新型穿梭载体的制作方法

专利名称：新型穿梭载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及双歧杆菌属微生物与大肠杆菌的穿梭载体、在利用了该穿梭载体的双歧杆菌属微生物中能够表达所希望的基因的表达载体、经该穿梭载体转化了的双歧杆菌属微生物和以该双歧杆菌属微生物作为有效成分的抗肿瘤剂。
背景技术：
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是一种革兰氏阳性厌氧性细菌，其基因组的GC含量高(例如，参照非专利文献1)。这种长双歧杆菌为非病原性的，在人和其它动物的大肠中，构成正常的微生物群的大部分(例如，参照非专利文献2)。一般认为其具有提高免疫反应(例如，参照非专利文献3)，对癌症的发生具有抑制效果(例如，参照非专利文献4)，保护宿主不受病毒感染(例如，参照非专利文献5、6)，可能产生抗菌物质(例如，参照非专利文献7)等促进宿主的健康的特性。在双歧杆菌属中，有可以广泛应用于世界范围内的发酵乳制品的制备的菌株。
进而，希望双歧杆菌的质粒应用于益生菌载体、感染性患者的经口疫苗的载体。根据最近的报告已明确在全身给药后，长双歧杆菌积累于低氧的实体瘤中(例如，参照非专利文献8、9)，带有与长双歧杆菌hup启动子相融合的大肠杆菌codA的重组质粒pBLES100-S-eCD在微生物中表达胞嘧啶脱氨酶(例如，参照专利文献1及非专利文献10、11)。由此证明了重组长双歧杆菌对于酶-药物前体疗法有效。不过，虽然在食品、药品和产业中倍受关注，然而主要由于缺少可以以基因传递的有效地复制的系统，因此对它们的遗传的特性几乎不了解。
可以在前述重组质粒pBLES100-S-eCD的构建中使用的pBLES100是由长双歧杆菌BK51的pTB6和大肠杆菌的pBR322构建的穿梭载体(例如，参照非专利文献12)。所涉及的穿梭载体pBLES100以2.2×104个转化子/μgDNA的有效地转化长双歧杆菌，在该细胞中于结构和胞质分离方面趋于稳定(例如，参照非专利文献13)。可是，由于在转染时，存在着带有未修饰DNA的质粒在微生物中被限制性酶切断的可能性，因此在外源基因的克隆中需要更高的转化率。
专利文献1特开2002-97144号公报非专利文献1Scardovi，Bergey’s Manual of SystematicBacteriology vol 2，eds.Sneath等人，pp.1418-1434(1986)非专利文献2Mitsuoka，Elsevier Applied Science，pp 69-114(1992)非专利文献3Yasui等人，J.Dairy Sci.，74，1187-1195(1991)非专利文献4Reddy等人，Cancer Res.，53，3914-3918(1993)非专利文献5Duffy等人，Pediatr.Res.，35，690-695(1994)非专利文献6Saaverdra等人，Lancet.，344，1046-1049(1994)非专利文献7Ibrahim等人，J.Food Prot.，56，713-715(1993)非专利文献8Yazawa等人，Cancer Gene Ther.，7，269-274(2000)非专利文献9Yazawa等人，Breast Cancer Res.Treat.，66，165-170(2001)非专利文献10Nakamura等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.，66，2362-2366(2002)非专利文献11Fujimori等人，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.，5，200-203(2002)非专利文献12Matsumura等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212(1997)非专利文献13Matsumura等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212(1997)。

发明内容
发明要解决的问题双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体pBLES100，如上文所述，以2.2×104个转化子/μgDNA的有效地转化长双歧杆菌，在该细胞中于结构和胞质分离方面趋于稳定，但是由于在转染时，存在着带有未修饰DNA的质粒在微生物中被限制性酶切断的可能性，因此在外源基因的克隆中需要更高的转化率。本发明的课题在于提供在双歧杆菌属微生物中的宿主范围广、且在双歧杆菌属微生物中拷贝数多的、在作为表达载体使用时能够在双歧杆菌属微生物中高表达所希望的蛋白质的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体、在利用了该穿梭载体的双歧杆菌属微生物中能够表达所希望的基因的表达载体、经该表达载体转化了的双歧杆菌属微生物以及以该双歧杆菌属微生物作为有效成分的抗肿瘤剂。
用于解决课题的方法本发明人等测定了来源于长双歧杆菌BK51的质粒pTB6的全序列(3624bp；序列号1)，鉴定了含有该双歧杆菌属微生物的质粒复制原点OriV的几个基因序列。OriV是含有dso、sso的358bp的序列，发现来源于含有复制蛋白(RepB 693bp)的全长为约1900bp的pTB6片段可以作为“双歧杆菌属微生物的复制单元”来使用。并且，在含有OriV和RepB的一部分的单元中无法确认复制能力。此外，还发现在双歧杆菌属微生物中，作为选择标记的氨苄青霉素抗性基因的表达产物，尤其是其N末端区域的表达在扩大宿主范围方面并不理想，从而完成本发明。
也就是说，本发明涉及(1)双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，其具有含有pTB6的复制原点(oriV)-repB区域的、不含MembB、MobA、OrfI和oriT区域的源于pTB6的区域部分；和含有大肠杆菌的复制原点(oriC)区域的源于大肠杆菌的质粒部分；
(2)根据上述(1)记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，源于pTB6的区域部分含有序列号1的第305-1564位所示的碱基序列构成的1260bp的碱基序列的源于pTB6的区域部分；(3)根据上述(1)或(2)记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，含有大肠杆菌的复制原点(oriC)区域的源于大肠杆菌的质粒部分是不含氨苄青霉素抗性基因(ampR)或者缺失了编码氨苄青霉素抗性基因(ampR)的表达产物-β-内酰胺酶的N末端区域的DNA的质粒部分；(4)根据上述(1)至(3)任一项记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，双歧杆菌属微生物是长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)或青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)；(5)根据上述(1)至(4)任一项记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，其平均拷贝数为6-30；(6)根据上述(1)至(5)任一项记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，其为pAV001；(7)在双歧杆菌属微生物中能够表达所希望的基因的表达载体，该载体是在权利要求1至6任一项记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体中插入了在与编码来源于长双歧杆菌的组蛋白样DNA结合蛋白质(HU蛋白质)的基因的表达相关的启动子和终止子之间以符合阅读框方式连接所希望的基因的表达单元；(8)根据上述(7)记载的表达载体，其特征在于，所希望的基因是胞嘧啶脱氨酶基因；(9)经上述(7)或(8)记载的表达载体转化的双歧杆菌属微生物；(10)抗肿瘤剂，其特征在于，其以上述(9)记载的双歧杆菌属微生物作为有效成分；(11)源于pTB6的双歧杆菌属微生物的质粒复制单元，其特征在于，其含有pTB6的复制原点(oriV)-repB区域，不含MembB、MobA、OrfI和oriT区域；和(12)根据权利要求11记载的源于pTB6的双歧杆菌属微生物的质粒复制单元，其特征在于，其含有序列号1的第305-1564位所示的碱基序列构成的1260bp的碱基序列。


图1是表示质粒pTB6(3624bp)的直线图谱和oriV的结构的图。(a)表示推测基础上的RepB、MembB、MobA和推测的蛋白质OrfI。箭头表示翻译的方向，数字表示核苷酸的位置。(b)oriV中概略地表示sso中的两组IR(305至417)，以及dso中的一组IR(481至504)和DR的4个重复单元(三角形)(577-664)。图与比例尺没关系。
图2是表示RepB和oriT中的序列的图。排列了在RepB中区域1和区域2的氨基酸序列(a)以及oriV中DR(b)和IR(c)的核苷酸序列。序列上的数字表示pTB6的预测的RepB的氨基酸位置，点线上的数字表示该区域中氨基酸的数目。(b)中的核苷酸位置表示DR的基因座，排列了重复单元的核苷酸序列。(c)中的核苷酸位置表示IR的基因座，排列了这些序列。以点覆盖的长方形表示氨基酸或核苷酸的保守区域。
图3是表示MobA中的氨基酸序列和oriV中的核苷酸序列的图。(a)排列了pTB6的MobA的部分氨基酸序列(从氨基酸第1位至第27以及第121至145位)和MOBσ系统质粒RSF1010(从氨基酸第1位至第27以及第108至131位，委托号M28829)。*表示MotifI中与DNA的切断结合活性相关的活性Tyr和MotifIII中的3H基序。(b)排列了pTB6的推测基础上的oriV核苷酸序列第3454-3510，和RSF1010的oriT中的核苷酸序列第3169-3132。箭头标记表示特征的IR，箭头表示RSF1010的由MobA产生的nic位点。该序列的上部或下部的数字表示MobA的氨基酸位置或pTB6的核苷酸位置。用以点表示的长方形所覆盖的区域表示与一致的氨基酸相同的核苷酸序列。
图4是表示重构的质粒的直线图谱的图。在pUC18的PstI-FspII位点中插入pTB6(第1-1872位核苷酸)的PstI-FspI片段，获得了复合质粒。将含有spc的pBLES100的1.6kbp-HincII-HindIII片段与HindIII-SspI片段(4.0kbp)或复合质粒的HindIII-FspI片段(3.4kbp)连接，分别获得pBRASTA100(5.6kbp)或pBRASTA101(5.0kbp)。在BamHI位点和pBRASTA101的BamHI位点和HindIII位点插入pUC18的0.6kbp-SspI-FspI片段(以短下线和阴影线画成的长方形来表示)，分别获得pBRASTA102(5.6kbp)，pBRASTA103(6.2kbp)。除了在pUC18的PstI-HincII位点插入的是pTB6的PstI-FspIDNA片段(第1873-3624位核苷酸)而不是PstI-FspIDNA片段(第1-1872位核苷酸)之外，其余以与构建pBRASTA100相同的方法构建质粒pSSO30Sp(5.4kbp)。通过将含有spc(1.3kbp)的pBLES100的AatII-EcoRV片段与通过在pUC18的AatII-HincII位点中插入pTB6的DNA片段(第472-1872位核苷酸)构建的重组分子的AatII-FspI片段(1.4kbp)相连接，构建了质粒pDSO44Sp(4.3kbp)。阴影线形成的长方形表示sso和dso。图与比例尺无关。
图5是表示长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD和长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD的制备过程的图。
图6是表示长双歧杆菌中胞嘧啶脱氨酶蛋白质的表达量的比较结果的图。显示出长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD表达了长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD的2-8倍的胞嘧啶脱氨酶蛋白质。
图7是表示根据长双歧杆菌中胞嘧啶脱氨酶蛋白质的酶活性比较(5FC→5FU的变化活性比较)的结果获得的经时菌数变化的图。
图8是表示根据长双歧杆菌中胞嘧啶脱氨酶蛋白质的酶活性比较(5FC→5FU的变化活性比较)的结果获得的5-FU浓度的图。
图9图9的A是表示用限制性酶消化从长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD和长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD培养后的菌体中提取的DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离核酸，提供给用AlkPhos DirectLabelling Reagents(Amersham Bioscience公司制)进行的Southern分析法的结果。此外，图9的B是表示根据信号强度比较长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD和长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD的质粒拷贝数的结果的图。
具体实施例方式
作为本发明的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，如果是具有含有pTB6的复制原点(oriV；序列号1表示的碱基序列的第305-664位)-repB区域(序列号1表示的碱基序列的第872-1564位)，不含MembB(序列号1表示的碱基序列的第1543-2355位)、MobA(序列号1表示的碱基序列的第2212-3300位)、OrfI(序列号1表示的碱基序列的第3587-517位)和oriT区域(序列号1表示的碱基序列的第3454-3510位)的源于pTB6的区域部分，和含有大肠杆菌的复制原点(oriC)区域的源于大肠杆菌的质粒部分的穿梭载体，就没有特别的限制，但是优选含有序列号1的第305-1564位表示的碱基序列构成的1260bp的碱基序列的复制单元，例如序列号1的第305-1564位表示的碱基序列构成的1260bp的碱基序列的复制最小单元，序列号1的第1-1900位表示的碱基序列构成的1900bp的复制单元，序列号1的第1-2355位所示的碱基序列构成的2355bp的复制最大单元。这样，通过作为不含MembB、MobA、OrfI和oriT区域的更小单元来使用，可以提高宿主细胞内的拷贝数。此外，优选比可以按照Biosci.Biotech.Biochem.，61，1211(1997)记载的方法构建的长双歧杆菌和大肠杆菌的穿梭载体pBLES100的拷贝数增多的例如平均拷贝数为3-30，其中增多为6-30的穿梭载体。
此外，作为本发明的穿梭载体中含有大肠杆菌的复制原点(oriC)区域的源于大肠杆菌的质粒部分，优选不含有氨苄青霉素抗性基因(ampR)，即使含有，优选缺失编码其表达产物-β-内酰胺酶的N末端区域的DNA的部分。通过β-内酰胺酶的N末端区域的缺失表达，能够扩大在双歧杆菌属微生物中的宿主范围。
作为上述本发明的穿梭载体中的双歧杆菌属微生物，可以具体例举长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，短双歧杆菌(B.breve)，动物双歧杆菌(B.animalis)，两歧双歧杆菌(B.bifidum)。与之相对，在长双歧杆菌之外的其它双歧杆菌属微生物中没有发现前述穿梭载体pBLES100复制。
作为本发明的穿梭载体，可以适当例举实施例2中的穿梭载体pAV001。
作为本发明的源于pTB6的双歧杆菌属微生物的质粒复制单元，如果是具有含有pTB6的复制原点(oriV；序列号1表示的碱基序列的第305-664位)-repB区域(序列号1表示的碱基序列的第872-1564位)，不含MembB(序列号1表示的碱基序列的第1543-2355位)、MobA(序列号1表示的碱基序列的第2212-3300位)、OrfI(序列号1表示的碱基序列的第3587-517位)和oriT区域(序列号1表示的碱基序列的第3454-3510位)的源于pTB6的区域部分，就没有特别的限制，但是优选含有序列号1的第305-1564位表示的碱基序列构成的1260bp的碱基序列的复制单元，可以适当例举，例如序列号1的第305-1564位表示的碱基序列构成的1260bp的复制最小单元，序列号1的第1-1900位表示的碱基序列构成的1900bp的复制单元，序列号1的第1-2355位所示的碱基序列构成的2355bp的复制最大单元。
作为本发明的在双歧杆菌属微生物中能够表达所希望的基因的表达载体，如果是在上述本发明的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的双歧杆菌中插入了在与编码来源于长双歧杆菌的组蛋白样DNA结合蛋白质(HU蛋白质)的基因的表达相关的启动子和终止子之间以符合阅读框方式连接所希望的基因的表达单元，就没有特别的限制，而且，作为上述所希望的基因也没有特别的限定，但是可以适当例举编码具有抗肿瘤活性的细胞因子或血管新生抑制物质的基因，和编码能够将低毒性的抗肿瘤物质前体转换为抗肿瘤物质的酶(以下简称为转化酶)的基因。
作为这种表达单元中的启动子和终止子，在各个可以以序列号2表示的碱基序列中，可以适当例举碱基编号1-192表示的DNA、碱基编号472-600表示的DNA。具有与HU基因的表达相关的启动子和终止子的表达载体是通过用限制性酶从长双歧杆菌的DNA中切出HU基因，将其整合到克隆载体中，再向与HU基因的表达相关的启动子下游整合所希望的基因而制备的。通过使用与该HU基因的表达相关的启动子和终止子，可以使所希望的基因有效表达。HU基因的分离方法可以例举用限制性酶HindIII消化长双歧杆菌的染色体DNA的方法。更具体的是，首先用限制性酶HindIII消化长双歧杆菌的染色体DNA，通过苯酚处理、乙醇沉淀来纯化。另一方面，用HindIII消化pBR322(宝酒造公司制造)、脱磷酸化处理后，以同样方式纯化。连接各个DNA，获得重组体DNA。接着，使用该重组DNA按照常规方法转化大肠杆菌mH3[Gene，45，37(1986)]，获得显示出氨苄青霉素抗性且呈现四环素敏感性的转化子。按照常规方法从获得的转化子中提取质粒DNA，按照常规方法将该质粒DNA导入大肠杆菌YK2741株[Gene，89，133(1990)]，进行该菌株的转化。由于YK2741株缺失HU基因和IHF(integration host factor)基因，所以通过利用呈现低温敏感性的菌株，涂布于含有氨苄青霉素的琼脂培养基上于27℃培养可以选择转化子。接着，再培养上述获得的YK2741株的转化子，通过常规方法提取该株带有的质粒，按照常规方法将该质粒DNA导入大肠杆菌YK1340[J.Mol.Biol.，204，581(1988)]，进行该菌株的转化。对获得的转化子，按照常规方法进行Mu噬菌体的感染试验。YK1340株是HU基因的缺陷株，由于Mu噬菌体的增殖需要HU蛋白质，Mu噬菌体感染、增殖、溶菌的转化子可以作为带有源于长双歧杆菌的HU基因的菌株的有力候选。因此，通过选择显示出氨苄青霉素抗性且Mu噬菌体感染增殖、溶菌的菌株所带有的质粒，可以获得带有与源于长双歧杆菌的HU基因的表达相关的启动子和终止子的质粒pBLHU15。此外，作为所希望基因的导入部位，优选通过使用Nsv V和Hpa I而生成的部位。
作为编码具有上述抗肿瘤活性的细胞因子的基因，可以列举有干扰素(IFN)-α、β、γ，粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-27、肿瘤坏死因子(TNF)-α、淋巴毒素(LT)-β、粒集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞释放抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T细胞活性化共刺激因子B7(CD80)、B7-2(CD86)、キット配体、制瘤素M等，但是其中优选IL-2。此外，可以组合两种以上的上述物质，例如，优选组合IL-6和TNF-α、IFN-α、IFN-β或IFN-γ，组合TNF-α和IFN-γ，组合anti-Fas和IFN-γ。此外，可以有效利用内皮他丁、血管他丁、クリングル1，2，3，4，5、NK4等血管新生抑制物质作为细胞因子之外的具有抗肿瘤活性的物质。
作为编码上述转化酶的基因，可以例举如下。可以列举使用5-氟胞嘧啶(5-FC)作为肿瘤物质前体，5-氟尿嘧啶(5-FU)作为抗肿瘤物质，胞嘧啶脱氨酶作为转化酶的组合。还可以例举使用5-aziridino-2，4-dinitrobenzamide)[CB1954]作为抗肿瘤物质前体、已知能在双链DNA上产生交联键的烷化剂作为抗肿瘤物质，硝基还原酶作为转化酶的组合。此外，可以例举使用更昔洛韦(ganciclovir)作为抗肿瘤物质前体，其代谢物作为抗肿瘤物质，单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(herpes simplex virus typel thymidine kinase)[HSV1-TK]作为转化酶的组合。而且，进而，也可以使用通过葡萄糖醛酸结合(抱合)、甘氨酸结合或赖氨酸结合等修饰抗肿瘤物质使之作为在人体中呈低毒性的前体(包含非活性化体)，使用对该前体进行脱修饰的酶作为转化酶。作为对该前体进行脱修饰的酶，也可以使用原本公知的酶，例如，可以列举葡萄糖醛酸结合的抗肿瘤物质前体和β-葡糖醛酸糖苷酶作为转化酶的组合。
作为本发明的双歧杆菌属微生物，如果是经上述本发明的表达载体转化的双歧杆菌属微生物，就没有特别的限定，具体可以例举长双歧杆菌，青春双歧杆菌，两歧双歧杆菌，假长双歧杆菌(B.pseudolongum)，嗜热双歧杆菌(B thermophirum)，婴儿双歧杆菌(B.infantis)，动物双歧杆菌等。其中，优选使用已知与年龄无关的常存于人的肠内的长双歧杆菌，青春双歧杆菌，两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌作为宿主细胞，更优选使用长双歧杆菌。这些菌都是市售的，或者也可以从保藏机构容易地获得。例如，可以使用长双歧杆菌ATCC-15707，两歧双歧杆菌ATCC-11863，婴儿双歧杆菌ATCC-15697。
并且，上述本发明的质粒复制单元，穿梭载体，表达载体，转化双歧杆菌属微生物的制备可以按照市售的实验书例如基因手册，讲坛社(遺伝子マニュァル講談社)、高木康敬编基因操作实验法，讲坛社(遺伝子操作実験法講談社)，分子克隆(Molecular Cloning)[冷泉港实验室(1982)]，分子克隆第2版(Molecular Cloning，2nd ed.)[冷泉港实验室(1989)]，Methodsin Enzymol，194(1991)，实验医学分册·根据酵母的基因实验法羊土社(実験医学別冊·酵母にょる遺伝子実験法羊土社)(1994)等中记载的方法进行。
上述经转化的双歧杆菌属微生物只在存在于厌氧环境下的肿瘤组织中增殖，可以在肿瘤组织内表达具有抗肿瘤活性的物质，转化酶等。因此，这种经转化的双歧杆菌属微生物可以作为对具有厌氧环境的肿瘤，优选实体瘤的治疗有效的药物使用。作为本发明的抗肿瘤剂，如果是含有上述本发明的双歧杆菌属微生物作为有效成分的制剂，没有特别的限定。本发明的抗肿瘤剂的给药途径没有特别的限定，可以例举经口给药或非经口给药等，但是特别优选非经口给药。作为非经口给药，可以例举气管内、直肠内、皮下、肌肉内和静脉内等给药途径。作为适于口服给药的制剂的例子，可以例举，例如片剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、糖浆剂、溶液剂、胶囊剂或悬浊剂等，作为适合非经口给药的制剂的例子，可以列举，例如，注射剂、点滴剂、吸入剂、喷雾剂、栓剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂等。在本发明中优选作为注射剂，其中尤其是作为静脉内注射剂来使用。
上述经转化的双歧杆菌属微生物中可以进行原本公知的后处理。例如，可以通过离心分离等进行粗纯化。此外，可以根据需要进行粗纯化后，使之溶解或悬浮于生理盐水、PBS(磷酸缓冲生理盐水)或配合乳酸的林格溶液等本领域一直使用的溶剂中。此外，也可以根据需要进行冷冻干燥或喷雾干燥，使之形成粉状物或粒状物。
作为本发明的抗肿瘤剂，可以以上述经转化的双歧杆菌属菌的溶液或悬浮液，或者其粒状或粉状的干燥物直接给药。但是，一般而言，理想的是以含有作为有效成分的上述物质、和1种或2种以上的制剂用添加物的药物组合物的形式给药。这种药物组合物可以按照原本在制剂学领域中公知或常用的方法制备。
在适于口服给药的液体制剂的制备中，可以使用例如水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等糖类；聚乙二醇、丙二醇等醇类；芝麻油、橄榄油、大豆油等油类；p-羟基苯甲酸酯类等防腐剂等制剂用添加物。此外，在胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等固体制剂的制造中，可以使用例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖等赋形剂；淀粉，藻酸钠等崩解剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等结合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂。
适于非口服给药的制剂中注射剂和点滴剂等血管内给药用制剂可以优选使用与人血液等渗的水性溶剂来制备。例如，可以使用选自于盐溶液、葡萄糖溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合物的水性溶剂，按照常规方法与适当的助剂一起将注射剂制备成溶液、悬浮液或分散液。用于肠内给药的栓剂可以使用例如可可脂、氢化脂肪或氢化羧酸等载体进行制备。喷雾剂可以使用不刺激人口腔和气管粘膜并且可以使作为有效成分的本发明所涉及的双歧杆菌属微生物分散成微细的颗粒从而促进吸收的载体进行制备，作为这样的载体例如可以使用乳糖或者甘油。此外，可以制备成气雾剂或干燥粉末等形式的制剂。在非口服用的制剂的制备中可以使用选自于例如稀释剂、香料、防腐剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、表面活性剂、增塑剂等中的1种或2种以上的制剂用添加物。并且，本发明的抗肿瘤剂的形式及其制备方法不局限于上述具体说明的方法。
本发明的抗肿瘤剂的给药量和给药次数没有特别的限定，可以根据双歧杆菌属菌所具有的基因的种类，用于治疗的疾病的种类，给药途径，患者的年龄和体重，症状和疾病的严重程度等各种条件适当选择。例如，通过在静脉内注射全身给药时，优选成人平均每天约给药2×106-2×107个/人左右，在肿瘤内局部给药时，优选每1个肿瘤给药约5×108个左右。不过，给药量并不局限于这些特定的例子。
本发明涉及的抗肿瘤剂，可以使用于具有厌氧环境的肿瘤，优选各种实体瘤。作为实体瘤，可以例举例如大肠癌、脑肿瘤、头颈部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、胰岛细胞癌、绒毛膜癌、结肠癌、肾细胞癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、精巢癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、卵巢癌、子宫癌、绒毛膜癌、甲状腺癌、恶性增生性良性瘤、皮肤癌、恶性黑色瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、神经纤维细胞瘤、Wilm氏瘤、视网膜神经胶质瘤、黑色素瘤、扁平上皮癌等。
本发明的药物也可以与其它药物等一起合用。尤其是，在施用导入了编码转化酶的基因的双歧杆菌属菌时，必须施用抗肿瘤物质前体。但是，这种抗癌物质前体也可以与导入了编码转化酶的基因的双歧杆菌属菌一起制成一个制剂。此外，各个制剂也可以同时或分间隔地施用。而且，优选合用乳果糖(Lactulose)。乳果糖是双歧杆菌属菌的营养源，而且由于人、小鼠和猪无法代谢，因此通过给药乳果糖可以在肿瘤组织内特异性地增加双歧杆菌属菌的菌数。给药量优选为成人每天约24-48g/人左右，不限制给药次数。此外，本发明的药物可以与其它的抗肿瘤剂等组合使用。
本发明中涉及的施用给患者的双歧杆菌属菌可以用抗生素简单地除去。由于这提高本发明涉及的基因输送系统的安全性，因此十分重要。
以下，通过实施例对本发明更具体地进行说明，但是本发明的技术范围不局限于这些例示。
实施例1(质粒pTB6的结构分析)[材料和方法]1.菌株、质粒和培养基本发明使用的菌株和质粒例举于表1。LB肉汤培养基(10g的Bacto-tryptone)，5g酵母提取物，5gNaCl和0.1％葡萄糖/升)中，于37℃下好氧地培养大肠杆菌，使之在含有1.5％的琼脂的LB肉汤培养基中形成菌落。补充了50mM蔗糖，0.34％半胱氨酸，0.02％抗坏血酸钠的MRS肉汤培养基(Difco Laboratories公司制，美国)中，于37℃厌氧地培养长双歧杆菌105-A(参照非专利文献12)。根据需要添加抗生素(50μg/ml氨苄青霉素(Ap)和/或75μg/ml的大观霉素(sp))。按照非专利文献12记载的方法，使用Gas-Pak厌氧系统(BBL公司制，美国)，使之在含有1.5％琼脂的培养基上形成菌落。
本研究中使用的细菌菌株和质粒

*)Sambrook，J.E.，Fritsch，F.，and Maniatis.T.，In“Molecular cloningalaboratory manual”2nd，eds.Cold Spring Harbor Laboratory，New York，(1989).
**)Matsumura.H.，Takeuchi，A.，ando Kano，Y.，Construction of Escherichiacoli-Bifidobacterium longum shuttle vector transforming B.longum 105-A and108-A.Biosci.Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212(1997).
2.质粒DNA的分离和分子操作按照附带的手册中记载的步骤，使用Qiagen Plasmid试剂盒(QIAGEN公司制，美国)，用改良的碱溶菌法提取质粒DNA。用0.9％的NaCl洗涤长双歧杆菌，用碱溶菌前用溶菌酶(1mg/ml)于37℃处理30分钟，在苯酚处理前用蛋白酶K(0.1mg/ml)于37℃处理15分钟。
按照非专利文献12记载的方法，制备长双歧杆菌感受态细胞。用50mM的缓冲蔗糖液洗涤对数期的后期的细胞3遍，再次悬浮于为原来的培养物体积的约1/100的冰浴的甘油(10％v/v)中。此外，按照文献(Takeuchi等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.66，598-603(2002))记载的方法，制备感受态大肠杆菌。按照非专利文献12记载的方法，以200Ω的平行电阻，2.5kV/cm和25μF使用GenePulser装置(Bio-Rad Labs.公司制，美国)，使用100ng的质粒DNA和50μl的细菌液进行电转染。
采用GeneAmp PCR系统9600和LATaq聚合酶(Takara公司制)进行DNA的扩增。使用两条引物[5’-GGCCGGAATTCTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCC-3’(序列号3)和5’-GGCCGGAATTCAGTACTCATATATACTTTAGATTGATTTA-3’(序列号4)]，通过PCR从pUC18扩增ColElori。接着，为了构建pBRASTA102，使用两条引物[5’-GCGGCGGATCCATTGAAAAAGGAAGAGTAT-3’](序列号5)和5’-CGGCCGGATCCTGCGCAACGTTGTTGCCAT-3’](序列号6)。此外，为了构建pBRASTA103，使用两条引物[5’-GCGGCAAGCTTATTGAAAAAGGAAGAGTAT-3’](序列号7)和[5’-CGGCCAAGCTTTGCGCAACGTTGTTGCCAT-3’](序列号8)，从pUC18扩增接近amp的启动子的一半。其它的DNA操作完全按照文献(Sambrook等人，Molecular cloninga laboratory manual 2ndeds.Cold SpringHarbor laboratory(1989))中记载的方法进行。
3.DNA测序和序列分析使用PstI切断pBLES100，制备pTB6的全长DNA(3.6kbp)，Sau3AI或AluI进行解析后，亚克隆到pUC18的多克隆位点。用ALF expressII DNA sequencer和Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit或Thermo Sequenase CyTM 5 Dye Terminator Cycle SequencingKit(Amersham Pharmacia Biotech公司制)进行测序，用DNASIS-Macv2.2和GENETYX-MAC软件实施利用计算机的序列的排列和序列分析。在同源性检索中使用FASTA和BLAST服务器。
1.质粒的构建测定穿梭质粒pBLES100的构成元件-长双歧杆菌BK51的pTB6的完整的核苷酸序列(3624bp)。根据数据库检索预测在pTB6(图1a)中有4个开放性阅读框(Orf)，即RepB(872-1564)，MembB(1543-2355)，MobA(3300-2212)，假定的蛋白质OrfI(3587-517)。pTB6的GC含量为65.1摩尔％，其水平就是长双歧杆菌的基因组DNA和质粒DNA中通常观察到的水平。
pTB6的全长核苷酸序列显示出与属于滚环复制型(RCR型)质粒家族组1的长双歧杆菌的质粒-pKJ36(3625bp)和pB44(3624bp)具有95％的同源性，与pNAC2(3684bp)具有92％的同源性，与pBLO1(3626bp)具有89％的同源性。检测出与1组质粒pDOJH10L(10073bp的5308-8999)也具有高达92％的同源性(表2)。
氨基酸同源性和氨基酸一致性

数字表示与pTB6的核苷酸同源性和氨基酸一致性的百分比。
*；除了pDOJH10L的5308-8999位核苷酸位点与pTB6的全核苷酸序列对比之外，其余的质粒的全序列均与pTB6(3624bp)进行了对比。**；将第1-230位氨基酸的RepB的氨基酸序列(pKJ36)，第54-283位氨基酸的RepB的氨基酸序列(pB44)，第54-281位氨基酸的RepB的氨基酸序列(pNAC2，pDOJH10L和pBLO1)，与pTB6的完整的RepB氨基酸序列(230个氨基酸)进行了比较。pKJ36，pB44，pNAC2，pDOJH10L和pBLO1的完整RepB的氨基酸数目分别为230，299，297，297，297。***；将pB44的Orf，pNAC2的OrfIII，pDOJH10L的OrfII，pBLO1的OrfI与OrfI进行了比较。-；与OrfI同源的OrfI尚未被报道。质粒的DNA序列的GenBank登录号和质粒的核苷酸大小分别是pKJ36(3625bp)为AF139129，pB44(3624bp)为AY066026，pNAC2(3684bp)为AY112723，pDOJH10L(10073bp)为AF538868，pBLO1(3626bp)为AF540971。
2.RepB和oriVpTB6的预测的Orf的氨基酸一致性示于表2。RepB(230个氨基酸(aa))相对于pKJ36的全长RepB(230个氨基酸)，pB44的RepB的第54-283位氨基酸区域，和pDOJH10L的RepB的第54-281位氨基酸区域，pNAC2和pBLO1分别显示出92％，91％，90％，89％，81％的一致性。两个局部位点-区域1(第117-138位氨基酸)和区域2(第183-188位氨基酸)在这些质粒中不保守(图2a)。
复制原点oriV由dso(双链起始点)和sso(单链起始点)构成，是前导链和滞后链的复制起始所必需的(Del Solar等人，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，62，434-494(1998))。推定该复制原点位于pTB6的第305和664位核苷酸之间的区域(图1b)。用sso检测出IR的2组(305-417)，用dso检测出IR(481-504)和DR(577-644)(图1b)。除最后的1个在3’末端具有T之外，DR由四个相同的22mer(5’-AACCTACACCAAAAGGGGAGCG-3’；序列号9)构成，11个核苷酸5’-CAAA-3’和5’-GGAGCG-3’在pKJ36，pB44，pNAC2，pDOJH10L，pBLO1的DR中保守(图2b)。dso中IR的核苷酸序列除了环区域的两个核苷酸之外，在这些质粒中保守(24个核苷酸中的22个)(图2c)。
3.MobA和oriTMobA是用于接合性地移动的质粒的最初的DNA加工蛋白质(Becker等人，J.Bacteriol.，185，3538-3546(2003))。pTB6的推测基础上的MobA的相对于pKJ36，pB44，pNAC2，pBLO1，pDOJH10L的氨基酸一致性分别相为85％，85％，58％，57％和46％(表2)。pTB6的MobA对于MOBΩ家族的质粒RSF1010的MobA也显示出显著的类似性(Francia等人，FEMS Microbiol.Rev.，28，79-100(2004))。DNA切断-结合作用中相关的基序I(Francia等人，FEMS Microbiol.Rev.，28，79-100(2004))的酪氨酸残基，和辅助由基序I进行的转移的开始的基序III的3H基序在pTB6的MobA中保守(图3a)。RSF1010的oriT中，与反向重复相邻的13mer核苷酸序列，5’-GTAAGTGCCGCCCT-3’(序列号10)被MobA切断(图3b)，但是第3454-3510位核苷酸显示出与RSF1010(Francia等人，FEMS Microbiol.Rev.，28，79-100(2004))的oriT中发现的结构类似的结构。根据这些结果预测pTB6的oriT在13mer序列的nic部位上被pTB6表达的MobA切断。
4.MembB和OrfIpKJ36和pDOJH10L的MembB与pTB6推测基础上的MembB分布显示出88％和57％的氨基酸一致性。pTB6的推测基础上的OrfI由184个氨基酸构成，对于pB44的Orf，pNAC2的OrfIII，pDOJH10L的OrfII和pBLO1的OrfI，显示出相当低的氨基酸一致性(30％-31％)(表2)。尚不了解这些蛋白质的功能。
5.质粒的复制所必需的区域为了了解质粒复制的控制，了解质粒的复制所必需的DNA区域是非常重要的。本发明人等构建了由pUC18，pTB6的oriV-repB区域(第1-1872位核苷酸)和pBLES100的spc(1.1kbp)构成的重组质粒(表3，图4)。从大肠杆菌HMS174中提取其结果产生的质粒pBRASTA100和pBRASTA101，使之转移到长双歧杆菌105-A中。如表3所示，这些质粒均有效地转化长双歧杆菌。质粒pBRASTA100有效地转化长双歧杆菌105-A(5.9×104转化子/μgDNA)。这与已经报道的pBLES100(2.2×104转化子/μgDNA)一样均为高效率。在pBRASTA101的情况下发现了比pBRASTA100高40倍的优良的转移效率(2.5×106转化子/μgDNA)。这些质粒在结构和胞质分离方面，在转化子中趋于稳定。此外，由pUC18，pTB6dso-repB和spc构成的sso缺失型pDSO44Sp(表3，图4)以1.3×106转化子/gDNA的高效率转化长双歧杆菌(表3)。另一方面，带有mobA和membB的一部分(1873-3624b)，但不具有orfI，oriV和repB的重组质粒pSSO30Sp完全无法转化长双歧杆菌(表3)。根据这些结果，得到以下结论pTB6在长双歧杆菌中的复制时，只有dso-repB区域的存在时就已足够，sso区域是非必需的。
以质粒转化长双歧杆菌

由大肠杆菌HMS174制备质粒，转移到长双歧杆菌105-A中。在Sp.的存在下在琼脂平板上选择转化子；N.D.；没有检测到转化子。
6.长双歧杆菌的高效转化如上所述，可知质粒pBRASTA101以超过pBRASTA100的40倍的高效率或超过pBLES100的100倍的高效率转化了长双歧杆菌。pBRASTA100和pBLES100带有正常的amp，pBRASTA101具有邻近于启动子的amp的一半的缺失变异(0.6kbp-SspI-FspIDNA片段的缺失)。为了确认amp中的缺失实际上对转化的影响，在pBRASTA101的BamHI位点中插入该0.6kbp片段，从大肠杆菌HMS174中提取作为结果获得的pBRASTA102(图4)，使之转移到长双歧杆菌105-A中。如表3所示，使用pBRASTA102获得了与使用pBRASTA100时几乎相同的转化率(7.5×104个转化子/μgDNA)。pBRASTA103通过在pBRASTA102的HindIII位点处插入0.6kbp片段构建而成，因此该质粒中存在两个这种片段的拷贝(图4)，转化能力与片段的拷贝数按比例地进一步降低。使这些质粒转化大肠杆菌HMS174时，没有发现这种转化率的降低。虽然由0.6kbp-DNA引起的质粒的限制的准确机制还不清楚，但是根据这些结果提示转化移入到长双歧杆菌105-A中的0.6kbp-DNA被切断，限制了质粒的复制。
在本发明中，测定长双歧杆菌质粒pTB6的核苷酸序列，预测推测基础上的Orf的氨基酸序列。根据序列分析，可知pTB6是由Corneau等人报道(Plasmid，51，87-100(2004))的RCR质粒家族组1中相关的质粒。这清楚地提示，由于组1的质粒，尤其是pKJ36与pTB6repB的高氨基酸一致性和oriV核苷酸序列的高同源性，因此pTB6通过滚环机制复制。
在pTB6的推测基础上的oriT基础上鉴定MOBΩ系统的质粒的oriT中保守的核苷酸序列。此外，在pTB6中还发现推测基础上的MobA中的基序I和基序III与MOBΩ系统的质粒的基序I和基序III具有显著的类似性。根据这些结果，提示因子再提供给宿主细胞或其它质粒时，可使pTB6移动。从这些方面，确信除了membB和orfI外，OriT和mobA缺损的质粒pBRASTA101和pDSO44Sp作为基因转移的安全的媒介是有用的。
最近，Nakamura等人和Fujimori等人使用pBR322和pTB6的复合质粒pBLES100，成功地使大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶基因(codA)在长双歧杆菌中表达。由此表明，pTB6在长双歧杆菌中外源基因的表达中是有用的载体。但是，已知双歧杆菌产生位点特异性核酸内切酶，因此，在导入到双歧杆菌时，存在非修饰DNA受损的情况(Khosaka等人，Gene.17，117-122(1982)，Khosaka等人，FRBS Lett.，14，63，170-174(1983)，Khosaka等人，Gene 31，251-255(1984)，Skrypina等人，Mol.Gen.Mikrobiol.Virusol.，5，15-16(1988))。小型质粒pBRASTA101和pDSO44Sp缺失oriT和mobA，具有高转化能力，因此本发明人等确信其在用于长双歧杆菌中克隆外源基因、使之表达中是实用的。
实施例2(穿梭载体pAV001的构建)[质粒的构建]从pBLES100通过PCR扩增含有来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的大观霉素腺嘌呤转移酶(AAD盒)的序列，亚克隆于pCR-BluntII-TOPO载体中(Invitrogen公司制)，制备出pCRTOPO-ScaI-AAD-Eaml105I。并且，分别在正向引物上添加ScaI，在反向引物上添加Eaml105I限制性酶切位点。
如图5所示，从Invitrogen公司购买的克隆载体pGFPuv(DEFINITIONCloning vector pGFPuv.登录号U62636版本U62636.1 GI1490528)由GFPuv基因和其两端的多克隆位点(Multi-Cloning Site、MCS)，氨苄青霉素抗性基因，大肠杆菌质粒复制原点的OriC(pUC Ori)构成。
使用限制性酶Eaml105I和ScaI切断该pGFPuv的氨苄青霉素抗性基因位点，制备除去的长片段。同样，使用限制性酶Eaml105I和ScaI，切断pCRTOPO-ScaI-AAD-Eaml105I，制备含有AAD盒的片段(约1100bp)。使用T4DNA连接酶连接上述两个片段，制备pGFPuv-SpR。并且，通过大肠杆菌确认制备的质粒pGFPuv-SpR的大观霉素抗性的赋予且同时确认氨苄青霉素抗性性质的缺失。
用限制性酶SalI(存在于GFPuv基因上游的多克隆位点)和SpeI(存在于GFPuv基因下游的多克隆位点)消化pGFPuv-SpR，制备出去除了GFPuv基因的质粒pAVN。
根据实施例1获得的来源于长双歧杆菌的质粒pTB6的全碱基序列信息，将含有RepB，SDO，DDO，AT富集重复，DnaA结合基序的约1900bp的序列鉴定为长双歧杆菌的质粒复制单元。
通过PCR从pTB6扩增含有长双歧杆菌的质粒复制单元的约1900bp，亚克隆于pCR-BluntII-TOPO载体中，制备出pCRTOPO-ApaI-1900-ScaI。并且，分别在正向引物上添加ApaI限制性酶位点，在反向引物上添加ScaI限制性酶位点。
用T4DNA连接酶连接用限制性酶ApaI和ScaI消化的pAVN的长片段(约2400bp)和同样用限制性酶ApaI和ScaI消化的pCRTOPO-ApaI-1900-ScaI的短片段(约1900bp)，制备出长双歧杆菌-大肠杆菌穿梭载体pAV001(约4300bp)。
实施例3(胞嘧啶脱氨酶基因表达载体pAV001-HU-eCD)[表达载体的构建]接着，用限制性酶HindIII和SpeI切断pBLES100-S-eCD，放出含有HU基因启动子、来源于大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶基因和HU基因中终止子的约2900bp。同样，使用T4DNA连接酶将上述约2900bp片段连接于在位于多克隆位点的限制性酶切位点用HindIII和SpeI切断的穿梭载体pAV001的长片段上，制备出pAV001-HU-eCD(约7100bp)。
制备分别导入了本次制备的pAV001-HU-eCD和pBLES100-S-eCD的长双歧杆菌，长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD和长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD，通过PCR确认了各质粒的存在。从分别于MRS培养基(OXID)在37℃于厌氧条件下传代培养长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD和长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD两天以上的培养液中通过离心分离分离菌体(1×109CFU)，用Puregene DNA Isolation试剂盒(GentraSystems公司制)提取总DNA。用限制性酶HindIII和Eco81I消化上述的回收的总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离核酸，用AlkPhos DirectLabelling试剂(Amersham Bioscience公司制)通过Southern分析法比较质粒的拷贝数(参照图9的A)。并且，作为信号的感光法，在X射线胶片上感光以碱性磷酸酶使之化学发光的核酸。信号强度的比较，用凝胶扫描系统(ATTO公司制)扫描经感光的X射线胶片，用CS分析仪扫描分析图像，求出质粒的拷贝数，结果发现，pBLES100-S-eCD的质粒拷贝数为约3.26个/细胞，而pAV001-HU-eCD的质粒拷贝数为约11.68个/细胞，pAV001-HU-eCD的质粒拷贝数为pBLES100-S-eCD的约3.6倍，发现与pBLES100-S-eCD相比，pAV001-HU-eCD的质粒复制数中有显著的差异(参照图9B)。
从分别于MRS培养基37℃厌氧条件下传代培养长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD和长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD两天以上的培养液中通过离心分离分离菌体(1×109CFU)，超声波破碎后，分别提取菌体内蛋白质。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离上述提取的蛋白质，通过Western分析法比较胞嘧啶脱氨酶蛋白质的信号强度。并且，分别使用兔抗胞嘧啶脱氨酶单克隆抗体(Sawaday Technology公司制)作为第一抗体，使用辣根过氧化物酶-抗兔免疫球蛋白G复合体(SantaCruz Biotechnology，Inc公司制)作为第二抗体。作为信号的感光法，在通过ECL法使之发光的X射线胶片上感光。信号强度的比较，用凝胶扫描系统(ATTO公司制)扫描经感光的X射线胶片，用CS分析仪(software，ATTO公司制)分析扫描图像，比较表达量。结果示于图6。根据信号强度的比较，清楚了长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD表达了长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD的2-8倍的胞嘧啶脱氨酶蛋白质。
从分别于MRS培养基于37℃厌氧条件下传代培养长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD(D)和长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD(B)，和作为对照的长双歧杆菌的野生株(A)，和没有导入胞嘧啶脱氨酶基因的长双歧杆菌::pAVN(C)两天以上的培养液中通过离心分离分离菌体(2×109CFU)，再次悬浮于4.5ml的MRS培养基中。接着，以2mg/ml的终浓度添加0.5ml的5FC(20mg/ml)，于37℃厌氧条件下培养。从0，4，8，18，24小时时的培养液中通过离心分离除去菌体，回收各个上清，通过气相色谱分析(5FU GC-MS法，BML)测定转化的5FU浓度。经时菌数变化示于图7，5-FU浓度示于图8。分析的结果可知4小时后为约1.83倍，8小时后为约1.52倍，18小时后为约1.34倍，24小时后为约1.57倍，平均为1.57倍的长双歧杆菌::pAV001-HU-eCD(D)，比长双歧杆菌::pBLES100-S-eCD(B)的5FU转化量多。
(向胞嘧啶脱氨酶基因表达载体pAV001-HU-eCD的双歧杆菌属导入基因)制备了通过电穿孔法在表4所示的菌株中导入胞嘧啶脱氨酶基因表达载体pAV001-HU-eCD的重组双歧杆菌。


现在，longum中包括作为longum的亚种的infantis和lactenis，而以往已知其为双歧杆菌属的个别的菌种。
(重组双歧杆菌的胞嘧啶脱氨酶活性的测定)从各个重组双歧杆菌的培养后的培养液中离心分离菌体，悬浮于含有50mM的HEPES的缓冲液中，用超声破碎机破碎菌体。然后，离心分离该破碎液，将除去不要的级分的上清作为蛋白提取试样。取出相当于0.05mg总蛋白量的蛋白提取试剂液，以总体积为250μl准确加入缓冲液，在准确加入250μL的20mM 5FC溶液，于37℃的水浴中温浴60分钟。在其中加入三氯乙酸提取后，由氢氧化钠中和的试样，用HPLC测定生成的5FU量和残留的5FC量。进行两次用HPLC进行的测定，确认测定误差少。
使用新型穿梭载体pAV001的胞嘧啶脱氨酶基因表达载体pAV001-HU-eCD可以导入于表4中的5株菌株中。而且，该导入基因-胞嘧啶脱氨酶在作为具有实际活性的蛋白质高表达，而且活性高(参照表5)。


工业上利用的可能性根据本发明，可以获得双歧杆菌属微生物中宿主范围广且在双歧杆菌属微生物中拷贝数多、在作为表达载体使用时可以在双歧杆菌属微生物中高表达所希望的蛋白质的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，以及利用了该穿梭载体的在双歧杆菌属微生物中能够表达所希望的基因的表达载体，以及经该表达载体转化了的双歧杆菌属微生物，以及以该双歧杆菌属微生物作为有效成分的抗肿瘤剂。
序列表<110>Anaeropharma Science<120>新型穿梭载体<130>2005C3023<150>JP2004-339677<151>2004-11-24<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3624<212>DNA<213>长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)<400>1gataggcagg ccagctcaag gcccgcgaga acgacctcgt ggcgcggcgc agggaacgcg 60aacgcaaggc ccgcaccaag cgcctgatcg aggtcggcgc gatggccgag tcggccgcgg120gcttcgaggg aggcgacgag agggccaagg agcacatcgc ccgcctcgtg cagctcggct180ccctggtgga gtccctgtgc tccaccgacg tgatggccaa ctacacgagc cgcgaggacc240tcagggccac cgtcgccaag gctctggaac acaacgtcag gaccagcgat ggcatgaact300ggaacctcca ggacctcgtc tacgaggcgc tgagcgagga atggcgcaaa agggacggcg360agatcagcga cccatgggcc aacgacgagg cggacggata ccagccgccc tcatacgagc420
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<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ggccggaatt ctgagcaaaa ggccagcaaa aggcc35<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ggccggaatt cagtactcat atatacttta gattgattta 40<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5
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<223>引物<400>6cggccggatc ctgcgcaacg ttgttgccat 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gcggcaagct tattgaaaaa ggaagagtat 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>8cggccaagct ttgcgcaacg ttgttgccat 30<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9aacctacacc aaaaggggag cg 22<210>10<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10gtaagtgcgc cct1权利要求
1.双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，其具有含有pTB6的复制原点oriV-repB区域，不含MembB、MobA、OrfI和oriT区域的源于pTB6的区域部分，和含有大肠杆菌的复制原点oriC区域的源于大肠杆菌的质粒部分。
2.根据权利要求1记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，源于pTB6的区域部分是含有序列号1的第305-1564位所示的碱基序列构成1260bp的碱基序列的源于pTB6的区域部分。
3.根据权利要求1或2记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，含有大肠杆菌的复制原点oriC区域的源于大肠杆菌的质粒部分是不含氨苄青霉素抗性基因ampR或者缺失了编码氨苄青霉素抗性基因ampR的表达产物—β-内酰胺酶的N末端区域的DNA的质粒部分。
4.根据权利要求1至3任一项记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，双歧杆菌属微生物是长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)或青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)。
5.根据权利要求1至4任一项记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，其平均拷贝数为6-30。
6.根据权利要求1至5任一项记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体，其特征在于，其为pAV001。
7.在双歧杆菌属微生物中能够表达所希望的基因的表达载体，该载体是在权利要求1至6任一项记载的双歧杆菌属微生物和大肠杆菌的穿梭载体中插入了在与编码来源于长双歧杆菌的组蛋白样DNA结合蛋白质(HU蛋白质)的基因的表达相关的启动子和终止子之间以符合阅读框地连接所希望的基因的表达单元。
8.根据权利要求7记载的表达载体，其特征在于，所希望的基因是胞嘧啶脱氨酶基因。
9.经权利要求7或8记载的表达载体转化的双歧杆菌属微生物。
10.抗肿瘤剂，其特征在于，其以权利要求9记载的双歧杆菌属微生物作为有效成分。
11.源于pTB6的双歧杆菌属微生物的质粒复制单元，其特征在于，含有pTB6的复制原点oriV-repB区域，不含MembB、MobA、OrfI和oriT区域。
12.根据权利要求11记载的源于pTB6的双歧杆菌属微生物的质粒复制单元，其特征在于，其含有序列号1的第305-1564位所示的碱基序列构成1260bp的碱基序列。
全文摘要
本发明提供在双歧杆菌属微生物(BM)中的宿主范围广且拷贝数多、在作为表达载体使用时可以高表达所希望的蛋白质的BM和大肠杆菌的穿梭载体；利用该穿梭载体的BM中能够表达所希望的基因的表达载体；经该表达载体转化的BM；和以该BM作为有效成分的抗肿瘤剂。本发明构建了平均拷贝数为6－30的BM和大肠杆菌的穿梭载体，该载体具有下述两部分含有pTB6的复制原点(oriV)－repB区域，不含MembB、MobA、OrfI和oriT区域的源于pTB6的区域部分，和含有大肠杆菌的复制原点(oriC)区域，缺失了编码氨苄青霉素抗性基因(ampR)的表达产物－β－内酰胺酶的N末端区域的DNA的源于大肠杆菌的质粒部分。
文档编号A61K35/74GK101065482SQ200580040078
公开日2007年10月31日 申请日期2005年11月24日 优先权日2004年11月24日
发明者加纳康生, 滨地芳典, 藤森实, 佐佐木贵之, 河野享子, 天野纯, 谷口俊一郎 申请人:阿内罗药物科学株式会社