专利名称：氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法，属于医药领域。
背景技术：
羟基喜树碱(hydroxycamptothecin，HCPT)是从中国珙桐科植物喜树中提取出来的生物碱，具有较强的细胞毒活性，可用于治疗多种恶性肿瘤，对腹水型肝癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌等有明显的疗效，在临床上被广泛应用。因其难溶于水，常将其内酯环打开形成钠盐制备成注射液而应用于临床，但其在体内代谢很快，半衰期仅5min。同时，在临床使用时发现其在发挥其抗肿瘤活性的同时，还产生骨髓抑制、呕吐和腹泻等严重副作用，导致药效显著降低且毒副作用增加。同时，喜树碱类药物的内酯结构是它们作用于靶酶的必要结构，内酯开环后形成的钠盐虽在生理条件下(pH7.4)可部分闭环转化成为内酯型而发生药效，但其只占总药量的10％～20％。
为提高HCPT疗效，同时降低其毒副作用，现国内外药学研究者将HCPT进行了剂型改革，已有HCPT微球、脂质体、纳米乳、固体脂质纳米粒等研制的报道。近年来，纳米脂质体作为一种新型药物传递系统，在提高药物溶解度、增加药物稳定性、降低药物副作用、缓控释给药和基因传输等方面有着广泛的应用。
但普通脂质体在体内易被单核巨噬细胞(MPS)吞噬，在血液循环中的滞留时间较短，药物的靶向释放减少。当脂质体粒径小于100nm，在血循环时间较长，但若粒径大于200nm，则易被巨噬细胞作为外来异物而吞噬，脂质体在体内循环时间很短。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法，该氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体具有高效、低毒、长循环的优点。
实现本发明目的的技术方案为一种氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体，该纳米脂质体含有氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱，平均粒径在0～100nm之间，脂质体基本组分为卵磷脂∶胆固醇2～4∶1，羟基喜树碱药物∶类脂1∶15～25，羟基喜树碱药物浓度为0.4～0.6mg/mL，水化介质为pH5.0～7.8的磷酸盐缓冲液。
且氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体为冻干品，含有5～15％(W/V)的冻干保护剂，冻干保护剂可用海藻糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、乳糖。
本发明还提供了制备氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体的方法，其具体步骤如下(1)、采用薄膜分散法制备羟基喜树碱脂质体，按处方量精密称取磷脂与胆固醇，溶解于足量含α-生育酚0.5～5mg·mL-1的氯仿溶液中，得类脂溶液，再加入处方量的羟基喜树碱甲醇溶液，转移至茄形瓶中，25～50℃恒温水浴中，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，以溶解有冻干保护剂的水化介质于25～50℃水化类脂薄膜，形成粗悬液，旋涡轻轻振摇，超声处理。
(2)、取药用壳聚糖适量，按摩尔比为HCl∶CS＝1.2～6∶1加到0.1～0.5mol/L的稀HCl中，加完后继续搅拌20～40min，超声脱气5～10min，再静置溶胀10～30min，然后加丙酮沉淀，边加边搅拌，将沉淀完全的氯化壳聚糖抽滤，并用少量丙酮洗2-3次，抽干后进行冷冻干燥，即得白色海绵状氯化壳聚糖。
(3)、取出制备好的脂质体粗悬液，以1～3mL/min的速度恒速滴加到40～120mL的0.1～0.5％(w∶v)的氯化壳聚糖溶液中，匀速搅拌，待脂质体全部滴加完毕再继续搅拌10～30min，即得混悬状氯化壳聚糖包衣脂质体，将所得包衣脂质体经高压均质机在140～280M Pa压力下经50～100nm膜挤压乳匀6～10次。
(4)、加入5～15％(W/V)冻干保护剂后，取包衣脂质体悬浮液装入小西林瓶中，以10～20K/min的降温速度降至-80～-65℃并预冻24～36h，再在压力5～8Pa，搁板温度-15～20℃的条件下冷冻干燥24～48小时，加盖即得氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体粉末状冻干品。
为解决普通脂质体在体内易被单核巨噬细胞(MPS)吞噬，在血液循环中的滞留时间较短，药物的靶向释放减少这一问题题，本发明采用了减小粒径，做成纳米脂质体，即将脂质体平均粒径控制在在0～100nm.之间；以及用氯化壳聚糖对脂质体进行包衣，在脂质体表面高度修饰，形成立体保护作用，使脂质体不被血液中的调理素识别、摄取，从而使脂质体清除速度减慢，血液中滞留时间延长。包衣脂质体与普通脂质体相比依包衣材料不同具备如下优势(1)增加长循环效果(延长药物t1/2)；(2)延缓或稳定药物释放；(3)增加制剂的主动靶向性；(4)增加生物粘附力；(5)促进药物的吸收。
而且本发明用壳聚糖的水溶性衍生物——氯化壳聚糖(Chitosan chloride，CS-Cl)作包衣，不仅可显著改善包衣材料的溶解性能，并由于静电作用可增加包衣脂质体对肿瘤细胞的靶向性。同时能增加脂质体膜的稳定性，缓慢释放药物，且脂质体乳匀到纳米级(粒径小于100nm)，在体内可以逃匿MPS的捕获，延长脂质体在血液循环中的滞留时间，达到缓释，靶向，长效的作用。
本发明将纳米技术与亲水性高分子包衣技术相结合，并利用冻干技术，制备的羟基喜树碱氯化壳聚糖包衣纳米脂质体，包封率高，稳定性好，大小均匀，表面荷正电，体外释药曲线符合Higuchi方程，静脉注射后能显著延长药物在血液循环中的时间，减少MPS对脂质体的捕获，能提高HCPT体内抗肿瘤活性。
本发明提供的羟基喜树碱氯化壳聚糖包衣纳米脂质体保存时为粉末状冻干品，使用前用生理盐水2mL复水化即可均匀形成脂质体混悬液，供静脉注射使用。
本发明提供的氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体较其他羟基喜树碱制品，具有高效、低毒、在血液循环中滞留时间长等优点，从而提高主药的抗肿瘤活性。
具体实施例方式
氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体实施例如下实施例1氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体基本组分为卵磷脂∶胆固醇2.2∶1，羟基喜树碱药物∶类脂1∶18，羟基喜树碱药物浓度为0.45mg/mL，水化介质为pH5.8的磷酸盐缓冲液，含有8％(W/V)的冻干保护剂乳糖，平均粒径小于100nm之间。
实施例2氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体基本组分为卵磷脂∶胆固醇4∶1，羟基喜树碱药物∶类脂1∶23，羟基喜树碱药物浓度为0.6mg/mL，水化介质为pH7.5的磷酸盐缓冲液，含有15％(W/V)的冻干保护剂甘露醇，平均粒径在0～100nm之间。
氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体制备方法实施例如下实施例3采用薄膜分散法制备HCPT脂质体。精密称取各处方量的磷脂与胆固醇(总类脂为100mg)，溶解于3mL含α-生育酚1mg·mL-1的氯仿溶液中，得类脂溶液。再加入处方量的HCPT甲醇溶液，转移至250mL茄形瓶中，40℃恒温水浴中，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，以10mL溶解有冻干保护剂山梨醇的水化介质于40℃水化类脂薄膜，形成粗悬液，旋涡轻轻振摇2h，超声2min。
取药用壳聚糖适量，按摩尔比HCl∶CS＝1.2∶1加到0.1mol·L-1的稀HCl中，待其加完继续搅拌20min，超声脱气5min，再静置溶胀10min，然后加丙酮沉淀，边加边搅拌，将沉淀完全的氯化壳聚糖置G3砂型漏斗中抽滤。并用少量丙酮洗2-3次，抽干后进行冷冻干燥，即得白色海绵状氯化壳聚糖。
取出制备的脂质体粗悬液10ml，以1mL·min-1的速度恒速滴加到40mL的0.4％(w∶v)的氯化壳聚糖溶液中，搅拌速度为300rpm，待脂质体全部滴加完毕再继续搅拌10min，即得混悬状氯化壳聚糖包衣脂质体。将上述包衣脂质体经高压均质机在140M Pa压力下经50nm膜挤压乳匀6次。
加入15％(W/V)冻干保护剂山梨醇后，取2ml包衣脂质体悬浮液装入小西林瓶中，以20K/min的降温速度降至-65℃并预冻24h，再冷冻干燥24h、压力8Pa，搁板温度-15℃，加盖即得。
上述羟基喜树碱氯化壳聚糖包衣纳米脂质体保存时为粉末状冻干品，使用前用生理盐水2mL复水化即可均匀形成脂质体混悬液，供静脉注射使用。
实施例4精密称取各处方量的磷脂与胆固醇(总类脂为100mg)，溶解于3mL含α-生育酚2mg·mL-1的氯仿溶液中，得类脂溶液。再加入处方量的HCPT甲醇溶液，转移至250mL茄形瓶中，37℃恒温水浴中，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，以10mL溶解有冻干保护剂蔗糖的水化介质于37℃水化类脂薄膜，形成粗悬液，旋涡轻轻振摇2h，超声2min。
取药用壳聚糖适量，加到0.3mol·L-1的稀HCl中(HCl∶CS＝1.0∶1摩尔比)，待其加完继续搅拌20min，超声脱气5min，再静置溶胀10min，然后加丙酮沉淀，边加边搅拌，将沉淀完全的氯化壳聚糖置G3砂型漏斗中抽滤。并用少量丙酮洗2-3次，抽干后进行冷冻干燥，即得白色海绵状氯化壳聚糖。
取出制备的脂质体粗悬液(约10ml)，以2mL·min-1的速度恒速滴加到60mL的0.2％(W/V)的氯化壳聚糖溶液中，搅拌速度为500rpm，待脂质体全部滴加完毕再继续搅拌10min，即得混悬状氯化壳聚糖包衣脂质体。将上述包衣脂质体经高压均质机在140M Pa压力下经50nm膜挤压乳匀8次。
加入15％(W/V)冻干保护剂蔗糖后，取2mL包衣脂质体悬浮液装入小西林瓶中，以20K/min的降温速度降至-65℃并预冻36h，再冷冻干燥24h(压力8Pa，搁板温度-15℃)，加盖即得。
权利要求
1.一种氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体，其特征在于纳米脂质体含有氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱，平均粒径在0～100nm之间。
2.根据权利要求1所述的氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体，其特征在于脂质体基本组分为卵磷脂∶胆固醇2～4∶1，羟基喜树碱药物∶类脂1∶15～25，羟基喜树碱药物浓度为0.4～0.6mg/mL，水化介质为pH5.0～7.8的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体，其特征在于脂质体为冻干品，加有5～15％(W/V)的冻干保护剂。
4.根据权利要求3所述的氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体，其特征在于冻干保护剂可用海藻糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖或乳糖。
5.权利要求1所述的氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体的制备方法，其特征在于采用如下具体步骤(1)、采用薄膜分散法制备羟基喜树碱脂质体，按处方量精密称取磷脂与胆固醇，溶解于足量含α-生育酚0.5～5mg·mL-1的氯仿溶液中，得类脂溶液，再加入处方量的羟基喜树碱甲醇溶液，转移至茄形瓶中，25～50℃恒温水浴中，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，以溶解有冻干保护剂的水化介质于25～50℃水化类脂薄膜，形成粗悬液，旋涡轻轻振摇，超声处理。(2)、取药用壳聚糖适量，按摩尔比为HCl∶CS＝1.2～6∶1加到0.1～0.5mol/L的稀HCl中，加完后继续搅拌20～40min，超声脱气5～10min，再静置溶胀10～30min，然后加丙酮沉淀，边加边搅拌，将沉淀完全的氯化壳聚糖抽滤，并用少量丙酮洗2-3次，抽干后进行冷冻干燥，即得白色海绵状氯化壳聚糖。(3)、取出制备好的脂质体粗悬液，以1～3mL/min的速度恒速滴加到40～120mL的0.1～0.5％(w∶v)的氯化壳聚糖溶液中，匀速搅拌，待脂质体全部滴加完毕再继续搅拌10～30min，即得混悬状氯化壳聚糖包衣脂质体，将所得包衣脂质体经高压均质机在140～280M Pa压力下经50～100nm膜挤压乳匀6～10次。(4)、加入5～15％(W/V)冻干保护剂后，取包衣脂质体悬浮液装入小西林瓶中，以10～20K/min的降温速度降至-65～-80℃并预冻24～36h，再在压力5～8Pa，搁板温度-15～20℃的条件下冷冻干燥24～48小时，加盖即得氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体粉末状冻干品。
全文摘要
本发明提供了一种氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法，该纳米脂质体含有氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱，平均粒径小于100nm，脂质体组分为卵磷脂∶胆固醇2～4∶1，羟基喜树碱药物∶类脂1∶15～25，药物浓度为0.4～0.6mg/mL，水化介质为pH5.0～7.8的磷酸盐缓冲液。本发明将纳米技术与亲水性高分子包衣技术相结合，并利用冻干技术，制备的氯化壳聚糖包衣的羟基喜树碱纳米脂质体，包封率高，稳定性好，大小均匀，表面荷正电，体外释药曲线符合Higuchi方程，静脉注射后能显著延长药物在血液循环中的时间，减少单核巨噬细胞对脂质体的捕获，能提高羟基喜树碱体内抗肿瘤活性。
文档编号A61K31/475GK1857223SQ20061001927
公开日2006年11月8日 申请日期2006年6月7日 优先权日2006年6月7日
发明者杜予民, 何文 申请人:武汉大学