专利名称：中药有效成分渔用抗菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及兽药技术领域，特别是涉及一种中药有效成分渔用抗菌剂。
背景技术：
目前控制水产动物细菌性疾病的主要手段是使用抗菌药物，而使用化学抗菌药物、抗生素药物普遍存在易引发病原菌耐药性、导致养殖鱼类药物残留超标等问题，因此国内外都在寻找更加安全有效的代用品。我国有使用中药防治水产动物疾病的传统，中药因具有资源丰富，残留少，副作用小等优势，符合无公害水产养殖要求等普遍认可的特点，已经成为人类研究防治水产动物疾病药物的主要材料。但从国内外有关防治水产动物细菌性疾病的报道中可见，相关试验大多数停留在中药单方和验方的抑菌和应用上，缺少对中药配方及有效成分配方的研究。由于从中药中提取有效成分(化合物单体)难度很大，找到有效部位(大类物质)十分困难，使现有渔用中药在有效成分的化学物质基础描述上存在很大的模糊性，技术含量较低。只有使用先进的技术，现代分离手段，才能将复方中药分离为各个有效部分，并从中提取分离到有效成分。从已有中药中提取分析有效成分，从而采用人工方法合成，可以大幅度减少药物筛选的人力和财力，也能极方便地运用于生产中。到目前为止，尚未见有关中药有效成分组成的渔用抗菌剂的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有抗菌药物存在的易引发病原菌耐药性、导致养殖鱼类药物残留超标、不符合无公害水产养殖要求等问题，提供一种中药有效成分渔用抗菌剂，其组分全部是纯中药有效成分，同时具有广谱抗菌作用。
本发明的中药有效成分渔用抗菌剂为水剂，其组分及质量百分含量分别为没食子酸10～12％、黄酮类4～5％、蒽醌类1～2％，其余为水；其中，黄酮类是黄芩苷或槲皮素或二者任意比例的混合物，蒽醌类是1，8-二羟基蒽醌或大黄素或芦荟大黄素或三者任意比例的混合物。
本发明的中药有效成分渔用抗菌剂的制备方法如下方法一因该中药有效成分渔用抗菌剂的各组分没食子酸、黄芩苷、槲皮素、1，8-二羟基蒽醌、大黄素以及芦荟大黄素等均可从市场购买，故最简单的方法是直接购买商用中药有效成分各单体，按上述配方混合，即制成抗菌剂。
方法二采用乙醇加热连续回流提取等方法，从富含没食子酸、黄酮类、蒽醌类的中药中提取这些有效成分。分别从斑地锦中提取没食子酸等有效成分、从苦参中提取黄酮类等有效成分、从大黄中提取蒽醌类等有效成分。取各单方中药分别提取其有效成分，按W∶V＝1∶8的比例加入浓度为70％的乙醇，用盐酸调节pH值为2，76℃下用索氏提取仪回流提取90分钟，收取液体，残渣再重复提取两次，合并抽提液，挥发至无醇味且干燥成粉。将获得的提取物没食子酸、黄酮类、蒽醌类干粉及水按上述比例混合，即制成抗菌剂。因各成分提取方法相同，各中药单方也可按相应比例合并提取。按照斑地锦∶苦参∶大黄＝5∶3∶1的质量比例混合提取其有效成分，取混合物2克，可制成100ml抗菌剂。该方法成本较低。用高效液相色谱法提取斑地锦中没食子酸得率可达到29.8％。
方法二所提中药有效成分的鉴定方法如下抗菌剂有效成分的薄层色谱鉴定用硅胶GF2540和0.5％的羧甲基纤维素钠制板，苯∶乙醇∶甲酸(7∶3∶1)为展开剂，氨熏-三氯化铁日光下显色，测量抗菌剂各成分点的比移值Rf。按Rf值大小排列，抗菌剂有效成分分别为没食子酸、槲皮素、黄芩苷、芦荟大黄素、大黄素和1-8二羟基蒽醌。
方法二所提中药有效成分的分离方法如下柱层析分离各有效成分用柱层析硅胶干法装柱，苯∶乙醇∶甲酸(7∶3∶1)为洗脱剂，用自动收集仪收集分离样品，每间隔一分钟收集一个样品，且用薄层分析(TLC)跟踪检测，同时合并相同斑点的洗脱液。柱层析分离共收集到抗菌剂77个样品，对比可知按洗脱顺序样品1～11是1，8二-羟基蒽醌、12～15是大黄素、17～21是芦荟大黄素、24～30是黄芩苷、33～47是槲皮素、49～77是没食子酸。
1，8-二羟基蒽醌 大黄 素芦荟大黄素 黄芩苷槲皮素 没食子酸该抗菌剂的使用方法如下使用时，抗菌剂拌饵剂量按0.25％～0.5％的比例添加在饲料中，即100ml抗菌剂混合在400～200g饲料中；口服和注射剂量为0.5～2.0ml/kg·d，即按每天每公斤鱼体重给予的抗菌剂剂量为0.5～2.0ml。
抗菌剂各有效成分的抑菌活性顺序为没食子酸＞蒽醌(包含1-8二羟基蒽醌、大黄素、芦荟大黄素)＞黄芩苷＞槲皮素。联合用药研究表明，没食子酸和蒽醌具有协同作用，没食子酸和黄芩苷、没食子酸和槲皮素、蒽醌和黄芩苷三组同属于累加作用。
本发明具有以下优点(1)抗菌剂具有广谱抗菌作用，对迟钝爱德华氏菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、鲁克氏耶尔森氏菌、柱状屈挠杆菌等水产动物常见致病菌的体外抑菌效果明显，抑菌环直径可达到2.0～4.0之间。
(2)抗菌剂能有效地防治水产动物细菌性疾病，药效试验表明对温和气单胞菌等常见致病菌的防治率在80％～95％之间，总体防治率可达到85％以上。酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性测定显示抗菌剂可以明显增强鱼体的非特异性免疫能力；谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆碱酯酶、肌酐和尿酸等生化指标测定显示抗菌剂对患病鱼受损的肝脏、肾功能和鱼机体均有明显的改善作用。
(3)抗菌剂安全无毒采用急性毒性试验进行抗菌剂安全性测定，急性毒性的分级标准LD50＞10mg/kg为无毒。试验抗菌剂给药量达到10000mg(生药)/kg时鱼体依然未出现中毒，表明抗菌剂对鱼体属于实际无毒级。
具体实施例方式
实施例1购买商用中药有效成分各单体没食子酸、黄酮类(黄芩苷、槲皮素)、蒽醌类(1，8-二羟基蒽醌、大黄素或芦荟大黄素)，按没食子酸10％、黄酮类(黄芩苷∶槲皮素为1∶1)4％、蒽醌类(1，8-二羟基蒽醌∶大黄素∶芦荟大黄素为1∶1∶1)1％，其余为水的比例混合，即制成抗菌剂。抑菌实验表明，对柱状屈挠杆的抑菌环直径达2.0，药效试验表明对柱状屈挠杆菌等常见致病菌的防治率达80％。
实施例2购买商用中药有效成分各单体；没食子酸、黄酮类(黄芩苷、槲皮素)、蒽醌类(1，8-二羟基蒽醌、大黄素或芦荟大黄素)，按没食子酸11％、黄芩苷4.5％、1，8-二羟基蒽醌1.5％，其余为水的比例混合，即制成抗菌剂。抑菌实验表明，对温和气单胞菌的抑菌环直径达到3.0，药效试验表明对温和气单胞菌等常见致病菌的防治率达90％。
实施例3购买商用中药有效成分各单体；没食子酸、黄酮类(黄芩苷、槲皮素)、蒽醌类(1，8-二羟基蒽醌、大黄素或芦荟大黄素)，按没食子酸12％、槲皮素5％、大黄素2％，其余为水的比例混合，即制成抗菌剂。抑菌实验表明，对迟钝爱德华氏菌的抑菌环直径达到4.0，药效试验表明对迟钝爱德华氏菌等常见致病菌的防治率达95％。
实施例4取各单方中药斑地锦、苦参、大黄，分别提取其有效成分，按W∶V＝1∶8的比例加入浓度为70％的乙醇，用盐酸调节pH值为2，76℃下用索氏提取仪回流提取90分钟，收取液体，残渣再重复提取两次，合并抽提液，挥发至无醇味且干燥成粉。将获得的提取物按没食子酸10％、黄酮类5％、蒽醌类1％，其余为水的比例混合，即制成抗菌剂。抑菌实验表明，对鲁克耶尔森氏菌的抑菌环直径达到2.0，药效试验表明对鲁克耶尔森氏菌等常见致病菌的防治率达80％。
实施例5取各单方中药斑地锦、苦参、大黄，分别提取其有效成分，按W∶V＝1∶8的比例加入浓度为70％的乙醇，用盐酸调节pH值为2，76℃下用索氏提取仪回流提取90分钟，收取液体，残渣再重复提取两次，合并抽提液，挥发至无醇味且干燥成粉。将获得的提取物按没食子酸12％、黄酮类5％、蒽醌类2％，其余为水的比例混合，即制成抗菌剂。抑菌实验表明，对杀鲑气单胞菌的抑菌环直径达到4.0，药效试验表明对杀鲑气单胞菌等常见致病菌的防治率达95％。
实施例6取各单方中药斑地锦、苦参、大黄，按照斑地锦∶苦参∶大黄＝5∶3∶1的比例混合提取其有效成分。取混合物2克，按W∶V＝1∶8的比例加入浓度为70％的乙醇，用盐酸调节pH值为2，76℃下用索氏提取仪回流提取90分钟，收取液体，残渣再重复提取两次，合并抽提液，加水至100ml，即制成抗菌剂。经测定，没食子酸、黄酮类、蒽醌类的含量分别为10.47％、4.2％、1.51％。抑菌实验表明，对嗜水气单胞菌的抑菌环直径达到3.5，药效试验表明对嗜水气单胞菌等常见致病菌的防治率达92％。
权利要求
1.一种中药有效成分渔用抗菌剂，其特征在于，抗菌剂为水剂，其组分及质量百分含量分别为没食子酸10～12％、黄酮类4～5％、蒽醌类1～2％，其余为水；其中，黄酮类是黄芩苷或槲皮素或二者任意比例的混合物，蒽醌类是1，8-二羟基蒽醌或大黄素或芦荟大黄素或三者任意比例的混合物。
全文摘要
一种中药有效成分渔用抗菌剂，其组分及质量百分含量分别为没食子酸10～12％、黄酮类4～5％、蒽醌类1～2％，其余为水；该抗菌剂能克服现有抗菌药物存在的易引发病原菌耐药性、导致养殖鱼类药物残留超标、不符合无公害水产养殖要求等问题，具有广谱抗菌作用，能有效地防治水产动物细菌性疾病，药效试验表明对温和气单胞菌等常见致病菌的防治率在80％～95％之间，总体防治率可达到85％以上，抗菌剂安全无毒。
文档编号A61P31/00GK1939297SQ20061009516
公开日2007年4月4日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者郑曙明, 吴青, 黄建军 申请人:西南大学