专利名称：：多肽及蛋白药物的聚乙二醇偶合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与胸腺五肽、胸腺素Cd、干扰素(IFN)或白介素等多肽或蛋白类药物的连接形成的偶合物；这种偶合物在体内能够緩慢释放活性多肽分子发挥药理作用。
背景技术：
：多肽和蛋白类药物如奥曲肽、T-20、胸腺素od(TaJ，降4丐素，干扰素(IFN),白介素(IL)等在临床得到越来越广泛的应用。但是，该类药物口服无效，在体内易被酶解失活，生物半衰期短，影响了其药理作用的发挥。聚乙二醇(PEG)是具有良好的生物兼容性的中性聚合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。将PEG与多肽和蛋白类药物分子偶联后，能够提高药物在血浆中的稳定性，减少药物的酶解；避免免疫系统对药物的识别和清除，降低免疫原性；同时避免药物在肾脏的代谢清楚，从而显著延长多肽或蛋白类药物在体内的半衰期。目前PEG对多肽或蛋白的化学修饰均是通过PEG的活性衍生物与药物分子中的氨基形成酰胺键或氨基甲酸酯键。由于蛋白或多肽分子中存在多个氨基，因此得到的偶合物是多种交联产物的混合物。而且，由于对活性位点的直接修饰或空间位阻作用，被修饰药物的生物活性损失较大。
发明内容本发明的目的是提供聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白类药物的连接形成的偶合物。通过选择适当的连接子可以保持偶合物在血浆中的稳定性；到达靶组织后，连接子可以在细胞内解离，释放活性形式的多肽或蛋白分子，产生药理作用。本发明一方面提供式I所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白分子中的氨基连接形成的偶合物CH30-PEG-0CH2C0NH-(AA)n-CONH-PI本发明另一方面提供式II所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白分子中的氨基连接形成的偶合物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)-CONH-PII本发明还提供式m所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽分子中的羧基连接形成的偶合物CH30-PEG-OCH2CH「NHCO-(AA)n-NHCO-PIII式I中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-杀^基酸残基，P代表胸腺五肽、胸腺素cx,、干扰素(IFN)或白介素等多肽或蛋白药物；n为1-6的整数。本发明还提供含有式I、II或III所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物作为活性成分的药物组合物。本发明最后还提供本发明还提供式i、n或m所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物，以及含有式i、n或in所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物作为活性成分的药物组合物作为药物的用途。具体实施例方式本发明中聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物的制备可以分为聚乙二醇衍生物的合成及其与多肽或蛋白的交联两个部分。式I所示的偶合物可以按照如下方法制备单甲氧基聚乙二醇在叔丁醇钾作用下，与溴乙酸乙酯反应；反应产物经氢氧化钠水解，然后将水解产物酸化，得到羧甲基取代的单曱氧基聚乙二醇衍生物CH30-PEG-OCH2COOH;通过接肽反应，制备寡肽衍生物CH30-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOH;CH30-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOH可以通过接肽反应与多肽的末端氨基连接，形成偶合物CH30-PEG-OCH2CONH-(AA)N-CONH-P(I);也可以将CH30-PEG-OCH2CONH-(AA)n-C00H与N-羟基琥珀酰亚胺反应成活泼酯CH30-PEG-0CH2C0NH-(AA)n-C00Su,后者再与多肽或蛋白分子中的游离氨基连接，形成偶合物CH30-PEG-0CH2C0NH-(AA)n-CONH-P(I)。式II所示的偶合物可以按照如下方法制备单甲氧基聚乙二醇与光气反应得到单甲氧基聚乙二醇的氯曱酸酯衍生物CH30-PEG-OCH2CH2OCOCl,再与氨基酸分子中的氨基反应，形成氨基甲酸酯衍生物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-AA-COOH;后者通过接肽反应，制备寡肽衍生物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH;CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH可以通过接肽反应与多肽的末端氨基连接，形成偶合物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-P(II);也可以将CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH与N-羟基琥珀酰亚胺反应成活泼酯CH30-PEG-OCH2CH2OCONH"(AA)n-COOSu，后者再与多肽或蛋白分子中的游离氨基连接，形成偶合物CH30-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-P(II)。式III所示的偶合物可以按照如下方法制备单甲氧基聚乙二醇与对曱苯磺酰氯反应，得到单甲氧基聚乙二醇的对甲苯磺酸酯衍生物CH30-PEG-OCH2CH2-OTs，再与邻苯二曱酰亚胺钾反应，将反应产物水解得到单甲氧基聚乙二醇的氨基衍生物CH30-PEG-OCH2CH2-NH2。后者通过接肽反应，制备寡肽衍生物CH30-PEG-0CH2CH厂NHC0-(AA)n-NH2;最后通过接肽反应与多肽的末端羧基连接，形成偶合物CH30-PEG-OCH2C&-NHCO-(AA)n-NHCO-P。在本发明中使用的下列英文缩写词及其含义如下TP5,胸腺五肽；PEG,聚乙二醇；Arg,精氨酸；Asp,天冬氨酸；Tyr，酪氨酸；Val,缬氨酸；Fmoc,芴曱氧羰基；DCC,二环已基碳二亚胺；HOBT,l-羟基苯并三唑；HBTU，2-(lH-1-羟基苯并三唑)-1，1，3,3-四甲基脲六氟磷酸；IFN-a2b，a2b干扰素；N醒，N-甲基吗啡啉；rhIL-2,重组人白介素-2;TFA，三氟乙酸；Ts-CI,对甲苯磺酰氯；RP-HPLC,反相高效液相色谱。下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，这些实施例不应作为对本发明的范围的限制。实施例1CH30-PEG5M。-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(U的制备1.1CH30-PEG5。。。-0CH2C00H的制备将单甲氧基聚乙二醇(MW5000)20.0g(4mmol)加到安装了分水器的圆底烧瓶中，加入曱苯溶解，蒸馏，并不断补充干燥的曱苯，在油浴中加热回流，至无水分蒸出.。4敬去分水器，加入8mmo1的4又丁醇钾，回流反应1小时。然后緩慢加入8mmo1的溴乙酸乙酯，回流反应6小时。过滤，将滤液减压蒸干，用CH2Cl2溶解残留物，加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，緩慢加入0.1N的氢氧化钠溶液，至pH达到10,室温搅拌2小时。然后用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，用等体积的三氯甲烷提取3次，合并提取液，用无水疏酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，加无水乙醚沉淀，滤集固体，得CH30-PEG5。。。-0CH2C00H12.5g。1.2CH30-PEG5。。。-0CH2C0NH-Ala-Leu-OSu的制备将CH30-PEG5。M-OCH2COOH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量L-丙氨酸甲酯，5倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，然后緩慢加入O.IN的氩氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。用0.IN的盐酸溶液调节PH至3,减压蒸除四氬呋喃，然后将水溶液用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH30-PEG5M。-OCH2CH2-NHCO-A1a-OH。将CH30-PEG測-0CH2CH厂NHC0-Ala-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量L-亮氨酸曱酯，5倍摩尔量的DCC,室温搅拌反应过夜，然后緩慢加入0.IN的氢氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。用0.IN的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氯呋喃，然后将水溶液用Sephadex-IO凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH30-PEG5。。-OCH2CH2-NHCO-A1a-Leu-OH。将CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-OH溶于干燥的四氬吹喃中，加入5倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺，1倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，过滤，得到CH30-PEG5。Q。-OCH2CONH-Ala-Leu-OSu的溶液备用。1.3CH30—PEG5000-OCH2CONH—Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr"OH(IJ的制备用lOOmgWang树脂(0.05mmol)为固相栽体，Fmoc-Arg(Mtr)，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-0H，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Tyr(tBu)为原料，DCC-HOBT作缩合剂，根据胸酰五肽的氨基酸序列，按标准的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Va卜Tyr(tBu)-Wang树脂，加入2倍摩尔量的CH30-PEGs。。。-0CH2C0NH-Ala-Leu-C00Su(0.l咖ol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以间曱酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，(TC反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，水冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。实施例2CH30-PEG5。。。-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-Toc广OH(I2)的制备用0.05mmolWang树脂为固相栽体，Fmoc-AA-OH(0.2mmo1)为原料，DCC-HOBT(0.2mmo1)为缩合剂，按照胸腺素oc!(Toc,)的氨基酸序列，用标准的Fmoc固相多肽合成方法合成全保护肽链Fmoc-TocWang树脂。用20%派p定/DMF脱除Fmoc后，加入0.6mmo1的CH30-PEG5。。。-0CH2C0NH-Ala-Leu-COOSu反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以5ml间曱酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，(TC反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA,加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，水冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。实施例3CH30-PEG12fl。。-0CH2C0NH-Ala-Leu-CONH-IFN-ct2b(U的制备参照实施例1.1的方法，用分子量12000的单甲氧基聚乙二醇代替分子量5000的单甲氧基聚乙二醇制备CH30-PEG，。-OCH2COOH。参照实施例1.2的方法，用CH30-PEG12a。。-OCH2COOH代替CH30-PEG5。。。-OCH2COOH制备CH30-PEG12。。。-OCH2CONH-Ala-Leu-OSu。将IFN-a2b溶于pH6.5，100mM的磷酸緩冲液，配成5mg/ml的溶液，滴加3倍摩尔量的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>的溶液，4T搅拌反应3小时。将反应液用pH4.5，10mM醋酸铵緩冲液稀释20倍。取羧甲基琼脂糖离子交换树脂(CM-Sepharose)装柱，离子交换树脂先用5个柱体积的PH4.5，lOmM醋酸铵緩沖液预平衡，然后将稀释后的反应液上样，先用pH4.5，10mM醋酸铵緩冲液洗脱，除去未反应的PEG衍生物；再用A液为pH4.5,40mM的醋酸铵緩沖液，A液为含2M氯化钠的pH4.5，40mM的醋酸铵緩冲液梯度洗脱，收集第二峰面积下的组分，即得一分子PEG与一分子IFN-cc2b交联的产物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>。实施4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>的制备将重组人白介素-2(rhIL-2)溶于pH6.5，lOOmM的磷酸緩冲液，配成2mg/ml的溶液，滴加3倍摩尔量的CH30-PEG訓。-OCH2CONH-Ala-Leu-COOSu的溶液，4。C搅拌反应3小时。将反应液用pH6.0,20mM磷酸緩冲液稀释20倍。取羧曱基琼脂糖离子交换树脂(CM-Sepharose)装柱，离子交换树脂先用5个柱体积的pH6.0，20mM磷酸緩冲液预平衡，然后将稀释后的反应液上样，先用pH6.0，20mM磷酸緩冲液洗脱，除去未反应的PEG衍生物；再用A液为pH7.Q，20mM的磷酸緩冲液，B液为含1M氯化钠的pH7.0,20mM的磷酸緩冲液梯度洗脱，收集第二峰面积下的组分，即得一分子PEG与一分子rhlL-2交联的产物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>。实施例5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(IU的制备5.1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>的制备将单甲氧基聚乙二醇(MW12000)14.4g用20ml曱苯和12ml二氯甲烷的混合溶剂溶解，加入lg(20mmol)无水三乙胺，0.56g三光气，搅拌反应过夜。将反应液减压蒸干，将残留物用干燥的四氢呋喃溶解，加入5倍摩尔量L-丙氨酸和干燥的三乙胺，室温搅拌反应过夜。用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氢呋喃，然后将水溶液用S印hadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氬氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下組分，水冻干燥，得到CH3O-PEG12。0。-CH2CH2OCONH-Ala-OH。将CH30-PEGu。。-OCH2CH2OCONH-Ala-OH溶于千燥的四氬呔喃中，加入5倍摩尔量L-亮氨酸甲酯，5倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，然后緩慢加入0.IN的氢氧化钠溶液，至pH达到10,室温搅拌2小时。用0.IN的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氬呋喃，然后将水溶液用Sephadex-IO凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-0H。将CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-OH溶于干燥的四氬吹喃中，加入5倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺，1倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，过滤，得到CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-C00Su的溶液备用。5.2CH3O-PEG12000-OCH2,CONH-Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-VahTyr-OH(nj的制备按照实施例1.3的方法合成H-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(0tBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂，加入2倍摩尔量的CH30-PEG12。。。-OCH2CH2-OCONH-Ala-Leu-COOSu(0.lmmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以5ml间甲酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，(TC反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA,加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。实施例6CH30-PEGu。。。-OCH2CH20CONH-Ala-Leu-CONH-Ta广OH(112)的制备按照实施例2的方法合成合成全保护肽链Fmoc-Ta广Wang树脂。用20%哌啶/DMF脱除Fmoc后，加入3倍摩尔量的CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OOTH-Ala-Leu-OSu，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以5ml间甲酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，(TC反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA,加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。实施例7CH30-PEG12。。。-0CH2CH20C0NH-Ala-Leu-C0NH-IFN-oc2b(EU)的制备将IFN-oc2b溶于pH6.5,lOOmM的裤酸緩沖液，配成5mg/ml的溶液，滴加3倍摩尔量的CH30-PEG腦。-0CH2CH20C0NH-Ala-Leu-C00Su的溶液，4。C搅拌反应3小时。将反应液用pH4.5，10mM醋酸铵緩冲液稀释20倍。取羧甲基琼脂糖离子交换树脂(CM-S印harose)装柱，离子交换树脂先用5个柱体积的PH4.5，lOmM醋酸铵緩冲液预平衡，然后将稀释后的反应液上样，先用PH4.5,lOmM醋酸铵緩冲液洗脱，除去未反应的PEG衍生物；再用A液为pH4.5,40mM的醋酸铵緩冲液，A液为含2M氯化钠的PH4.5,40mM的醋酸铵緩冲液梯度洗脱，收集第二峰面积下的组分，即得一分子PEG与一分子IFN-a2b交联的产物CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-C0NH-IFN-oc2b。实施8CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-C0NH-rhlL-2(EU)的制备将重组人白介素-2(rhlL-2)溶于pH6.5，100mM的磷酸緩冲液，配成2mg/ml的溶液，滴加3倍摩尔量的CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOSu的溶液，4X:搅拌反应3小时。将反应液用pH6.0，20mM磷酸緩冲液稀释20倍。取羧曱基琼脂糖离子交换树脂(CM-Sepharose)装柱，离子交换树脂先用5个柱体积的pH6.0,20mM磷酸緩冲液预平衡，然后将稀释后的反应液上样，先用pH6.0，20mM磷酸緩冲液洗脱，除去未反应的PEG衍生物；再用A液为pH7.0,20niM的磷酸緩冲液，B液为含1M氯化钠的pH7.0，20mM的磷酸緩沖液梯度洗脱，收集第二峰面积下的组分，即得一分子PEG与一分子rhlL-2交联的产物CH30-PEG12。。。-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-rhIL-2。实施例9CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-NHCO-Tyr-Val-Asp-Lys-Arg-H(m!)的制备9.1CH30-PBG5。。。-OCH2CH2-NH2的制备称取CH30-PEG濯-0CH2CH20H10.Og置于250ml反应瓶中，加入50mlCH2C12,固体溶解后再加入1.5g三乙胺和1.9gTs-Cl，室温搅拌反应。TLC监测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，力o100ml无水乙醚沉淀出固体，得6.5gCH30-PEG5。。。-0CH2CH20Ts。将6.0gCH30-PEG5。。-OTs溶于10mlDMF,加入2.0g邻苯二甲酰亚胺钾盐，120匸反应4小时。减压蒸去溶剂，将残余物溶于50ml无水乙醇，加入1.5ml水合肼，回流反应4小时。旋转蒸发除去溶剂，将残余物溶于CH2C12,用无水乙醚沉淀出固体，再以无水乙醇-乙瞇重结晶，得4.2gCH3O-PEG5。0。-OCH2CHr"NH2。9.2CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-H的制备将CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NH2，溶于水，滴加5倍摩尔量的Fmoc-Ala-OSu的四氢吹喃溶液。加完后，室温搅拌反应过夜。减压蒸去四氢呋喃，用哝啶脱除Fmoc后，用S印hadex-IO凝月交柱层析分离，以0.2M碳酸氬氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-H。将CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHCO-Ala-H溶于水，滴加5倍摩尔量的Fmoc-Leu-OSu的四氬呔喃溶液。加完后，室温搅拌反应过夜。减压蒸去四氢呋喃，用哌p定脱除Fmoc后，用S印hadex-lO凝月交柱层析分离，以0.2M;友酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH30-PEG5。。。-OCH2CH2-NHC0-Ala-Leu-H。9.3CH30-PEG训。-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-NHCO-Tyr-Va卜Asp-Lys-Arg-H(Hh)的制备以0.lmmolRink酰胺树脂为固相载体，0.2mmo1的Fmoc-AA-OH为原料，HBTU(0.2mrno1)-N丽(O.3mmo1)为缩合剂，按胸腺五肽的^J^酸序列，按标准的Fmoc固相多肽合成方法合成全保护肽树脂。最后加入0.6mmo1的CH30-PEG5M。-0CH2CH「NHC0-Ala-Leu-H，HBTU(0.2mmo1)-N醒(0.3mmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以EDT-间曱酚-TFA为裂解试剂，(TC反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。实施例IOCH30-PEG12。。。-0CH2CH2-NHC0-Ala-Leu-NHCO-Ta广H(OU的制备参照实施例9.1的方法，用分子量12000的单甲氧基聚乙二醇代替分子量5000的单曱氧基聚乙二醇制备CH30-PEG12。。。-OCH2CH2-NH2。参照实施例9.2的方法，用CH30-PEG12。。。-OCH2CH2-NH2代替CH30-PEG漏-CH2CH2-冊2制备CH30-PEG12。。。-OCH2CH「NHCO-Ala-Leu-H。以0.lmmolRink酰胺树月旨为固相载体，0.2画1Fmoc-AA-OH为原料，HBTU(O.2mmo1)-N醒(O.3mmo1)为缩合剂，按Ta!的氨基^f歹'j,用标准的Fmoc固相多肽合成方法合成全保护肽树脂。最后加入0.6mmo1的CH30-PEG12。。-OCH2CH2-HCO-Ala-Leu-H(O.2,1)，HBTU(O.2mmol)-誦(0.3mmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以EDT-间甲酚-TFA为裂解试剂，(TC反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。实施例11胸腺五肽及胸腺素ct!的PEG偶合物的活性评价11.1对小鼠脾淋巴细胞的增殖的影响用3H-TdR掺入法测定目标化合物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液。裂解红细胞后，洗涤三次；用苔盼兰染色，细胞计数，活细胞在95%以上。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液将脾细胞浓度调为5xl06细胞/ml。于96孔板中加入100nl/孔的细胞悬液；然后加入50pl/孔的样品，对照孔加5(^1含10%血清的培养液；最后加入50pl/孔的ConA,，总体积为200)il。于含5%C02的37。C培养箱中培养，培养结束前12小时，每孔加入25pl力-胸腺嘧咬核普酸(2xl()4Bq)。继续培养至实验结束，然后将培养板冻存于-20。C冰箱；测定时将冻融的细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪上读取掺入细胞DNA的[3H]-胸腺嘧咬核苷量，以cpm值K表细力包增殖的情况。表1小鼠脾淋巴细胞的增殖试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>11.2对T淋巴细胞产生IL-2和IFN"Y的诱导作用用ELISA法测定目标化合物对T淋巴细胞产生IL-2和IFN"Y的诱导作用。取活细胞计数95%以上的小鼠脾细胞悬液，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液将脾细胞浓度调为lx107细胞/ml。于48孔板中加入800n1/孔的细胞悬液；然后加入10(Vl/孔的样品，对照孔加10(^1含10%血清的培养液；最后加入100nl/孔的ConA。于含5%C02的37°C培养箱中培养24小时，离心取上清液。用小鼠IFN，和IL-2检测试剂盒测定IFN"7和IL-2的含量。表2对T淋巴细胞产生IL-2和IFN，的影晌<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例12干扰素的PEG偶合物的抗病毒活性评价用Wish细胞-VSV病毒系统测定干扰素及其PEG偶合物的抗病毒活性。采用细胞致病效应抑制为基础的抑制微量测定法，以能够保护半数细胞免受病毒攻击的待测样品的最大稀释度的倒数为干扰素单位。用国家IFNa标准品校准确定效价(IU)。表3干扰素及其PEG偶合物的抗病毒活性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例13白介素-2的PEG偶合物的活性评价用重组人白介素-2依赖细胞抹/MTT法测定白介素-2及其PEG偶合物的生物学活性，用国家标准品校准确定效价(IU)。以人血清白蛋白为标准蛋白，用Lowry法测定蛋白质含量，计算样品生物活性(IU/ml)与蛋白质含量(mg/ml)的比值，即为比活性。表4白介素-2及其PEG偶合物的生物活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例14体外蘇稳定性的测定在pH7.8的0.1%的胰蛋白酶溶液，分别加入待测样品，于37。C恒温水浴寸呆-显，分别于0、10min、30min、60min、120min及480min取才羊，按照实施例12、13的方法，测定各样品在不同时间点的生物活性，以O时的活性为画，计算相对活性。表5干扰素、白介素-2及其PEG偶合物的酶稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>权利要求1、聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白类药物的连接形成的偶合物。2、式I所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白分子中的氨基连接形成的偶合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式I中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表酸残基，P代表胸腺五肽、胸腺素cd、干扰素(IFN)或白介素等多肽或蛋白药物；n为1-6的整数。3、式II所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白分子中的氨基连接形成的偶合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式II中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-氨基酸残基，P代表胸腺五肽、胸腺素a,、干扰素(IFN)或白介素等多肽或蛋白药物；n为1-6的整数。4、式III所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽分子中的羧基连接形成的偶合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式III中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-#J^酸残基，P代表胸腺五肽、胸腺素cd、干扰素(IFN)或白介素等多肽或蛋白药物；n为1-6的整数。5、含有式I、II或ffl所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物作为活性成分的药物《且合物作为药物的用途。6、式i、n或in所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物，以及含有式i、n或ni所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物作为活性成分的药物组合物作为抗肿瘤或抗病毒药物的用途。全文摘要本发明的目的是提供聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与胸腺五肽、胸腺素α<sub>1</sub>、干扰素(IFN)或白介素等多肽或蛋白类药物的连接形成的偶合物。通过选择适当的连接子可以保持偶合物在血浆中的稳定性；到达靶组织后，连接子可以在细胞类解离，释放活性形式的多肽或蛋白分子，产生药理作用。文档编号A61K38/32GK101104078SQ200610098649公开日2008年1月16日申请日期2006年7月11日优先权日2006年7月11日发明者文王,靳雪峰申请人:北京美倍他药物研究有限公司