专利名称：I*－红景天苷及其制备和在抗老年性痴呆症药物中的应用的制作方法
技术领域：
I*-红景天苷及其制备和在抗老年性痴呆症药物中的应用，属于中药药物制剂技术领域，涉及细胞生物学、核技术、中药学及神经退行性疾病等。
背景技术：
近年来，天然药物成了药物研究及开发的一个热点。红景天属多年生草木或亚灌木植物，分布在俄罗斯远东地区及我国东北、西北及西南等高寒地区，一般海拔在1500-5000米左右。据统计，全世界共有红景天90多种，我国就分布有70多种。由于其生长在极其恶劣的环境下，如缺氧、低温干燥、强紫外线照射等，因而具有很强的生命力和特殊的适应性。
自上世纪50年代起，由于航空航天的发展，前苏联学者首先开始了太空防护药物的研究，经对红景天属植物进行系统的研究，发现该属植物具有类似人参等的兴奋中枢神经的作用，而没有人参等过度兴奋的作用。进一步研究表明，红景天具有抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗衰老及增强脑力、体力机能等方面的特殊功效，且自身毒性小，按1000mg/kg剂量给药不引起动物毒性反应，因而越来越受到人们的广泛重视，成为重要的抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗衰老的天然药物来源之一。
红景天苷(salidroside，也称毛柳苷)，化学名为对羟苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydroxyphenethyl-β-D-glucoside)，是红景天的特征性成份，也是主要活性成分之一。一般从各类高原药用红景天科植物及常用中药女贞子中分离提取，也有以酪醇和四溴代乙酰葡萄糖、或对羟基苯乙酸等为原料经化学合成获得，其结构式如下 随着社会的发展及环境问题的突出，人口老龄化及伴随的神经退行性疾病的发病率越来越高。老年性痴呆症(也称阿尔兹海默症Alzheimer’s Disease，AD)是其中重要的一类疾病，其主要的两大病理特征是神经元细胞外的淀粉样斑块(也称老年斑)沉积及神经元细胞内高度磷酸化的微管相关蛋白构成的神经纤维缠结。AD是一种慢性精神致残及致死性疾病，美国等发达国家老年性痴呆在老年人死因中仅次于心脏病、肿瘤和中风。专家们预言，本世纪危害人类健康的第一杀手将是老年性痴呆。
AD的发病机理复杂，与多个基因相关，目前已确知4种基因的突变与AD有关，它们是β淀粉样肽前体蛋白(Amyloid Protein Precursor，APP)基因、早老1基因(PS1)、早老2基因(PS2)和ApoE基因。此外，其它病因学危险因子已达百余种。主要涉及自由基、淀粉样斑块沉积、神经纤维缠结、炎症等。近来有许多研究认为AD的发生发展与自由基损伤密切相关，AD伴有大量自由基生成，而清除自由基能力又不足，所以神经元受到自由基损伤不可避免。
而红景天及其主要活性成份红景天苷具有抗自由基损伤的作用，如李天威等研究发现红景天苷对大鼠皮层神经细胞超氧阴离子和过氧化氢损伤有保护作用；文镜等报道红景天提取物能提高体内谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，减少组织中羟自由基含量，保护组织蛋白质和细胞膜；此外红景天对脑缺血再灌注时自由基的损伤也有保护作用。
红景天及其主要活性成份红景天苷在抗自由基损伤等方面具有明显的作用，但至今尚无对其在体内、体外的吸收、分布、代谢等的研究，也没有以老年性痴呆症为特定对象开展系统的药物干预的研究报道。
发明内容
本发明提供了一种I*-红景天苷的制备方法，目的是使红景天苷在制备预防及治疗老年性痴呆症药物中应用。本发明系统地将藏药红景天的特征活性成份红景天苷应用于老年性痴呆症的预防及治疗药物中，有机地将我国传统的中医药学与现代分子医学结合，为开发中药新药提供了新的思路，为老年性痴呆症患者提供了一种无毒副作用的预防和治疗新药，以减少患者的痛苦，改善患者的生存质量，也减轻社会及患者家庭的负担。本发明对红景天苷进行结构改造，在其酚羟基邻位处引入核素碘，使得有关红景天苷在体内、体外的吸收、分布、代谢及药效的状况可以简便、准确、快速地得到反映，更好地用于老年性痴呆症的预防及治疗药物的开发和制备中。
本发明的技术方案包括二项内容1.一种I*-红景天苷及其制备方法红景天苷的碘标记物I*-红景天苷，具有如下结构通式的化合物 式中碘I*表示核素碘123I、124I、125I、127I、131I中的任一种。
本发明涉及的I*-红景天苷的制备是将红景天苷采用氯胺-T法、过氧化物氧化法或Iodogen法进行碘标记，步骤如下(1)将红景天苷在磷酸盐缓冲体系中与适量NaI*及氧化剂在10-50℃下振荡混合一定时间；(2)向(1)中加入过量还原剂以终止反应；(3)将(2)小心、均匀点样于制备型硅胶层析板上，于三氯甲烷甲醇丙酮水层析体系中展开分离，刮取收集Rf0.6-0.7的硅胶，以适量0.2mol/LpH 7.4的PBS溶解，离心取水相。
上述步骤(1)所述反应时间对于氯胺-T为30-60s，其他则为10-25min；步骤(2)中所述还原剂包括硫代硫酸钠、偏重亚硫酸钠中的一种；步骤(3)所述层析体系为三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水体积比为6∶3∶1∶1(v/v)，适量缓冲液以能完全浸泡硅胶为宜，离心则为台式离心机1000cpm×10min。
优选条件如下10μg红景天苷溶于20μl 0.2mol/L PBS pH7.4中，加入20μl NaI*(0.5-2mCi)，1mg/ml的氯胺-T20μl，涡旋振荡30-60s，加入2mg/ml的偏重亚硫酸钠100μl终止反应。将反应液小心、均匀点样于制备型硅胶层析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)层析体系中展开分离，刮取收集Rf0.6-0.7的硅胶，以适量0.2mol/L pH7.4的PBS溶解，离心取水相。
2、以I*-红景天苷原型药红景天苷为活性成份被应用于制备预防和治疗老年性痴呆症药物的开发和制备中。
本发明的123I-红景天苷可通过SPECT(单光子发射计算机断层显像)、124I-红景天苷可通过PET(正电子计算机断层显像)用于乏氧组织等的显像，这是核医学所特有的无创、活体及动态影像手段；也可用于反映该化合物在体内、体外的吸收、分布、代谢及药效等，以便于将该化合物应用于药物中，在预防及治疗老年性痴呆相关疾病时作为有效观察手段。
本发明的I*-红景天苷可用于表征红景天苷应用于药物中时，在体内和体外的吸收、分布、代谢和药效的研究及在制药中的应用，也可用于乏氧组织的显像。
本发明的I*-红景天苷原型化合物红景天苷安全无毒，具有较强的抗过氧化作用、抗H2O2诱导的红细胞溶血作用、和明显的抗H2O2诱导或淀粉样蛋白聚集体诱导的神经元细胞氧化应激凋亡作用，维持和恢复神经元细胞的正常形态及功能，利用I*-红景天苷灵敏的放射性示踪作用，将其应用于以I*-红景天苷原型药红景天苷为活性成分的抗老年性痴呆症药物的开发及制备中。揭示其具有较好的预防和治疗老年性痴呆症的药用前景。
本发明也适用于与红景天苷结构相似的化合物。
本发明的有益效果(1)本发明制备了新化合物I*-红景天苷，其制备工艺简单，标记物稳定，便于临床、科研及药物开发的进一步应用。
(2)本发明的I*-红景天苷原型药红景天苷安全无毒，抗神经元细胞凋亡作用明显，有较好的预防和治疗老年性痴呆症的药用前景。
(3)本发明的I*-红景天苷可用于以其原型药红景天苷为活性成份被应用于制备预防和治疗老年性痴呆症药物的开发和制备中。
具体实施例方式
实施例1I*-红景天苷的制备(氯胺-T法) 10μg红景天苷溶于20μl 0.2mol/L PBS pH7.4中，加入20μl NaI*(500μCi-2mCi)，20μl 1mg/ml氯胺-T，涡旋振荡30-60s，加入100μl 2mg/ml硫代硫酸钠终止反应。将反应液小心、均匀点样于制备型硅胶层析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)层析体系中展开分离，刮取收集Rf0.6-0.7的硅胶，以适量0.2mol/L pH 7.4的PBS溶解，离心取水相。
实施例2I*-红景天苷的制备(过氧化物氧化法)10μg红景天苷溶于20μl 0.2mol/L PBS pH7.4中，加入20μl NaI*(500μCi-2mCi)，20μl 3％双氧水，涡旋振荡30-60s，室温放置15min，加入100μl 2mg/ml偏重亚硫酸钠终止反应。将反应液小心、均匀点样于制备型硅胶层析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)层析体系中展开分离，刮取收集Rf0.6-0.7的硅胶，以适量0.2mol/L pH 7.4的PBS溶解，离心取水相。
实施例3I*-红景天苷的制备(Iodogen法)取10μg红景天苷溶于20μl 0.2mol/L PBS pH7.4中，加入已涂布有2μgIodogen的Eppendorf管中，加入20μl NaI*(500μCi-2mCi)，涡旋振荡30-60s，于室温放置20min，取出反应液终止反应。将反应液小心、均匀点样于制备型硅胶层析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)层析体系中展开分离，刮取收集Rf0.6-0.7的硅胶，以适量0.2mol/L pH 7.4的PBS溶解，离心取水相。
实施例4I*-红景天苷的鉴定采用薄层层析和高效液相法鉴定A薄层层析以硅胶纸为支持介质，展开体系为三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水＝6∶3∶1∶1(v/v)，待展开结束，于紫外灯下检测标记物在Rf＝0.6-0.7处呈黄色斑点，将硅胶纸剪成等份十段，γ-计数仪测定各段放射性计数，I*-红景天苷标记物在Rf＝0.6-0.7处，游离碘在Rf＝0.0-0.1处。
B高效液相法Lichrospher C18(250×4.6μm，Hanbon Sci.&tech)，21％甲醇水溶液(含0.2％磷酸)，流速1ml/min，紫外检测(波长290nm)，未标记红景天苷原药的保留时间约为10min，I*-红景天苷的保留时间则约为5min，游离碘则为1min。
实施例5I*-红景天苷在ICR小鼠体内的分布正常4周龄ICR小鼠尾静脉注射131-I*-红景天苷(0.111MBq/只)，分别于5min、30min、60min、120min、240min断头处死，取血、心、肝、肺、肾、小肠、肌肉、脑、骨、脾等感兴趣组织，称湿重，γ-计数仪测定放射性计数，计算ID％/g组织。
结果显示放射性在肾及肝中分布最多，血及肺中次之。可由此判断红景天苷主要是通过肝脏代谢，肾脏排泄，肝和肾5分钟时ID％/g组织分别为9.25％和10.20％，4小时分别为0.27％和0.40％；在脑中分布较少，但清除较慢，5分钟时为0.27％，4小时为0.11％；血液清除快，5分钟时为5.11％，30分钟时即为1.70％；在心、肺、脾、肌、骨及肠中分布不多；2小时后各脏器的ID％/g组织基本在1％以下，揭示其在体内排泄较快，这也是其较小的毒副作用的原因之实施例6红景天苷的抗过氧化作用油脂的过氧化作用形成的毒性物质会导致一些极为严重的后果，如致癌、诱导机体突变、加速衰老等。取1mL红景天苷水溶液，加入1mL 2.50％(v/v)亚油酸、2mL 0.05mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液，1mL蒸馏水，密封后40℃恒温避光氧化，空白对照以溶剂代替抗氧化剂。于不同时间取0.1mL上述亚油酸乳化液，依次加入9.7mL 75％的乙醇和0.1mL 30％硫氰酸氨，再加入0.1mL0.02mol/L溶于3.5％盐酸的氯化亚铁，快速混匀，反应3分钟后测定500nm吸光值。
结果显示，与空白对照相比，红景天苷可使体系吸光值维持在较低的水平，过氧化作用受到明显的抑制，100μg/ml红景天苷的抑制率保持在20％左右，并且随着红景天苷浓度的增加，对亚油酸体系的抗氧化作用增大，即有一定的“剂量-效应”关系。
实施例7红景天苷的抗H2O2诱导的红细胞溶血作用红细胞具有典型的生物体细胞膜结构，被广泛应用于膜脂质过氧化的研究。取大鼠红细胞悬液1mL，模型管加入H2O2使终浓度为100mmol/L，样品管分别加入100mmol/L H2O2以及不同浓度的样品液，混匀后于37℃温浴1h，以生理盐水稀释，离心，取上清于540nm处比色测定，计算溶血率。
结果显示，红景天苷可使红细胞溶血率明显降低，随着浓度的增加，抑制率升高，50μg/ml、100μg/ml的红景天苷的抑制率分别达到68％和81％，具有明显的浓度依赖性。而VC、VE在100μg/ml时的抑制率仅为40％左右。
实施例8红景天苷抗H2O2诱导的神经元细胞的损伤神经元细胞SH-SY5Y经H2O2诱导后易引起氧化应激损伤，而经不同浓度的红景天苷干预后，观察细胞形态及细胞增殖状况。
结果显示经不同浓度红景天苷干预后，SH-SY5Y细胞形态明显好转，细胞数显著增加，此效应呈明显的浓度依赖性。
实施例9红景天苷抗老化淀粉样蛋白诱导的神经元细胞的损伤淀粉样斑块是老年性痴呆症患者的重要病理特征，其主要成份是淀粉样蛋白Aβ，研究表明Aβ易引起神经元细胞的氧化应激损伤。经不同浓度的红景天苷干预后，观察Aβ诱导的神经元细胞的形态及细胞增殖状况。
结果显示经红景天苷干预后，SH-SY5Y细胞形态明显好转，细胞凋亡现象明显减少，细胞增殖显著增加。
权利要求
1.红景天苷的碘标记物I*-红景天苷，其特征是具有如下结构通式的化合物 式中碘I*表示核素碘123I、124I、125I、127I、131I中的任一种。
2.如权利要求1所述的I*-红景天苷的制备方法，其特征是将红景天苷采用氯胺-T法、过氧化物氧化法或Iodogen法进行碘标记，包括如下步骤(1)将红景天苷在磷酸盐缓冲体系中与适量NaI*及氧化剂在10-50℃下振荡混合一定时间；(2)加入过量还原剂以终止反应；(3)小心、均匀点样于制备型硅胶层析板上，于三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水层析体系中展开分离，刮取收集Rf0.6-0.7的硅胶，以适量0.2mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，离心取水相；步骤(1)所述NaI*用量为1μg红景天苷与0.05-0.2mCi的NaI*反应；所述氧化剂包括氯胺-T、双氧水或Iodogen中的一种；所述反应时间对于氯胺-T为30-60s，对于双氧水或Iodogen则为10-25min；步骤(2)所述还原剂包括硫代硫酸钠、偏重亚硫酸钠中的一种；步骤(3)所述层析体系为三氯甲烷∶甲醇∶丙酮∶水体积比为6∶3∶1∶1，适量缓冲液以能完全浸泡硅胶为宜，离心则为台式离心机1000rpm×10min。
3.如权利要求1所述的I*-红景天苷的应用，其特征是表征红景天苷应用于药物中时，在体内和体外的吸收、分布、代谢和药效的研究及在制药中的应用。
4.根据权利要求3所述的I*-红景天苷的应用，其特征是在制备抗老年性痴呆症药物中的应用，其原型化合物红景天苷安全无毒，具有抗过氧化作用、抗H2O2诱导的红细胞溶血作用、抗H2O2诱导或淀粉样蛋白聚集体诱导的神经元细胞氧化应激凋亡作用，维持和恢复神经元细胞的正常形态及功能，利用I*-红景天苷灵敏的放射性示踪作用，将其应用于以I*-红景天苷原型药红景天苷为活性成分的抗老年性痴呆症药物的开发及制备中。
全文摘要
I*－红景天苷及其制备和在抗老年性痴呆症药物中的应用，属于中药药物制剂技术领域，涉及细胞生物学、核技术、中药学及神经退行性疾病等。本发明化合物I*－红景天苷是藏药红景天的活性成分红景天苷进行碘标记后的产物，其制备方法是采用氯胺－T法、过氧化物氧化法或Iodogen法对红景天苷进行结构改造，在其酚羟基邻位引入放射性核素碘。该I*－红景天苷属首次报道，其制备工艺简便，所得产物稳定，可应用于以I*－红景天苷原型药红景天苷为活性成分的抗老年性痴呆症药物的开发及制备中。
文档编号A61P25/00GK1821256SQ20061003879
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月8日 优先权日2006年3月8日
发明者俞惠新, 张莉, 林秀峰, 谭成, 陈波, 张荣军, 吴春英, 周杏琴, 杨敏, 朱钧清, 曹国宪, 罗世能 申请人:江苏省原子医学研究所