专利名称：用于预防和治疗转移性肿瘤的组合物的制作方法
技术领域：
本申请主要涉及癌症预防和治疗领域，更具体地涉及用于癌症(特别是转移性肿瘤)免疫预防和治疗的方法和组合物。
背景技术：
肿瘤的放射治疗和化疗并不能完全清除肿瘤细胞，同时还损伤了免疫系统。残存的肿瘤细胞(包括转移肿瘤)往往最终夺取了患者的生命。免疫治疗提供了最理想的完全清除残存肿瘤的方法，但是肿瘤往往因免疫系统被肿瘤抗原激活不足而逃脱免疫系统的攻击。免疫系统的激活不足原因在于免疫细胞浸入肿瘤细胞不足，或缺乏足够强的对浸潤肿瘤的淋巴细胞的活化信号。增加T淋巴细胞对肿瘤的浸润常常带来良好的预后。如何增加对肿瘤的免疫力成为清除肿瘤而又不损伤免疫系统的关键。
转移性疾病是癌症致病率和死亡率的主要原因，而且尽管经过数十年在治疗结果改善方面付出的巨大努力，其恶性肿瘤仍然是主要的医学挑战。免疫治疗有潜力成为有希望的根除散布的转移性肿瘤的方案，尤其是在早期。然而，目前在手术切除肿瘤后实行化疗或放疗的标准策略可能会在无意中阻碍免疫治疗的潜在益处。尽管手术切除可以适当地去除不受影响的已建立的肿瘤块，然而伴随此，肿瘤抗原的主要来源将消失，从而可能降低免疫应答的可能性和效力，因为过少的转移性肿瘤可能不能使CTL致敏。减少肿瘤负荷的化疗/放疗可能无意中破坏先前产生的肿瘤特异性CTL并抑制新产生抗肿瘤的CTL，以及可能地诱导耐受性。如何在目前的治疗方案和相关免疫治疗之间达成适当的平衡，一直是根除散布的转移性肿瘤的主要挑战。
目前使用体外扩增的肿瘤特异性T细胞进行的主动免疫策略和过继转移治疗很大程度地依赖于对给定的肿瘤抗原的了解。这些治疗可以应用有限数量的带有特征性肿瘤抗原的癌症患者，但是当出现抗原丢失变体(这常常可以在经历免疫学压力的肿瘤上观察到)时却时常无效。
LIGHT是一种新近鉴定到的针对基质细胞上的LTβR以及T细胞上的疱疹病毒进入介质(HVEM)的配体。我们先前的数据提示，LIGHT介导的信号转导可以增强肿瘤中用于幼稚细胞的募集和活化的淋巴组织趋化因子的产生。但是，不清楚LIGHT是否可用于转移性肿瘤的防治。在本申请中，我们着重于用高表达突变LIGHT的腺病毒进行肿瘤内注射以产生充足的CTL来根除转移性肿瘤。
因此，在本领域中需要提供改进的转移性肿瘤预防和治疗方法。本发明满足了这一需要和其它需要。
发明内容
本发明的发明人检查了手术切除前肿瘤微环境中直接产生的免疫应答是否将允许更多的肿瘤抗原特异性T细胞走出肿瘤部位以巡查和消除周边的转移性肿瘤细胞。在本研究中，我们证实，将表达LIGHT的腺病毒直接接种入自发转移的高侵略性4T1乳腺癌中，之后手术去除该原发性肿瘤，可以根除散布的转移性肿瘤细胞。而且，我们能够清楚地证实，局部治疗可以在肿瘤部位诱导促炎细胞因子环境，并产生充足的肿瘤特异性CTL以离开原发性肿瘤并根除转移性肿瘤。
我们的研究提示，手术前靶向原发性肿瘤可能是一项产生CTL以根除周边和远处的转移性肿瘤的有效策略。因此，我们的研究开辟了一条通过技巧地利用免疫治疗作为根除转移性疾病的手段治疗癌症的新路径。
一般而言，本发明涉及预防和/或治疗肿瘤的方法，该方法包括向患者施用免疫细胞(NK，T，and DC细胞)的激活剂。在特别优选的实施方案中，通过手术前靶向原发性肿瘤来预防和/或治疗转移瘤。
免疫细胞激活剂可以是CD8+T细胞的激活剂。所述激活剂的例子是抗体，尤其是单克隆抗体，人源化抗体等。在一个实施方案中，所述激活剂是编码激活CD8+T细胞的多肽的核酸。
在一个实施方案中，所述免疫细胞激活剂是编码激活免疫细胞的多肽、或者编码激活免疫细胞的多肽的核酸或者包含它的药用组合物。特别地，所述激活剂是LIGHT多肽或者编码LIGHT的核酸。
在另一个实施方案中，所述免疫细胞激活剂是包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)或者包含这种重组载体的药用组合物。
在另一个实施方案中，所述免疫细胞激活剂是包含并表达编码LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤(优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原)或者包含肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
在本发明中，除非另有说明，当提及LIGHT时，LIGHT可以是野生型的、也可以是突变的，尤其是突变LIGHT。优选地，所述突变LIGHT包含阻止蛋白酶对其降解的突变，例如，所述突变LIGHT是不含蛋白酶裂解位点的LIGHT，特别是，对于人LIGHT蛋白，不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位点EQLI的突变LIGHT。但是，本发明不限于通过该突变来减少蛋白酶的消化或降解。或者，所述突变LIGHT优选是具有细胞外域氨基酸序列和标签序列(例如便于纯化的标签)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。LIGHT可以来自哺乳动物，优选来自人，但也可以来自其它动物。
患者可以是哺乳动物，包括但不局限于人。
所述肿瘤可以是任何形式的肿瘤。可以是原发性肿瘤，但是更优选是转移性肿瘤。例如，在一些情况下，肿瘤是实体癌症，例如但不局限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头和颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、胃癌、脑癌、黑色素瘤、鼻咽癌、皮肤癌或肾癌。癌症可以是转移的癌症，例如转移的乳腺癌。癌症可以是生血细胞的癌症，例如淋巴瘤或白血病。当然，熟练技术人员会理解根据本发明可以治疗任何数目的肿瘤/癌症。
在本发明中，除非另有说明，“原发性肿瘤”是一个与“转移性肿瘤”相对的概念，因此，在原发性肿瘤切除后发生的转移性肿瘤也可看作“原发性肿瘤”。
在一个优选实施方案中，所述肿瘤是肝脏肿瘤。
在一个尤其优选的实施方案，本发明涉及预防和/或治疗转移性肿瘤的方法，该方法包括向患者施用免疫细胞激活剂。该免疫细胞激活剂可以是本文提到的任何免疫细胞激活剂，特别是LIGHT多肽或者编码LIGHT的核酸、包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)、包含并表达编码LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤、或者包含它们中一种或者多种的药物组合物。
本发明方法可以采用任何适当的方式给药，例如系统性给药，优选的是例如皮下、肿瘤内给药。
优选的是，在原发性肿瘤切除之前靶向原发性肿瘤。在此情况下，可以在肿瘤内给药。对于肝脏中的肿瘤，表达LIGHT或其它免疫刺激物的腺病毒也可以进行系统性地递送。
本发明还涉及免疫细胞激活剂在制备用于预防或者治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明还涉及包含免疫细胞激活剂的肿瘤细胞或者肿瘤。
本发明还涉及包含免疫细胞激活剂、用于预防或者治疗肿瘤的药物组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
在另一方面，本发明涉及预防和/或治疗肝脏病原体感染的方法，该方法包括向患者施用免疫细胞激活剂。如果适当的话，该免疫细胞激活剂可以是本文提到的任何免疫细胞激活剂，特别是LIGHT多肽或者编码LIGHT的核酸、包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)、或者包含它们中一种或者多种的药物组合物。组织特异性靶向可能是局部疾病更有效的治疗方法。腺病毒可用作病原体诱导的肝炎和肝癌(包括原发性和转移性肝癌)的肝特异性靶向试剂。腺病毒-LIGHT是靶向肝脏疾病(病原体和癌症)的理想试剂。
本发明该方法可以采用任何适当的方式给药，优选系统性给药。
本发明还涉及免疫细胞激活剂在制备用于预防或者治疗肝脏病原体感染的药物中的用途。
本发明还涉及包含免疫细胞激活剂、用于增强肝脏组织内的免疫和/或预防或者治疗肝脏病原体感染的药物组合物。
在优选实施方案中，肝脏病原体感染是病毒感染(特别是HBV和HCV感染)。
在更具体的方面，本发明涉及消除原发性肿瘤的方法，该方法包括给患者施用(例如，向肿瘤内导入)包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)或者包含这种重组载体的药用组合物。所述编码LIGHT的核酸可以编码突变或者未突变的LIGHT，和/或可以经过密码子优化或者未经过密码子优化。优选所述编码LIGHT的核酸编码本文所述的突变LIGHT，并经过密码子优化。
本发明还涉及预防转移性肿瘤的方法，该方法包括给患者施用(例如，向原发性肿瘤内导入)包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)或者包含这种重组载体的药用组合物。
本发明还涉及治疗已有转移性肿瘤的方法，该方法包括给患者施用(例如，向原发性肿瘤内导入)包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)或者包含这种重组载体的药用组合物。
本发明还涉及预防或者治疗肝脏病原体感染的方法，该方法包括给患者施用包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)或者包含这种重组载体的药用组合物。
本发明还涉及用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤的药用组合物，其含有包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)。
本发明还涉及用于预防或者治疗肝脏病原体感染的药用组合物，其含有包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)。所述编码LIGHT的核酸可以编码突变或者未突变的LIGHT，和/或可以经过密码子优化或者未经过密码子优化。优选所述编码LIGHT的核酸编码本文所述的突变LIGHT，并经过密码子优化。
相应地，本发明涉及包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)在制备药物中的用途，所述药物用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤。例如，该药物可通过将所述重组病毒导入到原发性肿瘤内来给药。
本发明还涉及包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)在制备药物中的用途，所述药物用于预防或者治疗肝脏病原体感染。
在另一具体方面，本发明涉及包含并表达编码LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤。优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原。
在一个具体实施方案中，本发明涉及肿瘤细胞或者肿瘤，其转导了包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)。
优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还被辐射处理。
本发明还涉及包含本发明肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
在一个实施方案中，本发明涉及用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤的治疗性和/或预防性肿瘤疫苗，该肿瘤疫苗包含上述本发明的肿瘤细胞或者肿瘤。优选地，该肿瘤疫苗还可包含可药用载体。
相应地，本发明还涉及包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)在制备例如治疗性和/或预防性肿瘤疫苗中的用途，所述肿瘤疫苗用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤。
本发明也涉及上述本发明的肿瘤细胞或者肿瘤在制备治疗性和/或预防性肿瘤疫苗中的用途，所述肿瘤疫苗用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤。
本发明还涉及本发明上述肿瘤疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤。
相关地，本发明涉及消除原发性肿瘤的方法，该方法包括向患者施用本发明的肿瘤疫苗。
本发明还涉及预防转移性肿瘤的方法，该方法包括向患者施用本发明的肿瘤疫苗。
本发明还涉及治疗已有转移性肿瘤的方法，该方法包括向患者施用本发明的肿瘤疫苗。
在用本发明的肿瘤疫苗治疗或者预防疾病时，可通过多种途径来给药，优选通过皮下途径给药。本发明的肿瘤疫苗可以在手术切除原发性肿瘤之后给予。
本发明还涉及用于增强肝脏抗转移性肿瘤、原发性肿瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力的表达免疫增强剂，其含有包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)。
LIGHT可刺激各种免疫细胞、T细胞、NK细胞和DC，因而可以作为免疫增强剂。LIGHT可打破局部肿瘤部位或者肝脏部位的耐受性，由于在这些部位LIGHT的高表达。腺病毒可以特异性靶向肝脏，肝脏含有比其它周围组织更多的T细胞和NK细胞。
本发明还涉及含有包含并表达编码LI GHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)在用于制备表达免疫增强剂中的用途，所述表达免疫增强剂用于增强肝脏抗转移性肿瘤、原发性肿瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力。
本发明还涉及增强肝脏抗转移性肿瘤、原发性肿瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力的方法，该方法包括给患者施用包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)或者上述本发明的表达免疫增强剂。
本发明也还涉及增加肝脏中TNF-α和IFN-γ或者CD8+T细胞的量的方法，该方法包括给患者施用包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)或者本发明的表达免疫增强剂。
在本发明中，本发明的药物和治疗方法可以与其它药物和治疗方法联合使用，例如本发明的药物和治疗方法还可以包括将原发性肿瘤切除、和/或化学治疗、和/或放射治疗。
在一个优选的实施方案中，在原发性肿瘤切除之前向原发性肿瘤内给予本发明的免疫细胞激活剂。
在一个实施方案中，本发明的药物(药物组合物)还包括其它活性成分，并且所述药物被配制成适于本发明的免疫细胞激活剂和所述其它活性成分同时给药或者分开给药的形式。
在某些实施方案中，免疫细胞激活剂和其它活性成分同时进行递送。在某些实施方案中，免疫细胞激活剂和其它活性成分在不同的时候进行递送。在一个实施方案中，所述其它活性成分是化学治疗药物，尤其是对免疫细胞没有实质性毒性的化疗药物。在另一个实施方案中，所述其它活性成分是放疗药物。在一个实施方案中，所述其它活性成分是抗癌疫苗，例如基因疫苗或者肽疫苗。在一个实施方案中，所述其它活性成分是治疗性多肽或者编码治疗性多肽的核酸。
在另一方面本发明还涉及包含并表达编码突变LIGHT的核酸的重组病毒，优选地，该重组病毒是重组腺病毒或者禽痘病毒。优选地，所述突变LIGHT包含阻止蛋白酶对其降解的突变，例如，所述突变LIGHT是不含蛋白酶裂解位点的LIGHT，特别是不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位点EKLI的小鼠突变LIGHT，或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位点EQLI的人突变LIGHT。在另一个实施方案中，所述突变LIGHT具有细胞外域氨基酸序列和标签序列(例如便于纯化的标签)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
为了获得更好的转录和翻译，还可以优化LIGHT的密码子。密码子修饰可改变基因的10-15％，以优化GC含量等。但是，密码子修饰不改变编码的氨基酸序列。
发明人已经系统地修饰了LIGHT的密码子，改变了10％的密码子。这允许更稳定地表达高水平的LIGHT。优选的例子在下文实施例中进行了描述。
优选所述编码LIGHT的核酸编码本文所述的突变LIGHT，并经过密码子优化。
在另一方面本发明还涉及包含本发明重组病毒的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
在另一方面本发明还涉及本发明病毒或者组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在另一方面，本发明还涉及治疗癌症或者破坏肿瘤的方法，包括向癌症患者给予包含并表达编码突变LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)或者包含这种重组载体的药用组合物；或者向癌症患者给予包含并表达编码突变LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤(优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原)或者包含这种肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。在一个优选实施方案中，所述给予是向肿瘤内给予。
在另一方面，本发明还涉及包含并表达编码突变LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤，优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原；还涉及包含本发明肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
在本发明的所有方面(包括本发明的组合物、用途、肿瘤细胞或者肿瘤、疫苗、或者重组病毒，如果适用的话)的一个优选实施方案中，所述LIGHT编码核酸是相对于宿主进行了密码子优化的核酸，更优选进行了密码子优化并突变了蛋白酶裂解位点以阻止蛋白酶对编码的LIGHT蛋白降解的核酸，例如，编码不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位点EKLI的小鼠突变LIGHT多肽或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位点EQLI的人突变LIGHT多肽并经过密码子优化的核酸，优选SEQ ID NO2和3中所示的编码核酸。
本发明还涉及经过密码子优化但不改变氨基酸序列的LIGHT编码核酸，优选人LIGHT编码核酸。本发明还涉及经过密码子优化并突变了蛋白酶裂解位点以阻止蛋白酶对编码的LIGHT蛋白降解的核酸，例如，编码不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位点EKLI的小鼠突变LIGHT多肽或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位点EQLI的人突变LIGHT多肽并经过密码子优化的核酸，优选SEQ IDNO2和3中所示的编码核酸。本发明还涉及包含上述核酸的载体以及转化了该载体的宿主细胞。
可考虑到，如果适当，在该说明书中所讨论的任何实施方案可以就本发明的任何方法或组合物进行实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于获得本发明的方法。
在整个该申请中，术语“大约”用于表明，值包含用于测定该值的设备、方法的固有误差变化，或者包含在研究患者中存在的变化。
在该说明书和权利要求中使用时，词“含有”、“具有”、“包括”或“包含”是宽泛的或无限制的，它们不排出另外的、未描述的成分或方法步骤。
本发明的其他目标、特征和优点将会从下面的详述中清楚地了解到。可是，应当理解，详述和特殊的实施例虽然指出了本发明的特殊实施方案，但只是为了举例说明，因为从该详述中，在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰对于本领域熟练技术人员来说都会是显而易见的。
图1A.通过用Ad-LIGHT在肿瘤内治疗来根除已经建立的转移性肿瘤。在Balb/c小鼠胁腹皮下注射的4T1乳腺癌细胞在肿瘤接种后第14天和第17天用Ad-LIGHT或Ad-control(Ad-对照)(2×109PFU)皮下处理。在第28天手术切除原发肿瘤(～150mm3)，在第35天处死小鼠用于肺集落生成试验(colonogenic assay)。数据代表三个实验。
B.用辐射后的自体肿瘤细胞接种根除已建立的肿瘤转移。在第0天在Balb/c胁腹皮下接种6×104个4T1肿瘤细胞。在第22天手术取出原发肿瘤，之后向乳房脂肪垫中皮下注射经Ad-LIGHT或Ad-对照(4×109PFU)感染及辐射后的4T1细胞(1×106个细胞)。第21天，在小鼠的乳房垫中第二次注射接种新鲜制备的细胞。肿瘤接种后第45天处死小鼠，并通过肺集落生成试验进行分析。数据为两个独立实验的代表。
#cologenic tumer cells per liver每个肝脏的集落生成肿瘤细胞数Ad-Control含有对照的腺病毒Ad-LIGHT含有LIGHT的腺病毒图2.肝细胞对腺病毒感染敏感。给小鼠注射3×109pfu。48小时后，消化肝细胞并收获用于通过LTbR-Ig和抗人-FITC测定进行的LIGHT表达分析。
图3.1×106个肿瘤细胞铺于100mm细胞培养皿中24小时，然后用Ad-LIGHT以4×108pfu/ml感染24小时。收获细胞，并通过FACS检查LIGHT表达先使用0.02mg/mL LTβR-Ig染色，然后使用第二步抗体PE偶联的猴抗人IgG染色(白色)；或者仅仅使用第二步抗体进行染色，作为对照(灰色)。
图4.Ad-LIGHT治疗可控制自发性转移瘤。A-B.4T1肿瘤细胞上LIGHT的局部表达可预防自发性转移瘤的发生。体外培养的4T1乳腺癌(1×106个细胞)用Ad-LIGHT或者Ad-对照(4×108PFU/ml)感染24小时，然后皮下注射1×105个细胞到Balb/c小鼠胁腹。检测肿瘤生长(A)，直到接种肿瘤后第35天处死小鼠，进行肺集落生成分析(B)。数据代表了两个实验。C.向肿瘤内注射Ad-LIGHT可预防转移瘤扩散。皮下注射1×105个4T1乳腺癌细胞到Balb/c小鼠胁腹。在接种肿瘤后第7天，向肿瘤内注射Ad-LIGHT或者Ad-对照(5×109PFU)。在第18天手术切除原发性肿瘤。在接种肿瘤后第35天处死小鼠，用于肺集落生成试验。数据代表两个独立实验。
图5.肿瘤内LIGHT刺激的抗原特异性T细胞可转移到远端部位。A.向OT-1小鼠皮下接种表达相同量Ld抗原的106Ag104Ld或者Ag104Ld-LIGHT细胞。10-14天后，向这些OT-1小鼠输注3×106CFSE-标记的2C T细胞。过继转移后第14-20天在引流淋巴结(DLNs)、非DLNs和脾脏以及肿瘤本身中评价2C T细胞表达CD44和分泌IFN-γ的情况。B-C.每只OT-1小鼠用两个肿瘤接种。原发性肿瘤是106Ag104Ld或者Ag104Ld-LIGHT肿瘤细胞，而继发性肿瘤是105Ag104Ld肿瘤细胞。在肿瘤攻击后第10-14天，向小鼠输注3x106CFSE-标记的2C T细胞。在原发性肿瘤和继发性肿瘤中在过继转移后第3、5和10天评价2C T细胞的存在和CFSE稀释(CFSE dilution)(B)。比较在带有表达LIGHT的Ag104Ld或者亲本Ag104Ld的宿主中继发性肿瘤内2C T细胞的百分比(C)。D.过继转移后，来自Ad-LIGHT处理小鼠淋巴器官的T细胞介导了对已建立肿瘤的排斥。将105Ag104Ld肿瘤细胞接种到C3B6F1小鼠中。在肿瘤攻击后第14天用5×1010个Ad-LIGHT或Ad-control病毒颗粒处理小鼠。在处理后第7天，我们从处理小鼠收集脾脏和淋巴结，纯化T细胞，并将107个这些T细胞过继转移到带有已经建立7天的Ag104Ld肿瘤的C3B6F1小鼠中。检测这些小鼠中肿瘤的生长。
图6.对原发性肿瘤用Ad-LIGHT处理可在继发性肿瘤中诱导强烈的抗肿瘤免疫应答。在原发性肿瘤攻击6天后用105Ag104Ld和105Ag104Ld肿瘤细胞接种每只C3B6F1小鼠。在继发性肿瘤接种5天后在原发性肿瘤接种物上用5×1010腺病毒颗粒进行肿瘤内Ad-LIGHT处理。检测原发性和继发性肿瘤的生长(A)。检查DLN、脾脏、原发性肿瘤和继发性肿瘤中CD8+T细胞占Ly5.2+细胞的百分数以及产生IFN-γ的CD8+T细胞占CD8+T细胞的百分数(B)，并进行统计学分析(C)。在Ad-LIGHT或者Ad-对照处理7天后收获脾脏和肿瘤组织，研磨这些组织，收集上清液进行细胞因子测定(D)。
图7显示了一个突变了蛋白酶位点、同时又优化了密码子的小鼠LIGHT序列(SEQ ID NO3)。
图8显示了野生型LIGHT、突变型LIGHT、突变且经密码子修饰的LIGHT的表达。
具体实施例方式
LIGHT治疗LIGHT是一个新发现的作用于免疫调节的基因。我们所进行的突变和密码子修饰能够提高其在细胞表面表达的稳定性从而更好地刺激免疫反应。对LIGHT的四个氨基酸的突变阻止了该蛋白质的降解。在未突变时，在转染的细胞系中没有抗肿瘤活性。密码子修饰允许表面上的LIGHT增加4-8倍(见下文实施例)。LIGHT的增加对于起抗肿瘤活性的增加是重要的。我们关于采用LIGHT将肿瘤组织转化为淋巴组织的发明包括了一个新的基因免疫治疗的思想和一个新的突变基因。
我们已经明确一种新的对肿瘤的免疫治疗方法通过在肿瘤组织中诱发淋巴组织使淋巴细胞能够直接接触和攻击肿瘤细胞，在肿瘤内部诱导适当的免疫反应并产生更多的效应T细胞从而清除转移瘤及根除肿瘤。LIGHT是作为基质细胞表达的淋巴毒受体和T细胞表达的HVEM的配合体。通过将突变的LIGHT引入肿瘤组织之中，将诱发出高水平的化学因子和粘附分子，并且伴随大量的未活化T淋巴细胞的津润。LIGHT的突变体阻止了蛋白酶对其的降解，使得LIGH能够在肿瘤细胞的表面完整表达。LIGHT对免疫反应的协同激活活性将对肿瘤特异的T淋巴细胞反应的选择性激活有极大的帮助，从而有益于清除现存的高进行性的原发肿瘤和其他衍生部位的肿瘤。表达LIGHT的肿瘤细胞可以作为临床相关的治疗性疫苗，可用于根除已存的原发肿瘤。表达LIGHT的肿瘤细胞作为临床相关的治疗性疫苗将在肿瘤内部吸引并活化原始淋巴细胞，从而产生更多的抗肿瘤淋巴细胞用于清除肿瘤。我们的研究已经证明肿瘤坏死因子超家族(TNFSF14)和LIGHT能够在肿瘤内部的基质细胞和淋巴细胞表面形成受体信号并吸引肿瘤特异性的T细胞。我们发现LIGHT转化的肿瘤细胞能够通过协同其两类受体的新的作用而增强对已存原发肿瘤的免疫清除反应。我们的研究数据表明肿瘤组织表达的LIGHT具有更强的激发对原发进行性肿瘤的清除作用，强于其他细胞因子和协同刺激分子的激发作用(NatureImmunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149)。到目前为止，象LIGHT这样，有如此双重的征召和激活T细胞的效能的分子尚未见有任何其他的报道。这样的特性使我们能够开发出一种全新的对肿瘤的免疫治疗方法。
优选地，LIGHT是突变LIGHT。特别优选的是，所述突变LIGHT包含阻止蛋白酶对其降解的突变，例如，所述突变LIGHT是不含蛋白酶裂解位点的LIGHT，特别是不合LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位点EQLI(对于人LIGHT而言)的突变LIGHT。在另一个实施方案中，所述突变LIGHT具有细胞外域氨基酸序列和标签序列(例如便于纯化的标签)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。LIGHT氨基酸序列以及氨基酸残基编号参见Nature Immunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149。另一个重要的改变是密码子修饰，这允许更好地表达LIGHT。在本发明之前，没有人进行密码子修饰来研究其表达。我们的数据显示，突变和密码子修饰显著提供了LIGHT的表达。
LIGHT或者突变体LIGHT的给药优选是通过各种病毒投送系统或表达LIGHT的肿瘤细胞来进行的。具体地，包括向癌症患者给予包含并表达编码突变LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)或者包含这种重组载体的药用组合物；或者向癌症患者给予包含并表达编码突变LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤(优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原)或者包含这种肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。在一个优选实施方案中，所述给予是向肿瘤内给予。特别是，将上述重组病毒或者肿瘤细胞注射到肿瘤原发部位优选的病毒投送系统包括，但不限于，重组的腺病毒和禽痘病毒(fowlpox virus)等其他病毒。在特别优选的实施方案中，突变体LIGHT通过重组的腺病毒和禽痘病毒来给药。如果原发肿瘤细胞在1-2月内未能被清除，肿瘤将被手术切除或放射照射。我们的前期实验发现经过LIGHT的治疗处理，动物体建立了强烈的肿瘤免疫记忆，能够清除末梢部位的肿瘤。
使用重组的腺病毒和禽痘病毒来给药具有特别的优点，例如，效率更高和更安全。由于易于生产而且产量高，重组腺病毒已经广泛用于人和动物实验，但是大多数患者可能会有抗腺病毒抗体，它们可能会迅速中和注入的腺病毒。还不清楚肿瘤内注射腺病毒是否会避免这种快速清除。很少有患者在血清中有抗禽痘病毒抗体。因此，这种重组病毒的持续是一个潜在优点。有可能能够初始使用重组腺病毒、然后用禽痘病毒治疗患者，以降低宿主清除病毒的反应。我们的初步结果显示，将带有50ul of重组LIGHT的5×1010病毒颗粒在肿瘤内注射到已建立的Ag104Ld肿瘤中，导致局部和远处肿瘤的排斥(5/5)，而对照病毒(没有LIGHT)没有明显保护(5只小鼠中0只被排斥)并且所有小鼠在两个月内死于肿瘤。重复实验获得了相似的结果。(请给出具体试验过程，更多的实例在以下给出)Ad-LIGHT可介导已经建立的自发肝转移性肿瘤(establishedspontaneous liver metastasis)的排斥。现有治疗方法可成功根除转移性肿瘤的极为稀少。我们目前测试了在手术切除肿瘤之前在肿瘤组织内产生免疫应答是否能够产生足以根除远处转移性肿瘤(distant metastases)的肿瘤特异性效应T细胞。将表达LIGHT的腺病毒接种到处于已经发生了转移的阶段的原发性4T1乳腺癌中。如下面的实施例证明的，这种治疗能够根除转移性肿瘤。
药物组合物本发明药物组合物含有有效量的免疫细胞激活剂和可药用载体。术语“可药用”是指当施用于动物(如果合适，例如为人类)时，不产生不利的、过敏的或其它不想要的反应的分子实体和组合物。根据本发明的公开内容以及Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.Mack Printing Company，1990(此处引用作为参考)的说明，本领域普通技术人员知道如何制备含有免疫细胞激活剂的药物组合物。而且，对于动物(例如人类)施用来说，应理解该制剂应该满足管理当局所要求的无菌性、热原性、总体安全性和纯度标准。
如此处所用，″可药用的载体″是指本领域普通技术人员所知的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓试剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、类似物质及其组合(参见，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack Printing Company，1990，pp.1289-1329，此处引用作为参考)。除非传统载体与活性组分不相容，否则它们都可以用于所述药物组合物中。
本发明的药物组合物可以含有不同类型的载体，这取决于它是以固体、液体还是气雾剂的形式施用以及它是否需要灭菌以适用于注射之类的施用途径。本发明组合物可以如本领域普通技术人员所知的经静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、肿瘤内、腹膜内、鼻内、直肠内、表皮(topical)、肌内、皮下、粘膜地、口服、表皮地、局部地、吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注等方式施用，或直接、经导管、经灌洗器而局部灌注扩散于靶细胞，或以霜剂、液体组合物(例如脂质体)或其它方式或上述的任何组合来施用。参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.Mack PrintingCompany，1990，此处引用作为参考)。
对于HBV、HCV、原发性肝脏肿瘤或肝脏中的转移性肿瘤，表达LIGHT或其它免疫刺激物的腺病毒也可以进行系统性地递送。
系统性给药的腺病毒能够优先地定位于肝脏并在该位点刺激局部免疫细胞以根除肿瘤。
用于癌症/肿瘤的组合疗法为了增强免疫细胞激活剂的效能，理想的是，将本发明的这些组合物和方法与有效治疗过度增生性疾病的物质(例如抗癌试剂)联用。“抗癌”试剂能对受试者中的癌产生负影响，例如，通过杀死一种或多种癌细胞、在一种或多种癌细胞中诱导细胞凋亡、降低一种或多种癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或数目、减少肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或一种或多种癌细胞的血液供应、提高对一种或多种癌细胞或肿瘤的免疫应答、防止或抑制肿瘤的发展、或者增加癌症患者的寿命。抗癌试剂包括，例如，化疗试剂(化学疗法)、放疗试剂(放射疗法)、手术方法(手术)、免疫治疗试剂(免疫疗法)、遗传治疗试剂(基因疗法)、激素疗法、其它生物试剂(生物疗法)和/或替代性疗法。
“抗癌”试剂的一个优选例子是调节性T细胞耗损剂。调节性T细胞耗损剂是任何一种或多种耗损调节性T细胞的化合物、组合物、混合物或者联合制剂。调节性T细胞耗损剂包括，但不限于，抗调节性T细胞抗体，如人源化的抗-CD4抗体；或者此处公开的、现有技术已知的或将要被发现的耗损调节性T细胞(特别是CD4+T细胞)的任何其它化合物或者一个或者多个这种化合物的组合。
在这些方面，所述调节性T细胞优选是CD4+T细胞，特别是CD4+CD25+T细胞。所述调节性T细胞可以在肿瘤部位处，和/或在肿瘤内，和/或在肿瘤外。所述耗损可以是肿瘤局部的，和/或是全身性的。
在一个实施方案中，所述调节性T细胞耗损剂是调节性T细胞的抗体，特别是抗CD4+抗体，如抗CD4+CD25+抗体；或者，所述调节性T细胞耗损剂是IL2-毒素。所述抗体优选是抗人CD4+抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体。优选地，抗体是人源化抗体。
更一般地说，这样的(抗癌)试剂将与免疫细胞激活剂一起以有效杀死癌细胞或抑制其增殖的组合量提供。这样的方法可以包括将细胞与试剂和免疫细胞激活剂同时接触，或者在一个时间段内接触，其中将免疫细胞激活剂与试剂分开施用给细胞、组织或生物产生了所需的治疗效果。这也可以通过下述方式实现将细胞、组织或生物与同时含有免疫细胞激活剂和一种或多种试剂的单一组合物或药物制剂接触，或者将细胞与两种或多种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物包含免疫细胞激活剂，而另一种组合物包含一种或多种试剂。
当用于细胞、组织或生物时，术语“接触”和“暴露”在此处是指这样一种过程，借助于该过程，免疫细胞激活剂和/或其它试剂(例如化疗试剂或放疗试剂)的治疗构建物被递送于靶细胞，或被直接并列置于所述靶细胞、组织或生物中。为了杀死细胞或使细胞静息，免疫细胞激活剂和/或额外试剂以有效杀死所述细胞或防止它们分裂的组合量递送给一种或多种细胞。
免疫细胞激活剂可以在其它试剂之前、与其同时和/或在其之后施用，其间的时间间隔为数分钟至数星期。在一些实施方案中，免疫细胞激活剂与其它试剂分开施用于细胞、组织或生物，在这样的实施方案中，通常应该保证每次递送之间的时间间隔不应太长，从而使得耗损CD4+T细胞的化合物和试剂仍能对所述细胞、组织或生物施加有利的组合效果。
实施例引入下面实施例来证明本发明的优选实施方案。本领域普通技术人员将意识到，下面实施例所公开的技术代表本发明人所发现的用于很好实施本发明的技术，因此可以认为它们构成了实施本发明的优选方式。但是，在阅读本发明公开内容后，本领域普通技术人员也应认识到，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变而仍能得到相似的结果，但又不背离本发明的精神和范围。
材料和方法小鼠和细胞系。5-8周大小的雌性C3HxB6F1(C3B6F1)和C3H小鼠购自US National Cancer Institute的Frederick CancerResearch Facility，并被饲养于芝加哥大学的不含病原体的特定设备中。根据学院和National Institutes of Health(NIH)的规定对动物进行照料和研究，并经芝加哥大学的动物使用委员会的批准。已经描述了表达鼠H-2Ld(AG104-Ld)的Ag104细胞系(Wang，2001)和Ag104纤维肉瘤(Wick等人，1997)。
组织学和免疫学。用于组织学检查的人类肿瘤组织于10％缓冲的中性福尔马林中固定，石蜡包埋，并使用标准方法用苏木精和曙红(H&E)染色，或根据制造商的说明用特异于CD4(NovocastraLaboratories，UK)和CD8(DAKO，CA)的单克隆抗体染色。分别通过使用DAB(Sigma-Aldrich，MO)的过氧化物酶技术或使用Vector Blue(Vector，CA)的APAAP技术来揭示抗-CD4或抗-CD8抗体的结合。对于乳腺癌样本，在一个随机选取的40倍高被视野中对CD4+和CD8+细胞进行手工计数。
测量脾和肿瘤中的细胞因子。根据描述(Janssen等人，2003)，本发明人制备了肿瘤和脾的匀浆。简而言之，收集相当数量的肿瘤或脾组织，称重，并在含有蛋白酶抑制剂的PBS中进行匀浆，通过离心收集上清液。根据制造商的说明，在配有细胞QuestPro和CBA软件的FACSCaliber血细胞计数器(BD Pharmingen)中使用细胞计数珠阵列试剂盒(CBA)来定量上清液中的细胞因子数量。
流式细胞分析。使用异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的、藻红蛋白(PE)缀合的、Cy-铬缀合的或生物缀合的针对小鼠CD45RB、CD4、CD8、CD25和IFN的抗体(均来自BD Pharmingen)进行FACS分析。链霉亲合素-Cy-铬缀合物来自BD Pharmingen；针对2C TCR的生物素缀合的克隆型抗体(1B2)细胞染色按照所描述的进行(Sun和Bevan，2003)。对于细胞内细胞因子染色，在Brefeldin A(Sigma-Aldrich)的存在下，用PMA(50ng/ml，Sigma-Aldrich)和离子霉素(500ng/ml，Sigma-Aldrich)对纯化自肿瘤组织的T细胞再刺激4小时。对于CFSE-标记的2C T细胞的分析，用生物素化的1B2抗体对分离的肿瘤或脾单细胞悬浮液进行染色，洗涤，并用PE偶联的抗-CD8和CyC偶联的链霉亲合素的混合物染色。用FlowJo软件(BD Pharmingen)分析FACS数据。
2C T细胞的适应性转移。本发明人首先通过将106MC57-SIY个肿瘤细胞皮下接种于B6/Rag-1-/-背景的2C小鼠(2C小鼠)的多个位点来激活2C T细胞(Sun和Bevan，2003)。发明人接着从这些被攻击的2C小鼠中分离淋巴结细胞和脾细胞，并在肿瘤接种后5天用CD8+T细胞富集试剂盒(Miltenyi Biotec)对CD8+T细胞进行负选择。当分析时，大部分2C细胞表达CD44高CD62L低表型。按照所描述的(Sun和Bevan，2003)，接着用CFSE对这些2C T细胞进行标记。发明人将3×106个CFSE-标记的T细胞(体积0.2-ml)静脉内注射于带有肿瘤的小鼠的眼窝后血管丛(retro-orbital plexus)。转移后48小时从脾和肿瘤中分离细胞，并进行FACS分析。
实时定量性RT-PCR检测。按照描述(Shedlock和Shen，2003)，对foxp-3进行实时定量性反转录PCR(RT-PCR)检测。简而言之，从肿瘤中分离总RNA，使用First Strand cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia，NJ)将5μg总RNA反转录成互补。在CepheidSmartCycler实时热循环仪(Cepheid，CA)上进行实时定量性PCR分析。根据制造商的说明(PE Applied Biosystems，MA)，用含有AmpliTaqGold DNA Polymerase的TaqMan Universal PCR master混合物扩增每一cDNA样品中的foxp-3和GAPDH。发明人利用比较型CT(扩增曲线和阈值的交点处的阈值循环数目)方法确定了目标基因的浓度，并将数值对内部GAPDH对照进行标准化。用于foxp-3的引物序列为5′-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3′(正向引物)和5′-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3′(反向引物)，用于FOXP-3的探针为5′-ATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-3′。
制备表达LIGHT的腺病毒。先前(22)已经制备了突变鼠LIGHT(mmLIGHT)。为了构建重组mmLIGHT-腺病毒，从pCDN3.1-mmLIGHT切下含有鼠LIGHT cDNA的BamH1/NotI片段，将该片段克隆在第一亲本质粒pLEP-ubp(左端质粒(？)，Tetr)的BamH/NotI位点中位于人类泛素启动子(ubp)后。之后，pLEP-mmLIGHT与第二质粒pREP(右端质粒，Ampr)在唯一的内含子编码的Cla I位点连接。用λ噬菌体包装提取物包装连接产物。通过Amp/Tet LB琼脂板上的生长选择pLEP/pREP杂合粘粒。利用Bgl II消化进一步鉴定含有插入的mmLIGHT的重组粘粒。通过I-Ceu I消化从重组粘粒中释放出Adv-mmLIGHT DNA片段，并且不经进一步纯化，用I-CeuI消化的混合物转染293细胞以制备重组腺病毒(Adv-mmLIGHT)。
肿瘤注射、治疗和通过集群生成试验评价肿瘤转移。对于Ag104Ld肿瘤，用结果部分中所述的剂量皮下接种C3B6F1小鼠的尾根部周围区域。对于B16-SIY和MC38肿瘤，分别用106或105个肿瘤细胞皮下接种B6小鼠的尾根部周围区域。对于4T1肿瘤，用105个肿瘤细胞皮下接种Balb/c小鼠的尾根部周围区域或乳房脂垫内。在含有所示量的病毒粒和pfu的50μl PBS中用Ad-LIGHT或Ad-对照病毒肿瘤内接种肿瘤块。为了手术切除原发性4T1肿瘤，在手术前麻醉小鼠，用无菌器械切除肿瘤。以金属夹闭合伤口。所有小鼠均未发生手术中的死亡。从此实验中排除在手术切除部位复发原发性肿瘤的小鼠。对于肿瘤转移的评价，收集并切碎肺，之后在补充5％FCS并含有1.5mg/ml 4型胶原酶(Sigma)的DMEM中于37℃振荡孵育期中以178rpm速度离解30分钟。然后，以在补充10％FCS和60μM 6-硫代鸟嘌呤的DMEM中的不同稀释度接种器官。5-10天后计数代表微转移的各单集落。
体外感染和用辐射后的肿瘤细胞免疫接种。在100mm细胞培养皿中接种1×106个细胞24小时，然后用Ad-对照或Ad-LIGHT以4×108pfu/ml进行24小时感染。收获细胞，通过以0.02mg/mL LTβR-Ig之后以PE-偶联的驴抗人IgG(Jackson，West grove，PA)染色，利用FACS检查LIGHT的表达。对于免疫接种，感染后收获的、经确认表达LIGHT的肿瘤细胞以1500rads照射，之后皮下注射至乳房脂垫内。所有感染均在经核准的防生物危害罩中实施。
从肿瘤组织分离细胞。首先给小鼠放血以减少血液对肿瘤组织的污染。收集肿瘤组织，PBS中洗涤，切成碎片，之后重新悬浮在补充5％FCS和1.5mg/ml胶原酶D(胶原酶D溶液)的DMEM中于37℃振荡孵育器中孵育40分钟。40分钟后收集单细胞悬浮液，在胶原酶D溶液中再消化细胞团快40分钟直到所有肿瘤组织均分解成单细胞悬浮液。
肿瘤生长差异的统计学分析。由于在相同小鼠中随时间重复观察到肿瘤的生长，故使用长度数据的随机效应模型来分析该数据。对于每一实验，假定肿瘤生长取决于治疗并且随时间遵循线性生长速率。该模式针对每组给出了线性生长的截距和斜率的大体估计。截距和斜率均被允许随小鼠个体而变化。我们的兴趣主要在于比较斜率，即生长速率，是否在不同的治疗组是不同的。由于在整个跟踪研究期间肿瘤的实际生长不可能遵循线性生长趋势。在一些实验中，肿瘤生长在早期时增加缓慢，在后期变快。我们也通过在上述随机效应模型中加入跟踪时间的二次项，对此进行了研究。
实施例1手术切除肿瘤前在肿瘤内给予ad-LIGHT可根除预先已经存在的转移性肿瘤由于皮下注射1054T1肿瘤细胞一贯在肿瘤接种后11天在肺中产生可检测的转移性肿瘤，所以在第11天的时间点之后用Ad-LIGHT(可表达LIGHT的重组腺病毒)治疗将会表明该治疗对接种的(seeded)转移性肿瘤细胞的有效性。我们给WT Balb/c小鼠皮下接种了1054T1肿瘤细胞。在肿瘤攻击后第14天，肿瘤已经建立成显著的实体块，此时开始2×109pfu Ad-LIGHT或者Ad-对照的治疗。该治疗给予两次(第14天和第17天)。然后，在最后一次治疗后，从用Ad-LIGHT或者Ad-对照治疗的小鼠经手术取出原发性肿瘤。
在接种原发性肿瘤后第35天处死小鼠，分析肺中的转移性肿瘤。在Ad-对照治疗的小鼠中观察到大量转移性集落，而在用Ad-LIGHT治疗的小鼠中检测到的转移性肿瘤细胞的数量显著降低(见图1A)。该结果提示，肿瘤内给予ad-LIGHT可有效增强免疫，根除预先已经存在的转移性肿瘤，特别是在肝脏中。
实施例2接种Ad-LIGHT感染的肿瘤细胞可治疗转移性肿瘤本实施例确定经过辐射的自体肿瘤细胞进行免疫接种是否能根除已经建立的转移性肿瘤。在第0天在Balb/c小鼠胁腹皮下接种6×1044T1肿瘤细胞。在第22天手术取出原发性肿瘤，之后在乳腺脂肪垫中皮下注射Ad-LIGHT或者Ad-对照(4×109PFU)感染的、经过辐射的4T1细胞(1×106细胞)。在第21天，在小鼠乳腺脂肪垫中第二次免疫接种(注射)新鲜制备的细胞。在肿瘤接种后第45天处死小鼠，通过肺集落生成实验进行分析。结果见图1B，表明用辐射后的自体肿瘤细胞接种根除了已建立的肿瘤转移。
重要的是，对于患有肝转移性肿瘤的这类肿瘤患者ad-LIGHT感染的肿瘤细胞可以是非常有效的疫苗。有利的是，在手术除去原发性肿瘤之后用这种疫苗治疗患者。
实施例3用Ad-LIGHT可治疗肝脏病原体感染和肿瘤为了检查注射ad-LIGHT后肝细胞是否表达LIGHT，用5×1010ad-LIGHT注射小鼠。24小时后，分离肝细胞并用可溶性LTbR(LIGHT的受体)染色。结果(见图2)清楚地显示，一部分肝细胞(4.5％)为LIGHT阳性。此数据证实肝细胞对腺病毒敏感。
如图1和图2所示，递送的表达免疫刺激的腺病毒可以在肝中累积，并增强局部免疫力。我们提议也可以将此方法用于治疗肝脏中的病原体和原发性癌症，例如，HBV、HCV和肝细胞癌(HCC)。
实施例4Ad-LIGHT控制自发的肿瘤转移已知肿瘤转移是癌症患者发病和死亡的主要原因，因此确定Ad-LIGHT对原发性肿瘤的治疗是否能够诱导足够的免疫应答以控制散布的转移瘤是极为有意义的。4T1乳腺癌就其解剖学位置、免疫原性、生长特征、及更重要的，转移性质而言极为类似人类乳腺癌(23-25)。由于手术去除生长中的4T1肿瘤后将不能赋予对再次攻击的防御作用，该肿瘤具有差的免疫原性(10)(数据未显示)。当我们向野生型(WT)Balb/c小鼠的乳房脂垫或尾根部周围区域皮下注射105个4T1肿瘤细胞时，在肿瘤接种后11天于各种器官和引流淋巴结(LN)中一致地检测到肿瘤转移。
为了确定在原发性肿瘤部位通过Ad-LIGHT产生的抗肿瘤应答是否可能足以清除或控制微散布的肿瘤细胞，我们首先用Ad-LIGHT或Ad-对照体外感染4T1肿瘤细胞。感染后24小时，用Ad-LIGHT感染的4T1肿瘤细胞表达高水平的LIGHT，而用Ad-对照感染的细胞不表达可检测水平的LIGHT(图3)。然后，从Ad-LIGHT感染后24小时的培养物收获肿瘤细胞，并将105个表达LIGHT的或Ad-对照感染的4T1肿瘤细胞皮下接种至Balb/c小鼠体内。监测皮下生长的原发性肿瘤35天，之后处死小鼠，使用集落试验评价肺中的转移。我们发现，原发性肿瘤的生长受到阻碍但是仍然继续发展而未完全受到排斥(图4A)。然而，尽管未能排斥原发性肿瘤，但是在接种表达LIGHT的4T1肿瘤细胞的小鼠的肺中未检测到转移细胞的集落，而在携带对照肿瘤的小鼠的肺中检测到大量的转移(图4B)。CD8+T细胞的耗竭废除了该效应(数据未显示)。对肿瘤转移的控制可以归因于在原发性肿瘤中局部表达的LIGHT，因为在该模型中远处的肿瘤细胞不可能被感染而表达LIGHT。这些结果说明，4T1肿瘤在肿瘤生长初期的LIGHT表达不足以诱导对原发性肿瘤产生排斥，但是足以在存在生长的肿瘤细胞的情况下控制肿瘤的转移。
我们接着意欲测试Ad-LIGHT的治疗效果。我们研究了直接递送至已建立的肿瘤内的Ad-LIGHT是否可以控制癌转移。7天在Balb/c小鼠皮下建立105个4T1肿瘤细胞的生长，之后向肿瘤内注射5×109pfuAd-LIGHT或Ad-对照。我们观察到，原发性肿瘤的生长在Ad-LIGHT治疗后受到一定程度的抑制，但是仍继续生长(数据未显示)。为了模拟临床治疗情况，在肿瘤接种后18天手术移除原发性肿瘤。然后在注射原发性肿瘤后35天处死小鼠，使用集落生成试验评价肺中的肿瘤转移。有意义的是，我们未在得到Ad-LIGHT治疗的小鼠的肺中检测到转移，而在对照小鼠的肺中发现了大量的转移癌细胞(图4C)。这些结果说明通过腺病毒基因转移递送至已经建立的原发性肿瘤中的LIGHT能够诱导显著的肿瘤特异性CTL以控制自发性肿瘤转移的发生。
实施例5激活的肿瘤抗原特异性T细胞离开LIGHT介导的肿瘤环境并随后出现在淋巴组织中我们观察到通过腺病毒向肿瘤内递送的LIGHT诱导了强烈的抗肿瘤免疫并且对自发性转移造成排斥。我们猜测，Ad-LIGHT能够从肿瘤内刺激肿瘤特异性CD8+T细胞并产生效应/记忆T细胞，这些效应/记忆T细胞随后系统循环并对散布的肿瘤细胞产生排斥作用。然而，验证在引流LN中检测到的激活的肿瘤特异性T细胞是来自肿瘤或者是在引流LN中产生的是困难的，因为在两个区室中可能发生肿瘤抗原的交叉呈现。为了清楚地区分该肿瘤特异性T细胞是最先在肿瘤中或是在淋巴组织中被激活，我们使用了如下系统，在该系统中反应性T细胞仅仅通过肿瘤细胞上的直接呈递识别抗原。我们先前已经报道过，在B6/OT-1/Rag-1-/-宿主(H-2b)(OT-1小鼠)中，识别Ag104Ld肿瘤(经转染表达H-2Ld的纤维肉瘤)的过继转移的2C TCR转基因T细胞不能被间接呈递所激活，而是仅仅能够通过异常MHC I型分子的直接呈递而被激活(22，26)。这些宿主小鼠缺乏与Ag104Ld肿瘤反应的内源性T细胞，而且2C T细胞是介导该抗肿瘤应答的唯一T细胞。此外，2C T细胞不能在CD8+OT-1 T细胞存在时在转移至这些小鼠中后经历稳态扩增(Brown，提交的手稿)。因此，在该模型中，由Ag104Ld肿瘤造成的致敏仅取决于肿瘤中向2C T细胞的直接呈递。此外，为了集中研究LIGHT的局部效应并避免能够到达淋巴器官的Ad-LIGHT的系统性扩散的可能性，我们使用了Ag104Ld或表达LIGHT的Ag104Ld肿瘤系。
在OT-1小鼠中皮下接种106Ag104Ld或Ag104Ld-LIGHT细胞，10-14天后输注3×106个CFSE-标记的2C T细胞。过继转移后14-20天在引流淋巴结(DLN)、非DLN和脾中以及在肿瘤自身中评价激活的2C T细胞的存在。我们首先观察到，在表达LIGHT的Ag104Ld肿瘤内存在大量激活的2C T细胞，这些细胞展示出CD44的高表面表达和产生IFN-γ(图5A)。相反，在亲本Ag104Ld肿瘤中几乎检查不到激活的2CT细胞(数据未显示)。重要的是，在此时，我们在淋巴组织(包括DLN、非DLN和脾)中发现百分比高得多的激活的2C T细胞(图5A)。这些激活的2C T细胞均表达高水平的CD44和IFN-γ(图5A)。本实验的结果强烈地提示，在LIGHT于肿瘤内部局部表达后，一些激活的抗原特异性T细胞能够迁移出肿瘤并进入系统循环中。
实施例6从原发性肿瘤产生的激活的肿瘤抗原特异性T细胞向远端肿瘤的移动由于阐明了肿瘤内的LIGHT表达能够引起活化的T细胞的系统再循环，我们意欲研究这些已有的肿瘤抗原特异性T细胞然后是否能够出巡周边组织以浸润不表达LIGHT的远端继发性肿瘤块。为了避免能够到达远端肿瘤的Ad-LIGHT的系统扩散的可能性，我们继续使用Ag104Ld或表达LIGHT的Ag104Ld肿瘤系以解决LIGHT在原发性肿瘤中的局部存在是否能够在远端肿瘤上引发抗肿瘤免疫的问题。我们使用与上述相同的模型系统，其中将2C T细胞过继转移至携带Ag104Ld肿瘤的OT-1小鼠，但是此次每只OT-1小鼠接种两个肿瘤。原发性肿瘤是106Ag104Ld或Ag104Ld-LIGHT，而继发性肿瘤是105Ag104Ld。肿瘤攻击后10-14天，转移CFSE标记的2C T细胞。在过继转移至肿瘤内后于第3、5和10天评价2C T的增殖。转移后3天，在表达LIGHT的Ag104Ld原发性肿瘤中存在CFSEhi未增殖的2C细胞。通过CFSE的原位稀释，在转移后5天观察到这些2C T细胞的随后增殖。到第10天，在Ag104Ld-LIGHT肿瘤中发现大量的增殖的2C T细胞(图5B)。在继发性Ag104Ld肿瘤中，在携带Ag104Ld-LIGHT肿瘤的小鼠中比在携带Ag104Ld的小鼠中以更高的频率检测到稀释的CFSE标记的2C T细胞的存在(图5B和C)。在携带两个Ag104Ld肿瘤的小鼠的原发性和继发性肿瘤中均仅仅检测到一小群浸润肿瘤的2C T细胞(图5C)。这些数据支持了如下观点LIGHT治疗后一些激活的抗原特异性T细胞能够迁移出原发性肿瘤并前往继发性肿瘤。
实施例7在原发性肿瘤部位Ad-LIGHT产生更多的CTL我们的实验结果到目前为止已经说明，在LIGHT介导的环境中激活的抗原特异性T细胞能够向远处不表达LIGHT的肿瘤迁移。为了检验Ad-LIGHT是否能够从原发性肿瘤产生更多的抗肿瘤CTL，然后这些CTL系统循环以排斥远端肿瘤，我们进行了过继转移实验，以研究来自经治疗的小鼠的淋巴器官的T细胞是否能够介导对已经建立的肿瘤产生排斥作用。由于肿瘤攻击后2周次级淋巴组织常常被转移性4T1肿瘤细胞污染，故这些实验不能使用4T1模型。我们给C3B6F1小鼠接种了105个Ag104Ld肿瘤细胞，然后在肿瘤接种后14天用5×109pfuAd-LIGHT或Ad-对照处理。在第21天，从处理的小鼠收集脾和淋巴结并纯化T细胞，将107个T细胞过继转移至经过7天已经建立了Ag104Ld肿瘤的C3B6F1小鼠体内。我们发现，接受来自Ad-LIGHT处理的小鼠的T细胞的小鼠均排斥其肿瘤，而接受来自Ad-对照处理的小鼠的T细胞的那些小鼠死于肿瘤负荷(图5D)。该结果说明，Ad-LIGHT处理而非对照病毒处理后循环中存在的活化的抗原特异性T细胞足以排斥已经建立的远端肿瘤。这些结果也说明，用Ad-LIGHT局部治疗肿瘤能够产生更多的CTL进入引流LN，之后这些CTL可以攻击已经建立的远端肿瘤。
实施例8Ad-LIGHT的局部治疗增强在该局部位置和远处位置的T细胞介导的应答评价Ad-LIGHT治疗是否直接改变原发性肿瘤位置和远处位置的肿瘤环境，相隔6天向C3B6F1小鼠两次皮下接种Ag104Ld肿瘤，以模拟新皮下转移瘤的形成。继发性肿瘤接种后5天，向原发性肿瘤施以肿瘤内Ad-LIGHT治疗。我们发现，在用Ad-LIGHT处理的小鼠中原发性和继发性肿瘤均受到排斥，而用Ad-对照处理的小鼠出现肿瘤的发展(图6A)。由于Ad-LIGHT的效应是CD8介导的，故我们检查了DLN、脾脏、原发性和继发性肿瘤中CD8+T细胞占Ly5.2+白细胞的百分数和产生IFN-γ的效应细胞在所有的这些CD8+T细胞中所占的百分数。Ad-LIGHT处理后原发性肿瘤和继发性肿瘤中CD8+T细胞和产生IFN-γ的效应CD8+T细胞的数量均急剧地增加(图6B和C)。导致肿瘤退化的抗肿瘤免疫的发生可能与细胞因子环境的改变相关(27)。为了检查这些淋巴器官中以及肿瘤自身内的细胞因子环境，在Ad-LIGHT或Ad-对照处理后7天收获了脾和肿瘤组织，研磨这些组织并收集上清液用于细胞因子测定。我们发现，相对于用Ad-对照处理的小鼠的脾脏，所测试的细胞因子，TNF-α，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，在Ad-LIGHT处理的小鼠的脾脏中无一存在显著改变。然而，在Ad-LIGHT处理下在原发性和继发性肿瘤中TNF-α和IFN-y均有相当大的增加(图6D)。因此，肿瘤排斥伴随着CD8+T细胞的增加、由效应CD8+T细胞产生的IFN-γ的产量增加、以及炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ在原发性和继发性肿瘤内的增加。这些结果说明，Ad-LIGHT在原发性肿瘤上的治疗能够从该肿瘤产生大量的效应细胞，这些细胞能够有效地勘查周围组织并应答远端肿瘤，从而导致继发性肿瘤负荷的衰退。
实施例9LIGHT的密码子修饰为了获得更好的转录和翻译，发明人优化了LIGHT的密码子。密码子修饰改变了基因的10-15％，以优化GC含量等，但是不改变编码的氨基酸序列。
图7显示了一个突变了蛋白酶位点、同时又优化了密码子的小鼠LIGHT序列(SEQ ID NO3)。合成基因序列，并将合成的基因克隆到质粒中。以野生型LIGHT和突变了蛋白酶位点的LIGHT(突变型LIGHT)为对照。突变了蛋白酶位点的小鼠LIGHT核酸见NatureImmunology，Vol.5，No.2，2004年2月，p.141-149。
通过标准lipofetant试验将2ug质粒DNA转染到293细胞系中。两天后，用小鼠LTbR-Ig测定LIGHT的表达。通过FACS和免疫荧光染色进行测定。结果显示，突变并经密码子修饰的LIGHT表达最佳。突变型LIGHT的表达也好于野生型LIGHT。结果见图8。
总体上看，通过修饰后，蛋白质的表达增加了10倍。
由此可以看出，将蛋白酶位点的突变和密码子修饰相结合，是一种新的有效增加LIGHT表达的方法。
按照同样的方法，发明人还优化了人的LIGHT。野生型和经过密码子修饰和蛋白酶位点突变的LIGHT的序列如下(SEQ ID NO2)。通过以上相同的实验方法证实，密码子修饰的人LIGHT有效增加了LIGHT的表达(结果未显示)。
正常人LIGHT(SEQ ID NO1)AGCCCAGGAGTGTTGAGCAATTTCGGTTTCCTCTGAGGTTGAAGGACCCAGGCGTGTCAG起始密码子＞CCCTGCTCCAGACACCTTGGGCATGGAGGAGAGTGTCGTACGGCCCTCAGTGTTTGTGGTGGATGGACAGACCGACATCCCATTCACGAGGCTGGGACGAAGCCACCGGAGACAGTCGTGCAGTGTGGCCCGGGTGGGTCTGGGTCTCTTGCTGTTGCTGATGGGGGCCGGGCTGGCCGT
CCAAGGCTGGTTCCTCCTGCAGCTGCACTGGCGTCTAGGAGAGATGGTCACCCGCCTGCCTGACGGACCTGCAGGCTCCTGGGAGCAGCTGATACAAGAGCGAAGGTCTCACGAGGTCAACCCAGCAGCGCATCTCACAGGGGCCAACTCCAGCTTGACCGGCAGCGGGGGGCCGCTGTTATGGGAGACTCAGCTGGGCCTGGCCTTCCTGAGGGGCCTCAGCTACCACGATGGGGCCCTTGTGGTCACCAAAGCTGGCTACTACTACATCTACTCCAAGGTGCAGCTGGGCGGTGTGGGCTGCCCGCTGGGCCTGGCCAGCACCATCACCCACGGCCTCTACAAGCGCACACCCCGCTACCCCGAGGAGCTGGAGCTGTTGGTCAGCCAGCAGTCACCCTGCGGACGGGCCACCAGCAGCTCCCGGGTCTGGTGGGACAGCAGCTTCCTGGGTGGTGTGGTACACCTGGAGGCTGGGGAGAAGGTGGTCGTCCGTGTGCTGGATGAACGCCTGGTTCGACTGCGTGATGGTACCCGGTCTTACTTCGGGGCTTTCATGGTGTGA人LIHGT的密码子修饰(经过密码子修饰和蛋白酶位点的突变)(SEQID NO2)起始密码子＞GAATTCGAGCTCGGTACCCGACACGGTACCGGATCCGCCACCATGGAGGAGAGCGTTGTGAGGCCCAGCGTGTTCGTGGTGGACGGCCAGACCGACATCCCCTTCACCCGGCTGGGCCGGAGCCACCGGAGGCAGAGCTGCTCCGTGGCCAGAGTGGGGCTGGGCCTGCTGCTCCTGCTGATGGGAGCCGGCCTGGCCGTGCAGGGCTGGTTCCTGCTGCAGCTGCACTGGCGGCTGGGCGAGATGGTGACCCGGCTGCCCGATGGCCCTGCCGGCAGCTGGCAGGAGCGGCGGAGCCACGAGGTGAACCCTGCCGCCCACCTGACCGGCGCCAACAGCAGCCTGACCGGCAGCGGCGGACCCCTGCTGTGGGAGACCCAGCTGGGCCTGGCCTTCCTGAGGGGCCTGAGCTACCACGACGGCGCCCTGGTGGTGACCAAGGCCGGCTACTACTACATCTACAGCAAGGTGCAGCTGGGCGGAGTGGGCTGCCCTCTGGGGCTGGCCAGCACCATCACCCACGGCCTGTACAAGCGGACC
CCCAGATACCCCGAGGAGCTGGAGCTGCTGGTGTCCCAGCAGAGCCCCTGTGGCAGGGCCACCTCCAGCAGCCGGGTGTGGTGGGACAGCAGCTTCCTGGGCGGCGTGGTGCACCTGGAGGCCGGCGAGAAAGTGGTTGTGAGGGTGCTGGACGAGCGGCTTGTGAGGCTGAGGGACGGCACCCGGAGCTACTTCGGCGCCTTCATGGTGTGATGAGCGGCCGCGAGCTCGTCTCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTG参考文献以下参考文献并入本文作为参考，它们补充、解释或者教导了这里使用的方法、技术和/或组合物，或者提供了为这些方法、技术和/或组合物提供了背景。
1.Fidler，I.J.2003.The pathogenesis of cancer metastasisthe′seed andsoil′hypothesis revisited.Nat Rev Cancer 3453-458.
2.Koscielny，S.，M.Tubiana，M.G. Le，A.J.Valleron，H.Mouriesse，G.Contesso，and D.Sarrazin.1984.Breast cancerrelationship betweenthe size of the primary tumour and the probability of metastaticdissemination.Br J Cancer 49709-715.
3.Koscielny，S.，M.Tubiana，and A.J.Valleron.1985.A simulationmodel of the natural history of human breast cancer.Br J Cancer52515-524.
4.Boon，T.，and P.van der Bruggen.1996.Human tumor antigensrecognized by T lymphocytes.J Exp Med 183725-729.
5.Rosenberg，S.A.1999.A new era for cancer immunotherapy based onthe genes that encodon cancer antigens.Immunity 10281-287.
6.Schreiber，H. 2003.Tumor Immunology.In FundamentalImmunology.W.E.Paul，editor.Lippincott Raven Press，New York.1557-1592.
7.Willimsky，G.，and T.Blankenstein.2005.Sporadic immunogenictumours avoid destruction by inducing T-cell tolerance. Nature437141-146.
8.Rosenberg，S.A. 2005. The emergence of modern cancerimmunotherapy.Ann Surg Oncol 12344-346.
9.Rosenberg，S.A.，J.C. Yang，and N.P. Restifo. 2004.Cancerimmunotherapymoving beyond current vaccines.Nat Med10909-915.
10.Danna，E.A.，P. Sinha，M.Gilbert，V.K.Clements，B.A.Pulaski，andS.Ostrand-Rosenberg.2004.Surgical removal of primary tumorreverses tumor-induced immunosuppression despite the presence ofmetastatic disease.Cancer Res 642205-2211.
11.Mullen，C.A.，D.A. Rowley，and H. Schreiber. 1989. Highlyimmunogenic regressor tumor cells can prevent development ofpostsurgical tumor immunity.Cell Immunol 119101-113.
12.Nguyen，L.T.，A.R. Elford，K. Murakami，K.M. Garza，S.P.Schoenberger，B.Odermatt，D.E.Speiser，and P.S.Ohashi.2002.Tumor growth enhances cross-presentation leading to limited T cellactivation without tolerance.J Exp Med 195423-435.
13.Debes，G.F.，C.N.Arnold，A.J.Young，S.Krautwald，M.Lipp，J.B.Hay，and E.C.Butcher. 2005.Chemokine receptor CCR7 requiredfor T lymphocyte exit from peripheral tissues.Nat Immunol6889-894.
14.Bromley，S.K.，S.Y.Thomas，and A.D.Luster.2005.Chemokinereceptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entryinto afferent lymphatics.Nat Immunol 6895-901.
15.Mauri，D.N.，R.Ebner，R.I.Montgomery，K.D.Kochel，T.C.Cheung，G.L.Yu，S.Ruben，M.Murphy，R.J.Eisenberg，G.H.Cohen，P.G.Spear，and C.F. Ware.1998.LIGHT，a new member of the TNFsuperfamily，and lymphotoxin alpha are ligands for herpesvirusentry mediator.Immunity 821-30.
16.Ngo，V.N.，H.Korner，M.D.Gunn，K.N.Schmidt，D.S.Riminton，M.D.Cooper，J.L.Browning，J.D.Sedgwick，and J.G. Cyster. 1999.Lymphotoxin alpha/beta and tumor necrosis factor are required forstromal cell expression of homing chemokines in B and T cell areas ofthe spleen.J Exp Med 189403-412.
17.Wu，Q.，Y. Wang，J.Wang，E.O.Hedgeman，J.L.Browning，and Y.X.Fu. 1999. The requirement of membrane lymphotoxin for thepresence of dendritic cells in lymphoid tissues. J Exp Med190629-638.
18.Wang，J.，A.Foster，R.Chin，P. Yu，Y. Sun，Y. Wang，K.Pfeffer，andY.X.Fu.2002.The complementation of lymphotoxin deficiency withLIGHT，a newly discovered TNF family member，for the restorationof secondary lymphoid structure and function.Eur J Immunol321969-1979.
19.Tamada，K.，K.Shimozali，A.I.Chapoval，G. Zhu，G. Sica，D.Flies，T.Boone，H.Hsu，Y.X.Fu，S.Nagata，J.Ni，and L.Chen.2000.Modulation of T-cell-mediated immunity in tumor andgraft-versus-host disease models through the LIGHT co-stimulatorypathway.Nat Med 6283-289.
20.Ware，C.F. 2005.Network communicationslymphotoxins，LIGHT，and TNF. Annu Rev Immunol 23787-819.
21.Wang，J.，R.A.Anders，Y. Wang，J.R.Turner，C.Abraham，K.Pfeffer，and Y.X.Fu.2005.The critical role of LIGHT in promoting intestinalinflammation and Crohn′s disease.J Immunol 1748173-8182.
22.Yu，P.，Y. Lee，W. Liu，R.K.Chin，J.Wang，Y. Wang，A.Schietinger，M.Philip，H.Schreiber，and Y.X.Fu.2004.Priming of naive T cellsinside tumors leads to eradication of established tumors. NatImmunol 5141-149.
23.Miller，F.R.，B.E.Miller，and G.H.Heppner.1983.Characterization ofmetastatic heterogeneity among subpopulations of a single mousemammary tumorheterogeneityin phenotypic stability.InvasionMetastasis 322-31.
24.Parviz，M.，C.S.Chin，L.J.Graham，C.Miller, C.Lee，K.George，and H.D.Bear.2003.Successful adoptive immunotherapy withvaccine-sensitized T cells，despite no effect with vaccination alone ina weakly immunogenic tumor model.Cancer Immunol Immunother52739-750.
25.Pulaski，B.A.，and S.Ostrand-Rosenberg.1998.Reduction ofestablished spontaneous mammary carcinoma metastases followingimmunotherapy with major histocompatibility complex class II andB7.1 cell-based tumor vaccines.Cancer Res 581486-1493.
26.Yu，P.，M.T.Spiotto，Y.Lee，H.Schreiber，and Y.X.Fu.2003.Complementary role of CD4+T cells and secondary lymphoid tissuesfor cross-presentation of tumor antigen to CD8+T cells.J Exp Med197985-995.
27.Yu，P.，Y. Lee，W.Liu，T.Krausz，A.Chong，H.Schreiber，and Y.X.Fu. 2005. Intratumor depletion of CD4+ cells unmasks tumorimmunogenicity leading to the rejection of late-stage tumors.J ExpMed 201779-791.
28.Bessis，N.，F.J.GarciaCozar，and M.C.Boissier. 2004.Immuneresponses to gene therapy vectorsinfluence on vector function andeffector mechanisms.Gene Ther 11 Suppl 1S10-17.
29.Wick，M.，P. Dubey，H.Koeppen，C.T.Siegel，P.E.Fields，L.Chen，J.A.Bluestone，and H.Schreiber.1997.Antigenic cancer cells growprogressively in immune hosts without evidence for T cell exhaustionor systemic anergy.J Exp Med 186229-238.
30.Blank，C.，I.Brown，A.C.Peterson，M.Spiotto，Y. Iwai，T.Honjo，andT.F. Gajewski.2004.PD-L1/B7H-1 inhibits the effector phase oftumor rejection by T cell receptor(TCR) transgenic CD8+T cells.Cancer Res 641140-1145.
序列表<110>傅阳心<120>用于预防和治疗转移性肿瘤的组合物<130>IDC050145<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>805<212>DNA<213>人<400>1agcccaggag tgttgagcaa tttcggtttc ctctgaggtt gaaggaccca ggcgtgtcag60ccctgctcca gacaccttgg gcatggagga gagtgtcgta cggccctcag tgtttgtggt120ggatggacag accgacatcc cattcacgag gctgggacga agccaccgga gacagtcgtg180cagtgtggcc cgggtgggtc tgggtctctt gctgttgctg atgggggccg ggctggccgt240ccaaggctgg ttcctcctgc agctgcactg gcgtctagga gagatggtca cccgcctgcc300tgacggacct gcaggctcct gggagcagct gatacaagag cgaaggtctc acgaggtcaa360cccagcagcg catctcacag gggccaactc cagcttgacc ggcagcgggg ggccgctgtt420atgggagact cagctgggcc tggccttcct gaggggcctc agctaccacg atggggccct480tgtggtcacc aaagctggct actactacat ctactccaag gtgcagctgg gcggtgtggg540ctgcccgctg ggcctggcca gcaccatcac ccacggcctc tacaagcgca caccccgcta600ccccgaggag ctggagctgt tggtcagcca gcagtcaccc tgcggacggg ccaccagcag660ctcccgggtc tggtgggaca gcagcttcct gggtggtgtg gtacacctgg aggctgggga720gaaggtggtc gtccgtgtgc tggatgaacg cctggttcga ctgcgtgatg gtacccggtc780ttacttcggg gctttcatgg tgtga 805<210>2<211>814<212>DNA<213>人工合成的<400>2gaattcgagc tcggtacccg acacggtacc ggatccgcca ccatggagga gagcgttgtg60aggcccagcg tgttcgtggt ggacggccag accgacatcc ccttcacccg gctgggccgg120agccaccgga ggcagagctg ctccgtggcc agagtggggc tgggcctgct gctcctgctg180atgggagccg gcctggccgt gcagggctgg ttcctgctgc agctgcactg gcggctgggc240
gagatggtga cccggctgcc cgatggccct gccggcagct ggcaggagcg gcggagccac300gaggtgaacc ctgccgccca cctgaccggc gccaacagca gcctgaccgg cagcggcgga360cccctgctgt gggagaccca gctgggcctg gccttcctga ggggcctgag ctaccacgac420ggcgccctgg tggtgaccaa ggccggctac tactacatct acagcaaggt gcagctgggc480ggagtgggct gccctctggg gctggccagc accatcaccc acggcctgta caagcggacc540cccagatacc ccgaggagct ggagctgctg gtgtcccagc agagcccctg tggcagggcc600acctccagca gccgggtgtg gtgggacagc agcttcctgg gcggcgtggt gcacctggag660gccggcgaga aagtggttgt gagggtgctg gacgagcggc ttgtgaggct gagggacggc720acccggagct acttcggcgc cttcatggtg tgatgagcgg ccgcgagctc gtctcgggga780tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttg81权利要求
1.包含免疫细胞激活剂、用于预防或者治疗肿瘤(特别是转移性肿瘤)的药物组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述免疫细胞激活剂是编码激活免疫细胞的多肽、或者编码激活免疫细胞的多肽的核酸或者包含它的药用组合物；特别地，所述激活剂是LIGHT多肽或者编码LIGHT的核酸。
3.权利要求1-2任一项的药物组合物，其中所述免疫细胞激活剂是包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)。
4.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中所述免疫细胞激活剂是包含并表达编码LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤(优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原)；特别是所述药物组合物作为治疗性疫苗或者预防性疫苗。
5.权利要求1-4任一项的药物组合物，其中所述药物采用系统性或者肿瘤内途径给药。
6.免疫细胞激活剂在制备用于预防或者治疗肿瘤(特别是转移性肿瘤)的药物中的用途。
7.权利要求6的用途，其中免疫细胞激活剂是权利要求2-4任一项所述的免疫细胞激活剂。
8.用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤的药用组合物，其含有包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)。
9.包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)在制备药物中的用途，所述药物用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤；例如，该药物可通过将所述重组病毒导入到原发性肿瘤内或者经过系统性途径来给药。
10.包含免疫细胞激活剂的肿瘤细胞或者肿瘤；优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还被辐射处理。
11.权利要求10的肿瘤细胞或者肿瘤，其是包含并表达编码LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤；优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原。
12.权利要求10的肿瘤细胞或者肿瘤，其转导了包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)。
13.包含权利要求10-12任一项的肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
14.用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤的治疗性和/或预防性肿瘤疫苗，该肿瘤疫苗包含权利要求10-12任一项的肿瘤细胞或者肿瘤；优选地，该肿瘤疫苗还可包含可药用载体。
15.包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)在制备治疗性和/或预防性肿瘤疫苗中的用途，所述肿瘤疫苗用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤。
16.权利要求10-12任一项的肿瘤细胞或者肿瘤在制备治疗性和/或预防性肿瘤疫苗中的用途，所述肿瘤疫苗用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤。
17.权利要求14的肿瘤疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于消除原发性肿瘤、预防转移性肿瘤、和/或治疗已有转移性肿瘤。
18.用于增强肝脏抗转移性肿瘤、原发性肿瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力的表达免疫增强剂，其含有包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)。
19.含有包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)在用于制备表达免疫增强剂中的用途，所述表达免疫增强剂用于增强肝脏抗转移性肿瘤、原发性肿瘤和/或病毒感染(例如HBV和HCV)的免疫力。
20.包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)在制备药物中的用途，所述药物用于增加肝脏中TNF-α和IFN-γ或者CD8+T细胞。
21.权利要求1-9、13-20任一项的药物组合物或者用途或者疫苗，其中所述药物或者药物组合物与其它药物或者治疗方法联合使用，例如将原发性肿瘤切除、和/或化学治疗、和/或放射治疗。
22.权利要求21的药物组合物或者用途或者疫苗，在原发性肿瘤切除之前向原发性肿瘤内给予免疫细胞激活剂或者在原发性肿瘤切除之后给予肿瘤疫苗。
23.包含并表达编码突变LIGHT的核酸的重组病毒，优选地，该重组病毒是重组腺病毒或者禽痘病毒；优选地，所述突变LIGHT包含阻止蛋白酶对其降解的突变，例如，所述突变LIGHT是不含蛋白酶裂解位点的LIGHT，特别是不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位点EQLI的突变LIGHT；在另一个实施方案中，所述突变LIGHT具有细胞外域氨基酸序列和标签序列(例如便于纯化的标签)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
24.包含权利要求23的重组病毒的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
25.权利要求23的重组病毒或者权利要求24的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
26.包含并表达编码突变LIGHT的核酸的肿瘤细胞或者肿瘤，优选地，该肿瘤细胞或者肿瘤还包含并表达肿瘤抗原。
27.包含权利要求26的肿瘤细胞或者肿瘤的药用组合物，特别是治疗性疫苗或者预防性疫苗。
28.包含免疫细胞激活剂、用于增强肝脏组织内的免疫和/或预防或者治疗肝脏病原体感染的药物组合物。
29.权利要求28的药物组合物，其中所述免疫细胞激活剂是编码激活免疫细胞的多肽、或者编码激活免疫细胞的多肽的核酸或者包含它的药用组合物；特别地，所述激活剂是LIGHT多肽或者编码LIGHT的核酸。
30.权利要求28-29任一项的药物组合物，其中所述免疫细胞激活剂是包含并表达编码LIGHT的核酸的重组载体(例如重组病毒，优选重组腺病毒或者禽痘病毒)。
31.免疫细胞激活剂在制备用于预防或者治疗肝脏病原体感染的药物中的用途。
32.权利要求31的用途，其中免疫细胞激活剂是权利要求29-30任一项所述的免疫细胞激活剂。
33.权利要求28-29任一项的药物组合物或者权利要求31-32的用途，其中肝脏病原体感染是病毒感染(例如HBV和HCV)。
34.权利要求1-22和28-33任一项的组合物、用途、肿瘤细胞或者肿瘤、或者疫苗，其中所述LIGHT多肽或者所述核酸编码的LIGHT多肽是野生型人LIGHT。
35.权利要求1-22和28-33任一项的组合物、用途、肿瘤细胞或者肿瘤、或者疫苗，其中所述LIGHT多肽或者所述核酸编码的LIGHT多肽是相对于野生型人LIGHT而言突变的LIGHT；优选地，所述突变LIGHT包含阻止蛋白酶对其降解的突变，例如，所述突变LIGHT是不含蛋白酶裂解位点的LIGHT，特别是不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位点EKLI的小鼠突变LIGHT，或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位点EQLI的人突变LIGHT；在另一个实施方案中，所述突变LIGHT具有细胞外域氨基酸序列和标签序列(例如便于纯化的标签)，如具有LIGHT第85-239位的氨基酸序列和flag序列。
36.权利要求1-35任一项的组合物、用途、肿瘤细胞或者肿瘤、疫苗、或者重组病毒，其中所述LIGHT编码核酸是相对于宿主进行了密码子优化的核酸，更优选进行了密码子优化并突变了蛋白酶裂解位点以阻止蛋白酶对编码的LIGHT蛋白降解的核酸，例如，编码不含小鼠LIGHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位点EKLI的小鼠突变LIGHT多肽或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位点EQLI的人突变LIGHT多肽并经过密码子优化的核酸，优选SEQ ID NO2和3中所示的编码核酸。
37.经过密码子优化但不改变氨基酸序列的LIGHT编码核酸，优选人LIGHT编码核酸。
38.经过密码子优化并突变了蛋白酶裂解位点以阻止蛋白酶对编码的LIGHT蛋白降解的核酸，例如，编码不含小鼠LI GHT蛋白第79-82位的蛋白酶解位点EKLI的小鼠突变LIGHT多肽或者不含人LIGHT蛋白第81-84位的蛋白酶解位点EQLI的人突变LIGHT多肽并经过密码子优化的核酸，优选SEQ ID NO2和3中所示的编码核酸。
39.包含权利要求37和38的核酸的载体以及转化了该载体的宿主细胞。
全文摘要
本发明公开了用于转移性肿瘤免疫预防和治疗的方法和组合物、以及用于增强肝脏组织内的免疫和/或预防或者治疗肝脏病原体感染的方法和组合物。所述组合物包含免疫细胞激活剂。优选地，所述免疫细胞激活剂是LIGHT多肽或其变体或者它们的编码核酸。
文档编号A61P35/00GK101091794SQ20061008681
公开日2007年12月26日 申请日期2006年6月19日 优先权日2006年6月19日
发明者傅阳心 申请人:博尔诚(北京)科技有限公司