用给患者，使得在体内形成经过修饰的治疗性多肽或肽和血液成分之间的共价键。此外，可以用重组蛋白例如白蛋白来进行相同的反应。非特异性的经过修饰的治疗性多肽或肽的化学反应基团会在体内与之反应的各种部位包括细胞，特别是红细胞(红血球)和血小板，以及蛋白质，如免疫球蛋白，包括IgG和IgM，血清白蛋白、铁蛋白、类固醇结合蛋白、运铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、α-2-巨球蛋白等。经过修饰的多肽或肽可以含有或可被化学修饰以含有结合硫醇(thiol)的反应基团。在本发明的一个实施方案中，经过修饰的多肽或肽可与聚乙二醇偶联。可替代地，经过修饰的多肽或肽可与用聚乙二醇修饰的糖脂或者用聚乙二醇修饰的脂肪酸偶联。一个方面，可将修饰的多肽或肽偶联到脂肪酸或脂肪酸衍生物上，提高其稳定性。脂肪酸的例子包括但是不限于，月桂酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸。脂肪酸衍生物的例子包括乙酯、丙酯、胆甾醇酯、辅酶A酯、硝基苯基酯、萘基酯、甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯、脂肪醇、脂肪醇乙酸酯等。另一个方面，可将修饰的多肽或肽工程制备到药物亲和复合物(drugaffinitycomplex)(DACTM)上。药物亲和复合物具有三个部分负责生物学活性的药物成分；将药物成分附着到反应化学基团上的连接体；以及位于连接体另一端的反应化学基团，负责将该构建物永久地结合到机体中的特定目标蛋白质上。例如，Kim等人(2003，Diabetes52(3)751)公开了一种GLP-1-白蛋白药物亲和复合物。Kim等人证明，白蛋白偶联的DACGLP-1结合到GLP-1受体(GLP-1R)上，并激活在表达该受体的异源成纤维细胞中形成cAMP。该结果表明，白蛋白偶联的DACGLP-1模拟天然的GLP-1。Kim等人提供一种用于延长GLP-1R信号活化的新方法。设计修饰的多肽或肽药物亲和复合物以通过皮下注射施用，并且在体内快速而选择性地结合白蛋白。所形成的生物偶联物具有与内源性多肽或肽相同的治疗活性和类似功效，而且在动物体内具有更为接近于白蛋白的药物动力学模式。药物组合物本发明提供药物组合物，其包含经过修饰的治疗性多肽和肽，该多肽和肽部分地或者基本上免受DPP裂解的作用，但是仍保留其功能活性和功效。这种药物组合物可以口服、胃肠外施用，如血管内(IV)、动脉内(IA)、肌肉内(IM)、皮下(SC)、腹膜内、经皮等途径施用。可以在适当情况下通过灌注进行施用。在某些情形下，可以进行口腔的、鼻内的、直肠的、经皮的、通过气雾施用，而经过修饰的多肽可以被转移到血管系统。例如，本发明的经过修饰的多肽与运铁蛋白部分构成的融合物或偶联物可以将经过修饰的多肽转移到血管系统，或者通过结合运铁蛋白受体跨过血脑屏障，如国际专利申请PCT/US03/26778中所述，该申请在此完全引入作为参考。虽然如果需要可以进行多次注射，但是通常进行一次注射。可以通过任何便利的工具来施用经过修饰的治疗性多肽或肽，包括注射器、套管针、导尿管等。特定的施用方式将根据要施用的量而变化，无论是单次药丸(asinglebolus)或者连续施用等等方式。优选地，可以进行血管内施用，其中导入的部位对本发明来说不是关键的，优选在存在快速血流的部位，例如静脉内施用时为外周静脉或者中央静脉。更优选地，可以皮下施用药物组合物。当施用与缓释技术或者保护性基质相结合时，其它途径也是有用的。目的在于使经过修饰的治疗性肽或多肽如在血液中被有效地分布，以便能够与血液成分或者组织成分反应。一般地，本发明包括药物组合物，其包含有效量的本发明的经过修饰的治疗性多肽或肽以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这种组合物包括具有各种缓冲组分(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂如去污剂(detergent)和增溶剂(例如，聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)以及膨胀物(例如，乳糖、甘露醇)；将所述材料纳入到聚合化合物如多聚乳酸、多聚乙醇酸等的颗粒制备物中，或者纳入到脂质体中。还可以使用透明质酸，这具有延长在循环中的持续时间的作用。这种组合物可能会影响当前的蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速度以及体内清除速度。参见例如，Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版(1990，MackPublishingCo.，Easton，Pa.18042)第1435-1712页，在此引入作为参考。例如，可在生理学上可接受的溶液中施用经过修饰的治疗性多肽或肽，所述溶液例如，去离子水、磷酸缓冲盐水(PBS)、生理盐水、含水乙醇或者其它醇溶液、血浆、蛋白质溶液、甘露醇、含水葡萄糖、醇、植物油等。其它添加剂包括缓冲剂、盐、生理学上可接受的稳定剂等等，其中所述溶液通常缓冲到约5-10的pH范围内，而缓冲剂的浓度范围通常在约50-250mM，盐的浓度范围通常在约5-500mM。生理缓冲液的例子，特别是用于注射的，包括Hank’s液和Ringer’s液。经皮制剂可含有渗透剂，如胆汁盐或梭链孢酸盐(fusidates)。药物组合物可制备成片剂或者锭剂、舌下片(sublingualtablets)、香囊(sachets)、paquets、软明胶胶囊、栓剂、乳剂(cream)、软膏剂(ointment)、皮肤凝胶剂、经皮装置、气雾剂、可饮用的和可注射的针剂。组合物还可以制备成液体形式，或者制备成干燥的粉末，例如便于储存和运输的冻干形式。还包括可植入的缓释制剂。口服剂量形式在一个实施方案中，本发明提供口服固体剂量形式的药物组合物，其包含经过修饰的治疗性多肽或肽，所述剂量形式在Remington′sPharmaceuticalSciences(1990)，第18版，MackPublishingCo.EastonPa.18042中有一般性的描述，其在此引入作为参考。固体剂量形式包括片剂、胶囊、药丸、锭剂(troche)或菱形片(lozenge)、扁胶剂(cachet)或小丸(pellet)。此外，脂质体的或者类蛋白的包装可用于配制本发明的组合物(例如美国专利US4,925,673中报道的类蛋白微球)。可以使用脂质体包装，该脂质体可用各种聚合物衍生化(例如美国专利US5,013,556)。对于治疗用的可能固体剂量形式的描述在由G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑，Marshall，K.，ModernPharmaceutics(1979)的第10章中给出，其在此引入作为参考。总之，所述制剂将包括经过修饰的治疗性多肽或肽和惰性成分，惰性成分使得免受胃环境的作用，并在肠道中释放生物活性材料。如果需要，对经过修饰的治疗性多肽或肽进行化学修饰，使得进行口腔呈递是有效的。通常，所包括的化学修饰是将至少一个部分(onemoiety)附着到经过修饰的治疗性多肽或肽本身上，其中所述部分使得可以从胃或者肠道摄取到血流中。还期望的是全面提高化合物的稳定性，并增加在机体的循环时间。在本发明中可用作共价附着载体的部分也可用于该目的。这种部分的例子包括PEG、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。参见，例如，Abuchowski和Davis，SolublePolymer-EnzymeAdducts，EnzymesasDrugs(1981)，Hocenberg和Roberts编辑，Wiley-Interscience，纽约，N.Y.，367-83；Newmark等人(1982)，J.Appl.Biochem.4185-9。可使用的其它聚合物为聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-三氧戊环(tioxocane)。如上指出，用于药物用途优选为PEG部分。同样，可将经过修饰的治疗性多肽或肽重组融合到另一种多肽上，提高其总体稳定性或者改善其口腔呈递。例如，将经过修饰的治疗性多肽或肽融合到运铁蛋白、黑素运铁蛋白或乳运铁蛋白上。用于制备融合蛋白的方法在美国专利申请US10/378,094中描述，该申请在此完全引入作为参考。对于口腔呈递的剂量形式，还可能使用经过修饰的脂族氨基酸的盐，如N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸钠(SNAC)作为载体来增强本发明的治疗性化合物的吸收。使用SNAC的肝素制剂的临床功效已经被EmisphereTechnologies实施的2期临床实验所证实。参见，美国专利US5,792,451，“口腔药物呈递组合物和方法”(Oraldrugdeliverycompositionandmethods)，其在此完全引入作为参考。本发明的经过修饰的治疗性多肽或肽可以做为颗粒大小约1mm的颗粒或者小球形式的极细微粒包含在制剂中。以胶囊施用的材料的制剂也可以是粉末形式、轻度压缩的栓剂或者甚至是片剂。治疗性制剂可以通过压缩来制备。还可以包括着色剂和调味剂。例如，配制经过修饰的治疗性多肽或肽(如通过脂质体或微球包装)，然后进一步包含在可食用的产品中，例如含有着色剂和调味剂的冷冻饮料。可以用一种惰性材料来稀释本发明的药物组合物或者增加其体积。这些稀释剂包括碳水化合物，特别是甘露醇、cc-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性的葡聚糖和淀粉。某些无机盐也被用作填充物，包括磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些商业上可获得的稀释剂为Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。在固体剂量形式的治疗性制剂中包括崩解剂。用作崩解剂的材料包括但是不限于淀粉，包括以淀粉为基础的商业崩解剂，Explotab。淀粉羟乙酸钠、安伯来特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、橙皮(orangepeel)、酸性羧甲基纤维素、天然海绵(naturalsponge)和膨润土(bentonite)都可以使用。另一种形式的崩解剂是不溶的阳离子交换树脂。粉末化的胶可以用作崩解剂和作为粘合剂，可以包括的粉末状的胶，例如琼脂、刺梧桐树胶(karaya)或者黄芪胶。褐藻酸及其钠盐也可以用作崩解剂。可用粘合剂来将经过修饰的治疗性多肽或肽固定在一起，形成坚硬的片剂，并包括来自天然产物的材料，例如阿拉伯树胶、黄芪胶、淀粉和白明胶。其它的包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可以用在醇溶液中，使治疗性组合物变成颗粒状。在本发明的药物组合物制剂中包括抗摩擦剂，以防止在制剂加工过程中变得粘稠。滑润剂可用作经过修饰的治疗性多肽或肽和模壁之间的隔离层，这些滑润剂包括但是不限于硬脂酸，包括其镁盐和钙盐，聚四氟乙烯(PTFE)，液体石蜡，植物油和蜡。可溶的滑润剂也可以使用，例如月桂基硫酸钠，月桂基硫酸镁，各种分子量的聚乙二醇，Carbowax4000和6000。添加助流剂可能改善经过修饰的治疗性多肽或肽在配制过程中的流动性能，并有助于在压缩过程中重新排列。助流剂包括淀粉、滑石粉、热解硅胶和水合硅铝化物。为了帮助本发明的经过修饰的治疗性多肽或肽溶解到水环境中，添加表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂包括阴离子去污剂，如月桂基硫酸钠、十六烷基磺基琥珀酸钠和十六烷基磺酸钠。可以使用阳离子去污剂，包括苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)或者苄索氯铵(benzethoniumchloride)。被包括在制剂中作为表面活性剂的可能非离子去污剂为聚桂醇(lauromacrogol)400、多聚氧基40硬脂酸盐、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60，甘油单硬脂酸酯，聚山梨醇酯40、60、65和80，脂肪酸糖酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂存在于蛋白或衍生物的制剂中，该蛋白或衍生物单独使用或者以不同比例构成混合物。制剂中还包括添加剂，来提高经过修饰的治疗性多肽和肽的摄取。可能具有这种特性的添加剂为例如脂肪酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。控制释放制剂也是期望的。可将本发明的经过修饰的治疗性多肽或肽纳入到惰性基质中，例如树胶中，该基质使得可以通过扩散或者浸析机制来释放。也可将缓慢降解基质纳入到制剂中，所述基质例如藻酸盐、多糖。本发明的化合物的控制释放的另一种形式是通过基于Orostherapeuticsystem(AlzaCorp.)的方法制备，即药物被封装在半透膜中，该膜使得水可以进入，并由于渗透作用将药物从单个小孔推出。某些糖衣也具有延迟释放的作用。其它包被方式也可用于制剂中。这些包被包括各种糖，其可用于包被盘(coatingpan)中。经过修饰的治疗性多肽或肽也可以在膜包被的片剂中给予，在这种情形下使用的材料分为两组。第一组是非肠道的材料，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟基-乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、羧基-甲基纤维素钠、providone和聚乙二醇。由肠道材料构成的第二组通常是邻苯二甲酸酯。多种材料的混合物也可用于提供最佳的膜包被。可以在平板包被或流化床或者通过压缩包被来进行膜包被。肺部呈递形式在另一个实施方案中，本发明还提供用于肺部呈递的包含经过修饰的治疗性多肽或肽的药物组合物。当吸入时，药物组合物被呈递到哺乳动物的肺部，并经过肺上皮内层进入血流。本发明提供设计用于肺部呈递治疗性产品的大量机械装置的用途，包括但是不限于雾化器、计量吸入器和粉末吸入器，对于本领域技术人员来说全部是熟悉的。适合用于实施本发明的商业上可获得的装置的某些特别例子是Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Mo.制造的Ultravent雾化器；MarquestMedicalProducts，Englewood，Colo.制造的AcornII雾化器；GlaxoInc.，ResearchTrianglePark，N.C.制造的Ventolin计量吸入器；FisonsCorp.，Bedford，Mass制造的Spinhaler粉末吸入器。所有这些装置需要使用适合分散经过修饰的治疗性多肽和肽的制剂。典型地，各种制剂特异于所用装置的类型，并且除了用于治疗的稀释剂、佐剂和/或载体之外，包括使用适当的推进材料。经过修饰的治疗性多肽或肽最有利地制备成颗粒形式，用于最有效地呈递到肺的深部(distallung)，平均颗粒尺寸小于10μm，最优选为0.5-5μm。药学上可接受的载体包括碳水化合物例如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。用于制剂中的其它成分包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可以使用天然的或合成的表面活性剂。使用PEG(甚至除了其用于衍生蛋白质或类似物之外)。也可使用葡聚糖，例如环葡聚糖。可使用胆汁盐和其它相关增强剂。可使用纤维素和纤维素衍生物。也可使用氨基酸，如用于缓冲制剂中。此外，还包括使用脂质体、微囊或者微球，包合络合物(inclusioncomplex)或者其它类型的载体。适合与喷气式雾化器或者超声波雾化器一起使用的制剂通常包括该具有创造性的化合物，该化合物以每毫升溶液约0.1-25mg生物活性蛋白的浓度溶解在水中。所述制剂还包括缓冲剂和单糖(例如，用于稳定蛋白质和调节渗透压)。雾化器制剂还含有表面活性剂，降低或者防止由于形成气雾时的溶液的雾化引起的表面诱导蛋白质聚合。与计量吸入器一起使用的制剂通常包含含有借助表面活性剂悬浮在推进剂中的该创造性的化合物的磨碎粉末。推进剂可以是可用于该目的的任何常规材料，例如氯氟碳、含氢氯氟碳、含氢氟碳或烃，包括三氯氟甲烷、二氯氟甲烷、二氯四氟乙醇以及1，1，1，2-四氟乙烷，或者它们的组合。合适的表面活性剂包括山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。用于从粉末吸入器装置中分散的制剂包括含有该创造性的化合物的磨碎干燥粉末，并且还包含便于粉末从该装置中分散量的填充剂，例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或者木糖醇，其含量例如约占所述制剂重量的50-90％。鼻呈递形式还包括鼻呈递本发明的经过修饰的多肽或肽的药物组合物。鼻呈递使得在将经过修饰的治疗性多肽或肽施用到鼻子之后，可以将该蛋白直接转移到血流中，而不需要在肺部沉积该产品。用于鼻呈递的制剂包括那些具有葡聚糖或环葡聚糖的制剂。还公开了通过跨越其它粘膜运输的呈递。剂量与治疗上述状况的方法相关的剂量方案可由主治医生，考虑改变药物作用的各种因素，例如，患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，任何感染的严重程度，给药时间和其它临床因素来确定。通常，日剂量方案在每公斤体重0.01-1000微克该创造性化合物的范围内，优选为每公斤体重0.1-150微克。用经过修饰的治疗性蛋白质治疗疾病本发明提供各种运铁蛋白融合蛋白，其可用于治疗多种疾病。例如，包含本发明的融合多肽或肽的药物组合物用于治疗疾病，例如但是不限于，胰岛素抗性(insulinresistance)、高血糖症(hyperglycemia)、高胰岛素血症(hyperinsulinemia)、或者游离脂肪酸或甘油的血液水平升高、高脂血症(hyperlipidemia)、肥胖症(obesity)、X综合症、代谢异常综合症、炎症、糖尿病并发症、受损的葡萄糖动态平衡、受损的葡萄糖耐受、II型糖尿病、前驱糖尿病(prediabetes)、高甘油三酯血症性动脉硬化症(hypertriglyceridemiaatherosclerosis)、神经系统紊乱、充血性心力衰竭、消化不良(dyspepsia)和过敏性肠道综合症(irritablebowelsyndrome)。经过修饰的多肽和肽还可用于诱导对CNS的抗焦虑作用，用于激活CNS或者用于术后治疗。由于本发明的经过修饰的治疗性多肽和肽融合到运铁蛋白或经修饰的运铁蛋白上，或者部分地或基本上得到保护而不受DPP活性的作用，所以该治疗性多肽和肽在体内比未经过修饰的治疗性多肽和肽更稳定。因此，施用较少量分子即可实现有效治疗。在某些情形下，较低剂量会减少副作用。在一个实施方案中，本发明的经过修饰的治疗性多肽和肽可用作一种镇定剂。因此，本发明提供一种使用本发明的经过修饰的多肽或肽使哺乳动物患者镇定的方法，该患者具有导致中枢或外周神经系统活动增加的异常。该方法包括给患者施用足以对该患者产生镇定或抗焦虑作用量的经过修饰的治疗性多肽或肽。可以脑室内(intracerebroventriculary)、口腔、皮下、肌肉内或者静脉内施用经过修饰的治疗性多肽或肽。这样的方法可用于治疗或者改善神经系统状况，例如焦虑、运动失调、攻击(aggression)、精神错乱、癫痫(seizure)、恐慌性攻击(panicattack)、癔病和睡眠失调(sleepdisorder)。而且，本发明包括增强哺乳动物患者的活动性的方法，包括给患者施用足以对患者产生激活作用的量的经过修饰的治疗性多肽或肽。所述患者患有会导致中枢或外周神经系统的活动性下降的状况。经过修饰的治疗性多肽或肽可用于治疗或者改善抑郁症(depression)、情感分裂性精神障碍、睡眠性呼吸暂停(sleepapnea)、专心程度差的注意力缺乏综合症、失忆(memoryloss)、健忘和发作性睡眠(narcolepsy)等等以唤醒中枢神经系统为有益的状况。同样，特定类型的手术、选择性腹部手术后的胰岛素抗性对术后第一天影响最大，持续至少5天，并可能需要3周才恢复正常。因此，术后的患者需要在手术损伤后施用本发明的经过修饰的促胰岛肽一段时间。因此，本发明的经过修饰的治疗性多肽或肽可用于术后治疗。患者需要在手术之前施用本发明的经过修饰的促胰岛肽约1-16小时，在对患者实施手术过程中施用，和在患者手术后施用不超过5天的一段时期。而且，本发明的经过修饰的治疗性多肽和肽，例如促胰岛肽，用于治疗胰岛素抗性，独立于其用于手术后治疗。胰岛素抗性可能是由于胰岛素与细胞表面受体结合减少，或者由于细胞内代谢发生改变。特征在于胰岛素敏感性下降的第一种类型通常可以通过提高胰岛素浓度来克服。特征在于胰岛素响应降低的第二种类型不能通过大量施用胰岛素来克服。创伤(trauma)后的胰岛素抗性能够通过给予与胰岛素抗性程度成正比的胰岛素量来克服，其显然是由胰岛素敏感性降低所引起。优选地，本发明提供经过修饰的促胰岛肽使高血糖正常化，这是通过葡萄糖依赖的、胰岛素依赖的和不依赖于胰岛素的机制来实现的。同样，经过修饰的促胰岛肽用作治疗糖尿病的主要制剂，特别是II型糖尿病。本发明特别适合用于治疗患有糖尿病的患者，包括I型糖尿病和II型糖尿病，因为所述肽的作用依赖于血液的葡萄糖浓度，因此，在使用当前的治疗方法时，低血糖的副作用的风险被极大地降低。有效使患者的血糖水平正常化的经过修饰的促胰岛肽的剂量将依赖于多种因素，其中包括，但不是限于，患者的性别、体重和年龄，不能调节血糖的严重程度，不能调节血糖的潜在原因，无论是葡萄糖或者其它碳水化合物来源被同时施用，施用的路径和生物利用度，在体内的持续性，制剂和功效。优选地，本发明的经过修饰的治疗性肽如促胰岛肽用于治疗受损的(impaired)葡萄糖耐受、糖尿、高脂血症、代谢性酸中毒、糖尿病、糖尿病性神经病和肾病。更优选地，用于治疗II型糖尿病的经过修饰的肽是经过修饰的GLP-1及其类似物。监控经过修饰的治疗性多肽和肽的存在使用用于测定功能活性的分析方法、HPLC-MS或针对所述多肽或肽的抗体，可以监测经过修饰的治疗性多肽和肽。例如，监测哺乳动物宿主的血液中的经过修饰的治疗性多肽或肽的活性和/或经过修饰的治疗性多肽或肽的存在与否。在不同时间点采集宿主血液的部分或样本，可以确定经过修饰的治疗性多肽或肽是否已经以足够产生治疗活性的量结合到持久的血液成分上，随后确定血液中的经过修饰的治疗性多肽或肽的水平。如果需要，还确定经过修饰的治疗性多肽或肽，如经过修饰的促胰岛肽结合到哪种血液成分上。作为一个例子，用了分析促胰岛活性的方法可以监测本发明的经过修饰的促胰岛肽。本发明的经过修饰的促胰岛肽具有促胰岛活性，其活性至少与未经过修饰的促胰岛肽的促胰岛活性相同。将经过修饰的肽提供给动物细胞，或者将该肽注射给动物，并分别监测免疫反应活性的胰岛素释放到溶液或者动物的循环系统中，确定经过修饰的促胰岛肽的促胰岛特性。使用可特异性检测胰岛素的放射性免疫测定，检测免疫反应活性的胰岛素的存在。虽然可以采用能够检测IRI存在的任何放射性免疫测定，但优选使用Albano，J.D.M.等人(1972ActaEndocrinol.70487-509)的分析方法的改进形式，其完全在此引入作为参考。通过胰腺灌注来确定经过修饰的治疗性多肽或肽的促胰岛特性(Penhos，J.C，等人1969Diabetes18733-738，其在此引入作为参考)。其中实施、改进和分析灌注的方式优选采用Weir，G.C等人(J.Clin.Investigat.541403-1412(1974))的方法，在此引入作为参考。用结合了质谱分析(MS)的HPLC分析经过修饰的治疗性多肽和肽的存在，这是本领域技术人员所熟知的。典型地，使用两个流动相，如0.1％TFA/水和0.1％TFA/乙腈。柱温度以及梯度条件可以是变化的。用于监测经过修饰的治疗性多肽和肽的存在的另一种方法使用特异于经过修饰的治疗性多肽和肽的抗体。使用对特定的经过修饰的治疗性多肽或肽具有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体，有助于解决任何的这样的问题。可以从宿主中生成或衍生抗体，所述宿主用特定的经过修饰的治疗性多肽或肽免疫，或用该治疗性多肽或肽的免疫原性片段免疫，或者用对应于所述治疗性多肽或肽的抗原决定簇的合成的免疫原免疫。优选的抗体对经过修饰的治疗性多肽或肽具有高特异性和亲和力。这样的抗体还可以用酶、荧光染料或放射性标记进行标记。可以用抗体监测血流中是否存在经过修饰的治疗性多肽和肽。可以通过SDS-PAGE和western印迹分析血液和/或血清样本。这种技术使得可以分析血液或血清，确定经过修饰的治疗性多肽或肽是否结合到血液成分上。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)已经可以用DNA重组技术生成稳定性和生物学活性增强的新分子。这些分子是融合到稳定蛋白上的生物活性蛋白和肽的组合，该稳定蛋白具有天然的长半衰期，例如免疫球蛋白Fc部分、白蛋白和运铁蛋白。这些融合分子保留活性部分的生物学活性，具有比天然的未被融合的蛋白或肽对应物更长的药物动力学。药物动力学增强还会改善生物学活性，减少不期望的副作用，并给患者提供更多便利。有许多这种融合蛋白的例子，如干扰素-白蛋白、干扰素-Fc、BNP-白蛋白、GLP-1-白蛋白、GLP-1-运铁蛋白。虽然融合蛋白对降解是稳定的并对降解具有抗性，但降解活性部分的可能蛋白酶机制会导致该分子被缓慢灭活。特别地，许多肽如GLP-1、强啡肽(dynorphin)(BermanYL，JulianoL，DeviLAJBiolChem.1995年10月6日；27023845-50)、脑啡肽(GuZF，MenozziD，OkamotoA，MatonPN，BunnettNWExpPhysiol.1993年1月；7835-48)、BNP、ANP、血管紧张素、缓激肽和PYY对蛋白酶如二肽基肽酶IV、神经内肽酶非常敏感。这些蛋白酶单独地或者组合地引起循环中的肽快速灭活。肽与大蛋白如白蛋白、Fc和运铁蛋白融合赋予对蛋白酶的显著抗性。然而，这不能完全消除由蛋白酶引起的灭活作用。因此，融合蛋白和蛋白酶抑制剂的组合具有比融合蛋白本身更高的PK和PD。本发明提供运铁蛋白融合蛋白，其包含对蛋白酶具有抗性的治疗性肽。优选地，本发明的经过修饰的治疗性肽是经过修饰的促胰岛肽，其部分地或者基本上得到保护而免受DPP活性作用。更优选地，经过修饰的促胰岛肽是经过修饰的GLP-1肽及其类似物和片段。经过修饰的GLP-1肽及其类似物和片段可用于治疗糖尿病，特别是II型糖尿病。野生型GLP-1的N-末端序列是His-Ala-Glu；本发明的经过修饰的GLP-1多肽包含选自如下组成的组的N-末端序列His-His-Ala-Glu(SEQIDNO115)、Gly-His-Ala-Glu(SEQIDNO116)、His-Gly-Glu、His-Ser-Glu、His-Ala-Glu、His-Gly-Glu、His-Ser-Glu、His-His-Ala-Glu(SEQIDNO82)、His-His-Gly-Glu(SEQIDNO83)、His-His-Ser-Glu(SEQIDNO84)、Gly-His-Ala-Glu(SEQIDNO85)、Gly-His-Gly-Glu(SEQIDNO86)、Gly-His-Ser-Glu(SEQIDNO87)、His-X-Ala-Glu、His-X-Gly-Glu和His-X-Ser-Glu，其中X是任何氨基酸。如下所述，可以进行其它修饰来降低和防止蛋白酶降解，这些分子可用于本发明的方法和组合物中。此外，任何的GLP-1部分或GLP-1类似物、衍生物，或模拟物可(作为一种融合蛋白)用于本发明的方法和组合物中。将氨基酸添加到GLP-1的N-末端，由于空间位阻，可以防止二肽基肽酶裂解GLP-1的第二位氨基酸。因此，GLP-1将保留功能活性。将20种氨基酸的任何一种或非天然的氨基酸添加到GLP-1的N-末端。组氨酸也是一种优选的氨基酸。在某些情形下，使用无电荷的或正电荷的氨基酸。优选地，添加较小的氨基酸，如甘氨酸。然后将具有额外氨基酸的经过修饰的GLP-1融合到运铁蛋白上，制备融合蛋白。在一个实施方案中，GLP-1肽被修饰，以在其氨基末端含有至少一个附加的氨基酸。在另一个实施方案中，GLP-1肽被修饰，以在其氨基末端含有至少5个附加的氨基酸。可替代地，GLP-1肽被修饰，以在其氨基末端含有1-5个附加的氨基酸。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种调控胰岛素分泌的胃肠激素，属于所谓的肠-胰岛轴。肠-胰岛轴指定一组从胃肠粘膜释放的激素，它们对消化道中营养成分的存在和吸收响应，促进胰岛素早期释放和增强释放。肠降血糖素(incretin)作用是对胰岛素分泌的增强作用，这对于正常的葡萄糖耐受来说可能是重要的。GLP-1因为负责肠降血糖素作用，因此是一种生理学上很重要的促胰岛激素。GLP-1是胰高血糖素原(proglucagon)基因的产物(Bell等人，Nature，1983，304368-371)。其以两种主要的大分子形式在肠道内分泌细胞中合成，GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。该肽于20世纪80年代早期在胰高血糖素原的cDNAs和基因被克隆之后被首次鉴定。对全长肽GLP-1(1-37和1-36酰胺)进行的最初研究表明，较大的GLP-1分子缺乏生物学活性。1987，三个独立的研究小组证明，去除前6个氨基酸会提高GLP-1分子的生物学活性。Schmidt等人(1985Diabetologia28704-707)公开了GLP-1的氨基酸序列。人GLP-1是一种37个氨基酸残基的肽，来源于胰高血糖素原，在回肠远端、胰腺和大脑的L细胞中合成。胰高血糖素原加工成GLP-1(7-36)酰胺、GLP-1(7-37)和GLP-2主要是在L细胞中发生。GLP-1(7-37)的氨基酸序列是SEQIDNO32(X＝Gly)His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。在GLP-1(7-36)酰胺中，末端的Gly被NH2替代。在患有II型糖尿病(非胰岛素依赖的糖尿病(NIDDM))的人类患者中，有时甚至在患有I型糖尿病的患者中，GLP-1样分子具有抗糖尿病活性。用GLP-1治疗仅在葡萄糖水平升高时产生活性，例如增加胰岛素分泌和生物合成，减少胰高血糖素分泌，延缓胃排空，因此提供一种可能比胰岛素或磺酰脲更为安全的治疗方法。使用适当的GLP-1治疗，患者体内的餐后葡萄糖水平会回到正常水平。还有报道表明，GLP-1样分子能够保护和甚至恢复II型糖尿病患者中的胰腺β细胞功能。任何GLP-1序列都可以通过在其氨基末端添加一个或多个氨基酸来修饰，包括GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)。GLP-1对胃肠道具有强大的作用。以生理学量灌注GLP-1能有效地抑制五肽胃泌素诱导的以及食物诱导的胃酸分泌(Schjoldager等人，Dig.Dis.Sci.1989，35703-708；Wettergren等人，DigDisSci1993；38665-673)。它还抑制胃排空速度和胰腺的酶分泌(Wettergren等人，DigDisSci1993；38665-673)。在用碳水化合物或者含脂溶液灌注人的回肠时，会对胃和胰腺的分泌和运动产生类似的抑制作用(Layer等人，DigDisSci1995，401074-1082；Layer等人，Digestion1993，54385-38)。伴随地，GLP-1分泌被极大地刺激，已经推测GLP-1可能至少部分地负责这种所谓的“回肠闸(ileal-brake)”作用(Layer等人，Digestion1993；54385-38)。事实上，最近研究表明，在生理学上GLP-1的回肠闸作用比其对胰岛的作用更重要。因此，在剂量响应研究中，GLP-1在至少与影响胰岛分泌所需的速度一样慢的灌注速度下影响胃排空的速度(Nauck等人，Gut1995；37(副刊2)A124)。GLP-1似乎影响食物摄取。心室内施用GLP-1显著地抑制大鼠的食物摄取(Schick等人.inDitschuneit等人(编辑)，ObesityinEurope，JohnLibbey&Companyltd，1994；363-367；Turton等人，Nature1996，37969-72)。这种作用似乎是高度特异性的。因此，N-末端延伸的GLP-1(1-36酰胺)是无活性的，并且适当剂量的GLP-1拮抗剂，毒蜥激动肽9-39，完全消除GLP-1的作用(Tang-Christensen等人，Am.J.Physiol.，1996，271(4Pt2)R848-56)。在大鼠中，急剧外周施用GLP-1不会剧烈地抑制食物摄取(Tang-Christensen等人，Am.J.Physiol.，1996，271(4Pt2)R848-56；Turton等人，Nature1996，37969-72)。然而，从肠道L细胞分泌的GLP-1还可作为一个过饱信号起作用也是可能的。在糖尿病患者中，GLP-1的促胰岛作用以及GLP-1对胃肠道的作用被保存(Willms等人，Diabetologia1994；37，副刊1A118)，这有助于减少食物诱导的葡萄糖偏移，但是更重要的是也可影响食物摄取。已经证明，以4ng/kg/min的速度持续静脉内施用GLP-1一周会显著地提高对NIDDM患者体内的甘油血症(glycaemic)的控制，而无明显的副作用(Larsen等人，Diabetes1996；45，副刊2233A.)。经过修饰的GLP-1部分地或基本上得到保护而免受DPP活性的作用，并且经过修饰的GLP-1类似物可用于治疗I型和II型糖尿病以及肥胖症。如在此所用，术语“GLP-1分子”是指GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物。如在此所用，术语“GLP-1类似物”被定义为与GLP-1相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失、倒置或添加的分子。许多GLP-1类似物在本领域是已知的，包括，例如，GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Val8-GLP-1(7-37)、Gln9-GLP1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)(SEQIDNO72)美国专利US5,118,666公开了GLP-1类似物的例子，例如GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)。术语“GLP-1衍生物”被定义为一种分子，其具有GLP-1或GLP-1类似物的氨基酸序列，但是其氨基酸侧链基因，α-碳原子，末端氨基基团，或末端羧酸基团中的一个或多个还具有化学修饰。化学修饰包括，但不限于，添加化学部分、产生新键和去除化学部分。如在此所用，术语“GLP-1相关化合物”是指落入GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物的定义中的任何化合物。WO91/11457公开了活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37的类似物，其作为GLP-1部分是有用的。EP0708179-A2(EliLilly&Co.)公开了GLP-1类似物和衍生物，其包括N-末端咪唑基团和任选地连接到位置34的赖氨酸残基上的无支链的C6-C10酰基基团。EP0699686-A2(EliLilly&Co.)公开了某些GLP-1N-末端截短片段，据报道它们具有生物学活性。美国专利US5,545,618公开了基本上由GLP-1(7-34)、GLP1(7-35)、GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)，或其酰胺形式，及其药学上可接受的盐组成的GLP-1分子，具有至少一种选自如下的修饰(a)甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸或D-赖氨酸取代位置26和/或位置34上的赖氨酸；或用甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸或D-精氨酸取代位置36上的精氨酸(SEQIDNO73)；(b)抗氧化的氨基酸取代位置31上的色氨酸(SEQIDNO74)；(c)如下取代中的至少一种取代酪氨酸取代位置16上的缬氨酸；赖氨酸取代位置18上的丝氨酸；天冬氨酸取代位置21上的谷氨酸；丝氨酸取代位置22上的甘氨酸；精氨酸取代位置23上的谷氨酰胺；精氨酸取代位置24上的丙氨酸；以及谷氨酰胺取代位置26上的赖氨酸(SEQIDNO75)；和(d)如下取代中至少一种取代甘氨酸、丝氨酸或半胱氨酸取代位置8上的丙氨酸；天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或苯丙氨酸取代上位置9的谷氨酸；丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或苯丙氨酸取代位置10上的甘氨酸；以及谷氨酸取代位置15上的天冬氨酸(SEQIDNO76)；和(e)用甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或苯丙氨酸，或D-或N-酰化或烷基化形式的组氨酸取代位置7上的组氨酸(SEQIDNO77)；其中，在取代(a)、(b)、(d)和(e)中，被取代的氨基酸可任选是D型的，取代位置7的氨基酸可选择地是N-酰化或N-烷基化形式的。美国专利US5,118,666公开一种具有促胰岛活性的GLP-1分子。这种分子选自具有如下氨基酸序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(GLP-1，7-34，见SEQIDNO32)或His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly(GLP-1，7-35，见SEQIDNO32)；以及所述肽的衍生物，其中所述肽选自所述肽的药学上可接受的酸加成盐；所述肽的药学上可接受的羧酸盐；所述肽的药学上可接受的低级烷基酯；和选自酰胺、低级烷基酰胺和低级二烷基酰胺的所述肽的药学上可接受的酰胺。美国专利US6,277,819教导了降低心肌梗塞形成后的死亡率和发病率的方法，包括给患者施用GLP-1、GLP-1类似物和GLP-1衍生物。GLP-1类似物用如下结构式表示(SEQIDNO**)R1-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-X2-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-X3-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2(SEQIDNO78)及其药学上可接受的盐，其中R1选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸；X1选自Ala、Gly、Val、Thr、Ile和α-甲基-Ala；X2选自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；X3选自Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly；R2选自NH2和Gly-OH；只要GLP-1类似物的等电点的范围在约6.0至约9.0，并且如果R1为His，X1是Ala，X2是Glu，和X3是Glu时，R2必须是NH2。Ritzel等人(JournalofEndocrinology，1998，15993-102)公开了一种GLP-1类似物，[Ser8]GLP-1，其中第二个N-末端的丙氨酸用丝氨酸替代。该修饰不影响该肽的促胰岛活性，但是产生一种血浆稳定性比GLP-1高的类似物。美国专利US6,429,197教导在急性卒中(stroke)或出血后用GLP-1治疗是一种理想的治疗方法，优选进行静脉内施用，这是因为这种处理提供一种手段，用于优化胰岛素分泌、增强脑合成代谢、通过抑制胰高血糖素增强胰岛素效力，并维持血糖正常或者轻微的低血糖，而不会有严重的低血糖或其它副作用的风险。本发明提供一种在急性卒中或出血后用GLP-1或其生物学活性类似物治疗缺血或者再灌注大脑的方法，优化胰岛素分泌，通过抑制胰高血糖素对抗性来增强胰岛素效力，以及维持血糖正常或者轻微的低血糖，而不会有严重的低血糖的风险。美国专利US6,277,819提供一种降低心肌梗塞后死亡率和发病率的方法，包括以使血糖正常化的有效剂量给需要的患者施用一种选自GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物及其药学上可接受的盐的化合物。美国专利US6,191,102公开一种降低需要降低体重的患者的体重的方法，通过以足以引起体重下降的剂量给患者施用一种组合物一段有效引起体重下降的时间，所述时间至少为4周，该组合物包含胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽类似物(GLP-1类似物)、胰高血糖素样肽衍生物(GLP-1衍生物)或其药学上可接受的盐。皮下施用后，GLP-1是完全具有活性的(Ritzel等人，Diabetologia1995；38720-725)，但是主要由于二肽基肽酶IV样酶降解而被快速降解(Deacon等人，JClinEndocrinolMetab1995，80952-957；Deacon等人，JClinEndocrinolMetab1995，80952-957；Deacon等人，1995，Diabetes441126-1131)。因此，不幸的是，GLP-1和许多其类似物在人体中具有短的血浆半衰期(Orskov等人，Diabetes1993；42658-661)。因此，本发明的目的是提供经过修饰的GLP-1或其类似物，它们相对于GLP-1(7-37)具有延长的作用模式。本发明的还有一个目的是提供GLP-1的衍生物及其类似物，它们的清除速度低于GLP-1(7-37)。而且，本发明的一个目的是提供药物组合物，该组合物包含稳定性增强的经过修饰的GLP-1或GLP-1类似物。因此，本发明包括经过修饰的GLP-1或GLP-1类似物用于治疗与GLP-1相关的疾病的用途，这些疾病例如，但是不限于上述的那些。本发明的一个方面涉及包含经过修饰的GLP-1和GLP-1类似物的药物组合物的制备，所述包含经过修饰的GLP-1和GLP-1类似物的药物组合物可通过已经建立的配制药物组合物的方法的任何一种来制备，例如，如Remington′sPharmaceuticalSciences，1985中所描述。该组合物可以是适合全身注射或灌注的形式，并同样可以用合适的液体载体配制，例如无菌水或者等渗盐水或者葡萄糖溶液。该组合物通过本领域熟知的常规灭菌方法进行灭菌。所得到的液体溶液可以包装起来使用或者在无菌条件下过滤和冻干，在施用之前冻干制备物与无菌水溶液组合。所述组合物含有相似的生理状况所需的药学上可接受的辅助物质，例如缓冲试剂，张力调节试剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。本发明的经过修饰的GLP-1和GLP-1类似物还适合用于鼻、经皮、肺或直肠施用。用于组合物中的药学上可接受的载体或稀释剂可以是任何常规固体载体。所述固体载体的例子为乳糖、石膏粉(terraalba)蔗糖、滑石粉、白明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁和硬脂酸。类似地，载体或稀释剂可包括本领域知晓的任何缓释材料，例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，单独使用或与蜡(wax)混合。以持续释放制剂形式提供本发明的组合物是特别有利的。同样，组合物配制成含有经过修饰的GLP-1或GLP-1类似物的微胶囊或微粒，用适当的药学上可接受的生物可降解聚合物包装或分散，这种聚合物例如聚乳酸、聚乙醇酸或者乳酸/乙醇酸共聚物。用于鼻施用，制备物可含有溶解或悬浮在液体载体特别是水性载体中的经过修饰的GLP-1或GLP-1类似物，用于气雾应用。所述载体含有添加剂，例如增溶剂，例如丙二醇、表面活性剂，吸收增强剂，例如卵磷脂(缩醛磷脂酰胆碱)或环式糊精，或者防腐剂如对羟基苯甲酸酯。一般地，本发明的经过修饰的多肽或肽以每单位剂量与药学上可接受的载体一起分散在单位剂量形式中。而且，本发明包括经过修饰的GLP-1和GLP-1类似物用于制备医学产品的用途，该医学产品可用于治疗与血糖水平升高相关的疾病(代谢病)，例如但是不限于上述那些疾病。特别地，本发明包括经过修饰的GLP-1和GLP-1类似物用于治疗糖尿病的用途，包括II型糖尿病、肥胖症、严重烧伤(severeburn)和心力衰竭，包括充血性心力衰竭和急性冠状动脉综合症。本发明还提供部分或基本上受到保护而免受DPP活性作用的经过修饰的毒蜥激动肽-3和毒蜥激动肽-4。毒蜥激动肽-3和毒蜥激动肽-4是促胰岛肽，包含39个氨基酸(残基2和残基3不同)，与GLP-1具有约53％的同源性。毒蜥激动肽-3序列为HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQIDNO79)，而毒蜥激动肽-4的序列为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQIDNO80)。本发明还包括经过修饰的毒蜥激动肽-4片段，其包含氨基酸序列例如毒蜥激动肽-4(1-31)HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY(SEQIDNO81)。此外，本发明还包括毒蜥激动肽-3和毒蜥激动肽-4肽的经过修饰的类似物。用于治疗糖尿病、前驱糖尿病或肥胖症的经过修饰的GLP-1融合蛋白或偶联物可以将经过修饰的GLP-1与异源分子融合，提高体内总稳定性。通过本领域知晓的方法重组或者共价连接到异源分子上，将经过修饰的GLP-1与异源分子融合。可将经过修饰的GLP-1融合或共价连接到如血浆蛋白如血清白蛋白或运铁蛋白，免疫球蛋白或其部分如Fc结构域上。更优选地，经过修饰的多肽或肽融合到运铁蛋白、乳运铁蛋白或黑素运铁蛋白上。用于制备这种融合蛋白的方法描述在美国专利申请US10/378,094中，其在此完全引入作为参考。GLP-1分子可通过不同长度的接头连接到异源蛋白上，以在所融合的蛋白之间提供更好的物理分离和更多的空间灵活性，从而使治疗性蛋白可达性最大化，例如使其可达其相关受体。接头肽可由柔性的或更具刚性的氨基酸组成。例如，可以使用的接头如多聚甘氨酸链。所述接头可以少于约50个、40个、30个、20个、10个或5个氨基酸残基。接头可被共价连接到或在异源蛋白和GLP-1之间。优选地，接头可以是一个Ser残基、两个Ser残基、肽Ser-Ser-Gly、肽PEAPTD、肽(PEAPTD)2、与IgG铰链连接子组合的肽PEAPTD，以及与IgG铰链连接子组合的肽(PEAPTD)2。这些接头可用于将GLP-1连接到运铁蛋白上。可对连接到经过修饰的多肽或肽上的运铁蛋白进行修饰。其可呈现糖基化程度下降。经过修饰的运铁蛋白多肽可选自单个运铁蛋白N结构域、单个运铁蛋白C结构域、运铁蛋白N结构域和C结构域、两个运铁蛋白N结构域以及两个运铁蛋白C结构域。如上讨论，GLP-1激活和调控机体内的重要内分泌激素系统，并且在葡萄糖代谢中起关键的控制作用。与市场上所有其它糖尿病治疗剂不同，GLP-1作为β细胞的生长因子起作用，具有恢复潜能，从而改善胰腺分泌胰岛素的能力，并且通过提高敏感性和更好地稳定葡萄糖水平使得已有的胰岛素水平更加有效地起作用。这减少了每日监控葡萄糖水平的负担，并可能延缓由糖尿病导致的血糖波动引起的严重的长期副作用。此外，GLP-1能够降低食欲并降低体重。肥胖症是对葡萄糖代谢控制差的固有结果，并且只会使糖尿病状况恶化。由于天然GLP-1在循环中被迅速降解(半衰期只有数分钟)，所以天然GLP-1的临床应用受到限制。为了维持循环中的治疗剂水平，需要使用泵或者膜片装置(patchdevice)持续施用高剂量，这增加了治疗成本。这对于长期使用是不方便的，特别是与所有其它药物治疗协同使用来治疗糖尿病和监控葡萄糖水平时。经过修饰的GLP-1融合蛋白保留了GLP-1的活性，但是具有运铁蛋白的长半衰期(14-17天)、稳定性和生物分布特性。这些特性能提供一种低成本、小体积的每月s.c.(皮下)注射，而且这类产品完全是长期使用所需的。还可经过修饰的GLP-1共价连接到血液成分上，提高其稳定性。例如经过修饰的GLP-1共价连接到血清白蛋白、运铁蛋白、免疫球蛋白或免疫球蛋白的Fc部分上。在一个实施方案中，可将经过修饰的GLP-1连接到脂肪酸或者脂肪酸衍生物上。在另一个实施方案中，经过修饰的GLP-1被工程化到药物亲和复合物(DAC)中。如先前所讨论的，Kim等人(2003，Diabetes52(3)751)公开了GLP-1-白蛋白药物亲和复合物。Kim等人证明，白蛋白偶联的DACGLP-1模拟天然的GLP-1。Kim等人提供了一种用于长期活化GLP-1R信号的新方法。在进行皮下施用时，DAC经过修饰的GLP-1在体内快速地并且选择地结合白蛋白。所形成的生物偶联物具有与内源性GLP-1相同的治疗活性和相似的功效，并具有更接近于白蛋白的药物动力学模式。经过修饰的GLP-1及其融合蛋白与其它治疗剂组合在本发明的一个方面，本发明的经过修饰的GLP-1肽及其融合蛋白，例如，GLP-1-Tf融合蛋白，与至少一种第二治疗性分子组合使用来治疗II型糖尿病、肥胖症和其它与异常的葡萄糖水平相关的疾病或状况，所述第二治疗性分子如Glucophage(盐酸二甲双胍(metformin)片剂)或GlucophageXR(盐酸二甲双胍长释片剂)。Glucophage和GlucophageXR是用于控制II型糖尿病的口服抗高血糖药。GlucophageXR是Glucophage的长释制剂。因此，由于药物从GlucophageXR中缓慢释放，每天只需服用一次GlucophageXR。Glucophage帮助机体从肝脏中生成较少葡萄糖。因此，Glucophage有效控制患者体内的血糖水平。Glucophage不会使机体产生更多的胰岛素，因此，其极少引起低血糖(低血糖症)。Glucophage还有助于降低血液的脂成分、甘油三酯和胆固醇，这些物质在患有II型糖尿病的人体中通常是高水平的。二甲双胍已经被证明能够降低食欲，当人们开始服用该药物时有助于其降低一些体重。二甲双胍已经被批准与磺酰脲或者胰岛素一起用于治疗，或者作为单一治疗剂治疗(单独地)。二甲双胍已经被建议用于治疗各种心血管疾病，例如胰岛素抗性患者中的高血压(WO9112003-Upjohn)，用于溶解血液凝块(与t-PA-衍生物组合)(WO9108763、WO9108766、WO9108767和WO9108765-BoehringerMannheim)，缺血性缺氧和组织缺氧(EP283369-Lipha)，动脉硬化(DE1936274-Brunnengraber&Co.，DE2357875-Hurka，和美国专利US4,205,087-ICI)。此外，已经建议使用二甲双胍组合前列腺素类似物环戊烷衍生物作为冠状动脉扩张物以及用于降低血压(美国专利US4,182,772-Hoechst)。二甲双胍还被建议与2-羟基-3，3，3-三氟丙酸衍生物(美国专利US4,107,329-ICI)、1，2-二芳基乙烯衍生物(美国专利US4,061,772-Hoechst)、取代的芳基氧基-3，3，3-三氟-2-丙酸、酯和盐(美国专利US4,055,595-ICI)、取代的羟苯基-哌啶酮(美国专利US4,024,267-Hoechst)以及部分氢化的1H-茚并-[1，2B]-吡啶衍生物(美国专利US3,980,656-Hoechst)组合，用于降低胆固醇。Montanari等人(PharmacologicalResearch，25(1)，1992)公开以每天两次500mg的剂量(b.i.d.)使用二甲双胍以与每天三次850mg二甲双胍(t.i.d.)相似的方式增加缺血后的血流。Sirtori等人(J.Cardiovas.Pharm.，6914-923，1984)公开，每天三次850mg剂量(t.i.d)的二甲双胍增加患有外周血管疾病患者的动脉血流。本发明提供各种疾病的治疗方法，包括本发明的经过修饰的GLP-1或其融合蛋白与一种或多种治疗试剂例如二甲双胍联合。在一个实施方案中，用经过修饰的GLP-1或其融合蛋白组合二甲双胍来治疗疾病以及与异常血糖水平相关的状况，例如糖尿病。优选地，用GLP-1/mTf融合蛋白组合二甲双胍来治疗II型糖尿病或肥胖症。可与本发明的经过修饰的GLP-1及其融合蛋白组合的其它治疗剂包括，但是不限于磺酰脲和磺酰脲样制剂、噻唑二酮(thiazolidinedione)、过氧物酶体增殖物激活受体(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptor)(PPAR)γ调节物、PPARα调节物、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B抑制剂、胰岛素受体酪氨酸激酶活化剂、11β-羟基类固醇脱氢酶抑制剂、糖原磷酸化酶抑制剂、葡萄糖激酶活化剂、β-3肾上腺素能激动剂以及胰高血糖素受体激动剂。DPP-IV抑制剂已经证明DPP-IV的抑制剂在治疗各种由DPP-IV介导的状况中是很有前景的。例如，在葡萄糖耐受和与高血糖相关的状况如II型糖尿病或肥胖症的治疗中，DPP-IV的抑制剂是非常有前景的方案。而且已经证明，DPP-IV与免疫反应有关，例如移植排斥(Transplantation1997，63(10)1495-1500)。因此，DPP-IV可用于防止移植排斥。此外，由于肺的内皮细胞DPP-IV结合癌细胞的纤连蛋白会促进癌细胞转移，因此DPP-IV的抑制剂可用于治疗癌症，用于预防癌细胞转移(J.Biol.Chem.1998，273(3724207-24215)。同样认为DPP-IV在牙周炎的发病机理中起重要作用(Infect.Immun.2000，68(2)，716-724)，并且负责灭活GLP-2，GLP-2是促进肠道在大切除术后的恢复的因子(J.Surg.Res.1999，87(1)，130-133)。因此，DPP-IV抑制剂还可用于肠道的恢复。WO95/15309公开了某些肽衍生物，它们是DPP-IV的抑制剂，从而可用于处理大量由DPP-IV介导的过程。WO95/13069公开某些环胺化合物，其可用于刺激释放天然的或内源的生长激素。欧洲专利555,824公开某些苯并咪唑基化合物，其延长凝血酶时间并抑制凝血酶和丝氨酸相关蛋白酶。ArchivesofBiochemistryandBiophysics，第323卷，第1期，148-154(1995)公开某些氨基酰基吡咯烷-2-腈，可用作DPP-IV抑制剂。JournalofNeurochemistry，第66卷，2105-2112(1996)公开了某些Fmoc-氨基酰基吡咯烷-2-腈，可用于抑制脯氨酰寡肽酶。BulletinoftheChemicalSocietyofJapan，第50卷，第7期，1827-1830(1977)公开氨基六肽，即Z-Val-Val-lmPro-Gly-Phe-Phe-OMe，及其相关氨肽的合成。此外，还检测了所述化合物的抗菌特性。WO90/12005公开某些氨基酸化合物，其抑制脯氨酰内肽酶活性，因此可用于治疗痴呆或健忘症。DerwentAbstract95302548公开某些N-(芳基(烃基)羰基)取代的杂环化合物，其是胆碱脂酶的活化剂，外周选择性增强，可用于治疗由于胆碱脂酶活性下降引起的状况。ChemicalAbstracts84177689公开某些1-酰基-吡咯烷-2-腈化合物，可用作具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的脯氨酸化合物的中间物。ChemicalAbstracts96116353公开某些3-氨基-2-巯基-丙基-脯氨酸化合物，它们是Ras法尼基-转移酶抑制剂，可用于治疗各种癌症或髓样白血病。WO95/34538公开抑制DPP-IV的某些吡咯烷(pyrrolidide)、磷酸盐、吖丁啶(azetidine)、肽和氮杂脯氨酸，用于治疗可通过DPP-IV抑制改善的状况。WO95/29190公开某些化合物，特征在于具有许多KPR型重复模式，由肽基质所携带，使得它们多次呈现在酶DPP-IV前，并对DPP-IV具有亲和性，该化合物能够抑制HIV进入细胞。WO91/16339公开某些四肽硼酸，它们是DPP-IV的抑制剂，可用于治疗自体免疫性疾病以及通过IL-2抑制所介导的状况。WO93/08259公开某些多肽硼酸，它们是DPP-IV的抑制剂，可用于治疗自体免疫性疾病以及通过IL-2抑制所介导的状况。WO95/11689公开某些四肽硼酸，它们是DPP-IV的抑制剂，可用于阻止HIV进入细胞。东德专利158109公开某些N-保护的肽基-氧肟酸和硝基苯甲酰草酰胺，其可用作DPP-IV的抑制剂。WO95/29691中公开了某些二肽脯氨酸磷酸盐(酯)，它们是DPP-IV的抑制剂，可用于治疗免疫系统异常。德国专利DD296075公开了某些氨基酸酰胺化合物，其抑制DPP-IV。BiochimicaetBiophysicaActa，第1293卷，147-153公开了某些二肽和三肽p-硝基苯胺(nitroanilide)的制备，以研究侧链的修饰对它们的DPP-IV和PEP催化水解的影响。BioorganicandMedicinalChemistryLetters，第6卷，第10期，1163-1166(1996)公开了某些2-氰基吡咯烷，它们是DPP-IV的抑制剂。J.Med.Chem.，第39卷，2087-2094(1996)公开了某些含有脯氨酸硼酸的二肽，它们是DPP-IV的抑制剂。Diabetes，第44卷，126-1131(96年9月)涉及这些的研究，该研究证明当GLP-1酰胺通过皮下或者静脉内路径施用给糖尿病患者或者非糖尿病患者时被迅速降解。美国专利US6,727,261提供新的DPP-IV抑制剂吡哆[2，1-a]异喹啉衍生物，可用于治疗和/或预防与DPP-IV相关的疾病和受损的葡萄糖耐受。与DPP-IV相关的疾病例如糖尿病，特别是非胰岛素依赖的糖尿病，这些化合物还可用于治疗和/或预防Bowl病、溃疡性结肠炎、MorbusCrohn、肥胖症(obesity)和/或代谢综合征。美国专利US6,716,843提供α-氨基酸磺酰基化合物，可用作DPP-IV的抑制剂。美国专利US6,645,995公开了2-取代的不饱和杂环化合物，其中杂环中的氮原子通过酰胺键或者肽键连接到氨基酸或氨基酸衍生物上。这些化合物是有效的和选择性的DPP-IV的抑制剂，可有效用于治疗可通过抑制DPP-IV来调控或正常化的状况。美国专利US6,617,340公开了N-(取代的甘氨酰)-吡咯烷，以及所述化合物在抑制二肽基肽酶-IV的用途。美国专利US6124,305公开了N-(取代的甘氨酰)-2-氰基吡咯烷，其抑制DPP-IV。这些化合物可用于治疗由DPP-IV所介导的状况。给患有II型糖尿病的93位患者(平均HbA1c为7.4％)施用Novartis化合物1-[[[2-[(5-氰基嘧啶-2-基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-2-氰基-(S)-吡咯烷(NVPDPP728)4周，在该4周的研究期间，血浆葡萄糖、胰岛素和HbA1c的水平下降(参见DiabetesCare2002，25(5)869-875)。使用DPP-IV抑制剂的组合治疗一个方面，本发明提供包含治疗性蛋白、多肽或肽的运铁蛋白融合蛋白与一种或多种DPP-IV抑制剂组合用于治疗各种状况的用途。本发明提供药物组合物，其包含运铁蛋白融合蛋白和一种或多种DPP-IV抑制剂。如美国专利申请US10/378,094所公开，其在此完全引入作为参考，可以修饰与治疗性蛋白、多肽或肽连接的运铁蛋白。其可呈现糖基化程度下降。经过修饰的运铁蛋白多肽可选自单个运铁蛋白N结构域、单个运铁蛋白C结构域、运铁蛋白N和C结构域、两个运铁蛋白N结构域以及两个运铁蛋白C结构域。与运铁蛋白连接的治疗性多肽或肽可以是其天然形式或经过修饰的形式。优选地，运铁蛋白融合蛋白包含作为治疗性肽的GLP-1，该GLP-1被连接到经过修饰的运铁蛋白分子上，如美国专利申请US10/378,094中所公开。而且，本发明的组合治疗包含GLP-1/mTf融合蛋白，一种或多种DPP-IV抑制剂，以及另一种治疗性分子。这种分子可以是Glucophage或GlucophageXR。另一个方面，本发明提供对二肽基蛋白酶裂解具有抗性的经过修饰的蛋白或肽或其融合蛋白与一种或多种DPP-IV抑制剂组合的用途。本发明公开了药物组合物，其包含经过修饰的蛋白或肽或其融合蛋白与一种或多种DPP-IV抑制剂组合。优选地，经过修饰的肽是经过修饰的GLP-1，而融合蛋白是经过修饰的GLP-1/mTf蛋白。此外，本发明的组合治疗包含经过修饰的GLP-1或者经过修饰的GLP-1/mTf蛋白、一种或多种DPP-IV抑制剂以及其它治疗性分子例如Glucophage或GlucophageXR。DPP-IV抑制剂可用于本发明的方法中，以治疗任何相关疾病。例如，在此公开的GLP-1-运铁蛋白融合蛋白可与DPP-IV抑制剂组合用于治疗前驱糖尿病(prediabetes)、糖尿病、肥胖症或者糖尿病的症状，所述DPP-IV抑制剂如1-[[[2-[(5-氰基嘧啶-2-基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-2-氰基-(S)-吡咯烷(NVPDPP728)。所述治疗剂可以顺序施用或者同时施用。运铁蛋白融合蛋白可包含GLP-1(7-37)肽(SEQIDNO32)或者GLP-1(7-36)肽(SEQIDNO32的氨基酸1-30)。更优选地，GLP-1(7-37)肽或GLP-1(7-36)肽包含将A8突变为G和将K34突变为A。运铁蛋白蛋白还可在GLP-1(7-37)肽或GLP-1(7-36)肽和运铁蛋白分子之间包含接头。优选地，该接头为(PEAPTD)2肽。使用内肽酶抑制剂的组合治疗来增强融合蛋白的药物动力学和药效学本发明还提供使用神经内肽酶(NEP)抑制剂和运铁蛋白融合蛋白的组合治疗。而且，本发明包括使用NEP和DPP-IV抑制剂以及运铁蛋白融合蛋白的组合治疗。NEP和DPPIV的抑制剂可以同时或顺序施用。而且，所述抑制剂和运铁蛋白融合蛋白可以同时或顺序施用。可以在施用运铁蛋白融合蛋白之前或之后，施用抑制剂。运铁蛋白融合蛋白包含GLP-1(7-37)肽(SEQIDNO32)或GLP-1(7-36)肽(SEQIDNO32的氨基酸1-30)。更优选地，GLP-1(7-37)肽或GLP-1(7-36)肽包含将A8突变为G和将K34突变为A。运铁蛋白蛋白在GLP-1(7-37)肽或GLP-1(7-36)肽和运铁蛋白分子之间还可以包含接头。优选地，该接头为(PEAPTD)2肽。神经内肽酶(NEP)也被称作为脑啡肽、中性溶酶(neprilysin)和心房肽酶，是存在于许多组织中的膜结合锌指金属内肽酶，这些组织包括大脑、肾脏、肺、胃肠道、心脏和外周血管系统。NEP通过降解循环的利钠肽(natriureticpeptide)，在利钠肽的清除中起主要作用，从而阻碍利钠肽对血管舒张、血压和血量的作用。NEP通过降解和灭活利钠肽，从而与高血压、心力衰竭和肾衰竭相关。除了降解循环的利钠肽，NEP还降解其它引起血管舒张的物质，包括循环的缓激肽；肾上腺髓质素、肾血管舒张肽和促尿钠排泄-利尿肽(natriuretic-diureticpeptide)；和/或肾脏形式的ANP尿舒张素(urodilatin)。NEP还参与血管收缩物内皮素同种型ET-1的降解，并且也可能与ET-1的形成相关(Brunner-LaRocca等人，CardiovascularResearch51(2001)510-520)。NEP还降解血管紧张素II，一种有效的血管收缩物，内啡肽，以及大量与代谢相关的肽例如缓激肽，GLP-1(Hupe-Sodmann，K.，McGregor，GP.，Brideribaugh，R等人RegulatoryPeptide1995；58149-56，Hupe-Sodmann，K，Goeke，R.，Goeke，B等人Peptide1997；18625-32)，PYY(MedeirosMD，TurnerAJ.，Endocrinology.1994年5月；134(5)2088-94)和胰高血糖素(TrebbienR等人AmJPhysiolEndocrinolMetab.2004年9月；287(3)E431-8)。文献中已经公开了大量NEP抑制剂例如磷酸阿米酮(phosphoramidon)或NEP/ACE抑制剂(包括美国专利US5,508,272中公开的omapatrilat、美国专利US5,552,397中公开的gempatrilat、美国专利US5,430,145中公开的sampatrilat和MDL100240)，用于单独治疗(monotherapeutictreatment)如高血压和心力衰竭。Nathisuwan等人，“AReviewofVasopeptidaseInhibitorANewModalityintheTreatmentofHypertensionandChronicHeartFailure”，Pharmacotherapy，22(1)，27-42(2002)。Candoxatril和ecadotril是两种高度特异的NEP抑制剂，目前正进行临床实验，是心力衰竭的未来药物。这两种药物是可在体内被代谢为活性同源物的药物前体。Candoxatril在肝脏中被活化为candoxatrilat，而ecadotril被转化为其活性同源物S-四氢噻吩(S-thiorphan)。一些ACE/NEP抑制剂的例子被公开在美国专利US5,508,272、US5,362,727、US5,366,973、US5,225,401、US4,722,810、US5,223,516、US5,552,397、US4,749,688、US5,504,080、US5,612,359和US5,525,723，以及欧洲专利申请EP0481,522、EP0534363A2、EP534,396和EP534,492。本发明提供包含运铁蛋白融合蛋白和DPP-IV抑制剂以及ACE/NEP抑制剂的组合(联合)治疗，用于治疗各种疾病或状况。这种疾病或状况包括但是不限于糖尿病，优选为II型糖尿病，充血性心力衰竭，肥胖症，高血压以及过敏性肠综合症(irritablebowelsyndrome)。转基因动物本发明的一个实施方案包含转基因的非人动物的生产，该动物表达受到保护而免受DPP活性的作用的经过修饰的多肽或肽。在某些实施方案中，包含表达融合蛋白的转基因的非人动物，该融合蛋白包含经过修饰的多肽或肽并且稳定性提高。在大量专利和专利申请中已经描述了成功生产转基因的非人动物，例如美国专利US6,291,740(2001年9月18日授权)；美国专利US6,281,408(2001年8月28日授权)；以及美国专利US6,271,436(2001年8月7日授权)，其内容在此完全引入作为参考。改变动物的遗传组成的能力使得它们可以进行大量商业应用，所述动物例如被训养的动物包括母牛、猪、山羊、马、牛和绵羊。这些应用包括动物的生产，该动物表达大量容易收集的形式(例如，表达到乳汁或血液中)的外源性蛋白，体重增加、饲料转化率高、肉质组成(carcasscomposition)改善、奶产量或奶成分高、抗病和对特定微生物感染具有抗性的动物，生产生长速度快或者繁殖性能强的动物。在基因组中含有外源DNA序列的动物被称作为转基因动物。最为广泛用于生产转基因动物的方法是将DNA显微注射到受精胚胎的原核中(Wall等人，J.Cell.Biochem.49113)。用于生产转基因动物的其它方法包括用逆转录病毒或者逆转录病毒载体感染胚胎。已经报道用野生型或者重组的逆转录病毒感染植入前或植入后的小鼠胚胎(Janenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA731260；Janenich等人，Cell24519；Stuhlmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA817151；Jahner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826927；VanderPutten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826148-6152；Stewart等人，EMBOJ.6383-388)。用逆转录病毒感染胚胎的可替代方法是将病毒或者生产病毒的细胞注射到小鼠胚胎的囊胚腔中(Jahner，D.等人，Nature298623)。已经报道，采用子宫内逆转录病毒感染妊娠中期小鼠胚胎，将转基因导入到小鼠的生殖细胞中(Jahner等人，同上文)。已经报道用逆转录病毒或逆转录病毒载体感染牛和羊的胚胎来生成转基因动物。这些方案包括微注射逆转录病毒颗粒或生长停止(即用丝裂菌素C处理)的细胞，该细胞将逆转录病毒颗粒排到受精卵或早期胚胎的卵黄周空间(PCT国际专利申请WO90/08832；以及Haskell和Bowen，Mol.Reprod.Dev.，40386。PCT国际专利申请WO90/08832描述将野生型猫白血病病毒B注射到2-8个细胞阶段的羊胚胎的卵黄周空间。从经过注射的胚胎获得的胎儿被证实含有多个整合位点。美国专利US6,291,740(2001年9月18日授权)描述使用转导分化细胞的逆转录病毒载体(例如来源于鼠白血病病毒[MLV]的载体)，将外源DNA导入到未成熟的卵母细胞和成熟的未受精的卵母细胞(即受精前的卵母细胞)中来生产转基因动物。该专利还描述了用于细胞巨化病毒启动子起始以及小鼠乳腺肿瘤LTR表达各种重组蛋白的方法和组合物。美国专利US6,281,408(2001年8月28日授权)描述了用胚胎干细胞生产转基因动物的方法。简而言之，胚胎干细胞和桑椹胚用于混合细胞共培养，生成转基因动物。共培养前，通过例如电穿孔、微注射或者逆转录病毒呈递，将外源遗传物质导入到胚胎干细胞中。通过选择标记如新霉素，对以这种方式转染的胚胎干细胞进行选择，选择发生基因整合的细胞。美国专利US6,271,436(2001年8月7日授权)描述转基因动物的生产，该方法包括分离原始的生殖细胞，培养这些细胞来产生原始的生殖细胞来源的细胞系，转化原始的生殖细胞和所培养的细胞系，用这些被转化的细胞和细胞系来生产转基因动物。生成转基因动物的效率被极大地提高，从而使得在生产转基因非啮齿类动物种属时可以采用同源重组。基因治疗本发明的一个实施方案包括本发明的多肽或肽构建物用于基因治疗的用途。通过在N-末端添加一个或多个附加的氨基酸来修饰多肽或肽，使其免受DPP活性的作用。例如，提供编码在其N-末端包含附加His残基的GLP-1的核酸构建体，用于基因治疗。此外，提供编码经过修饰的GLP-1/运铁蛋白融合蛋白的核酸构建体，用于基因治疗。本发明的经过修饰的GLP-1构建体受到保护而不受DPP活性的作用，并且更为稳定；因此，它们理想地适合用于基因治疗。简而言之，最近在Ijima等人(2001年6月10日)HumanGeneTherapy(美国)12/91063-77中证实了可以通过注射腺病毒载体来进行基因治疗，该载体含有编码可溶的融合蛋白的基因，该融合蛋白由细胞毒性淋巴细胞抗原4(CTLA4)和人免疫球蛋白G1的Fc部分组成。在该基因治疗申请中，通过关节内注射该载体来成功治疗II型胶原诱导关节炎的鼠科模型。在许多美国专利中也描述了基因治疗，包括美国专利US6,225,290(2001年5月1日授权)；美国专利US6,187,305(2001年2月13日授权)；和美国专利US6,140,111(2000年10月31日授权)。美国专利US6,225,290提供方法和构建物，从而使哺乳动物个体的肠上皮细胞被遗传改变以可操作地插入表达具有期望治疗作用的蛋白的基因。通过施用主要由裸DNA组成的制剂来转化肠道细胞，并口服施用该DNA完成了所述转化。口腔或其它的胃肠内施用路径提供简单的施用方法，而裸核酸的使用避免与使用病毒载体相关的并发症，并实现基因治疗。所表达的蛋白质直接分泌到胃肠道和/或血流中，获得治疗性的血液水平的蛋白质，从而治疗需要该蛋白的患者。被转化的上皮细胞提供短期或长期的疾病治疗方案，所述疾病与特定蛋白的缺陷相关，或者适合通过该蛋白的过度表达来治疗。美国专利US6,187,305提供在脊椎动物来源特别是哺乳动物的细胞中进行基因或DNA打靶的方法。简而言之，通过DNA的同源重组或打靶，将DNA导入到脊椎动物来源的原代细胞和后代细胞中，所述DNA被导入到脊椎动物来源的原代细胞和后代细胞的基因组DNA中的预先选择的位点上。美国专利US6,140,111(2000年10月31日授权)描述了逆转录病毒基因治疗载体。所公开的逆转录病毒载体包括感兴趣基因的插入位点，并且其能够在大量各种被转化的细胞类型中高水平表达来源于该感兴趣的基因的蛋白。还公开了缺乏可选择标记的逆转录病毒载体，从而使得它们适合在多种疾病状态的治疗中进行人类基因治疗，而不共表达标记产物，例如抗生素。这些逆转录病毒载体特别适合用于某些包装细胞系中。逆转录载体插入哺乳动物细胞的基因组的能力使得它们成为治疗人和动物的遗传病的基因治疗中的特别有前景的候选物。基因治疗通常包括(1)将遗传物质添加到患者体内细胞中，或(2)从机体中取出患者细胞，将新的遗传物质添加到细胞中，并将它们再引入机体中，即体外基因治疗。对如何在多种细胞中用逆转录病毒载体进行基因治疗的讨论可见于，例如1989年9月19日授权的美国专利US4,868,116，和1990年12月25日授权的US4,980,286(上皮细胞)，1989年8月10公开的WO89/07136(肝细胞)，1990年7月25日公开的EP378,576(成纤维细胞)，以及1989年6月15日公开的WO89/05345和1990年6月28日公开的WO/90/06997(内皮细胞)，其公开内容在此引入作为参考。可以相信，无需进一步描述，利用先前的描述和下面的说明性实施例，本领域普通技术人员能够实施和利用要求保护的本发明。因此，如下的工作实施例特别地指出本发明的优选实施方案，而不解释为以任何方式限制所公开的其它部分。本申请全文所有提及的文章、出版物、专利和文件在此完全引入作为参考。实施例实施例1具有二肽基肽酶IV保护的经过修饰的GLP-1该实施例描述免受DPP-IV活性作用的经过修饰的GLP-1肽。采用标准的固相Fmoc化学合成如下肽，并用C18柱通过反相HPLC进行纯化，并通过220nm的吸光度来量化。通过质谱分析法(MALDI-TOF)分析纯化的肽GLP-1NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO32的氨基酸1-30)GLP-1(A8G)NH2-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO90)H-GLP-1NH2-His-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO91)H-GLP-1(A8G)NH2-His-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO92)HH-GLP-1NH2-His-His-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO93)G-GLP-1NH2-Gly-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH(SEQIDNO94)H-毒蜥激动肽-4NH2-His-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-COOH(SEQIDNO95)二肽基肽酶-IV处理等克分子数浓度的各种肽(6μM)用溶于25mMTris-Cl(pH8.0)中的2μg重组人DPP-IV(1μg/μL，R&DSystems，Minneapolis，MN)处理。同时对各种肽平行进行除了DPP-IV外的对照反应。室温温育消化物2小时，在该时间内，反应用添加了1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Calbiochem，SanDiego，CA)的Krebs-Ringer缓冲液(BiosourceInternational，Camarillo，CA)稀释10倍。如下讨论，对肽进行分析，以确定剩余GLP-1受体的活化活性。环AMP刺激分析处理的前一天，以2×104细胞/孔的密度，在四个96-孔组织培养平板的RPMI/10％FBS培养液中植入CHO-GLPlR细胞(Montrose-Rafizadeh等人1997J.Biol.Chem.272，21201-21206)。第二天，细胞以约60-80％的汇合度均匀分布。在植入培养平板的第二天，用Krebs-Ringer缓冲液(KRB)洗涤细胞两次，接着37℃在KRB中培养1小时，来降低细胞内的cAMP水平。接着在KRB/IBMX中培养10分钟以抑制细胞内的分解cAMP的酶。在KRB/IBMX中制备各种测试化合物的稀释液，37℃，三孔CHO-GLPlR细胞用每孔50μl测试化合物处理整20分钟。用冰冷的磷酸缓冲盐水洗涤培养物两次来终止处理。室温添加0.1ml溶解缓冲液1B(AmershamBiosciencescAMPBiotrakEIA试剂盒)10分钟，制备裂解产物。使用cAMPBiotrakEnzymeImmunoassaySystem(AmershamBiosciencesCorporation，Piscataway，NJ，产品号RPN225)，按照试剂盒说明，对全体积的各种细胞提取物进行分析，确定cAMP浓度。发现本发明的肽对DPP-IV的抗性高于未经过修饰的形式。活性GLP-1的特异ELISA可替代地，用ELISA系统(胰高血糖素样肽-1[Active]ELISA试剂盒[LincoResearch，Inc.，St.Charles，MO])分析DPP-IV对本发明的GLP-1和GLP-1衍生物的降解，该系统特异于完整的活性GLP-1，但是不识别N-末端的两个氨基酸由于DPP-IV的作用而被去除的GLP-1，即GLP-1(9-36或9-37)。等克分子数浓度的GLP-1和H-GLP-1(1200pM)用溶于25mMTris-Cl(pH8.0)的重组人DPP-IV(200ng/μL，R&DSystems，Minneapolis，MN)处理，用试剂盒中提供的分析缓冲液稀释来终止反应，该试剂盒含有蛋白酶抑制剂。该试剂盒包含包被了抗GLP-1的单克隆抗体的96-孔微量滴定平板。洗涤平板(在平板清洗机，ThermoLabsystemsUltrawashPlus中，用25mM硼酸缓冲盐水x4洗涤)，然后室温用肽样本温育3小时(300pM和10倍连续稀释液放入平板)。在如上所述洗涤后，室温用碱性磷酸酶偶联的抗GLP抗体(试剂盒中的即用成分)温育平板2小时。洗涤后，将4-甲基伞形基磷酸盐(4-MethyllumbelliferylPhosphate)(MUP)底物(在50mM硼酸盐pH9.5以1∶200稀释)添加到所有孔中，室温在黑暗中温育30分钟。在355nm激发波长和460nm发射波长，在SpectraMaxGeminiEM荧光平板读数器中对平板进行读数。因为H-GLP-1比GLP-1不容易结合单克隆抗体，因此在DPP-IV处理后剩余的活性H-GLP-1的浓度用H-GLP-1标准曲线确定。图8显示H-GLP-1对DPP-IV作用的抗性实质上比GLP-1更高。实施例2经过修饰的GLP-1融合蛋白该实施例描述包含融合到经过修饰的运铁蛋白分子上的经过修饰的GLP-1的融合蛋白，经过修饰的GLP-1受到保护而免受DPP-IV活性的作用。为了构建编码运铁蛋白分泌前导序列的序列，设计如下重叠引物，所述前导序列后面为GLP-1和运铁蛋白的N-末端部分P0236-TTCCCATACAAACTTAAGAGTCCAATTAGCTTCATCGCCA(SEQIDNO96)P0237-GGTTTAGCTTGTTTTTTTATTGGCGATGAAGCTAATTGGACTCTTAAGTTTGTATGGGAA(SEQIDNO97)P0244-ATAAAAAAACAAGCTAAACCTAATTCTAACAAGCAAAGATGAGGCTCGCCGTGGGAGCCC(SEQIDNO98)P0245-CAGGACGGCGCAGACCAGCAGGGCTCCCACGGCGAGCCTCATCTTTGCTTGTTAGAATTA(SEQIDNO99)P0248-TGCTGGTCTGCGCCGTCCTGGGGCTGTGTCTGGCGCATGCTGAAGGTACTTTTACTTCTGATGTTTCTTC(SEQIDNO100)P0249-AATTCTTTAGCAGCTTGACCTTCCAAATAAGAAGAAACATCAGAAGTAAAAGTACCTTCAGCATGCGCCAGACACAGCCC(SEQIDNO101)P0250-TTATTTGGAAGGTCAAGCTGCTAAAGAATTTATTGCTTGGTTGGTTAAAGGTAGGGTACCTGATAAAACT(SEQIDNO102)P0251-AGTTTTATCAGGTACCCTACCTTTAACCAACCAAGCAATA(SEQIDNO103)这些引物的位置显示如下。AflII-+---->>...........P0236............>>721ccaatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatacaaacttaagagtccaattagcggttacaatgcagggcaatataacctcaagaagggtatgtttgaattctcaggttaatcg<<...........P0237............<<>>P0236.>>>>.....................P0244........................>>781ttcatcgccaataaaaaaacaagctaaacctaattctaacaagcaaagatgaggctcgccaagtagcggttatttttttgttcgatttggattaagattgttcgtttctactccgagcgg<<...........P0237............<<<<...........P0245............<<>>...nL.....>mrla>>P0244.>>>>.....................P0248........................>>841gtgggagccctgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggcgcatgctgaaggtactcaccctcgggacgaccagacgcggcaggaccccgacacagaccgcgtacgacttccatga<<...........P0245............<<<<...........P0249............<<>......................nL......................>>vgallvcavl.glcla>>...GLP-1.....>haegt>>.....P0248.......>>>>...............P0250...................>>901tttacttctgatgtttcttcttatttggaaggtcaagctgctaaagaatttattgcttggaaatgaagactacaaagaagaataaaccttccagttcgacgatttcttaaataacgaacc<<...................P0249..........................<<<<.P0251<<>.............................GLP-1.............................>ftsdvssylegqaakefiawKpnI-----+>>.........P0250..............>>961ttggttaaaggtagggtacctgataaaactgtgagatggtgtgcagtgtcggagcatgagaaccaatttccatcccatggactattttgacactctaccacacgtcacagcctcgtactc<<...........P0251............<<>....GLP-1....>>lvkgr>>.....................mTf......................>vpdktvrwcavsehe(SEQIDNO104是编码链；SEQIDNO105是所编码的蛋白质。)加入引物(8μL20pmolconc.)并加热到65℃5分钟，然后进行退火反应将温度缓慢降低到室温。在将T4DNA连接酶添加到退火反应中，并在室温接着温育2小时，取出1μl反应物，用于PCR反应中来扩增具有外引物(outerprimers)P0236和P0251的完整插入物。PCR反应条件如下94℃5分钟25个循环94℃30秒50℃30秒72℃1分钟72℃7分钟4℃放置用AflII和KpnI消化所生成的PCR产物，并连接到先用AflII和KpnI消化的pREX0094上(图1)。用连接物转化大肠杆菌。对来自所生成的克隆的DNA进行测序，选择符合AflII/KpnI插入物长度的克隆，并命名为pREX0198(图2)。接着，pREX0198用NotI和PvuI消化并插入到pSAC35(图3)中，生成pREX0240(图4)。为了生成编码天然运铁蛋白分泌前导序列、之后是融合到经过修饰的运铁蛋白(mTf)上的H-GLP-1(7-36)的质粒，设计重叠引物P0424和P0425，将额外的N-末端组氨酸添加到pREX0198所编码的序列。P04245’到3’CTGTGTCTGGCGCATCATGCTGAAG(SEQIDNO106)P04255’到3’CTTCAGCATGATGCGCCAGACACAG(SEQIDNO107)pREX0198用作模板用于起始PCR反应，在各个反应中使用两条重叠突变引物和两条外引物，即P0424加上P0012，以及P0425加上P0025。然后，为了将它们连接在一起，在第二轮PCR中，这些反应的产物用作模板，并仅使用外引物，即P0012加上P0025。两轮PCR的反应条件为1×94℃1分钟，20×94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟和1×72℃7分钟，到结束。来自最后反应的PCR产物用AflII和KpnI消化，并连接到用AflII/KpnI消化的pREX0052(图5)中，生成pREX0367(图6)。对构建体进行DNA测序，证实插入了编码额外组氨酸的密码子。然后用NotI和PvuI(后者破坏氨苄青霉素抗性基因)消化pREX0367，并连接到预先用NotI消化的pSAC35上，生成pREX0368(图7)。通过电穿孔将pREX0368转化到宿主酿酒酵母菌株中，根据亮氨酸原养型(leucineprototrophy)在缓冲的最低培养液(minimalmedium)平板上选择被转化的克隆。在选择单个克隆后，酵母转化子存放在40％海藻糖中，并在-70℃储存。通过在调整到pH6.5的液体最低培养液中生长来确定表达，并通过SDS-PAGE、western印迹和ELISA分析上清液。如2003年3月4日提交的美国专利申请10/378,094中所述，构建编码GLP-1/mTf(pREX0100)和H-GLP-1/mTf的质粒，该专利申请在此完全引入作为参考。为了制备GLP-1/mTf融合蛋白，可使用GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)的氨基酸序列。haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr(SEQIDNO32的氨基酸1-30)haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg(SEQIDNO32)例如，再将GLP-1(7-36)的肽序列可反译成DNA，并优化密码子用于酵母表达catgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttggaaggtcaagctgctaaagaahaegtftsdvssylegqaaketttattgcttggttggttaaaggtaga(SEQIDNO117)fiawlvkgr(SEQIDNO32的氨基酸1-30)特异地设计引物，以在退火后形成5′XbaI和3′KpnI粘性末端，并且使得能够直接连接到XbaI/KpnI切割的pREX0052上，正好位于前导序列的5′末端和mTf的N-末端。可替代地，工程化制备其它粘性末端以连接到其它载体上。XbaI-+-----1aggtctctagagaaaaggcatgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttgtccagagatctcttttccgtacgacttccatgaaaatgaagactacaaagaagaataaac>>......FL.......>>rslekr>>..................GLP-1....................>haegtftsdvssylKpnI------+61gaaggtcaagctgctaaagaatttattgcttggttggttaaaggtagggtacctgatacttccagttcgacgatttcttaaataacgaaccaaccaatttccatcccatggactat>......................GLP-1......................>>egqaakefiawlvkgr>>..mTf..>>vpdSEQIDNOs118和119在退火和连接后，对克隆进行测序，以验证正确插入。该载体被命名为pREX0094。用NotI从pREX0094中切出表达盒，并亚克隆到NotI酶切的酵母载体pSAC35中，制备pREX0100。然后将质粒电穿孔到宿主酿酒酵母菌株中，在最低培养液平板上选择亮氨酸原养型的转化子。通过在液体最低培养液中生长来确定表达，并且通过SDS-PAGE、western印迹和ELISA分析上清液。GLP-1/mTf和H-GLP-1/mTf被表达，并通过阳离子交换和阴离子交换层析从发酵培养物(所述培养物在标准条件下生长)中纯化。二肽基肽酶-IV处理等克分子数浓度的GLP-1/mTf和H-GLP/1-mTF(2μM)用25mMTris-Cl(pH8.0)中的重组人DPP-IV(1μg/μL，R&DSystems)处理。同时对各种融合蛋白平行进行除了DPP-IV外的对照反应。室温下温育消化物2小时，在该时间内，反应用添加了1mMIBMX(Calbiochem)的Krebs-Ringer缓冲液(BiosourceInternational)稀释20倍。环AMP刺激分析处理的前一天，以1×105细胞/孔的密度，在组织培养平板(24-孔)的RPMI/10％FBS培养液中植入CHO-GLPlR细胞。第二天，细胞以约60-80％的汇合度均匀分布。在细胞植入培养平板后的第二天，用Krebs-Ringer缓冲液(KRB)洗涤细胞两次，接着37℃在KRB中温育1小时，来降低细胞内的cAMP水平。接着在KRB/IBMX中温育10分钟以抑制细胞内的分解cAMP的酶。在KRB/IBMX中制备各种测试化合物的稀释液，并在37℃，三孔CHO-GLPlR细胞用每孔0.15ml测试化合物处理整50分钟。用冰冷的磷酸缓冲盐水洗涤培养物两次来终止处理。室温添加0.2ml溶解缓冲液1B(AmershamBiosciencescAMPBiotrakEIA试剂盒)10分钟，制备裂解产物，然后使用cAMPBiotrakEnzymeImmunoassaySystem(AmershamBiosciences)，按照试剂盒说明，分析100μl各细胞提取物，确定cAMP浓度。实施例3用于治疗糖尿病的经过修饰的GLP-1/mTf在该实施例中，本发明的经过修饰的GLP-1/mTf用作治疗剂来治疗糖尿病。将经过修饰的GLP-1/mTf施用给Zucker大鼠，Zucker大鼠是II型糖尿病的标准动物模型。Zucker大鼠的血糖水平异常高。已经证明，用GLP-1处理这些动物诱导胰岛素分泌，并降低血糖。Zucker大鼠禁食过夜，然后用H-GLP-1或融合到运铁蛋白上的H-GLP-1(H-GLP-1/mTf)处理。在皮下注射H-GLP-1或H-GLP-1/mTf30分钟后，动物进行葡萄糖耐受测试(GTT)。对于该测试来说，给禁食动物饲喂葡萄糖溶液(1.5mg/g体重)，并以适当的时间间隔测量血糖。在施用葡萄糖后不久，未被处理的动物的血糖水平升高，并缓慢下降到基线，而注射了H-GLP-1或H-GLP-1/mTf的动物由于GLP-1的促胰岛作用显示更快恢复到正常的血糖水平。在另一个实验中，经过修饰的H-GLP-1或H-GLP-1/mTf用于使Zucker大鼠的高水平的禁食葡萄糖恢复到正常水平，该Zucker大鼠未施用葡萄糖。而在未被处理的动物中，血糖水平仍然很高，而在用H-GLP-1或经过修饰的H-GLP-1/mTf处理的动物中，血糖显著下降。实施例4具有二肽基肽酶IV保护作用的经过修饰的胰高血糖素该实施例描述了经保护而免受DPP-IV活性作用的经过修饰的胰高血糖素分子。用标准的固相Fmoc化学合成如下肽，并用C18柱通过反相HPLC纯化，并通过220nm的吸光度进行量化。通过质谱分析(MALDI-TOF)分析经过纯化的肽胰高血糖素NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH(SEQIDNO35)H-胰高血糖素NH2-His-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Val-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH(SEQIDNO108)如上所述，该肽用DPP-IV预处理，然后用表达所克隆的胰高血糖素受体的重组细胞系分析其激活胰高血糖素受体的能力。实施例5具有二肽基肽酶IV保护作用的经过修饰的GIP该实施例提供了受到保护而免受DPP-IV活性作用的经过修饰的GIP分子。用标准的固相Fmoc化学合成如下肽，并用C18柱通过反相HPLC纯化，并通过220nm的吸光度进行量化。通过质谱分析(MALDI-TOF)分析经过纯化的肽GIPNH2-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-COOH(SEQIDNO31)Y-GIPNH2-Tyr-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-COOH(SEQIDNO109)如上所述，该肽用DPP-IV预处理，然后用表达所克隆的GIP受体的重组细胞系分析其激活GIP受体的能力。应当理解，先前的讨论和实施例仅提供对某些优选实施方案的详细描述。因此，对本领域技术人员来说，显然可以进行各种改进和进行等同替代，而不脱离本发明的精神和保护范围。在本专利申请中提及的所有杂志、其它参考文献、专利和专利申请全文引入作为参考。序列表<110>比奥雷克西斯药物公司(BIOREXISPHARMACEUTICALCORPORATION)Sadeghi，HomayounPrior，ChristopherP.Ballance，DavidJ.<120>使用包含GLP-1的运铁蛋白融合蛋白的组合治疗<130>054710-5012-WO<150>US60/598,031<151>2004-08-03<160>119<170>PatentInversion3.2<210>1<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>1AlaProValArgSer15<210>2<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>2AlaProThrSerSer15<210>3<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>3IleProThrGluIle15<210>4<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>4ValProProGlyGlu15<210>5<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>5SerProGlyGlnGly15<210>6<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>6SerProGlyProVal15<210>7<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>7LysProArgLeuLeu15<210>8<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>8GlyProValSerAla15<210>9<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>9AlaProAlaArgSer15<210>10<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>10ThrProLeuGlyPro15<210>11<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>11AlaProProArgLeu15<210>12<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>12PheProThrIlePro15<210>13<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>13ValProLeuSerArg15<210>14<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>14MetProIleThrArg15<210>15<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>15MetProValGluArg15<210>16<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>16GlyProGluThrLeu15<210>17<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>17AlaProLeuAlaThr15<210>18<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>18MetProMetPheIle15<210>19<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>19GluProAspAlaIle15<210>20<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>20TyrProSerLysPro15<210>21<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>21AlaProLeuGluPro15<210>22<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>22TyrProIleLysPro15<210>23<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>23LeuProIleCysPro15<210>24<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>24SerProTyrSerSer15<210>25<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>25ArgProLysProGln15<210>26<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>26SerProAlaProPro15<210>27<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>27MetProGlyMetIle15<210>28<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>28MetProSerCysSer15<210>29<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>29LeuProGlyValLeu15<210>30<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>30AlaProMetAlaGlu15<210>31<211>42<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>31TyrAlaGluGlyThrPheIleSerAspTyrSerIleAlaMetAspLys151015IleHisGlnGlnAspPheValAsnTrpLeuLeuAlaGlnLysGlyLys202530LysAsnAspTrpLysHisAsnIleThrGln3540<210>32<211>31<212>PRT<213>人(Homosapiens)<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第31位的X＝G或-NH2。<400>32HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgXaa202530<210>33<211>33<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>33HisAlaAspGlySerPheSerAspGluMetAsnThrIleLeuAspAsn151015LeuAlaAlaArgAspPheIleAsnTrpLeuIleGlnThrLysIleThr202530Asp<210>34<211>44<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>34TyrAlaAspAlaIlePheThrAsnSerTyrArgLysValLeuGlyGln151015LeuSerAlaArgLysLeuLeuGlnAspIleMetSerArgGlnGlnGly202530GluSerAsnGlnGluArgGlyAlaArgAlaArgLeu3540<210>35<211>29<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>35HisSerGlnGlyThrPheThrSerAspTyrSerLysTyrLeuAspSer151015ArgArgAlaGlnAspPheValGlnTrpLeuMetAsnThr2025<210>36<211>27<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>36HisAlaAspGlyValPheThrSerAspPheSerLysLeuLeuGlyGln151015LeuSerAlaLysLysTyrLeuGluSerLeuMet2025<210>37<211>103<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>37GlyProGluThrLeuCysGlyAlaGluLeuValAspAlaLeuGlnPhe151015ValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheAsnLysProThrGlyTyrGly202530SerSerSerArgArgAlaProGlnThrGlyIleValAspGluCysCys354045PheArgSerCysAspLeuArgArgLeuGluMetTyrCysAlaProLeu505560LysProAlaLysSerAlaArgSerValArgAlaGlnArgHisThrAsp65707580MetProLysAlaGlnLysGluValHisLeuLysAsnAlaSerArgGly859095SerAlaGlyAsnLysThrTyr100<210>38<211>9<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>38ArgProProGlyPheSerProPheArg15<210>39<211>11<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>39ArgProLysProGlnGlnPhePheGlyLeuMet1510<210>40<211>22<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>40ArgProValLysValTyrProAsnGlyAlaGluAspGluSerAlaGlu151015AlaPheProLeuGluPhe20<210>41<211>36<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>41TyrProSerLysProAspAsnProGlyGluAspAlaProAlaGluAsp151015MetAlaArgTyrTyrSerAlaLeuArgHisTyrIleAsnLeuIleThr202530ArgGlnArgTyr35<210>42<211>36<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>42TyrProIleLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerProGluGlu151015LeuAsnArgTyrTyrAlaSerLeuArgHisTyrLeuAsnLeuValThr202530ArgGlnArgTyr35<210>43<211>199<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>43LeuProIleCysProGlyGlyAlaAlaArgCysGlnValThrLeuArg151015AspLeuPheAspArgAlaValValLeuSerHisTyrIleHisAsnLeu202530SerSerGluMetPheSerGluPheAspLysArgTyrThrHisGlyArg354045GlyPheIleThrLysAlaIleAsnSerCysHisThrSerSerLeuAla505560ThrProGluAspLysGluGlnAlaGlnGlnMetAsnGlnLysAspPhe65707580LeuSerLeuIleValSerIleLeuArgSerTrpAsnGluProLeuTyr859095HisLeuValThrGluValArgGlyMetGlnGluAlaProGluAlaIle100105110LeuSerLysAlaValGluIleGluGluGlnThrLysArgLeuLeuGlu115120125GlyMetGluLeuIleValSerGlnValHisProGluThrLysGluAsn130135140GluIleTyrProValTrpSerGlyLeuProSerLeuGlnMetAlaAsp145150155160GluGluSerArgLeuSerAlaTyrTyrAsnLeuLeuHisCysLeuArg165170175ArgAspSerHisLysIleAspAsnTyrLeuLysLeuLeuLysCysArg180185190IleIleHisAsnAsnAsnCys195<210>44<211>92<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>44AlaProAspValGlnAspCysProGluCysThrLeuGlnGluAspPro151015PhePheSerGlnProGlyAlaProIleLeuGlnCysMetGlyCysCys202530PheSerArgAlaTyrProThrProLeuArgSerLysLysThrMetLeu354045ValGlnLysAsnValThrSerGluSerThrCysCysValAlaLysSer505560TyrAsnArgValThrValMetGlyGlyPheLysValGluAspHisThr65707580AlaCysHisCysSerThrCysTyrTyrHisLysSer8590<210>45<211>145<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>45SerLysGluProLeuArgProArgCysArgProIleAsnAlaThrLeu151015AlaValGluLysGluGlyCysProValCysIleThrValAsnThrThr202530IleCysAlaGlyTyrCysProThrMetThrArgValLeuGlnGlyVal354045LeuProAlaLeuProGlnValValCysAsnTyrArgAsnValArgPhe505560GluSerIleArgLeuProGlyCysProArgGlyValAsnProValVal65707580SerTyrAlaValAlaLeuSerCysGlnCysAlaLeuCysArgArgSer859095ThrThrAspCysGlyGlyProLysAspHisProLeuThrCysAspAsp100105110ProArgPheGlnAspSerSerSerSerLysAlaProProProSerLeu115120125ProSerProSerArgLeuProLysProSerAspThrProIleLeuPro130135140Gln145<210>46<211>5<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>46AlaProGlyProArg15<210>47<211>27<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>47ValProLeuProAlaGlyGlyGlyThrValLeuThrLysMetTyrPro151015ArgGlyAsnHisTrpAlaValGlyHisLeuMet2025<210>48<211>133<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>48AlaProThrSerSerSerThrLysLysThrGlnLeuGlnLeuGluHis151015LeuLeuLeuAspLeuGlnMetIleLeuAsnGlyIleAsnAsnTyrLys202530AsnProLysLeuThrArgMetLeuThrPheLysPheTyrMetProLys354045LysAlaThrGluLeuLysHisLeuGlnCysLeuGluGluGluLeuLys505560ProLeuGluGluValLeuAsnLeuAlaGlnSerLysAsnPheHisLeu65707580ArgProArgAspLeuIleSerAsnIleAsnValIleValLeuGluLeu859095LysGlySerGluThrThrPheMetCysGluTyrAlaAspGluThrAla100105110ThrIleValGluPheLeuAsnArgTrpIleThrPheCysGlnSerIle115120125IleSerThrLeuThr130<210>49<211>153<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>49AlaProValArgSerLeuAsnCysThrLeuArgAspSerGlnGlnLys151015SerLeuValMetSerGlyProTyrGluLeuLysAlaLeuHisLeuGln202530GlyGlnAspMetGluGlnGlnValValPheSerMetSerPheValGln354045GlyGluGluSerAsnAspLysIleProValAlaLeuGlyLeuLysGlu505560LysAsnLeuTyrLeuSerCysValLeuLysAspAspLysProThrLeu65707580GlnLeuGluSerValAspProLysAsnTyrProLysLysLysMetGlu859095LysArgPheValPheAsnLysIleGluIleAsnAsnLysLeuGluPhe100105110GluSerAlaGlnPheProAsnTrpTyrIleSerThrSerGlnAlaGlu115120125AsnMetProValPheLeuGlyGlyThrLysGlyGlyGlnAspIleThr130135140AspPheThrMetGlnPheValSerSer145150<210>50<211>4<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>50TyrProPhePhe1<210>51<211>4<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>51TyrProLeuGly1<210>52<211>58<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>52ArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAla151015ArgIleIleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThr202530PheValTyrGlyGlyCysArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAla354045GluAspCysMetArgThrCysGlyGlyAla5055<210>53<211>68<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>53SerProTyrSerSerAspThrThrProCysCysPheAlaTyrIleAla151015ArgProLeuProArgAlaHisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGly202530LysCysSerAsnProAlaValValPheValThrArgLysAsnArgGln354045ValCysAlaAsnProGluLysLysTrpValArgGluTyrIleAsnSer505560LeuGluMetSer65<210>54<211>246<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>54AsnProLeuLeuIleLeuThrPheValAlaAlaAlaLeuAlaAlaPro151015PheAspAspAspAspLysIleValGlyGlyTyrAsnCysGluGluAsn202530SerValProTyrGlnValSerLeuAsnSerGlyTyrHisPheCysGly354045GlySerLeuIleAsnGluGlnTrpValValSerAlaGlyHisCysTyr505560LysSerArgIleGlnValArgLeuGlyGluHisAsnIleGluValLeu65707580GluGlyAsnGluGlnPheIleAsnAlaAlaLysIleIleArgHisPro859095GlnTyrAspArgLysThrLeuAsnAsnAspIleMetLeuIleLysLeu100105110SerSerArgAlaValIleAsnAlaArgValSerThrIleSerLeuPro115120125ThrAlaProProAlaThrGlyThrLysCysLeuIleSerGlyTrpGly130135140AsnThrAlaSerSerGlyAlaAspTyrProAspGluLeuGlnCysLeu145150155160AspAlaProValLeuSerGlnAlaLysCysGluAlaSerTyrProGly165170175LysIleThrSerAsnMetPheCysValGlyPheLeuGluGlyGlyLys180185190AspSerCysGlnGlyAspSerGlyGlyProValValCysAsnGlyGln195200205LeuGlnGlyValValSerTrpGlyAspGlyCysAlaGlnLysAsnLys210215220ProGlyValTyrThrLysValTyrAsnTyrValLysTrpIleLysAsn225230235240ThrIleAlaAlaAsnSer245<210>55<211>184<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>55GlyProValProThrProProAspAsnIleGlnValGlnGluAsnPhe151015AsnIleSerArgIleTyrGlyLysTrpTyrAsnLeuAlaIleGlySer202530ThrCysProTrpLeuLysLysIleMetAspArgMetThrValSerThr354045LeuValLeuGlyGluGlyAlaThrGluAlaGluIleSerMetThrSer505560ThrArgTrpArgLysGlyValCysGluGluThrSerGlyAlaTyrGlu65707580LysThrAspThrAspGlyLysPheLeuTyrHisLysSerLysTrpAsn859095IleThrMetGluSerTyrValValHisThrAsnTyrAspGluTyrAla100105110IlePheLeuThrLysLysPheSerArgHisHisGlyProThrIleThr115120125AlaLysLeuTyrGlyArgAlaProGlnLeuArgGluThrLeuLeuGln130135140AspPheArgValValAlaGlnGlyValGlyIleProGluAspSerIle145150155160PheThrMetAlaAspArgGlyGluCysValProGlyGluGlnGluPro165170175GluProIleLeuIleProArgVal180<210>56<211>77<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>56ValProLeuSerArgThrValArgCysThrCysIleSerIleSerAsn151015GlnProValAsnProArgSerLeuGluLysLeuGluIleIleProAla202530SerGlnPheCysProArgValGluIleIleAlaThrMetLysLysLys354045GlyGluLysArgCysLeuAsnProGluSerLysAlaIleLysAsnLeu505560LeuLysAlaValSerLysGluArgSerLysArgSerPro657075<210>57<211>74<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>57GlyProAlaSerValProThrThrCysCysPheAsnLeuAlaAsnArg151015LysIleProLeuGlnArgLeuGluSerTyrArgArgIleThrSerGly202530LysCysProGlnLysAlaValIlePheLeuThrLysLeuAlaLysAsp354045IleCysAlaAspProLysLysLysTyrValGlnAspSerMetLysTyr505560LeuAspGlnLysSerProThrProLysPro6570<210>58<211>74<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>58GlnProAspAlaIleAsnAlaProValThrCysCysTyrAsnPheThr151015AsnArgLysIleSerValGlnArgLeuAlaSerTyrArgArgIleThr202530SerSerLysCysProLysGluAlaValIlePheLysThrIleValAla354045LysGluIleCysAlaAspProLysGlnLysTrpValGlnAspSerMet505560AspHisLeuAspLysGlnThrGlnThrPro6570<210>59<211>76<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>59GlnProAspSerValSerIleProIleThrCysCysPheAsnValIle151015AsnArgLysIleProIleGlnArgLeuGluSerTyrThrArgIleThr202530AsnIleGlnCysProLysGluAlaValIlePheLysThrLysArgGly354045LysGluValCysAlaAspProLysGluArgTrpValArgAspSerMet505560LysHisLeuAspGlnIlePheGlnAsnLeuLysPro657075<210>60<211>76<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>60GlnProValGlyIleAsnThrSerThrThrCysCysTyrArgPheIle151015AsnLysLysIleProLysGlnArgLeuGluSerTyrArgArgThrThr202530SerSerHisCysProArgGluAlaValIlePheLysThrLysLeuAsp354045LysGluIleCysAlaAspProThrGlnLysTrpValGlnAspPheMet505560LysHisLeuAspLysLysThrGlnThrProLysLeu657075<210>61<211>77<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>61GlyProValSerAlaValLeuThrGluLeuArgCysThrCysLeuArg151015ValThrLeuArgValAsnProLysThrIleGlyLysLeuGlnValPhe202530ProAlaGlyProGlnCysSerLysValGluValValAlaSerLeuLys354045AsnGlyLysGlnValCysLeuAspProGluAlaProPheLeuLysLys505560ValIleGlnLysIleLeuAspSerGlyAsnLysLysAsn657075<210>62<211>68<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>62LysProValSerLeuSerTyrArgCysProCysArgPhePheGluSer151015HisValAlaArgAlaAsnValLysHisLeuLysIleLeuAsnThrPro202530AsnCysAlaLeuGlnIleValAlaArgLeuLysAsnAsnAsnArgGln354045ValCysIleAspProLysLeuLysTrpIleGlnGluTyrLeuGluLys505560AlaLeuAsnLys65<210>63<211>72<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>63LysProValSerLeuSerTyrArgCysProCysArgPhePheGluSer151015HisValAlaArgAlaAsnValLysHisLeuLysIleLeuAsnThrPro202530AsnCysAlaLeuGlnIleValAlaArgLeuLysAsnAsnAsnArgGln354045ValCysIleAspProLysLeuLysTrpIleGlnGluTyrLeuGluLys505560AlaLeuAsnLysArgPheLysMet6570<210>64<211>69<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>64GlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAspTyr151015ValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysHisPheTyrTrpThr202530SerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArgAsp354045LysGluIleCysAlaAspProArgValProTrpValLysMetIleLeu505560AsnLysLeuSerGln65<210>65<211>7<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>65TyrProPheValGluProIle15<210>66<211>95<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>66AlaProGlyProArgGlyIleIleIleAsnLeuGluAsnGlyGluLeu151015CysMetAsnSerAlaGlnCysLysSerAsnCysCysGlnHisSerSer202530AlaLeuGlyLeuAlaArgCysThrSerMetAlaSerGluAsnSerGlu354045CysSerValLysThrLeuTyrGlyIleTyrTyrLysCysProCysGlu505560ArgGlyLeuThrCysGluGlyAspLysThrIleValGlySerIleThr65707580AsnThrAsnPheGlyIleCysHisAspAlaGlyArgSerLysGln859095<210>67<211>8<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>67HisSerAspAlaValPheThrAsp15<210>68<211>6<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>68HisSerAspGlyIlePhe15<210>69<211>8<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>69HisSerGlnGlyThrPheThrSer15<210>70<211>8<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>70PheProThrIleProLeuSerArg15<210>71<211>8<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>71HisSerAspGlyThrPheThrSer15<210>72<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第2位的X＝V或S；第3位的X＝Gln，D-Gln或Asp；第10位的X＝T或G；第12位的X＝K或A。<400>72HisXaaXaaGlyThrPheThrSerAspXaaSerXaaTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly202530<210>73<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第20位的X＝G，S，C，T，N，Q，Y，A，V，I，L，M，F，A，d-Lys或K；第28位的X＝G，S，C，T，N，Q，Y，A，V，I，L，M，F，A，d-Lys或K；第30位的X＝G，S，C，T，N，Q，Y，A，V，I，L，M，F，K，R，d-Arg或OH。<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第29位的X＝G或OH；第31位的X＝G或OH。<400>73HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaXaaGluPheIleAlaTrpLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>74<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第25位的X＝抗氧化的氨基酸；第29位的X＝G或OH；第30位的X＝R或OH；第31位的X＝G或OH。<400>74HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaXaaLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>75<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第10位的X＝Y或V；第12位的X＝K或S；第15位的X＝D或E；第16位的X＝S或G；第17位的X＝R或Q；第18位的X＝R或A；第20位的X＝Q或K。<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第29位的X＝G或OH；第30位的X＝R或OH；第31位的X＝G或OH。<400>75HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspXaaSerXaaTyrLeuXaaXaa151015XaaXaaAlaXaaGluPheIleAlaTrpLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>76<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第2位的X＝G或S或C或A；第3位的X＝D或G或S或C或T或N或Q或Y或A或V或I或L或M或F或E；第4位的X＝S或C或T或N或Q或Y或A或V或I或L或M或F或G；第9位的X＝E或D。<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第29位的X＝G或OH；第30位的X＝R或OH；第31位的X＝G或OH。<400>76HisXaaXaaXaaThrPheThrSerXaaValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>77<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第1位的X＝G或S或C或T或N或Q或Y或A或V或I或L或M或F或d-His或烷基化His或酰化His；第29位的X＝G或OH；第30位的X＝R或OH；第31位的X＝G或OH。<400>77XaaAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValXaaXaaXaaXaa202530<210>78<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>取代的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第1位的X＝1-或d-His，脱氨基-His，2-氨基-His，β-羟基-His，同组氨酸(homohistidine)，α-氟甲基-His，和α-甲基-His；第2位的X＝A，G，V，T，I或α-甲基-Ala；第15位和第21位的X＝E，Q，A，T，S或G。<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>第31位的X＝Gly或NH2。<400>78XaaXaaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuXaaGly151015GlnAlaAlaLysXaaPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgXaa202530<210>79<211>39<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>79HisSerAspGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGlu151015GluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSer202530SerGlyAlaProProProSer35<210>80<211>39<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>80HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGlu151015GluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSer202530SerGlyAlaProProProSer35<210>81<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>修饰的毒蜥激动肽(exendin)-4<400>81HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGlu151015AlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProTyr202530<210>82<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修饰的GLP-1N-末端<400>82HisHisAlaGlu1<210>83<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修饰的GLP-1N-末端<400>83HisHisGlyGlu1<210>84<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修饰的GLP-1N-末端<400>84HisHisSerGlu1<210>85<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修饰的GLP-1N-末端<400>85GlyHisAlaGlu1<210>86<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修饰的GLP-1N-末端<400>86GlyHisGlyGlu1<210>87<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>修饰的GLP-1N-末端<400>87GlyHisSerGlu1<210>88<211>32<212>PRT<213>人工的<220><223>修饰的GLP-1<400>88HisHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgGly202530<210>89<211>32<212>PRT<213>人工的<220><223>修饰的GLP-1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>X＝除1-或d-Lys外的氨基酸<400>89HisHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValXaaGlyArgGly202530<210>90<211>30<212>PRT<213>人工的<220><223>A8G修饰的GLP-1<400>90HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>91<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>用额外的N-末端His修饰的GLP-1<400>91HisHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>92<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>用额外的N-末端His和A8G修饰的GLP-1<400>92HisHisGlyGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>93<211>32<212>PRT<213>人工的<220><223>用2个额外的N-末端His残基修饰的GLP-1<400>93HisHisHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeu151015GluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>94<211>31<212>PRT<213>人工的<220><223>用额外的N-末端Gly修饰的GLP-1<400>94GlyHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGlu151015GlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>95<211>40<212>PRT<213>人工的<220><223>用额外的N-末端His修饰的毒蜥激动肽-4<400>95HisHisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGlu151015G1uGluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyPro202530SerSerGlyAlaProProProSer3540<210>96<211>40<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的引物<400>96ttcccatacaaacttaagagtccaattagcttcatcgcca40<210>97<211>60<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的引物<400>97ggtttagcttgtttttttattggcgatgaagctaattggactcttaagtttgtatgggaa60<210>98<211>60<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的引物<400>98ataaaaaaacaagctaaacctaattctaacaagcaaagatgaggctcgccgtgggagccc60<210>99<211>60<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的引物<400>99caggacggcgcagaccagcagggctcccacggcgagcctcatctttgcttgttagaatta60<210>100<211>70<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的引物<400>100tgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggcgcatgctgaaggtacttttacttctg60atgtttcttc70<210>101<211>80<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的引物<400>101aattctttagcagcttgaccttccaaataagaagaaacatcagaagtaaaagtaccttca60gcatgcgccagacacagccc80<210>102<211>70<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的引物<400>102ttatttggaaggtcaagctgctaaagaatttattgcttggttggttaaaggtagggtacc60tgataaaact70<210>103<211>40<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的引物<400>103agttttatcaggtaccctacctttaaccaaccaagcaata40<210>104<211>300<212>DNA<213>人工的<220><223>编码修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的序列<220><221>CDS<222>(109)..(300)<400>104ccaatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatacaaacttaagagtccaattagc60ttcatcgccaataaaaaaacaagctaaacctaattctaacaagcaaagatgaggctc117MetArgLeu1gccgtgggagccctgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggcg165AlaValGlyAlaLeuLeuValCysAlaValLeuGlyLeuCysLeuAla51015catgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttggaaggt213HisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly20253035caagctgctaaagaatttattgcttggttggttaaaggtagggtacct261GlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGlyArgValPro404550gataaaactgtgagatggtgtgcagtgtcggagcatgag300AspLysThrValArgTrpCysAlaValSerGluHisGlu5560<210>105<211>64<212>PRT<213>人工的<220><223>编码修饰的GLP-1-修饰的Tf融合蛋白的序列<400>105MetArgLeuAlaValGlyAlaLeuLeuValCysAlaValLeuGlyLeu151015CysLeuAlaHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyr202530LeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeuValLysGly354045ArgValProAspLysThrValArgTrpCysAlaValSerGluHisGlu505560<210>106<211>25<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建具有天然Tf分泌信号的质粒的引物<400>106ctgtgtctggcgcatcatgctgaag25<210>107<211>25<212>DNA<213>人工的<220><223>用于构建具有天然Tf分泌信号的质粒的引物<400>107cttcagcatgatgcgccagacacag25<210>108<211>30<212>PRT<213>人工的<220><223>用额外的N-末端His修饰的胰高血糖素<400>108HisHisSerGlnGlyThrPheThrSerAspTyrSerLysValLeuAsp151015SerArgArgAlaGlnAspPheValGlnTrpLeuMetAsnThr202530<210>109<211>43<212>PRT<213>人工的<220><223>用额外的N-末端Tyr修饰的GIP<400>109TyrTyrAlaGluGlyThrPheIleSerAspTyrSerIleAlaMetAsp151015LysIleHisGlnGlnAspPheValAsnTrpLeuLeuAlaGlnLysGly202530LysLysAsnAspTrpLysHisAsnIleThrGln3540<210>110<211>5<212>PRT<213>人工的<220><223>二肽基肽酶丝氨酸蛋白酶基序<400>110GlyTrpSerTyrGly15<210>111<211>6<212>PRT<213>人工的<220><223>运铁蛋白分泌信号序列<400>111ArgSerLeuAspLysArg15<210>112<211>6<212>PRT<213>人工的<220><223>运铁蛋白分泌信号序列<400>112ArgSerLeuAspArgArg15<210>113<211>6<212>PRT<213>人工的<220><223>运铁蛋白分泌信号序列<400>113ArgSerLeuGluLysArg15<210>114<211>6<212>PRT<213>人工的<220><223>运铁蛋白分泌信号序列<400>114ArgSerLeuGluArgArg15<210>115<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>DPP-抗性的N-末端<400>115HisHisAlaGlu1<210>116<211>4<212>PRT<213>人工的<220><223>DPP-抗性的N-末端<400>116GlyHisAlaGlu1<210>117<211>90<212>DNA<213>人工的<220><223>编码GLP-1(7-36)的DNA序列<400>117catgctgaaggtacttttacttctgatgtttcttcttatttggaaggtcaagctgctaaa60gaatttattgcttggttggttaaaggtaga90<210>118<211>118<212>DNA<213>人工的<220><223>具有GLP-1插入的pREX0052位点<220><221>CDS<222>(1)..(117)<400>118aggtctctagagaaaaggcatgctgaaggtacttttacttctgatgtt48ArgSerLeuGluLysArgHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspVal151015tcttcttatttggaaggtcaagctgctaaagaatttattgcttggttg96SerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeu202530gttaaaggtagggtacctgata118ValLysGlyArgValProAsp35<210>119<211>39<212>PRT<213>人工的<220><223>具有GLP-1插入的pREX0052位点<400>119ArgSerLeuGluLysArgHisAlaGluGlyThrPheThrSerAspVal151015SerSerTyrLeuGluGlyGlnAlaAlaLysGluPheIleAlaTrpLeu202530ValLysGlyArgValProAsp3权利要求1.治疗患者中的疾病或状况的方法，包括施用有效量的运铁蛋白(Tf)融合蛋白和至少一种第二试剂。2.权利要求1的方法，其中第二试剂选自DPP-IV抑制剂和神经内肽酶(NEP)抑制剂。3.权利要求1的方法，其中Tf融合蛋白易受DPP-IV清除。4.权利要求1的方法，其中Tf融合蛋白对DPP-IV清除敏感、具有抗性或具有部分抗性。5.权利要求1的方法，其中Tf融合蛋白包含一个或多个融合到Tf分子上的GLP-1肽。6.权利要求5的方法，其中Tf融合蛋白还包含接头。7.权利要求6的方法，其中接头为PEAPTD或(PEAPTD)2。8.权利要求5的方法，其中GLP-1肽位于融合蛋白的N-末端。9.权利要求5的方法，其中GLP-1肽是具有SEQIDNO32的GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)(SEQIDNO32的氨基酸1-30)。10.权利要求9的方法，其中GLP-1肽已经通过将A8突变为G进行修饰。11.权利要求9的方法，其中GLP-1肽已经通过将K34突变为A进行修饰。12.权利要求9的方法，其中GLP-1肽已经通过将A8突变为G和将K34突变为A进行修饰。13.权利要求12的方法，其中GLP-1肽通过接头(PEAPTD)2连接到Tf分子上。14.权利要求5的方法，其中Tf分子被修饰，以与完全糖基化的Tf分子相比其糖基化程度下降。15.权利要求5的方法，其中Tf分子被修饰以不显示糖基化。16.权利要求5的方法，其中Tf分子被修饰以包含至少一个防止糖基化的突变。17.权利要求5的方法，其中Tf分子被修饰，以与野生型Tf分子相比其对运铁蛋白受体(TfR)的亲和力降低。18.权利要求5的方法，其中Tf分子被修饰以不结合TfR。19.权利要求5的方法，其中Tf分子被修饰，以与野生型Tf分子相比其对铁的亲和力下降。20.权利要求5的方法，其中Tf分子被修饰以不结合铁。21.权利要求5的方法，其中Tf分子是乳运铁蛋白或黑素运铁蛋白。22.权利要求1的方法，其中该疾病是代谢疾病。23.权利要求22的方法，其中代谢疾病是前驱糖尿病、糖尿病或肥胖症。24.权利要求23的方法，其中糖尿病是II型糖尿病。25.权利要求1的方法，其中疾病是充血性心力衰竭。26.权利要求1的方法，其中疾病是过敏性肠综合症或消化不良。27.权利要求1的方法，其中有两种第二试剂。28.权利要求27的方法，其中两种第二试剂是DPP-IV抑制剂和NEP抑制剂。29.权利要求29的方法，其中两种第二试剂同时施用。30.权利要求1或29的方法，其中运铁蛋白融合蛋白和一种或多种第二试剂顺序施用。31.权利要求1或29的方法，其中运铁蛋白融合蛋白和一种或多种第二试剂同时施用。32.一种组合物，其包含运铁蛋白(Tf)融合蛋白和至少一种第二试剂。33.权利要求32的组合物，其中第二试剂选自DPP-IV抑制剂和神经内肽酶(NEP)抑制剂。34.权利要求32的组合物，其中Tf融合蛋白易受DPP-IV清除。35.权利要求32的组合物，其中Tf融合蛋白对DPP-IV清除敏感、具有抗性或具有部分抗性。36.权利要求32的组合物，其中Tf融合蛋白包含一个或多个融合到Tf分子上的GLP-1肽。37.权利要求36的组合物，其中Tf融合蛋白还包含接头。38.权利要求37的组合物，其中接头为PEAPTD或(PEAPTD)2。39.权利要求36的组合物，其中GLP-1肽位于融合蛋白的N-末端。40.权利要求36的组合物，其中GLP-1肽是具有SEQIDNO32的GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)(SEQIDNO32的氨基酸1-30)。41.权利要求40的组合物，其中GLP-1肽已经通过将A8突变为G进行修饰。42.权利要求40的组合物，其中GLP-1肽已经通过将K34突变为A进行修饰。43.权利要求40的组合物，其中GLP-1肽已经通过将A8突变为G和将K34突变为A进行修饰。44.权利要求43的组合物，其中GLP-1肽通过接头(PEAPTD)2连接到Tf分子上。45.权利要求32的组合物，其中Tf分子被修饰，以与完全糖基化的Tf分子相比其糖基化程度下降。46.权利要求32的组合物，其中Tf分子被修饰以不显示糖基化。47.权利要求32的组合物，其中Tf分子被修饰以包含至少一个防止糖基化的突变。48.权利要求32的组合物，其中Tf分子被修饰，以与野生型Tf分子相比其对运铁蛋白受体(TfR)的亲和力降低。49.权利要求32的组合物，其中Tf分子被修饰以不结合TfR。50.权利要求32的组合物，其中Tf分子被修饰，以与野生型Tf分子相比其对铁的亲和力下降。51.权利要求32的组合物，其中Tf分子被修饰以不结合铁。52.权利要求32的组合物，其中Tf分子是乳运铁蛋白或黑素运铁蛋白。全文摘要本发明提供包含运铁蛋白融合蛋白和DPP－IV抑制剂和/或神经内肽酶(NEP)抑制剂的组合治疗。运铁蛋白融合蛋白包含可用于疾病如糖尿病等疾病治疗中的治疗性的多肽或肽。文档编号A61K51/08GK101035568SQ200580033674公开日2007年9月12日申请日期2005年8月3日优先权日2004年8月3日发明者霍马扬·萨德吉,克里斯托弗·普赖尔,戴维·J·巴兰斯申请人:比奥雷克西斯技术股份有限公司