专利名称：预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防幽门螺杆菌感染而引起的胃炎和消化道溃疡等相关性疾病的预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗及其制备方法。
背景技术：
胃炎和消化道是发病率很高的消化系统疾病，其中胃癌是最为常见的恶性肿瘤之一。幽门螺杆菌寄生于人胃或十二指肠黏膜，是引起胃炎和消化道溃疡病原菌，也与胃癌、胃粘膜组织相关淋巴瘤发病密切相关。因此，预防或清除幽门螺杆菌感染，可显著减少上述疾病的发病率。
目前治疗幽门螺杆菌感染相关性疾病通常采用5’-硝基咪唑类和青霉素类抗生素，它虽有较好的疗效，但还存在着诱导细菌耐药、反复感染及医药费用高昂等问题。
众所周知的疫苗接种是预防传染性疾病最为简便经济、长期有效的措施，但传统的细菌性疫苗还不能用于幽门螺杆菌感染相关性疾病的预防，其原因是传统的细菌性疫苗通常采用甲醛杀灭的全菌制备而成，然而幽门螺杆菌是一种微需氧菌，它不但要求较高的营养，而且培养周期较长、产量较低；除此之外，该菌大量液体培养技术尚未过关，故研制幽门螺杆菌全菌疫苗受到很大限制。
综上所述，寻求一种能有效预防幽门螺杆菌感染而引起的胃炎和消化道溃疡等相关性疾病，是当今医学领域中的重要课题之一。
发明内容
本发明是要填补上述现有技术中还存在的空缺，提供一种能有效预防幽门螺杆菌感染引起的胃炎和消化道溃疡等相关性疾病，且制造成本较低的预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗及其制备方法。
本发明预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗是一种内置LTB佐剂UreB-HpaA基因重组口服疫苗，它以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB为免疫增强佐剂、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位UreB和幽门螺杆菌黏附素HpaA为抗原，采用基因工程技术构建ltB、ureB和hpaA基因人工融合基因ltB-ureB-hpaA及其原核表达系统，采用提纯的重组表达产物的幽门螺杆菌基因工程疫苗。通过基因工程技术制备的两种细菌三个基因构成的融合基因原核表达系统及其产物，使该疫苗具有表达产物中同时含有重组佐剂rLTB及rUreB和rHpaA两种重组蛋白抗原，从而能对幽门螺杆菌感染引起的胃炎和消化道溃疡等相关性疾病具有免疫预防效果，且还具有制备方法简便可靠、生产成本较为低廉等特点。
本发明预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗的制备方法及其效果鉴定步骤1)大肠杆菌ltB基因、幽门螺杆菌ureB和hpaA基因的克隆和测序及其原核表达系统构建；2)ltB-ureB-hpaA人工融合基因及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导目的重组蛋白rLTB-UreB-HpaA表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况和产量；4)Ni-NTA亲和层析法提纯rLTB-UreB-HpaA；rLTB-UreB-HpaA水溶液即可直接制备成口服滴丸。
上述的rLTB-UreB-HpaA还可经冷冻干燥与药用赋形剂磷酸钙混合后制备成口服胶囊。
此后还采用GM1-ELISA对rLTB-UreB-HpaA分子中的rLTB佐剂活性进行鉴定，采用幽门螺杆菌小鼠感染模型、小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌培养与鉴定、小鼠胃黏液中特异性S-IgA测定等方法，测定和确定口服免疫的幽门螺杆菌基因工程疫苗rLTB-UreB-HpaA的免疫保护作用及其局部特异性抗体产生情况。
本发明的有益效果是1)本发明通过人工融合基因及其原核表达的目的重组蛋白rLTB-UreB-HpaA提供一种预防幽门螺杆菌感染及其相关消化道疾病的多价口服基因工程疫苗，并采用GM1-ELISA、小鼠感染模型、特异性S-IgA测定等方法，证实该基因工程疫苗中rLTB仍保持有佐剂活性、口服免疫后可使90.9％小鼠不感染幽门螺杆菌、72.7～82.8％免疫小鼠产生特异性S-IgA；从而能有效预防幽门螺杆菌感染而引起的胃炎和消化道溃疡等相关性疾病，从而解决了当今医学领域中尚无幽门螺杆菌疫苗产品、填补该疫苗产品的空缺；2)本发明方法制备的重组蛋白rLTB-UreB-HpaA是一种无害人体的细菌融合蛋白，制备方法安全可靠、成本较低，故易于推广应用；3)本发明预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗，是以口服滴丸或口服胶囊供人们服用故使用方便，而且还因制造成本低而价格较低，以利于推广应用。
图1大肠杆菌44815株(E.coli strain 44815)ltB基因核苷酸和氨基酸序列(其中产不耐热肠毒素的大肠杆菌44815株购自北京中国药品生物制品检定所；下划横线区为引物序列；每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列；符号“*”代表终止密码)；图2.幽门螺杆菌Y06株(Helicobacter pylori strain Y06)ureB基因核苷酸和氨基酸序列(其中幽门螺杆菌Y06株分离自慢性胃炎患者胃黏膜活检标本；下划横线区为引物序列；每排上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列；符号“*”代表终止密码)；图3.幽门螺杆菌Y06株(Helicobacter pylori strain Y06)hpaA基因核苷酸和氨基酸序列(其中幽门螺杆菌Y06株分离自慢性胃炎患者胃黏膜活检标本，下划横线区为引物序列；每排上一行为核苷酸序列、下一行为氨基酸序列，符号“*”代表终止密码)；图4.大肠杆菌44815株(E.coli strain 44815)ltB基因及幽门螺杆菌Y06株(Helicobacterpylori strain Y06)ureB和hpaA基因的ltB-ureB-hpaA融合基因核苷酸和氨基酸序列(其中下划横线区为上、下游引物序列及连接引物位置，每排上一行为核苷酸序列、下一行为氨基酸序列，符号“*”代表终止密码，大肠杆菌44815株ltB基因去除其终止密码TAG，幽门螺杆菌Y06株ureB和hpaA基因均分别去除其启动密码ATG及终止密码TAG和TAA，表达载体pET42a的CTCGAG序列是用于亚克隆构建表达载体的限制性核酸内切酶XhoI位点，CACCACCACCACCACCACCACCAC序列是利用其编码的8×His以用于Ni-NTA亲和层析法提纯目的表达产物，TAA为终止密码以终止表达)；
图5感染小鼠胃黏膜标本中位于胃小凹中的幽门螺杆菌(镀银染色，×1000倍)；图6小鼠胃粘膜活检标本中分离培养的幽门螺杆菌(革兰染色，×1000倍)。
具体实施例方式
实施例1、本实施例预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗是采用基因工程技术，构建包括大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)B亚单位(LTB)及幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)和幽门螺杆菌尿黏附素(HpaA)基因的人工融合基因ltB-ureB-hpaA及其原核表达系统pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coli BL21DE3，以重组表达并获取目的产物rLTB-UreB-HpaA作为疫苗佐剂和抗原，成为一种预防幽门螺杆菌感染的内置LTB佐剂UreB-HpaA基因重组口服疫苗；其中大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB为免疫增强佐剂、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位UreB和幽门螺杆菌黏附素HpaA为抗原，采用基因工程技术构建ltB、ureB和hpaA基因人工融合基因ltB-ureB-hpaA及其原核表达系统，采用提纯的重组表达产物的幽门螺杆菌基因工程疫苗。
本发明研制基因工程疫苗对抗原及其基因的选择所有幽门螺杆菌菌株均有编码尿素酶基因并表达尿素酶，其中尿素酶B亚单位(UreB)具有序列保守、表达量高、表面分布、大分子量和颗粒状结构、抗原性强等特点，故将UreB作为幽门螺杆菌基因工程疫苗首选抗原；所有幽门螺杆菌菌株均有编码幽门螺杆菌黏附素(HpaA)基因并表达HpaA，HpaA位于该菌表面的鞘膜蛋白，序列保守、表达量高、抗原性较强且与细菌黏附有关；因此将HpaA作为另一幽门螺杆菌基因工程疫苗抗原。
本发明基因工程疫苗采用口服疫苗的理由是注射免疫通常是诱生血清抗体；但从幽门螺杆菌侵入人体后只寄居在胃或十二指肠黏膜浅表部位、从未发现该菌侵入血流，由此可见血清抗体等抗感染免疫成分无预防或阻断幽门螺杆菌感染的作用；而口服免疫主要诱导黏膜局部免疫应答，且根据幽门螺杆菌感染及机体免疫应答特点。因此，采用幽门螺杆菌口服疫苗才有可能产生有效的免疫保护作用。
基因工程疫苗虽具有抗原成分明确、副作用小等优点，但单一蛋白抗原构成的疫苗免疫效果往往较差。近年有不少研究资料证明，大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)有很强的黏膜免疫佐剂活性。LT由两种亚单位A(LTA)和B(LTB)组成，其中LTA是LT的毒性部位，LTB功能是黏附细胞而无毒性。已有不少文献报道，LTB有很强的诱导黏膜免疫的活性，是良好的黏膜免疫佐剂。
若采用基因工程技术，将大肠杆菌LTB、幽门螺杆菌UreB和HpaA分别重组表达，必然增加生产成本。因此，本实施例采用不同基因人工融合技术，将ltB、ureB和hpaA三个基因串联成为ltB-ureB-hpaA一个融合基因，然后构建ltB-ureB-hpaA原核表达系统。ltB-ureB-hpaA原核表达系统重组表达产物为rLTB-UreB-HpaA，其分子中同时含有黏膜免疫佐剂LTB、幽门螺杆菌抗原UreB和HpaA，不仅可因分子量增大而提高抗原性，并可有效地降低生产成本而有利于产业化。此外，还对rLTB-UreB-HpaA抗原性和免疫反应性、表达产量和提纯方法、佐剂活性、口服免疫小鼠后预防幽门螺杆菌感染的效果等进行了验证，rLTB-UreB-HpaA产量可达细菌总蛋白的35.5％，其中rLTB仍保持有佐剂活性，口服免疫后可使100％小鼠不感染幽门螺杆菌、91.7～100％小鼠产生特异性S-IgA，其结果表明，rLTB-UreB-HpaA可用于预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗。
本实施例预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗的制备方法包含以下的步骤1)大肠杆菌ltB基因、幽门螺杆菌ureB和hpaA基因的克隆和测序及其原核表达系统构建；2)ltB-ureB-hpaA人工融合基因及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导目的重组蛋白rLTB-UreB-HpaA表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况和产量；4)Ni-NTA亲和层析法提纯rLTB-UreB-HpaA。此外还采用GM1-ELISA对rLTB-UreB-HpaA分子中的rLTB佐剂活性进行鉴定；采用幽门螺杆菌小鼠感染模型、小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌培养与鉴定、小鼠胃黏液中特异性S-IgA测定等方法，测定和确定口服免疫的幽门螺杆菌基因工程疫苗rLTB-UreB-HpaA的免疫保护作用及其局部特异性抗体产生情况。
本实施例中的产不耐热肠毒素LT的大肠杆菌菌株分别可从我国法定菌种保藏单位或美国菌种保藏中心(ATCC)、英国菌种保藏中心(NCTC)等国内外菌种保藏单位购得；产不耐热肠毒素LT大肠杆菌44815株(E.coli strain 44815)购自北京中国药品生物制品检定所；所有幽门螺杆菌均有ureB和hpaA基因，幽门螺杆菌菌株如ATCC26695、NCTC11637及国内菌株，可分别从我国法定菌种保藏单位或美国菌种保藏中心(ATCC)美国菌种保藏中心(ATCC)、英国菌种保藏中心(NCTC)购得；本实施例中所用的幽门螺杆菌Y06株系从北京中国药品生物制品检定所购得；本实施例中所用的一切实验用材料和试剂及相关设备均可从各自国内外相关产业公司或国外公司国内销售代理公司购得，实验动物可从多个国内大学、中国科学院、中国疾病预防控制中心、各省实验动物中心等单位购得。在微生物学、分子生物学等技术领域的专业人员，均可重复本实施例中的制备方法并进行试用。
上述人工融合基因ltB-ureB-hpaA的制备方法是1)取用购自北京中国药品生物制品检定所的产LT大肠杆菌44815株和幽门螺杆菌Y06株，大肠杆菌拉丁文名是Escherichia coli(E.coli)；幽门螺杆菌拉丁文名是Helicobacter pylori(H.pylori)；大肠杆菌44815株接种于LB琼脂平板上，普通大气中37℃培养24小时；幽门螺杆菌Y06株接种于加有5％脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂平板上，85％氮气、10％二氧化碳、5％氧气条件下37℃培养72小时；用灭菌生理盐水收集细菌并反复离心、悬浮3次；2)分别取离心沉淀的大肠杆菌44815株和幽门螺杆菌Y06株菌体，用苯酚(pH7.8-8.0)-氯仿(1∶1，V∶V)提取、0.1倍3mol乙酸钠和2倍体积无水乙醇沉淀获得DNA；3)分别以大肠杆菌44815株和幽门螺杆菌Y06株DNA为模板，采用PCR分别扩增全长大肠杆菌ltB基因及全长幽门螺杆菌ureB和hpaA基因，T-A克隆法插入克隆质粒pUC-M-T中，然后3个重组克隆质粒分别转入大肠杆菌DH5α株内，用双末端脱氧法测定目的基因核苷酸序列(如图1～图3所示)；3)采用连接引物PCR，将序列正确的ltB、ureB、hpaA连接成人工融合基因ltB-ureB-hpaA，T-A克隆法插入克隆质粒pUC-M-T中，然后转入大肠杆菌DH5α株内，用双末端脱氧法测定核苷酸序列(如图4所示)。
上述原核表达系统pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coli BL21DE3的制备方法是1)在LB液体培养基中扩增含pET42a质粒的大肠杆菌DH5α株，采用小量碱变性法提取pET42a质粒，限制性核酸内切酶NdeI和XhoI酶切，使pET42a线性化；2)在LB液体培养基中扩增重组质粒pUC-M-T-ltB-ureB-hpaA，采用小量碱变性法提取该质粒，限制性核酸内切酶Nde I和XhoI酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳分离酶切目的片段ltB-ureB-hpaA；3)将线性化pET42a和酶切目的片段ltB-ureB-hpaA等比混合，T4连接酶37℃连接12小时，获得目的重组表达质粒pET42a-ltB-ureB-hpaA；3)在LB液体培养基中扩增大肠杆菌BL21DE3株，将目的重组表达质粒pET42a-ltB-ureB-hpaA转入该菌中，获得原核表达系统pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coliBL21DE3，用双末端脱氧法测定核苷酸序列，确保在E.coli BL21DE3中含有序列正确的表达质粒pET42a-ltB-ureB-hpaA。
上述目的重组表达产物rLTB-UreB-HpaA的表达和提纯方法是1)在LB液体培养基中接种pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coli BL21DE3，30℃或37℃、300转/分钟旋转培养4小时，加入0.5mol/L的IPTG，按上述条件继续培养4～6小时；2)超声破碎离心收集的细菌，过Ni-NTA亲和层析柱，利用重组表达目的产物rLTB-UreB-HpaA的C端6×His标签，分离、洗脱、收集目的重组表达产物rLTB-UreB-HpaA。上述实验结果如下1)pET42a-ltB-ureB-hpaA-E.coli BL21DE3可有效表达rLTB-UreB-HpaA，产量可达细菌总蛋白的35.5％；2)Ni-NTA亲和层析后rLTB-UreB-HpaA可达到电泳纯。
为证实目的重组表达产物rLTB-UreB-HpaA的抗原性、免疫反应性和佐剂活性，分别以rLTB-UreB-HpaA为抗原免疫家兔观察特异性抗体产生情况、以rLTB-UreB-HpaA为抗原检测其与幽门螺杆菌全菌抗体(购自DAKO公司)的免疫结合反应、以rLTB-UreB-HpaA为包被分子检测其与牛神经节苷酯GM1的结合能力。
目的重组表达产物rLTB-UreB-HpaA的抗原性、免疫反应性和佐剂活性实验分别描述如下1)抗原性检测体重2.5～3.0kg家兔皮内多点注射rLTB-UreB-HpaA，每次剂量1mg，间隔一周注射一次，共4次；末次注射后第10天，抽取免疫家兔心血、分离血清，以rLTB-UreB-HpaA为抗原，用琼脂双扩散法或Western杂交法鉴定血清中有无rLTB-UreB-HpaA特异性抗体及其效价；2)免疫反应性检测以rLTB-UreB-HpaA为抗原，用Western杂交法检测幽门螺杆菌全菌抗体能否识别rLTB-UreB-HpaA并与之结合；3)佐剂活性检测由于LTB佐剂活性主要取决于其与哺乳动物细胞表面神经节苷酯GM1的结合能力，故以牛神经节苷酯GM1为包被分子，采用免疫酶联免疫法(ELISA)检测rLTB-UreB-HpaA抗血清与牛神经节苷酯GM1的结合能力。上述实验结果如下1)rLTB-UreB-HpaA免疫家兔后可产生特异性抗体，其琼脂双扩散法效价为1∶8、Western杂交法效价1∶1000；2)稀释度高达1∶3000的幽门螺杆菌全菌抗体能识别rLTB-UreB-HpaA并与之结合，形成明显的特异性黑褐色杂交条带；3)佐剂活性检测rLTB-UreB-HpaA抗血清能与牛神经节苷酯GM1结合，其OD490均值±SD为0.52±0.11，高于阴性对照的0.05±0.02的3倍以上，故判为有较强的牛神经节苷酯GM1结合能力。
为证实目的重组表达产物rLTB-UreB-HpaA动物免疫保护效果，首先建立了幽门螺杆菌SS1株BALB/c小鼠感染模型，并采用感染小鼠胃黏膜活检标本镀银染色、胃黏膜活检标本中幽门螺杆菌分离培养、分离菌株染色镜检和生化反应，对小鼠感染模型进行鉴定。BALB/c小鼠分别口服免疫rUreB、rHpaA、rLTB+rUreB、rLTB+rHpaA、rLTB-UreB-HpaA后，按建立小鼠感染模型中所用幽门螺杆菌SS1株感染剂量和次数进行攻击，然后采用小鼠胃黏膜活检标本中幽门螺杆菌分离培养、分离菌株染色镜检和生化反应，对不同疫苗抗原组合对小鼠的免疫保护作用进行验证，并检测小鼠血清IgA和胃液S-IgA。
幽门螺杆菌SS1株BALB/c小鼠感染模型、不同疫苗抗原组合对小鼠的免疫保护作用实验分别描述如下1)幽门螺杆菌感染小鼠模型的建立用pH7.4、0.01mol/L的PBS收集幽门螺杆菌SS1株新鲜培养物，采用麦氏比浊法确定浓度后，用布氏肉汤分别配制成浓度为5×1010CFU/ml菌液；BALB/c小鼠由上海复旦大学动物中心提供，清洁级雌性6～8周龄体重18±1g的BALB/c小鼠感染前12小时禁食不禁水、前0.5小时灌胃0.1mol/L NaHCO30.2ml中和胃酸，将小鼠分成免疫组、感染组和对照组，每组12只，试验组和感染组小鼠每只灌胃5×1010CFU/ml菌液0.2ml(1×1010CFU)，对照组小鼠每只灌胃无菌布氏肉汤0.2ml，共灌喂3次，每次间隔1d，每次感染后4小时内禁食禁水；2)幽门螺杆菌分离与鉴定小鼠末次感染后4周断颈处死，每只小鼠取胃窦部组织标本2块，1块组织匀浆后接种于用于8％脱纤维羊血哥伦比亚琼脂平板上，以分离培养幽门螺杆菌，残留匀浆用于快速尿素酶试验，另1块组织用10％甲醛溶液固定、包埋、切片后用Warthin-Starry镀银染色法检查；将琼脂平板上生长的疑似菌落增菌后，进行革兰染色镜检、快速尿素酶和氧化酶试验，若菌体为革兰阴性弧状或海鸥状、尿素酶和氧化酶试验阳性者鉴定为幽门螺杆菌；3)免疫保护试验分别将rLTB、rUreB、rHpaA、rLTB-UreB-HpaA溶于pH7.4、0.01mol/L PBS中；将BALB/c小鼠分成5个试验组和2个对照组，每组12只；5个试验组小鼠分别用rUreB、rHpaA、rLTB+rUreB、rLTB+rHpaA、rLTB-UreB-HpaA进行免疫，末次免疫后第28、30、32d灌胃5×1010CFU/ml的幽门螺杆菌SS1株悬液0.2ml(1×1010CFU)，对照组分为感染但不免疫的感染对照组和不免疫、不感染的正常对照组，感染前后的处理与幽门螺杆菌感染小鼠模型中相同；小鼠末次感染后第4周，眼眶后窦采血并分离血清，小鼠断颈处死后取小鼠胃体部分，用3ml终浓度为50mmol/L EDTA、20nmol/L蛋白酶抑制剂亮肽素和胃酶抑素的0.01mol/L PBS(pH7.4)中反复漂洗，1000r/min离心10分钟后取上清，加入20μl 100mmol/L PMSF，再15000r/min4℃离心20分钟，取上清加入0.1ml小牛血清，以上采集的血清和胃液标本用于检测抗体；小鼠胃窦组织标本采集及检查均与幽门螺杆菌感染小鼠模型中相同；4)血清IgA和胃漂洗液S-IgA检测以0.1ml包被缓冲液配制的20μg/ml rUreB或rHpaA为包被抗原、胃漂洗液或1∶200稀释的血清为一抗、兔抗鼠lgA为二抗、HRP标记的羊抗兔IgG为三抗，邻苯二胺为底物，用ELISA检测各标本中S-IgA或血清IgA，若受检标本OD490值≥正常对照组小鼠OD490均值+3SD为阳性。上述实验结果如下1)模型小鼠幽门螺杆菌感染率小鼠胃组织标本用Warthin-Starry镀银染色法检查均可查见黑色的幽门螺杆菌(图5)，胃组织标本中幽门螺杆菌分离阳性率可达100％并有典型形态，如图6所示；2)免疫保护率rUreB或rHpaA为疫苗抗原时免疫保护率均为66.7％，rLTB+rUreB或rLTB+rHpaA为疫苗抗原时免疫保护率均为83.3％，rLTB+rUreB+rHpaA为疫苗抗原时免疫保护率为90.9％，rLTB-rUreB-rHpaA为疫苗抗原时免疫保护率可达100％(参见下列的表1)；3)血清IgA和胃漂洗液S-IgA阳性率rUreB或rHpaA为疫苗抗原时，IgA和S-IgA均为阴性；rLTB+rUreB或rLTB+rHpaA为疫苗抗原时，rUreB和rHpaA的IgA阳性率均为25.0％、rUreB和rHpaA的S-IgA阳性率分别为63.6％和50.0％，rLTB+rUreB+rHpaA为疫苗抗原时，rUreB和rHpaA的IgA阳性率分别为33.3％和25.0％，rUreB和rHpaA的S-IgA阳性率分别为81.8％和72.7％；rLTB-UreB-HpaA为疫苗抗原时，rUreB和rHpaA的IgA阳性率均75.0％，rUreB和rHpaA的S-IgA阳性率分别为100％和91.7％(参见下列的表2)。
综上所述，rLTB-UreB-HpaA能形成一种口服幽门螺杆菌基因工程疫苗产品而用于预防幽门螺杆菌感染的相关疾病。
表1免疫小鼠胃粘膜标本中幽门螺杆菌SS1株分离阳性率和免疫保护率(n＝12)
注“+”表示将不同的单一成分混合；“-”表示一个融合基因表达蛋白分子中所包含的不同基因产物。
表2免疫小鼠特异性血清IgA和胃液S-IgA检测结果(n＝12)
注“+”表示将不同的单一成分混合；“-”表示一个融合基因表达蛋白分子中所包含的不同基因产物实施例2、本实施例预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗是将疫苗抗原rLTB-UreB-HpaA水溶液直接制备成口服滴丸，其水溶液的浓度可为1mg/ml；还可将rLTB-UreB-HpaA冷冻干燥后与药用赋形剂磷酸钙混合后制备成口服胶囊，其中的磷酸钙也有较弱的佐剂活性。每粒口服胶囊内含100～500μg，该量的大小可视不同的对象进行选择，不同的性别、不同的年龄段的人，其用量不同；甚至还可在不同的动物中以不同剂量进行喂给。
权利要求
1.一种预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗其是一种内置LTB佐剂UreB-HpaA基因重组口服疫苗，它以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB为免疫增强佐剂、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位UreB和幽门螺杆菌黏附素HpaA为抗原，采用基因工程技术构建ltB、ureB和hpaA基因人工融合基因ltB-ureB-hpaA及其原核表达系统，采用提纯的重组表达产物的幽门螺杆菌基因工程疫苗。
2.一种制备权利要求1所述预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗的方法，它包含以下的步骤1)大肠杆菌ltB基因、幽门螺杆菌ureB和hpaA基因的克隆和测序及其原核表达系统构建；2)ltB-ureB-hpaA人工融合基因及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导目的重组蛋白rLTB-UreB-HpaA表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况和产量；4)Ni-NTA亲和层析法提纯rLTB-UreB-HpaA；5)采用GM1-ELISA对rLTB-UreB-HpaA分子中的rLTB佐剂活性进行鉴定；6)采用幽门螺杆菌小鼠感染模型、小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌培养与鉴定、小鼠胃黏液中特异性S-IgA测定等方法，测定和确定口服免疫的幽门螺杆菌基因工程疫苗rLTB-UreB-HpaA的免疫保护作用及其局部特异性抗体产生情况。
3.根据权利要求2所述预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗的方法，其特征是所说的rLTB-UreB-HpaA水溶液直接制备成口服滴丸。
4.根据权利要求2所述预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗的方法，其特征是所说的rLTB-UreB-HpaA经冷冻干燥后与药用赋形剂磷酸钙混合后制备成口服胶囊。
全文摘要
用于预防幽门螺杆菌感染而引起的胃炎和消化道溃疡等相关性疾病的预防幽门螺杆菌感染的基因重组口服疫苗及其制备方法。它是一种以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB为免疫增强佐剂、幽门螺杆菌尿素酶B亚单位UreB和幽门螺杆菌黏附素HpaA为抗原，采用基因工程技术构建ltB、ureB和hpaA基因人工融合基因ltB－ureB－hpaA及其原核表达系统，采用提纯的重组表达产物的内置LTB佐剂UreB－HpaA基因重组口服疫苗。在以GM1－ELISA、小鼠感染模型、特异性S－IgA测定等方法证实rLTB－UreB－HpaA无害人体，且能以口服滴丸或口服胶囊供人们服用、防病，并且制造成本较低、以利于推广应用。
文档编号A61K47/02GK1973903SQ20061015504
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月4日 优先权日2006年12月4日
发明者严杰, 毛亚飞 申请人:严杰, 毛亚飞