专利名称：一种从人参叶中提取分离人参皂苷混合物的方法
技术领域：
本发明涉及从人参叶中提取分离各种不同的人参皂苷组成的混合物即人参皂苷混合物的方法，属于天然药物化学研究领域。
背景技术：
人参叶是人参(Panax ginseng C.A.Mey.)的干燥叶，秋季采收，晾干或烘干；气清香，味微苦而甘；具有补气，益肺，祛暑，生津之功能；用于气虚咳嗽，暑热烦燥，津伤口渴，头目不清，四肢疲乏。
到目前为止人们从人参叶中分得多种人参皂苷，其中经常提到的有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd等。
发明内容
由不同的人参皂苷组成的混合皂苷即通常所说的分组皂苷具有不同的生物活性。比如说由人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd等组成的二醇组人参皂苷具有中枢抑制作用，抗溶血作用；而主要由人参皂苷Re、人参皂苷Rg1等组成的三醇组人参皂苷则具有中枢兴奋作用及溶血作用。
本发明要提供一种从人参叶中提取分离各种不同的人参皂苷混合物的新方法，尤其是含有人参皂苷F1、人参皂苷F2以及三七皂苷Fe的人参皂苷混合物的新方法，更加具体说是要提供从人参叶中提取分离主要由人参皂苷Re和人参皂苷Rg1组成且人参皂苷Re的含量大于人参皂苷Rg1的人参皂苷混合物；主要由人参皂苷Re和人参皂苷Rg1组成且人参皂苷Rg1的含量大于人参皂苷Re的人参皂苷混合物；主要由人参皂苷F1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3组成的人参皂苷混合物；主要由人参皂苷F1和人参皂苷Rg2组成的人参皂苷混合物；主要由人参皂苷F2、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd组成的人参皂苷混合物；主要由人参皂苷F1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd组成的人参皂苷混合物；主要由人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3组成的人参皂苷混合物的方法。获得的人参皂苷混合物可用于制备药物组合物、保健食品以及人参皂苷单体。具体技术方案如下。
目前从人参叶中提取分离人参叶总皂苷，最常用的方法是大孔吸附树脂法。即人参叶加水煎煮提取，提取液过大孔吸附树脂吸附，用水洗净，乙醇溶液洗脱，洗脱液回收溶剂，获得人参叶总皂苷。
在上述洗脱过程中通常使用的是较高浓度的乙醇的水溶液，所以全部皂苷被洗脱下来，得到的是人参叶总皂苷。我们通过研究发现，如果将乙醇的浓度调得较低，即用较低浓度的乙醇的水溶液(比如18％)洗脱，用硅胶薄层层析(展开剂正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝4∶1∶5，上层)检查被洗脱下来的成分，发现只在相当于人参皂苷Rg1和人参皂苷Re处出现两个斑点，同时它的高效液相色谱图中也不出现其它人参皂苷的峰，说明低浓度的乙醇水溶液洗脱下来的只是人参皂苷Rg1和人参皂苷Re。用大量的低浓度的乙醇水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的斑点，也就是说将人参皂苷Rg1和人参皂苷Re洗脱完全后再用较高浓度的乙醇水溶液进行洗脱，这时其他人参皂苷被洗脱下来。用硅胶薄层层析(展开剂正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝4∶1∶5，上层)检查被高浓度乙醇水溶液洗脱下来的成分，发现除了人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc和人参皂苷Rb3等斑点外，在相当于人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的位置仍然出现与人参皂苷Rg1和人参皂苷Re相同颜色的斑点。为了弄清这两个斑点是不是人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，我们利用高效液相色谱进行了验证，结果发现它们不是人参皂苷Rg1和人参皂苷Re。说明这两个斑点是与人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的Rf值完全相同的其他成分(以正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝4∶1∶5，上层为展开剂的条件下)。为了弄清这两个斑点是什么成分，我们利用硅胶柱层析和ODS柱层析的方法，分离、纯化了上述两个成分，并通过13C-NMR鉴定了其化学结构。结果发现在人参皂苷Rg1处出现的斑点是人参皂苷F2，在人参皂苷Re处出现的斑点是三七皂苷Fe。从上述研究结果，我们得到了如下结论。即人参叶中除了存在经常提到的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3外还存在人参皂苷F2和三七皂苷Fe；当展开剂为(正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝4∶1∶5，上层)时人参皂苷Rg1和人参皂苷F2、人参皂苷Re和三七皂苷Fe的Rf值完全一致。更重要的是上述研究结果告诉我们，利用大孔吸附树脂和低浓度的乙醇水溶液，可以把人参皂苷Rg1和人参皂苷F2、人参皂苷Re和三七皂苷Fe分开，也就是说将人参叶提取物或人参叶总皂苷用大孔吸附树脂吸附后用低浓度的乙醇水溶液洗脱的话，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re被洗脱下来，而与它们极性接近的人参皂苷F2和三七皂苷Fe仍然被吸附在树脂上。另外我们还发现在人参皂苷Rg1(人参皂苷F2)斑点的上方还存在一个较为明显的斑点，经硅胶柱层析和ODS柱层析分离、纯化并通过13C-NMR波谱分析，发现它是人参皂苷F1。接着我们对人参叶及人参叶总皂苷中的人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe的含量进行了测定。结果发现人参叶及人参叶总皂苷中人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe含量较高，尤其是人参皂苷F1、人参皂苷F2。测定的具体结果是人参叶中含有人参皂苷F10.5％左右、人参皂苷F20.4％左右、三七皂苷Fe 0.1％左右；而人参叶总皂苷中含有人参皂苷F17％左右、人参皂苷Rg110％左右、人参皂苷F26％左右、人参皂苷Re 20％左右、三七皂苷Fe 1％左右、人参皂苷Rd 10％左右、人参皂苷Rb24％左右、人参皂苷Rc 4％左右、人参皂苷Rb11％左右和人参皂苷Rb30.8％左右，同时还含有少量人参皂苷Rg2及其他人参皂苷。
过去曾经有文献报道从人参叶中分离并鉴定了人参皂苷F1、人参皂苷F2和三七皂苷Fe。但是至今为止，人们认为人参叶或人参叶总皂苷中主要含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3，关于人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe的研究报道很少。也就是说，至今为止人们认为人参叶总皂苷是人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3的混合物。但是我们通过研究发现人参叶总皂苷是人参皂苷F1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、人参皂苷Re、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3的混合物。
至此我们发现了人参叶中除了含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3外还含有较大量的人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe；人参叶总皂苷应该是人参皂苷F1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、人参皂苷Re、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3的混合物；这些发现为从人参叶中提取分离各种不同组成的人参皂苷的混合物，即人参皂苷混合物奠定了基础。在此基础上我们发明了如下人参皂苷混合物尤其是含有人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe的人参皂苷混合物的制备方法。具体技术方案如下。
将人参叶提取物(人参叶总皂苷)用大孔吸附树脂吸附后先用低浓度乙醇水溶液洗脱，这时人参皂苷Rg1和人参皂苷Re被洗脱下来，而与它们极性接近的人参皂苷Rg2、人参皂苷F2和三七皂苷Fe以及极性比它们小的人参皂苷F1、极性比它们大的人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb3等仍然被吸附在树脂上。因此用较低浓度的乙醇的水溶液将人参皂苷Rg1和人参皂苷Re洗脱完全后，再用较高浓度的乙醇水溶液洗脱，就可以把人参皂苷Re、人参皂苷Rg1同其他人参皂苷分开。
进一步的研究表明除了乙醇之外，甲醇、丙酮、正丙醇、异丙醇等有机溶剂的水溶液或者它们的混合物的水溶液也具有相同的效果。也就是说将人参叶加水煎煮提取，提取液过大孔吸附树脂吸附，先用较低浓度的上述有机溶剂的水溶液洗脱，此时洗脱下来的只是人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，其他人参皂苷仍然被吸附在树脂上。将人参皂苷Re和人参皂苷Rg1洗脱完全后再用较高浓度的上述有机溶剂的水溶液洗脱，这时洗脱下来的是包括人参皂苷F1、三七皂苷Fe和人参皂苷F2在内的其他人参皂苷，从而可以将人参叶中的人参皂苷分成两部分，即人参皂苷Re和人参皂苷Rg1的混合物(人参皂苷混合物A)和人参皂苷F1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3的混合物(人参皂苷混合物B)。
人参皂苷混合物A中只含有人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，其中人参皂苷Re的含量大于人参皂苷Rg1的含量，大约是人参皂苷Rg1的2-3倍。
人参皂苷混合物B中含有人参皂苷F1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd和三七皂苷Fe，不含或含有少量残留的人参皂苷Re和人参皂苷Rg1。是否残留人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，与用较低浓度的有机溶剂的水溶液洗脱程度有关，如果洗脱彻底，人参皂苷混合物B中不含人参皂苷Re和人参皂苷Rg1。
为了只洗脱下人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，所用的乙醇、甲醇、丙酮、正丙醇、异丙醇或它们的混合物的水溶液的浓度不能过高。如果使用的乙醇、甲醇、丙酮、正丙醇、异丙醇的水溶液的浓度过高则会洗脱下人参皂苷Rd、人参皂苷Rc等二醇组人参皂苷；但也不能过低，如果所用的乙醇、甲醇、丙酮、正丙醇、异丙醇或它们的混合物的水溶液的浓度过低的话会洗脱不下人参皂苷Re和人参皂苷Rg1。我们发现它们的浓度一般在15％-40％之间为好，最好是15％-20％。因为乙醇或甲醇或丙酮或正丙醇或异丙醇的最佳浓度与使用的大孔吸附树脂的极性有关，因此最终应根据大孔吸附树脂的极性高低，选择适当的浓度。
人参皂苷Re和人参皂苷Rg1被洗脱下来后溶解在低浓度的有机溶剂的水溶液中。这种溶液难于浓缩，为了解决这个问题本发明采用了如下方法。即将含有人参皂苷Re和人参皂苷Rg1的水溶液直接或用水少加稀释后重新过大孔吸附树脂，这时溶解在溶液中的人参皂苷Re和人参皂苷Rg1将会重新被吸附在大孔吸附树脂上，然后再用高浓度乙醇洗脱后回收溶剂即可。
本发明中所述的大孔吸附树脂可以用AB-8、D4020、860021、D101、D102、D103、HP-20等常用大孔吸附树脂或具有相同或相似性能的其他牌号的吸附树脂。
本发明进一步利用重结晶的方法从人参皂苷混合物A中获得了人参皂苷Rg1的含量大于人参皂苷Re含量的主要含有人参皂苷Re和人参皂苷Rg1的人参皂苷混合物；利用氧化铝柱层析的方法从人参皂苷混合物B中获得了若干个组成更加简单的人参皂苷混合物。具体如下。
将人参皂苷混合物A用水或醇的水溶液重结晶，此时人参皂苷Re结晶析出，过滤后可分别得到人参皂苷Re和母液。母液经活性炭或脱色树脂脱色后重新过大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱，回收乙醇，得到新的人参皂苷混合物即人参皂苷混合物C。此混合皂苷的特点是其中人参皂苷Rg1的含量大于人参皂苷Re，大约是人参皂苷Re的2-3倍，正好与人参皂苷混合物A相反。
将人参皂苷混合物B上氧化铝柱，先用水或低浓度的有机溶剂的水溶液洗脱，这时洗脱下来的是人参皂苷F1和人参皂苷Rg2(可能包括少量残存的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re)，从而获得主要含有人参皂苷F1和人参皂苷Rg2的混合皂苷即人参皂苷混合物D；将人参皂苷F1洗脱完全后再用高浓度的有机溶剂的水溶液洗脱，这时洗脱下来的是人参皂苷F2、三七皂苷Fe和人参皂苷Rd，从而获得主要含有人参皂苷F2、三七皂苷Fe和人参皂苷Rd的人参皂苷混合物即人参皂苷混合物E，最后用四氢呋喃的水溶液洗脱，这时洗脱下的是人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3，从而获得主要含有人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3的混合皂苷即人参皂苷混合物F；或者将人参皂苷混合物B上氧化铝柱，直接用高浓度的有机溶剂的水溶液洗脱，这时洗脱下的是人参皂苷F1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、三七皂苷Fe和人参皂苷Rd(可能包括少量残存的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re)，从而获得主要含有人参皂苷F1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、三七皂苷Fe和人参皂苷Rd的混合皂苷即人参皂苷混合物G，最后用四氢呋喃的水溶液洗脱，这时洗脱下的是人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3，丛而获得主要含有人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3的混合皂苷即人参皂苷混合物F。上述氧化铝柱层析中所说的有机溶剂是指乙醇或甲醇或丙酮或正丙醇或异丙醇或它们的混合物。
上述氧化铝柱层析过程中洗脱人参皂苷F1、人参皂苷Rg2最好使用水，如果使用低浓度的有机溶剂的水溶液即乙醇或甲醇或丙酮或正丙醇或异丙醇或它们的混合物的水溶液洗脱话，其浓度应该控制在不至于把人参皂苷F2、三七皂苷Fe和人参皂苷Rd洗脱下来为宜，一般应低于40％；洗脱人参皂苷F2、三七皂苷Fe应使用较高浓度的乙醇或甲醇或丙酮或正丙醇或异丙醇或它们的混合物的水溶液，其浓度一般在40％-95％之间，最好在60％左右；四氢呋喃的水溶液的浓度在35％-85％之间，最好在50％左右；使用的氧化铝最好是中性氧化铝。
具体实施例方式
实施例1人参叶7公斤，加水煎煮提取三次，每次加水量分别是人参叶重量的18、12、10倍，煎煮时间分别是2、1.5、1小时，合并煎煮液，过D4020大孔吸附树脂吸附，用水冲净，18％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1后改用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1为止(硅胶薄层层析，正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝4∶1∶5，上层，10％硫酸喷雾，105℃加热显色，以下相同)。18％乙醇洗脱液重新过AB-8大孔吸附树脂吸附，然后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，洗脱液回收乙醇，得人参皂苷混合物A 308克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg19.68％、人参皂苷Re22.61％。85％乙醇洗脱液直接回收乙醇，获得人参皂苷混合物B 326克。经HPLC检测，含人参皂苷Rb11.92％、人参皂苷Rb23.98％、人参皂苷Rb30.48％、人参皂苷Rc 4.41％、人参皂苷Rd 8.63％、人参皂苷F15.97％、人参皂苷F26.19％、三七皂苷Fe 1.78％。
人参皂苷混合物A 300克，加600毫升水加热溶解，放置，沉淀，过滤，水洗沉淀，干燥，得人参皂苷Re 102.2克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg11.21％、人参皂苷Re96.54％，不含其它人参皂苷。母液过D941脱色树脂脱色，用水稀释后过AB-8大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，回收乙醇，得人参皂苷混合物C 140.3克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg122.71％、人参皂苷Re9.68％。
人参皂苷混合物B 30克用400毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(500克)，先用水冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1为止，洗脱液用D101大孔吸附树脂吸附后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷F1，回收乙醇，得人参皂苷混合物D 10.2克。经HPLC检测，含人参皂苷F117.5％，人参皂苷Rg23.43％。然后用50％的乙醇溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F2和三七皂苷Fe为止，洗脱液直接回收溶剂，得人参皂苷混合物E 6.3克。经HPLC检测，含人参皂苷F229.53％、三七皂苷Fe 6.25％，人参皂苷Rd 17.62％。最后用50％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物F 3.4克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd 22.5％、人参皂苷Rb211.2％、人参皂苷Rc 9.5％、人参皂苷Rb15.8％和人参皂苷Rb32.2％。
人参皂苷的HPLC测定条件如下①人参皂苷Rg1、人参皂苷Re测定条件色谱柱ZORBAX 250×4.6mm ODS柱；流动相乙腈∶水＝20∶80；流速1.5ml/min；柱温25℃；检测波长203nm，以下相同；②人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd测定条件色谱柱ZORBAX 250×4.6mm ODS柱；流动相乙腈∶水＝31∶69；流速1.5ml/min；柱温25℃；检测波长203nm，以下相同；③人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe测定条件色谱柱ZORBAX 250×4.6mm ODS柱；流动相乙腈∶水＝38∶62；流速1.5ml/min；柱温25℃；检测波长203nm，以下相同。
实施例2人参叶7公斤，加水煎煮提取三次，每次加水量分别是人参叶重量的16、14、12倍，煎煮时间分别是2、1.5、1小时，合并煎煮液，过D101大孔吸附树脂吸附，用水冲净，22％甲醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，然后改用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1为止，分别收集洗脱液。22％甲醇洗脱液用水稀释后重新过AB-8大孔吸附树脂吸附，然后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，洗脱液回收乙醇，得人参皂苷混合物A 278克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg113.36％、人参皂苷Re29.68％。85％乙醇洗脱液直接回收乙醇，获得人参皂苷混合物B 318克。经HPLC检测，含人参皂苷Rb11.73％、人参皂苷Rb23.69％、人参皂苷Rb30.58％、人参皂苷Rc 2.88％、人参皂苷Rd 7.95％、人参皂苷Rg10.15％、人参皂苷Re 0.6％、人参皂苷F16.15％、人参皂苷Rg20.8％、人参皂苷F25.36％、三七皂苷Fe 1.52％。
人参皂苷混合物A 270克，加540毫升水加热溶解，放置，沉淀，过滤，水洗沉淀，干燥，再次重结晶，得人参皂苷Re 85克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg11.8％、人参皂苷Re98.9％。母液过D941脱色树脂脱色，用水稀释后过D4020大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，回收乙醇，得人参皂苷混合物C 131.2克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg123.8％、人参皂苷Re10.9％。
人参皂苷混合物B 100克用1000毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(1500克)，先用水冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1，洗脱液用AB-8大孔吸附树脂吸附后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷F1，洗脱液回收乙醇，回收乙醇，得人参皂苷混合物D 29克。经HPLC检测，含人参皂苷F116.3％、人参皂苷Rg23.13％。然后用55％的甲醇溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F2和三七皂苷Fe为止，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物E 25克。经HPLC检测，含人参皂苷F228.33％、三七皂苷Fe 9.25％，人参皂苷Rd11.4％。最后用50％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物F 15克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd 25.0％、人参皂苷Rb28.8％、人参皂苷Rc 5.8％、人参皂苷Rb15.2％和人参皂苷Rb31.8％。
实施例3人参叶7公斤，加水煎煮提取三次，每次加水量分别是人参叶重量的18、12、8倍，煎煮时间分别是2、1.5、1小时，合并煎煮液，过HP-20大孔吸附树脂吸附，用水冲净，19％丙酮洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，然后改用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1为止(TLC法，正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝4∶1∶5，上层，10％硫酸喷雾，105℃加热显色，以下相同)，分别收集洗脱液。19％丙酮洗脱液用水稀释后重新过AB-8大孔吸附树脂吸附，然后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，洗脱液回收乙醇，得人参皂苷混合物A 287克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg113.06％、人参皂苷Re29.61％。85％乙醇洗脱液直接回收乙醇，获得人参皂苷混合物B 413克。经HPLC检测，含人参皂苷Rb11.62％、人参皂苷Rb23.08％、人参皂苷Rb30.68％、人参皂苷Rc 2.91％、人参皂苷Rd 9.33％、人参皂苷Rg11.15％、人参皂苷Re 1.06％、人参皂苷F16.97％、F29.19％、三七皂苷Fe3.78％。
人参皂苷混合物A 240克，加480毫升10％乙醇的水溶液加热溶解，放置，沉淀，过滤，水洗沉淀，干燥，得人参皂苷Re 83克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg12.54％，人参皂苷Re97.35％。母液过D941脱色树脂脱色，用水稀释后过AB-8大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，回收乙醇，得人参皂苷混合物C 120克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg135.56％，人参皂苷Re 13.27％。
人参皂苷混合物B 150克用1500毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(3000克)，先用20％的乙醇水溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1为止，洗脱液用AB-8大孔吸附树脂吸附后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷F1，回收乙醇，得人参皂苷混合物D 35.3克。经HPLC检测，含人参皂苷F116.3％、人参皂苷Rg23.93％。然后用65％的丙酮溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F2和三七皂苷Fe为止，洗脱液直接回收溶剂，得人参皂苷混合物E 41.3克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg10.20％、人参皂苷Re0.34％、人参皂苷F10.86％、人参皂苷F220.53％、三七皂苷Fe5.98％，人参皂苷Rd 12.1％。最后用50％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物F 22克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd 20.8％、人参皂苷Rb211.9％、人参皂苷Rc 7.8％、人参皂苷Rb16.1％和人参皂苷Rb32.3％。
实施例4人参叶7公斤，加水煎煮提取三次，每次加水量分别是人参叶重量的18、12、8倍，煎煮时间分别是2、1.5、1小时，合并煎煮液，过860021大孔吸附树脂吸附，用水冲净，20％正丙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，然后改用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1为止，分别收集洗脱液。20％正丙醇洗脱液用水稀释后重新过AB-8大孔吸附树脂吸附，然后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，洗脱液回收乙醇，得人参皂苷混合物A 287克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg113.6％、人参皂苷Re28.6％。85％乙醇洗脱液直接回收乙醇，获得人参皂苷混合物B 413克。经HPLC检测，含人参皂苷Rb11.62％、人参皂苷Rb23.08％、人参皂苷Rb30.68％、人参皂苷Rc 2.91％、人参皂苷Rd 9.33％、人参皂苷F16.47％、F25.12％、三七皂苷Fe2.08％。
人参皂苷混合物A 240克，加480毫升40％的乙醇的水溶液加热溶解，放置，沉淀，过滤，水洗沉淀，干燥，得人参皂苷Re 83克，经HPLC检测，含人参皂苷Rg11.34％，人参皂苷Re97.05％。母液过D941脱色树脂脱色，用水稀释后过AB-8大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，回收乙醇，得人参皂苷混合物C 120克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg132.26％，人参皂苷Re 11.07％。
人参皂苷混合物B 150克用1500毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(3000克)，先用15％的甲醇水溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1为止，洗脱液用AB-8大孔吸附树脂吸附后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷F1，回收乙醇，得人参皂苷混合物D 31.0克。经HPLC检测，含人参皂苷F118.3％、人参皂苷Rg24.12％、。然后用65％的正丙醇溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F2和三七皂苷Fe为止，洗脱液直接回收溶剂，得人参皂苷混合物E 40.3克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg10.22％、人参皂苷Re0.39％、人参皂苷F10.96％、人参皂苷F220.28％、三七皂苷Fe5.08％，人参皂苷Rd 11.6％。最后用50％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物F 21.8克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd 21.8％、人参皂苷Rb210.9％、人参皂苷Rc 7.5％、人参皂苷Rb16.5％和人参皂苷Rb32.4％。
实施例5人参叶7公斤，加水煎煮提取三次，每次加水量分别是人参叶重量的18、12、8倍，煎煮时间分别是2、1.5、1小时，合并煎煮液，过D201大孔吸附树脂吸附，用水冲净，16％异丙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，然后改用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1为止，分别收集洗脱液。16％异丙醇洗脱液重新过AB-8大孔吸附树脂吸附，然后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，洗脱液回收乙醇，得人参皂苷混合物A 297克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg113.06％、人参皂苷Re29.61％。85％乙醇洗脱液直接回收乙醇，获得人参皂苷混合物B 413克。经HPLC检测，含人参皂苷Rb11.62％、人参皂苷Rb23.08％、人参皂苷Rb30.68％、人参皂苷Rc 2.91％、人参皂苷Rd 9.33％、人参皂苷F16.97％、F25.19％、三七皂苷Fe 1.78％。
人参皂苷混合物A 330克，加660毫升水加热溶解，放置，沉淀，过滤，水洗沉淀，干燥，得人参皂苷Re 99克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg11.04％，人参皂苷Re 97.35％。母液过D941脱色树脂脱色，用水稀释后过AB-8大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Re和人参皂苷Rg1，回收乙醇，得人参皂苷混合物C150克，经HPLC检测，含人参皂苷Rg135.56％，人参皂苷Re 13.27％。
人参皂苷混合物B 150克用1500毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(3000克)，先用10％的丙酮水溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1为止，洗脱液用AB-8大孔吸附树脂吸附后用85％乙醇洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷F1，回收乙醇，得人参皂苷混合物D 34.9克。经HPLC检测，含人参皂苷F119.3％、人参皂苷Rg23.68％。然后用55％的异丙醇溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F2和三七皂苷Fe为止，洗脱液直接回收溶剂，得人参皂苷混合物E 42.5克。经HPLC检测，含人参皂苷Rg10.29％、人参皂苷Re0.24％、人参皂苷F10.16％、人参皂苷F221.58％、三七皂苷Fe5.28％，人参皂苷Rd 14.10％。最后用50％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物F 27.4克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd 20.1％、人参皂苷Rb211.3％、人参皂苷Rc 7.2％、人参皂苷Rb13.1％和人参皂苷Rb32.8％。
实施例6人参皂苷混合物B 30克用300毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(600克)，用65％的乙醇溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe为止，洗脱液直接回收溶剂，得人参皂苷混合物G 15.5克。经HPLC检测，含人参皂苷F112.30％、人参皂苷F210.08％、三七皂苷Fe 2.05％、人参皂苷Rd 8.3％。然后用80％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物F12.0克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd20.8％、人参皂苷Rb211.9％、人参皂苷Rc7.8％、人参皂苷Rb16.1％和人参皂苷Rb32.3％。
实施例7人参皂苷混合物B 30克用300毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(600克)，用75％的甲醇溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe为止，洗脱液直接回收溶剂得人参皂苷混合物G15.5克。经HPLC检测，含人参皂苷F112.30％、人参皂苷F212.08％、三七皂苷Fe3.05％、人参皂苷Rd6.4％。然后用50％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物F22克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd20.8％、人参皂苷Rb211.9％、人参皂苷Rc7.8％、人参皂苷Rb16.1％和人参皂苷Rb32.3％。
实施例8人参皂苷混合物B30克用300毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(600克)，用75％的丙酮溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe为止，洗脱液直接回收溶剂，得人参皂苷混合物G15.5克。经HPLC检测，含人参皂苷F112.30％、人参皂苷F212.08％、三七皂苷Fe3.05％、人参皂苷Rd7.5％。然后用45％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂得人参皂苷混合物F22克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd20.8％、人参皂苷Rb211.9％、人参皂苷Rc7.8％、人参皂苷Rb16.1％和人参皂苷Rb32.3％。
实施例9人参皂苷混合物B 30克用300毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(600克)，用75％的正丙醇溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe为止，洗脱液直接回收溶剂，得人参皂苷混合物G15.5克。经HPLC检测，含人参皂苷F112.30％、人参皂苷F212.08％、三七皂苷Fe3.05％、人参皂苷Rd8.1％。然后用50％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物F22克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd20.8％、人参皂苷Rb211.9％、人参皂苷Rc7.8％、人参皂苷Rb16.1％和人参皂苷Rb32.3％。
实施例10人参皂苷混合物B30克用300毫升水超声溶解，过中性氧化铝柱(600克)，用75％的异丙醇溶液冲洗至洗脱液中检测不到人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe为止，洗脱液直接回收溶剂，得人参皂苷混合物G15.5克。经HPLC检测，含人参皂苷F112.30％、人参皂苷F212.08％、三七皂苷Fe3.05％、人参皂苷Rd6.8％。然后用50％的四氢呋喃的水溶液洗脱至洗脱液中检测不到人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1，洗脱液回收溶剂，得人参皂苷混合物F22克。经HPLC检测，含人参皂苷Rd20.8％、人参皂苷Rb211.9％、人参皂苷Rc7.8％、人参皂苷Rb16.1％和人参皂苷Rb32.3％。
本发明利用大孔吸附树脂和乙醇等有机溶剂将人参皂苷Rg1、人参皂苷Re同其他人参皂苷分开，尤其是将人参皂苷Rg1和人参皂苷F2，人参皂苷Re和三七皂苷Fe分开，从而获得只含有人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的人参皂苷混合物和不含有人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的人参皂苷混合物，获得了其他手段难以获得的有效部位。在此基础上又利用重结晶或氧化铝柱层析的方法，进一步将它们分成若干个新的人参皂苷混合物，而这些人参皂苷混合物可能具有不同生物活性或更强生物活性。本发明的方法具有方法独特、操作简单、生产成本低的显著优点。
权利要求
1.一种从人参叶中提取分离主要由人参皂苷Re和人参皂苷Rg1组成且人参皂苷Re的含量大于人参皂苷Rg1的人参皂苷混合物的方法，其特征在于将人参叶提取物用大孔吸附树脂吸附后用低浓度有机溶剂的水溶液洗脱。
2.一种从人参叶中提取分离主要由人参皂苷Re和人参皂苷Rg1组成且人参皂苷Rg1的含量大于人参皂苷Re的人参皂苷混合物的方法，其特征在于将人参叶提取物用大孔吸附树脂吸附后用低浓度有机溶剂的水溶液洗脱，获得的人参皂苷混合物用水或醇的水溶液重结晶，过滤，母液回收溶剂即得。
3.一种从人参叶中提取分离主要由人参皂苷F1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3组成的人参皂苷混合物的方法，其特征在于将人参叶提取物用大孔吸附树脂吸附，用低浓度有机溶剂的水溶液将人参皂苷Rg1和人参皂苷Re洗脱完全后用高浓度有机溶剂的水溶液洗脱。
4.一种从人参叶中提取分离主要由人参皂苷F1和人参皂苷Rg2组成的人参皂苷混合物的方法，其特征在于将人参叶提取物用大孔吸附树脂吸附，用低浓度有机溶剂的水溶液将人参皂苷Rg1和人参皂苷Re洗脱完全后用高浓度有机溶剂的水溶液洗脱，获得的人参皂苷混合物上氧化铝柱，用水洗脱。
5.一种从人参叶中提取分离主要由人参皂苷F2、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd组成的人参皂苷混合物的方法，其特征在于将人参叶提取物用大孔吸附树脂吸附，用低浓度有机溶剂的水溶液将人参皂苷Rg1和人参皂苷Re洗脱完全后用高浓度有机溶剂的水溶液洗脱，获得的人参皂苷混合物上氧化铝柱，用水将人参皂苷F1洗脱完全后用有机溶剂的水溶液洗脱。
6.一种从人参叶中提取分离主要由人参皂苷F1、人参皂苷Rg2、人参皂苷F2、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd组成的人参皂苷混合物的方法，其特征在于将人参叶提取物用大孔吸附树脂吸附，用低浓度有机溶剂的水溶液将人参皂苷Rg1和人参皂苷Re洗脱完全后用高浓度有机溶剂的水溶液洗脱，获得的人参皂苷混合物上氧化铝柱，用有机溶剂的水溶液洗脱。
7.一种从人参叶中提取分离主要由人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3组成的人参皂苷混合物的方法，其特征在于将人参叶提取物用大孔吸附树脂吸附，用低浓度有机溶剂的水溶液将人参皂苷Rg1和人参皂苷Re洗脱完全后用高浓度有机溶剂的水溶液洗脱，获得的人参皂苷混合物上氧化铝柱，用有机溶剂的水溶液将人参皂苷F1、人参皂苷F2、三七皂苷Fe洗脱完全后用四氢呋喃的水溶液洗脱。
8.权利要求1至7所述的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂选自AB-8、D4020、860021、D101、D102、D103、HP20的一种或一种以上。
9.权利要求1至7所述的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、正丙醇、异丙醇或它们的两种或两种以上混合物。
10.权利要求1至7所述的制备方法，其特征在于所述的低浓度有机溶剂的水溶液是体积百分比浓度小于40％的溶液。
11.权利要求1至7所述的制备方法，其特征在于所述的高浓度有机溶剂的水溶液是体积百分比浓度大于45％的溶液。
12.权利要求4至7所述的制备方法，其特征在于所述的氧化铝是中性氧化铝。
13.权利要求1至7所述的制备方法获得的人参皂苷混合物在制备药物组合物、保健食品以及人参皂苷单体中的应用。
全文摘要
本发明公开了从人参叶中提取分离各种不同人参皂苷混合物的方法，尤其是提取分离含有人参皂苷F
文档编号A61K36/258GK1869056SQ20061009361
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月21日 优先权日2006年6月21日
发明者桂明玉, 金永日, 李绪文, 金永学 申请人:海南亚洲制药有限公司