专利名称：一种姜提取物、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物及其新的制药用途，具体涉及一种姜提取物，其制备方法及在制备防治肝纤维化的药物中的应用。
背景技术：
肝纤维化是指肝脏纤维结缔组织的过度沉积，是纤维增生和纤维分解不平衡的结果。纤维增生是机体对于损伤的一种修复反应，各种病因所致反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死可导致肝脏持续不断的纤维增生而形成肝纤维化，从许多慢性肝病，特别是慢性病毒性肝炎的临床及病理演变来看，肝纤维化和肝硬化是连续的发展过程，二者难以截然分开。
抗纤维化的治疗旨在减轻纤维化的程度，延缓其发展，乃至逆转其病理进程。现有技术中，主要采用下列方法一是用干扰素等抑制胶原合成；二是用秋水仙碱等药物抑制微管蛋白聚合，从而干扰细胞的胶原分泌。而通过促进胶原降解的方法进行治疗，以及基因治疗等方法则尚在研究之中。有多种中药被报道具有护肝作用，但目前尚未见到生姜用于治疗肝纤维化的报道。
生姜是一种传统中药，它具有散寒解表、温中止呕、化痰止咳和解毒等功效，可用于风寒感冒、咳嗽、胃寒呕吐等疾病。现代植物化学和药理学研究发现，生姜中的主要有效成分为姜辣素，包括姜酚(gingerol)，姜酮(zingerone)和姜烯酮(shogaol)等，其中又以姜酚最为重要，其含量直接影响到生姜制剂的质量和功效。
当用于制备药物时，需要提取姜的有效成份。常见的提取方法是乙醇循环法，但其提取率低，获得的姜酚含量低。因而，近两年，开始出现了采用超临界二氧化碳萃取生姜油的报道。采用这类方法获得的姜提取物——生姜油中，姜辣素的含量通常在10％～20％之间。
滴丸作为一种药物剂型，可以使药物以恒定速度溶出，控释滴丸的作用可达数日，因而适于制备需要较长时间连续使用的药物。然而，滴丸的载药量小，多数滴丸的重量小于100毫克，由此需要进一步富集药物的有效成份或有效部位。上述生姜油中姜辣素的含量显然还不能适于制作滴丸的需求。
发明内容
本发明目的是提供一种姜提取物的新的用途，以及适于该用途的制备姜提取物的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种姜提取物的制备方法，包括下列步骤，(1)将干姜粉碎至粒度30-50目，作为制备原料；(2)采用超临界二氧化碳流体萃取方法萃取，萃取压力24-30MPa，温度42-45℃，反应3-6小时，CO2流速为9-10kg/h.kg原料；经萃取的流体分别经过两级解析，所述第一级解析的压力为12-14MPa，温度为56-60℃，第二级解析的压力为6-7MPa，温度为38-42℃；将上述萃取获得的淡黄色姜油用柱层析法进行分离，使得姜辣素的含量大于50％，获得所需的姜提取物。
本发明同时要求保护采用上述方法制备获得的姜提取物。
以及所获得的姜提取物在制备防治肝纤维化的药物中的应用。
较优选的方案是，所述的药物剂型为滴丸。
上述技术方案中，超临界CO2流体(SFE-CO2)萃取流程如下CO2钢瓶→冷冻系统→高压泵→萃取釜→解析釜I→解析釜II→循环。
经过超临界二氧化碳萃取获得的姜油，为淡黄色油状物，其具有浓烈的鲜姜天然香气和辛辣味，经GC-MS定性定量鉴定了59个成分，姜辣素的含量为13.09％，其中，姜酚(gingerol)1.78％，姜烯酚(shogaol)2.36％，姜酮(zingerone)3.52％，姜烯(Zangiberene)4.43％，其他50多种单萜、倍半萜类物质，相对含量为46.83％。
将上述姜油采用柱层析的方法进一步提取，得到精制姜油，测定提取物中姜辣素的含量大于50％，为本发明所需的姜提取物。
为了更好地解决主要药效成分姜酚的稳定性，将部分精制姜油用β-CD包合。缓释滴丸处方设计中同时含有提取物和包合物两部分，调节二者的比例，获得不同的释药效果。
滴丸的制备方法是称取一定量的辅料，加热熔融后加盖密闭并保温60℃，滴入甲基硅油中冷凝，待收缩成丸后，收集丸粒，吸去表面黏附的冷却剂，放入干燥器干燥即得。
优选使用水溶性载体PEG6000制成固体分散体，使药物分子不易形成聚集体，或使微粒不易形成聚附体，保证了药物的高度分散性，加快药物的溶出和吸收，构成缓释滴丸的速释部分。优选使用水不溶性的硬脂醇、β-CD的包合对药物释放起阻滞作用，构成缓释滴丸的缓释部分。用本法制成姜油缓释滴丸，使药物在体内缓慢释药达12h，故处方筛选的依据定为2h释药约40％，10h释药80％以上，制剂服用后既可使血药浓度快速达到治疗范围，又能持续维持一段时间的药物浓度。
对上述制剂的药效研究表明1.在整体动物急性肝损伤实验中，精制姜油具有明显的保肝作用，它可抑制四氯化碳和醋氨酚所致动物血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)升高(表1、表2)；使升高的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平明显降低(表3)，精制姜油还可降低由四氯化碳损伤引起的肝细胞丙二醛(MDA)含量升高和超氧化歧化酶(SOD)活性升高(表4)。病理学检查表明，精制姜油同时可明显改善急性肝损伤动物的肝脏显微结构。精制姜油对四氯化碳和H2O2诱导的BRL肝细胞损伤具有明显的保护作用(表5)，可使细胞培养上清液中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平明显降低(表5)。
2.在实验性肝纤维化模型中，用精制姜油治疗后可明显改善肝纤维化的程度，降低大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)的升高(表6、表7)，并可提高血清总蛋白(TP)和白蛋白(Alb)含量(表8)，明显减少肝组织中的胶原纤维沉积和假小叶的形成。
3.精制姜油的保肝作用可能机制主要与其抗氧化有关，包括降低丙二醛(MDA)，增加超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)的活性(表9、表10)。它的抗肝纤维化作用机制，除了抗氧化作用外，还包括通过降低体内的转移生长因子-β1(TGF-β1)对肝星状细胞(HSC)的激活作用(表11)，减少胶原的合成以及降低基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)对基质金属蛋白酶(MMPs)的抑制作用而增加胶原的分解(表12)。
经动物实验证实，精制姜油小鼠口服的LD50为20ml/kg，95％可信限为18.7-21.2ml/kg。对中毒致死小鼠尸解，未见心、肝、脾、肺、肾、脑等主要实质性脏器有明显的病理改变。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1.本发明提出了姜提取物在制备抗肝纤维化的药物中的应用，实验表明，其保肝和抗肝纤维化的作用是十分显著的，可以用于进一步开发新的保肝和抗肝纤维化药物。
2.由于姜提取物是纯天然物质，在对抗肝纤维化的过程中，不会产生其它副作用。
3.本发明通过控制解析的参数，以及采用柱层析法作进一步精制，获得了姜辣素含量大于50％的姜提取物，因而可以用于滴丸剂型的制备。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述实施例一姜提取物的制备超临界CO2流体(SFE-CO2)萃取流程如下CO2钢瓶→冷冻系统→高压泵→萃取釜→解析釜I→解析釜II→循环。
萃取的参数为萃取釜压力为24mpa、温度为42℃，解析釜I的压力为12.4mpa，温度为60℃，解析釜II的压力为6.5mpa，温度为40℃，CO2流速为10kg/h.kg原料，时间为4-6小时。
中药材干姜粉碎过筛，粒度30-50目，称取10kg投入萃取釜中，经过4-6小时萃取后，从解析釜I和解析釜II中出料，为淡黄色的姜油180g，其具有浓烈的鲜姜天然香气和辛辣味，经放置后，底部有少量黄色沉淀。
经GC-MS定性定量鉴定了59个成分，姜辣素的含量为13.09％，其中，姜酚(gingerol)1.78％，姜烯酚(shogaol)2.36％，姜酮(zingerone)3.52％，姜烯(Zangiberene)4.43％，其他50多种单萜、倍半萜类物质，相对含量为46.83％。
将上述姜油采用柱层析的方法进一步提取，得到精制姜油，测定提取物中姜辣素的含量大于50％，即为所获得的姜提取物。
实施例二用于防治肝纤维化的滴丸的制备以实施例一获得的姜提取物作为滴丸内容药物，为了更好地解决主要药效成分姜酚的稳定性，将部分精制姜油用β-CD包合。缓释滴丸处方设计中同时含有提取物和包合物两部分，调节二者的比例，获得不同的释药效果。
对滴丸剂的辅料及配比首先进行预试验。称取一定量的辅料，加热熔融后加盖密闭并保温60℃，滴入甲基硅油中冷凝，待收缩成丸后，收集丸粒，吸去表面黏附的冷却剂，放入干燥器干燥即得。对各处方滴制成丸的难易情况从以下几个方面评价圆整度、硬度、料液的黏度、流动性、易滴制程度等。
预试验结果显示，选定的处方随着PEG4000或PEG6000用量的增加，适当加大水不溶性载体的用量，系统地考察和筛选缓释滴丸剂的处方，选取方中EG6000，PEG20000，硬脂醇用量以及精制姜油中姜酚与β-CD包合物的配比为考察因素，每个因素各取4个水平，采用L16(45)正交试验表进行试验，以0～12h滴丸剂内姜酚的累积百分释放量(F)为考察指标，考察滴丸剂的缓释效果。
释放度试验参照《中国药典)2000版第一部转溶法项下操作。精密称取样品适量(相当于姜酚60mg)，量取pH 1.2人工胃液500mL注入溶出杯中，控制温度(37±0.5)℃，转速为(100±1)r·min-1，1，2h后取样5mL，2h后转移至pH6.8的人工肠液中继续释放，分别于4，6，8，10，12h定时取样5mL，0.8μm微孔滤膜过滤，同时补充同体积同温度的溶出介质。弃去初滤液，续滤液按给定的色谱条件测定含量，由此获得不同时间药物的累积释放量。
优选使用水溶性载体PEG6000制成固体分散体，使药物分子不易形成聚集体，或使微粒不易形成聚附体，保证了药物的高度分散性，加快药物的溶出和吸收，构成缓释滴丸的速释部分。优选使用水不溶性的硬脂醇、β-CD的包合对药物释放起阻滞作用，构成缓释滴丸的缓释部分。用本法制成姜油缓释滴丸，使药物在体内缓慢释药达12h，故处方筛选的依据定为2h释药约40％，10h释药80％以上，制剂服用后既可使血药浓度快速达到治疗范围，又能持续维持一段时间的药物浓度。
实施例三姜提取物滴丸治疗肝纤维化的应用试验以实施例二获得的姜提取物滴丸进行各种对比试验，试验结果见下列各表，表明1.在整体动物急性肝损伤实验中，精制姜油具有明显的保肝作用，它可抑制四氯化碳和醋氨酚所致动物血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)升高(表1、表2)；使升高的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平明显降低(表3)，精制姜油还可降低由四氯化碳损伤引起的肝细胞丙二醛(MDA)含量升高和超氧化歧化酶(SOD)活性升高(表4)。病理学检查表明，精制姜油同时可明显改善急性肝损伤动物的肝脏显微结构。精制姜油对四氯化碳和H2O2诱导的BRL肝细胞损伤具有明显的保护作用(表5)，可使细胞培养上清液中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平明显降低(表5)。
2.在实验性肝纤维化模型中，用精制姜油治疗后可明显改善肝纤维化的程度，降低大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)的升高(表6、表7)，并可提高血清总蛋白(TP)和白蛋白(Alb)含量(表8)，明显减少肝组织中的胶原纤维沉积和假小叶的形成。
3.精制姜油的保肝作用可能机制主要与其抗氧化有关，包括降低丙二醛(MDA)，增加超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)的活性(表9、表10)。它的抗肝纤维化作用机制，除了抗氧化作用外，还包括通过降低体内的转移生长因子-β1(TGF-β1)对肝星状细胞(HSC)的激活作用(表11)，减少胶原的合成以及降低基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)对基质金属蛋白酶(MMPs)的抑制作用而增加胶原的分解(表12)。
经动物实验证实，精制姜油小鼠口服的LD50为20ml/kg，95％可信限为18.7-21.2ml/kg。对中毒致死小鼠尸解，未见心、肝、脾、肺、肾、脑等主要实质性脏器有明显的病理改变。
表1精制姜油对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用(n＝10，x±s)
与正常对照组比较，ΔΔP＜0.01；与肝损伤模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表2精制姜油对醋氨酚致小鼠急性肝损伤的保护作用(n＝10，x±s)
与正常对照组比较，ΔΔP＜0.01；与肝损伤模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表3对大鼠CCl4肝细胞损伤后ALT、AST的影响(n＝4，x±s)
与正常对照组比较，ΔΔP＜0.01；与肝损伤模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4对大鼠CCl4致肝细胞损伤后SOD、MDA的影响(n＝4，x±s)
与正常对照组比较，ΔΔP＜0.01；与肝损伤模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表5对大鼠H2O2致肝细胞损伤的保护作用(n＝4，x±s)
与正常对照组比较，ΔΔP＜0.01；与肝损伤模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01表6对大鼠CCl4肝纤维化血清ALT和AST的影响(n＝10，x±s)
与正常对照组比较，ΔΔP＜0.01；与肝损伤模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01表7对大鼠CCl4肝纤维化血清HA和LN的影响(n＝8，x±s)
与正常对照组比较，ΔΔP＜0.01；与肝损伤模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表7
表11对大鼠CCl4肝纤维化血清TGF-β1的影响(n＝8，x±s)
与正常对照组比较，ΔΔP＜0.01；与肝损伤模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01表12对大鼠CCl4肝纤维化血清TIMP-1mRNA的影响(n＝10，x±s)
与正常对照组比较，ΔΔP＜0.01；与肝损伤模型组相比较，*P＜0.05，**P＜0.0权利要求
1.一种姜提取物的制备方法，包括下列步骤，(1)将干姜粉碎至粒度30-50目，作为制备原料；(2)采用超临界二氧化碳流体萃取方法萃取，萃取压力24-30MPa，温度42-45℃，反应3-6小时，CO2流速为9-10kg/h.kg原料；其特征在于经萃取的流体分别经过两级解析，所述第一级解析的压力为12-14MPa，温度为56-60℃，第二级解析的压力为6-7MPa，温度为38-42℃；将上述萃取获得的淡黄色姜油用柱层析法进行分离，使得姜辣素的含量大于50％，获得所需的姜提取物。
2.权利要求1所述方法制备获得的姜提取物。
3.权利要求1获得的姜提取物在制备防治肝纤维化的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的药物剂型为滴丸。
全文摘要
本发明公开了一种姜提取物及其制备方法，结合超临界二氧化碳流体萃取和柱层析方法，获得了姜辣素含量大于50％的姜提取物。本发明同时公开了这种姜提取物在制备防治肝纤维化的药物中的应用。实验表明，本发明获得的姜提取物，在保肝和抗肝纤维化方面的作用十分显著，可以用于进一步开发新的保肝和抗肝纤维化药物；并且，由于获得了姜辣素含量大于50％的姜提取物，因而可以用于滴丸剂型的制备。
文档编号A61P1/16GK1857701SQ20061003876
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月7日 优先权日2006年3月7日
发明者孙晓飞, 谢梅林, 耿涛 申请人:苏州大学