专利名称：鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及禽用生物药剂， 一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗 的制备方法。
背景技术：
预防和控制传染病的发生对现代养禽业具有非常重要的意义。目前， 一般 采用的方法主要是加强卫生和消毒，但仅靠这些并不能使现代养禽业集约化大 规模生产抵抗得住传染病的传播，给养禽业造成很大的损失的事是经常的事； 事实证明，养禽业控制其传染性疾病最主要的手段应该是以预防为主，而接种 疫苗被认为是最行之有效的措施。
疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经 过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制 剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具 伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生 理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便 会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。灭活疫苗俗 称"死疫苗"，是将病原微生物灭活后使其失去致病能力但仍保留免疫原性而 制成的，进入机体后可直接引起免疫应答，但不能繁殖，比较安全、稳定。具 有生产方便，使用安全，易于保存的特点。
鸡新城疫俗称"鸡瘟"，是由鸡新城疫病毒引起的一种高度接触性传染病。 主要经呼吸道和消化道感染，各种年龄的鸡均可感染，以雏鸡最为严重发病率 和死亡率可达80%以上。鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起鸡的 一种急性、高度接触性呼吸道疾病，传播途径主要是经呼吸道感染；发病多集
中在冬、春季；6周龄死亡率高，可达20%左右。
目前，浓縮可提高免疫抗原在疫苗终产品的浓度，常用的浓縮方法有离心沉
淀法、氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法，但上述几种方法均有其缺点， 浓縮可提高免疫抗原在疫苗终产品的浓度，常用的浓縮方法有离心沉淀法、氢氧 化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法，但上述几种方法均有其缺点，本公司经过 长期实验采用纤维膜超滤浓縮法，本方法可使效价提高.
现在的制备方法中，灭活是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病 性，但尽可能地不影响或少影响其免疫原性。灭活的方法包括物理方法和化学 方法。物理法如加热、射线照射等方法，化学法是用化学灭活剂进行的，是目 前常用的灭活方法。常用的灭活剂有甲醛、乙酰乙烯基亚胺、乙烯亚胺、e-丙 酸内酯等。甲醛的灭活原理是它能使微生物的蛋白质、核酸变性，导致死亡， 但不明显影响其免疫原性
现在的制备方法中，佐剂的类型一般由氢氧化铝胶、弗氏佐剂、白油佐剂、
矿物油、水花生油乳剂、吐温-80、司盘、左旋咪唑、脂质体等，与抗原混合成
悬浊状态，尽可能延长在注射部位的贮留时间，从而持续不断地剌激机体免疫
系统，以产生较强的免疫应答；可出现免疫增强的作用。
发明内容
为了解决鸡新城疫与传染性支气管炎严重影响养禽业尤其是鸡的呼吸道 传染性疾病的问题，本发明的目的是提供一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联 灭活疫苗的制备方法，使其可有效地防止这两种禽病的发生，具有生产方便， 使用安全，易于保存的优点。
该鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方法，主要提出了新城 疫与传染性支气管炎二联灭活疫苗的组和，采用NDVLaSota株病毒液，含重量 比10 22%， IBVM41株病毒液，含重量比10 22%;分别浓縮、灭活；再
加入佐剂白油，免疫助剂吐温、司本、硬脂酸铝制成联苗。
该鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方法，生产用毒种的制
备，NDVLaSota株和IBVM4,株毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育， 收获；制苗用病毒液的制备，NDV La Sota株和IBV M^株毒种分别适当稀释， 分别接种易感鸡胚，孵育；收活毒种分别浓縮、灭活.取制苗用NDV La Sota 毒株液159b和IBVM4,毒株液1596加吐温-80制成水相.用白油、司本-80、硬脂酸 铝制成油相.水相与油相之比为1:1.5—起乳化，分装，帖签，装箱，入库。
该鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方法，生产用毒种的制 备NDVLaSota株和IBVM4,株毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育， 收获；制苗用病毒液的制备NDV La Sota株和IBV M^株毒种分别适当稀释， 分别接种易感鸡胚，孵育；收活毒种分别浓縮、灭活，取制苗用NDV La Sota 毒株液16W和IBV M^毒株液169b,加吐温-80制成水相，用白油、司本_80、硬 脂酸铝制成油相，水相与油相之比为1:2—起乳化，分装，帖签，装箱，入库。
该鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方法，生产用毒种的制 备NDVLaSota株和IBVM4,株毒种分别适当稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育， 收获；制苗用病毒液的制备NDV La Sota株和IBV l株毒种分别适当稀释， 分别接种易感鸡胚，孵育；收活毒种，分别浓縮、灭活，取制苗用NDV LaSota 毒株液179&和IBV M4,毒株液179b，加吐温-80制成水相，用白油、司本-80、硬 脂酸铝制成油相，水相与油相之比为l:2,5—起乳化，分装，帖签，装箱，入库。
该鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方法，生产用毒种的制 备NDVLaSota株和IBVM^株毒种分别适当稀释，同时接种SPF鸡胚，孵育， 收获；制苗用病毒液的制备NDV La Sota株和IBV M"株毒种分别适当稀释， 同时接种易感鸡胚,孵育；收获毒种，灭活，加吐温-80制成水相，用白油、司 本-80、硬脂酸铝制成油相，水相与油相之比为1:2—起乳化，分装，帖签,装 箱，入库。
该鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方法，具体浓縮工艺流
程将三种制苗用病毒胚液从冰箱取出，融化后分别在无菌条件下用灭菌的装 有四层纱布和一层100目铜网的无菌漏斗滤过，除去鸡胚液残渣和其他粗颗粒 杂质；然后将粗滤的三种病毒液分别倒入浓縮装置的储缸内，开启一级滤柱的 浓縮阀门，关闭二级超滤柱的阀门，开动电机，使病毒液通过一级滤柱；然后 关闭一级滤柱阀门，开启二级超滤柱阀门，使病毒液反复通过二级滤柱，截留 病毒并排除水分，直至浓縮后的病毒液达到设计的浓縮终点为止。
制备鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的方法，灭活是指破坏微生 物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但尽可能地不影响或少影响其免疫原性
灭活是指破坏病菌微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但尽可能地不影 响或少影响其免疫原性，本发明DNVLasota病毒液采用O. 05 0.15%甲醛溶液，
35 38'C灭活12 17小时，IBV l病毒液采用2-8t;低温灭活120-145小时，
可使病毒彻底灭活，而且不影响其免疫原性。
制备鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的方法，在成品检验中传染 性支气管炎检验，采用血清学的方法判定效力，比常规的功毒检测方法更为准确 结果更可靠，使二种抗原间的免疫干扰问题得到了很好的解决，采用血清学的 方法判定步骤方法，具体方法为取一月龄易感鸡15只，其中IO只各颈部皮 下注射疫苗0.3ml,另5只不接种，作为对照，21日后采血，分离血清，用传染 性支气管炎抗原测定HI抗体。
由于采用了上述的技术方案，本发明具有如下优越性
本发明在生产工艺中独创的将二种毒珠液同时接种同一鸡胚的方法比起两 种毒珠液分别接种鸡胚,节省了鸡胚的使用数量,减少了疫苗生产的操作步骤， 避免了毒种污染机会，而且省去了疫苗制作中的浓縮环节，节省时间，提高效 率。
本发明经过大量试验最终找到了二种毒珠液最佳的配合比例，并解决了两 种毒株液之间的互相干扰问题.使一次接种代替以往的二次接种，收获和灭活 也改两次完成为一次完成，节省了生产成本，縮短了生产周期。本创新必将掀
起灭活苗生产史上的一次革命.
联苗是指不同种微生物或其代谢产物组成的疫苗，联苗可简化接种程序， 减少接种动物应激反应的次数，此外对于产蛋鸡，尤其是种鸡应尽可能避免或 减少在产蛋期间做免疫接种，而鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗主要 是在开产前使用，使用剂量与单苗相当，但其效力与单苗相同，具有使用简便， 接种程序简单等优点，减少疫苗的免疫次数，避免家禽产生不必要的应激，达 到事半功倍的效果。
浓縮可提髙免疫抗原在疫苗终产品中的浓度，本发明的浓縮方法采用了纤
维膜超滤浓縮法，可提高免疫抗原在疫苗终产品的浓度达3倍以上。纤维膜超 滤浓縮装置，设有二级孔径不同的纤维滤柱。 一级滤柱的纤维可滤除部分细菌 和杂质。二级超滤株的中空纤维可截留病毒粒子。
具体实施方式
一
生产用毒种的制备NDV La Sota株和IBV M^株毒种分别适当稀释，分别 接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备NDV La Sota株和IBV仏， 株毒种分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，孵育；收活毒种分别浓縮、灭活. 取制苗用NDV La Sota毒株液15%和IBV En毒株液15%，加吐温-802%制成水 相，用白油60%、司本-804%、硬脂酸铝2%制成油相，水相与油相之比为1:1. 5 一起乳化，分装，帖签,装箱，入库。
具体实施方式
二
生产用毒种的制备NDVLaSota株和IBVM^株毒种分别适当稀释，分别 接种SPF鸡胚，孵育，收获男；制苗用病毒液的制备NDV La Sota株和IBV仏, 株毒种分别适当稀释，分别接种易感鸡胚，孵育；收活毒种，分别浓縮，灭活， 取制苗用NDV La Sota毒株液16%和IBV 1 毒株液16%，加吐温-802%,制成 水相，用白油60%、司本-804%、硬脂酸铝2%制成油相，水相与油相之比为 l:2—起乳化，分装，帖签,装箱，入库。
具体实施方式
三
生产用毒种的制备NDVLaSota株和IBV^株毒种分别适当稀释，分别接
种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备NDV La Sota株和IBV M4,株
毒种分别适当稀释，分别接种易感鸡胚,孵育；收活毒种，分别浓縮，灭活，取 制苗用NDV La Sota毒株液17%和IBV M4,毒株液17%加吐温-802%制成水相.用 白油60%、司本-804%、硬脂酸铝2%制成油相，水相与油相之比为1:2.5 — 起乳化；分装，帖签，装箱，入库。
具体实施方式
四
生产用毒种的制备NDV La Sota株和IBV M^株毒种分别适当稀释，同时 接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备NDV La Sota株和IBV仏, 株毒种分别适当稀释，同时接种易感鸡胚，孵育；收获毒种，灭活，加吐温-802 %制成水相，用白油60%、司本-804%、硬脂酸铝2%制成油相，水相与油相 之比为1:2--起乳化；分装，帖签，装箱，入库。
权利要求
1、一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于新城疫与传染性支气管炎二联灭活疫苗组和，采用NDVLaSota株病毒液，含重量比10～22％；IBVM41株病毒液，含重量比10～22％；分别浓缩、灭活；再加入佐剂白油，免疫助剂吐温、司本、硬脂酸铝制成联苗。
2、 根据权利要求1所述的鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方 法，其特征在于生产用毒种的制备，NDV La Sota株和IBV M^株毒种分别适当 稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备；NDV La Sota株 和IBVM4,株毒种分别适当稀释，分别接种易感鸡胚,孵育；收活毒种分别浓縮、 灭活；取制苗用NDV La Sota毒株液15%和IBV M^毒株液15%,加吐温-80制成水 相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相；水相与油相之比为1:1.5—起乳化； 分装，帖签，装箱，入库。
3、 根据权利要求1所述的鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方 法，其特征在于生产用毒种的制备NDV La Sota株和IBV M4,株毒种分别适当 稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备NDV La Sota株 和IBVM4,株毒种分别适当稀释，分别接种易感鸡胚,孵育；收活毒种分别浓縮、 灭活取制苗用NDVLaSota毒株液1696和IBVM^毒株液1696，加吐温-80制成水 相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相；水相与油相之比为1:2—起乳化；分 装，帖签，装箱，入库。
4、 根据权利要求1所述的鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方 法，其特征在于生产用毒种的制备NDV La Sota株和IBV M^株毒种分别适当 稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；制苗用病毒液的制备NDV La Sota株 和IBVM^株毒种分别适当稀释，分别接种易感鸡胚,孵育；收活毒种，分别浓缩、灭活取制苗用NDVLaSota毒株液179&和IBV恥,毒株液1796，加吐温-80制成水 相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相；水相与油相之比为1:2.5—起乳化； 分装，帖签，装箱，入库。
5、 根据权利要求1所述的鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方 法，其特征在于生产用毒种的制备NDV La Sota株和IBV仏,株毒种分别适当 稀释，同时接种SPF鸡胚，孵育，收获制苗用病毒液的制备NDV La Sota株 和IBV l株毒种分别适当稀释，同时接种易感鸡胚,孵育；收获毒种，灭活，加 吐温-80制成水相，用白油、司本-80、硬脂酸铝制成油相；水相与油相之比为1:2 一起乳化；分装，帖签,装箱，入库。
6、 根据权利要求1所述的鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方 法，其特征在于具体浓縮工艺流程将三种制苗用病毒胚液从冰箱取出，融化 后分别在无菌条件下用灭菌的装有四层纱布和一层100目铜网的无菌漏斗滤过， 除去鸡胚液残渣和其他粗颗粒杂质；然后将粗滤的三种病毒液分别倒入浓縮装置 的储缸内，开启一级滤柱的浓縮阀门，关闭二级超滤柱的阀门，开动电机，使病 毒液通过一级滤柱；然后关闭一级滤柱阀门，开启二级超滤柱阀门，使病毒液反 复通过二级滤柱，截留病毒并排除水分，直至浓縮后的病毒液达到设计的浓縮终 点为止。
7、 根据权利要求1所述的鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方 法，其特征在于灭活是指破坏病菌微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性， DNVLasota病毒液采用0.05 0.15%甲醛溶液，35 38'C灭活12 17小时，IBV M"病毒液采用2-8'C低温灭活120-145小时，可使病毒彻底灭活，而且不影响其免 疫原性。
全文摘要
一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于新城疫与传染性支气管炎二联灭活疫苗组和，采用NDVLaSota株病毒液，含重量比10～22％；IBVM41株病毒液，含重量比10～22％；分别浓缩、灭活；再加入佐剂白油，免疫助剂吐温、司本、硬脂酸铝制成联苗。
文档编号A61K39/12GK101108248SQ20061004842
公开日2008年1月23日 申请日期2006年7月18日 优先权日2006年7月18日
发明者乔荣岑, 习向峰, 孙进忠, 张许科, 荣骏弓 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司