对作为癌症治疗特别是结肠直肠癌治疗靶标的磷脂酶a2的鉴定及其作用机制的制作方法

专利名称：对作为癌症治疗特别是结肠直肠癌治疗靶标的磷脂酶a2的鉴定及其作用机制的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及组织样品的体外分析测试，并且更加具体而言涉及癌 症中基因表达方面。
背景技术：
"心血管疾病血浆多肽"(CPP)、 CPP的片段以^L翻译后修饰的形式 以较低水平存在于患有冠状动脉疾病(CAD)的个体血浆中.CPP是分泌的 因子，因此是容易检测的并且可用于药物开发、心血管疾病的诊断和预防. 参阅于2004年7月15日提出的PCT/EP2004/007842, "SECRETED POLYPEPTIDE SPECIES REDUCED IN CARDIOVASCULAR DISORDERS", GeneProt公司(瑞士，日内瓦)在Ajfir浆中检测到了磷脂 酶A2(PLA2)的片段并且合成了该片段，该肽被命名为GP—1221076 (还称 作CPP-51或GPA071).
在本领域还需要关于磷脂酶A2及其片M血浆中的功能的额外信息。
发明简述
将分泌的磷脂酶A2，即GPA071肽注射人小鼠中。获得了许多器官中 的基因表达镨，令人惊奇地是，GPA071肽显示出对肝脏中的基因表达调
节具有显著的作用。所影响的基因是整联蛋白信号途径、wnt途径以及 PTEN途径的成员。基因表达的改变通常预示着，GPA071肽和PLA2对 细胞的增殖和侵袭具有积极作用，经基因注释指向了结肠直肠癌。据我们 所知，这是第一次发现分泌的磷脂酶A2对整联蛋白信号具有上游刺激作 用。
因此，本发明提供了多肽(分泌磷脂酶A2，如GPA071肽)用于制造治 疗增殖性疾病或病症，如癌症，特别是结肠直肠癌的药物的用途，
在进一步的方面，本发明涉及治疗增殖性疾病或病症，如癌症，特别 是结肠直肠癌的方法，其包括向患有疾病或病症的包括人在内的哺乳动物 施用有效量的如上所定义的多肽。
在另一个方面，本发明涉及用于增殖性疾病或病症，如癌症，特别是 结肠直肠癌的药物组合物，其包含有效量的如上所定义的多肽以及可药用 栽体。
在另一个方面，4^发明涉^L磷脂酶A2用作癌症治疗，特别是结肠直 肠癌治疗靶标的用途，
优选实施方案的详述
使用Velocegenomics方法(描述于2004年11月11日提出的 PCT/EP2004/012572， "USE OF ORGANIC COMPOUND"),将GPA071 肽注射人小鼠中。获得了许多器官中的基因表达谱.令人惊奇地是， GPA071肽显示出对肝脏中的基因表达调节具有显著的作用。所影响的基 因是整联蛋白信号途径、wnt途径以及PTEN途径的成员。见表l。
表1
变化基因基因名称
倍数
1.33Actnl辅肌动蛋白，al
0.81Atf4激活转录因子4
0.74Atf5激活转录因子5
0.78Ape腺瘤性结肠息肉
0.82膜联蛋白A7基因表达的改变通常预示着，GPA071肽和PLA2对细胞的增殖和侵 袭具有积极作用，经基因注释指向了结肠直肠癌.
Catnb联蛋白j8
Cdl51CD151抗原
Ccl28趋化因子(C-C基序)配体28
Ccl9趋化因子(C-C基序)配体9
Crsp3Spl转录激活所需的辅因子，亚基3
Cttn皮层肌动蛋白
Pscdlcytohesin 1 (血小板白细胞C激酶底物同系物，Sec7以及巻
曲结构域1)
Dvlldishevelled, dsh同系物1 (Drosophila)
Dst肌动蛋白结合蛋白
FAK黏着斑激酶(PTK2蛋白质酪氨酸激酶2)
IhhIndian hedgehog
IkbkgKB激酶抑制剂了
Ilk整联蛋白偶联激酶 B jSi 沾浙jS&
Ick Lifr鹏剤肥双辨 白血病抑制因子受体
Madh4MAD同系物4 (Drosophila)
Mapkapk2MAP激酶活化的蛋白激酶2
MknklMAP激酶相互作用丝氨斷苏氨酸激酶l
Mtal转移相关1
BC024131转移抑制基因1
Mapk8 Map3kl2丝裂原活化蛋白激酶8
丝^L^活化蛋白激酶激酶激酶12
Prkcl蛋白激酶C, X
Prkcl蛋白激酶C， X
Ppp2rla蛋白礴酸酶2(以前为2A),调节亚基A(PR65), a同种型
Arhuras同系物基因家族，成员U
5133400C09RikRIKEN cDNA 5133400C09基因
Sstr2促生长素抑制素受体2
SoslSon of sevenless同系物1 (Drasfip/^/a)
Shcl包含src同系物2结构域的转4t蛋白CI
Socs4细胞因子信号抑制蛋白4
Aktl胸腺瘤病毒原癌基因1
Tgfa转化生长因子a
Tgm2转谷氨酰胺酶2, C多舦
Usf2上游转录因子2
Crkv-crk肉瘤病毒CT10癌基因同系物(鸟类)
Crkv-crk肉瘤病4"CT10癌基因同系物(鸟类)
Wntll无翅相关MMTV整合位点11
9731583 1030058587382797 Jc^gp55f5^35SSJgg^s25ccnsis
磷脂酶A2多核苷酸和多肽的结构是已知的。磷脂酶A2超家族信号 转导酶日益增加Dennis EA, Trends in Biochemical Sciences 22:1 (1997)。 从人血浆中分离的GPA071的肽序列(识别号GP_1221076)是
参阅于2004年7月15日提出的PCT/EP2004/007842， "SECRETED POLYPEPTIDE SPECIES REDUCED IN CARDIOVASCULAR DISORDERS"(在此引用作为参考)。所合成的124个氨基酸的小鼠 GPA071 的 肽 序 列 是
EDFICNCDREAAICFSKVPYNKEYKNLDTGKFC (SEQ ID NO:2)。
基于该基因表达分析发现，磷脂酶A2通过活化黏着斑复合物和整联 蛋白信号途径而起作用。这可通过增加胆汁酸的释放直接发生，反过来胆 汁酸激活了黏着斑激酶和下游信号事件，导致潜在的netto促增殖和促迁 移作用。Debruyne PR等，Oncogene 21(44): 6740-50 (2002年10月3日)。 在胆汁酸和整联蛋白之间可能存在连接的证据由Haussinger D等， Gastroenterology 124(5): 1476-87 (2003年5月)证明。然而，基因表达的改 变可以源于补偿性作用并且掩盖了抗增殖作用(见下文)。体内验证试验， 例如本文提供的那些试验是必需的。
通过注射GPA071影响到了结肠直肠癌所涉及的许多基因，例如P-联 蛋白(参阅Waterman ML， Cancer Metastasis Rev. 23(1-2): 41-52 (2004年 1-6月))、APC、 wntll(肠癌)。虽然认为分泌的磷脂酶A2可起到保护作用 避免患有结肠直肠肺瘤，但是磷脂酶A2还是将结肠直肠癌与APC信号连 接起来。Kennedy BP等，Cancer Res. 58(3): 500-3 (1998年2月1日)。
Velocegenomics方法描述于2004年ll月 11日提出的 PCT/EP2004/012572， "USE OF ORGANIC COMPOUND，，(在此引用作为 参考)中。以300、 600或1000 Mg/天的剂量向雄性C57BL/6小鼠皮下4吏用 肽(在这里为GPA071)7-14天。处理阶段结束时，将来自所有器官的样品 速冻并用GeneCWp⑧分析表达镨。
使用TRIzol试剂(Life Technologies)并根据产品说明书从这些水冻组 织中提取总RNA。通过X = 260 nm (A260nm)的吸收将总RNA定量，并 且通过A260nm/A280nm比值评价纯度。通过变性凝胶电永险查完整性。 将RNA储存于-80。C直至分析。使用Superscript Choice System (Life Technologies)将质量好的总RNA合成双链cDNA。然后，将cDNA体外转 录(MEGAscriptT" T7试剂盒，Ambion)形成生物素标记的cRNA。接着， 将12-15 mg标记cRNA与Affymetrix Mouse MOE430A表达探针列阵于 45°C杂交16小时.然后按照EukGE-WS2方法(Affymetrix)洗涤阵列， 并用10mg/ml链霉亲和素-藻红蛋白缀合物(MolecularProbes)染色。用2 mg/ml乙酰化BSA (Life Technologies)、 100 mM MES、 1 M [Na+、0.05 % Tween20、 0.005 % Antiofoam (Sigma) 、 0,1mg/ml山羊IgG和0.5 mg/ml 生物素化抗体将信号放大，然后用链霉亲和素溶液再次染色。洗涤后，用 GeneArray 扫描仪(Affymetrix)扫描阵列两次。
通过将用给定的寡核苷酸探针对测量的信号强度的差异平均(AvgDiff 值)，来评估表达水平。在该研究中使用的图像获得和数字转换软件是 Affymetrix Microarray Suite第5版(MAS5)。为了鉴定受处理影响的基因， 在第一次波动分析中将数据集初次过滤以排除其数值系统性地处于试验噪 音高情况下的低表达范围(在许多次试验中AvgDiff值为50，对应于任何试 验点的最小拷贝数)的基因。在第二轮的选择中，阈值t-检验p4(0.05)基 于双组M差模型(总体误差模型(Global Error Model))并且(如果可能)使 用多假设检验的逐步下I^^正(Benjamini和Hochberg 4^iL现率 )鉴定在 处理与非处理之间具有不同数值的基因.
然后使用Fisher，s精确检验将所选择的基因集与已经建立的对于途径
和细胞成分的基因集相比较。使用Venn图表鉴定在不同的器官之间共同 的基因改变。高度相关基因的表达镨用于使用几种距离度量(标准，Pearson) 发现在各个试验点具有相关改变的基因。
与如上所述统计学算法的结合以及与共同生物学主题所涉及的其它被调节 基因的关系。
如本文所使用，术语"多肽"指蛋白质、肽、寡肽或合成寡肽。这些术 语可互换使用。这些术语中的任何一个是指通过肽键或酰胺键连接在一起 的两个或多个M酸的链，而不管翻译后的修饰如糖基化或磷酸化。多肽 还可以由一个以上的亚基组成，其中每一亚基由分开的DNA序列编码。
本发明的多肽可包括具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的>11^^ 列的GPA071。本发明多肽还包括本发明多肽的功能活性多肽片段。如本 文所示，功能活性可通it^L模型系统中测量肽调节基因表达的活性，例如 通过Velocegeneomics方法来证明。如本文所使用，术语"生物活性的" 指分子引起或影响生物事件。在一个优选的实施方案中，GPA071或其片 段的生物活性水平通过检测表1中所列一个或多个基因的表达水平来测 量。优选地，确定表l中多数基因的表达。本发明的"生物活性多肽"包 括GPA071及其片段。还包括其絲紗列与GPA071及其功能活性片段 的同一性至少50%的同系物。
此种多肽片段意思是指这样的多肽，即其M酸序列与本发明多肽的 M酸序列的部分(并非4^P)完全相同。此类多肽片段可以是"无支撑的" 或者可以是更长多肽的部分，其中此类多肽部分形成了所述更长多肽的一 部分或区域，最优选作为单一连续区域。片段可以包含至少10个氨基酸、 优选至少15、 20或25个氨基酸。更优选地，片段包含至少30个氨基酸。 另一优选片段包含至少40、 50、 60、 65、 70或75个#^酸.最优选地， 片段包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的12、 22、 32、 35、 39、 66、 72
此类多肽还可以是这样的片段，例如通过蛋白酶如胰蛋白酶产生的水 解产物。本发明的多肽或多肽片段可包含SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:2 的C末端片段。此C末端片段可包含C末端的至少IO个M酸、优选至 少20或25个氨基酸、甚至更优选至少30个M酸或者至少65、 70或75 个氨基酸。至少10个氨基酸可以包含最C末端的至少10个氨基酸。多肽 可包含SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:2的至少32、 35、 39、 66、 72或75 个最C末端的M酸。片段还可包含内部片段。
多肽还可以具有这样的^^酸序列，即其与上述多肽如SEQIDNO:l 或SEQ ID NO:2中任意一个的^J^酸序列具有至少50%、优选至少60%、 更优选至少70%或80%并且最优选至少卯％ ，如95%、 97%或99%的 同一'性。
氨基酸^在此以标准的单字母或三字母符号表示A (Ala)丙氨酸； C (Cys)半胱氨酸；D (Asp)天冬氨酸；E (Glu)谷氨酸；F (Phe)苯丙氨酸； G (Gly)甘氨酸；H (His)组氨酸；I (lie)异亮氨酸；K (Lys)赖氨酸；L (Leu)亮氨酸；M (Met)蛋氨酸；N (Asn)天冬跣胺；P (Pro)脯氨酸；Q (Gin)谷氨跣胺；R (Arg)精氨酸；S (Ser)丝氨酸；T (Thr)苏氨酸；V (Val) 缬氨酸；W (Trp)色氨酸；Y (Tyr)酪氨酸.
用于比较参照序列和另一序列(即"候选"序列)的术语"同一性百分 比(％)"或相似术语意思是指两个序列间的最佳比对，候选序列与相当于 所指出百分比的亚单位位置中的参照序列相同，对于多核苷酸比较而言亚 单位为核苷酸，对于多肽比较而言为氨基酸，如本文所使用，所比较序列 的"最佳比对"是使亚单位间的匹配最大化和使建立比对时所采用缺口的 数量最小化的比对。同一性百分比可使用商业可得的运算执行工具确定， 如Needleman和Wunsch， J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)所述算法 (Wisconsin序列分析包中的"GAP，，程序，Genetics Computer Group, Madison, WI)。本领域中用于构建比对和计算同一性百分比或其它的相似 性度量的其它软件包包括"BestFit"程序，该程序基于Smith & Waterman,
Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)的算法(Wisconsin序列 分析包，Genetics Computer Group, Madison, WI)。同一性百分比还可 通过WU-BLAST-2产生。Altschul等，Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)。 WU-BLAST-2使用几种搜索^lt，其中大多数^lt^L设置成默认 值。将可调整的M设置成如下值重叠跨度=1，重叠片段=0.125，字开 端(T)-ll 。 M酸序列同 一性百分比通过匹配的相同残基数量除以比对区 戎基总数确定。例如，为了得到具有与参照>^酸序列具有至少95%同一 性的MM列的多肽，在参照序列中，不多于5%的#^酸残基被删除 或者被另外的M酸取代，或者参照序列总^H基酸残基中不多于5%的氨 基酸数量被插入到参照序列中。参照序列的这些改变可以发生在参照#* 酸序列的^J^末端或g末端位置或者这些末端位置间的任何位置，或者 单独散布于参照序列的瓶基当中，或者以一个或多个连续基团散步于参照 序列中。应当理解，在与本发明的参照序列比较过程中，候选序列可以是 较长多肽或多核苷酸的组成成分或片段，并且以计算百分比同一性为目的 的此种比较可以相对于相关组成成分或片段开展。
本发明还包括本文所述的多肽或多肽片段的功能保守性变体。此类变 体可以^使用本领域标准方法产生，例如通过保守M酸替代。 一般地，此 类替化lL Ala、 Val、 Leu和lie间的替代；Ser和Thr间的替^ ;酸性残 基Asp和Glu间的替代；Asn和Gin间的替代；和碱性^t^ Lys和Arg 间的替代；或者芳香族残基Phe和Tyr间的替代，特别优选的是其中几个、 5-10、 1-5或2个氨基酸以任意组合被取代、删除或加入的变体.
在多个其它实施方案中，多肽或其片段或多肽变体或同系物可以是线 性的或分支的，其可包含修饰的氨基酸，其可被非氨基酸中断，和/或其可 以装配成一个以上多肽链的复合物。如本领域众所周知，多肽可以是天然 修饰或者通过介入修饰；例如形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷 酸化或任意其它操作或修饰，例如与标记成分缀合。在一些实施方案中， 多肽或多肽片段包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等) 以及本领域已知的其它修饰。
本发明的多肽或多肽片段包括分离的天然存在多肽。优选地，此天然
存在多肽在所选择群体中的频率为至少5%，最优选至少10%。所选择群 体可以是群体遗传学领域研究的任何认可群体。优选地，所选择群体是高 加索人、黑人或亚洲人。更加优选地，所选择^^是法国人、德国人、英 国人、西班牙人、瑞士人、中国人、日本人、韩国人、华M加J^A、冰 岛人、北美洲人、以色列人、阿拉伯人、土耳其人、希腊人、意大利人、 波兰人、太平洋岛人或印度人。
农时重逸合成
本发明的多肽或其片段还包括重组产生的多肽、合成产生的多肽以及 此类本发明多肽和其片段的组合。制备此类多肽的方法在本领域众所周知。 例如，本发明的多核苷酸片段或多肽可以从体液(包括但不限于血清、尿 和腹水)分离，所述体液或者通过化学或生物学方法合成(例如细胞培养、 重组基因表达)。在本文中，如果没有明确说明，"分离的"包括含义"从 共存材料中分离"。
本发明的重组多肽可以通过本领域众所周知的方法从包含表达系统的 基因工程宿主细胞制备。因此，在进一步的方面，本发明涉及通过重组技
术产生多肽，涉及包含编码本发明多肽的一个或多个核酸的表达系统，涉 及用此类表达系统进行基因工程^tit的宿主细胞，以及涉及分离多肽的方 法。
术语"核酸"意思是指天然的或半合成的或合成的或修饰的核酸分子。
苷酸序列、寡核苷酸或多核苷酸r这些术语旨在互换使用。RNA可以丄 tRNA (转移RNA)、 snRNA (小核RNA)、 rRNA (核糖体RNA)、 mRNA (信 使RNA)、反义RNA和核酶形式。DNA可以是质粒DNA、病毒DNA、 线性DNA、染色体或基因组DNA、 cDNA或者它们的衍生物。此外，这 些DNA和RNA可以是单链的、双链的、三链的或四链的。术语还包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯和天然核酸磷酸主链的其它变体。
杂交反应的"严*件"可通过本领域普通技术人员容易地确定，一 般是基于探针长度、洗涤温度以及盐浓度进行经验计算。通常，较长的探 针需要较高的温度来正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交一般 取决于已变性核酸与环境中的互4hM在大约但低于解链温度下重新退火的
能力。探针与可杂交序列之间的同源性程;^逸高，可4吏用的相对温度就越 高。结果，由此可见，较高的相对温度将使反应M更加严格，而较低的 温度则使反应条件严格程度较差。此外，严格性与盐浓度成反比。"严格
条件"示例如下(l)洗涤时用低离子强度和高温度条件，例如0.015 M氯 化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1。/。十二烷1^危酸钠，50°C; (2)使用变性剂，例 如甲酰胺，例如50%(体积/体积)甲跣胺和0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠緩冲液(pH 6.5)和750 mM氯 化钠、75mM柠檬酸钠，42°C。备选地，严M件可以是50%甲酰胺， 5xSSC(0.75MNaCl， 0.075 M柠檬酸钠)，50 mM磷酸钠(pH6.8)， 0.1% 焦磷酸钠，5xDenhardt，s溶液，超声降解的鲑精DNA (50 pg/ml)， 0.1% SDS 以及10%硫酸葡IMt， 42。C;于42。C在0.2xSSC (氯化钠/柠檬酸钠)和 50%甲Sfe^， 55。C洗涤；接着用由包含EDTA的O.lxSSC组成的高严格 洗涤液于55°C洗涤。对于杂^应严格性的额外细节和解释参见Ausubel 等，Protocols in Molecular Biology (1995)。
多肽可以根据本领域已知的方法在诸多表达系统中的任何系统中重组 表达。Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley Sons, New York, 1990)。此类表达系统包括染色体、附加体和病桊时生 的系统，例如从细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵 母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、 禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病桊时生的载体，以及从它们的组合衍 生的病毒，例如从质粒和噬菌体遗传元件衍生的那些栽体，例如粘粒和嗟 菌粒.
表达系统还包^节和引M达的控制区。 一般，可以使用能够使核
酸在宿主中维持、增殖或表达以产生多肽的任何系统或载体。适宜的核苷
酸序列可以通过任何多种众所周知的和常规的技术，如描述于Sambrook 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1989)中的那些插 入到表达系统中。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入到适宜的限 制性内切核酸酶位点。
载体成分一般包括但不限于一个或多个复制起点、 一个或多个标志基 因、增强子元件、启动子、信号序列或分泌序列以及转录终止序列。
表达载体可有两个复制系统，因此允许其维持于两种生物中，例如用 于表达的哺乳动物或昆虫细胞中和用于克隆和扩增的原核宿主中。众所周 知多种细菌、酵母菌抹和病毒的此类序列。
优选地，表达栽体包含用于筛选所转化宿主细胞的标志基因。选择基 因在本领域众所周知并且随着所使用的宿主细胞而变化。表达和克隆栽体 通常包M择基因，其也称作选择标记。 一般，选择基因编码(a)赋予抵抗 抗生物和其它毒素如氨节青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的蛋白质，
(b)补足营养缺陷的蛋白质，或者(c)供应关鍵营养物的蛋白质，如D-丙氨 酸消旋酶基因。
启动子序列或者编码组成型启动子，或者编码诱导型启动子。启动子 可以是天然存在的启动子或者杂合启动子。杂合启动子组合了 一个以上启 动子的元件，其在本领域是已知的并且可用于本发明。此外，对于整合表 达栽体，表达载体包含至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，优选包含 位于表达构建体侧翼的两个同源序列。通过将适宜同源序列插入到栽体中 可将整合栽体靶向宿主细胞的特定基因座。整合载体的构建在本领域众所 周知。
适宜分泌信号可整合到目的多肽中，允许多肽分泌至内质网腔、周质 空间或细胞外环境中。这些信号可以4一相对多肽而言为内源的，或者是外 源的。信号序列可以是选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠 毒素II前导序列的原核生物信号序列。对于酵母分泌，信号序列可以是例
如酵母转化酶前导序列、a因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克 鲁维酵母酵母属(KluyveromycesJa-因子前导序列)。在哺乳动物细胞表达系 统钟，来自同一物种或相关物种的分泌多肽的哺乳动物信号序列以及病毒 分泌信号前导序列可用于指导肽、其变体或同系物的分泌。适宜的宿主细 胞包括酵母、细菌、古细菌、真菌、以及昆虫和动物细胞，包括哺乳动物 细胞，例如原代细胞，包括但不限于干细胞。适宜宿主的M性实例包括 细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、链球菌属(Streptococci)、葡萄球菌属 (Staphylococci)、链霉菌属(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis); 真菌细胞，例如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、其它酵母 细胞或曲霉属(AspergiUus);昆虫细胞，如果錄(Drosophila)S2和灰翅^M 属(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，如CHO、 COS、 HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293以及Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞.
可根据其调节所插入序列表达的能力或者以所希望的方式加工所表达 多肽的能力选择宿主细胞株。此类多肽修饰包括但不限于乙跣化、g化、 糖基化、磷酸化、脂质化和酰基化。剪切"前多肽原"形式的翻译后加工 对于正确的插入、折叠和/或功能也是重要的。
转化的宿主细胞包括但不限于用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达 载体转化的微生物如细菌；用酵母表达载体转化的酵母；和用重组昆虫病 毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞和哺乳动物表达系统。
用于肽表达的适当条件会随着表达栽体和宿主细胞的选择而变化，并 且可通过本领域技术人员经常规实验容易地确定。例如，在表达栽体中使 用组成型启动子会要求对宿主细胞的生长和繁殖进行优化，而使用可诱导 启动子则需要用于诱导的适当生长糾.此外，在一些实施方案中，重要 的是收获时机。与昆虫细胞一同使用的杆状病毒系统是裂解病毒，因此收 获时机的选择对产物产量而言是至关重要的。
目的GPA071肽片段不但可以通过重组方法直接产生，而且还可以作 为与异源多肽的融合多肽产生.此类异源多肽一般置于GPA071肽或其片 段的^^末端或^末端，并且提供了用于抗标签抗体选择性结合的表位
标签。因此，此标签使得能够通过使用抗标签抗体或者其它类型的结合表
位标签的亲和基质容易地纯化肽或其片段。表位标签的实例是6xHis或 c-myc标签。备选地，GPA071肽或其片段可以以例如GST融合蛋白的形 式表达。适当的构建体一般为本领域已知并且可从商业供应商如 Invitrogen (San Diego， Calif.，美国)、Stratagene (La Jolla， Calif.，美国)、 Gibco BRL (Rockville, Md.，美国)或Clontech (Palo Alto， Calif.,美国) 获得。
差厉4迷付一估
可通过本领域技术人员已知的标准技术直接评估样品中的基因表达，
印迹(检测DNA) 、 Northern印迹(确定mRNA的转录)、斑点印迹(DNA 或RNA)或原位杂交。备选地，在分析中可以使用抗体来检测核酸，例如 特异双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或 DNA-蛋白质双链体。此类抗体可以是标记的，并且在双链体结合至一个表 面的情况下进行分析，因此当在表面上形成双链体时，可以检测结合至双 ^:体的抗体的存在。M地，基因表达可通过细胞或组织切片的免疫组织
的表达。用于此类免疫分析法的抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体， 并且可以针对天然磷脂酶A2序列或者基于本文所提供DNA序列的 GPA071片段制备。
摩或这蛋^^时趟必
所表达GPA71或GPA71片段可以在表达后使用本领域技术人员已知 的多种方法中的任何方法纯化或分离。合适的技术会取决于GPA71或 GPA71片段的表达方式而改变。多肽可以例如以分泌蛋白质的形式从培养 基回收或者从宿主细胞裂解液回收.可通过多种物理或化学手段破坏细胞， 例如冻融循环、超声、；Wfe破坏或使用细胞裂解剂，而膜结合的多肽可以
使用适宜去污剂溶液(例如Triton-X 100)或酶解从膜中释放。用于多肽纯化 或分离的适宜技术也会取决于样品中存在什么样的其它成分而变化。所需 要的纯化程度也取决于GPA71或其片段的使用而变化。通过分离或纯化 去除的污染物成分是一般干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，包括酶、激 素及其它溶质。所选择的纯化步骤会取决于例如所使用的产生过程的性质 和所产生的特定片段。
通常，分离的GPA071或其片殺:会通过至少一个纯化步骤制备。用于 纯化的众所周知的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子 交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、高效液相色谱、羟磷灰 石色语和凝集素层析。最优选地，采用亲和层析用于纯化。还可使用超滤 和透析以;5U目关联的蛋白质浓缩。参阅例如，Scopes R， Protein Purification (Springer-Verlag， New York, N.Y., 1982)。在分离或纯化过程中多肽变 性的情况下，可使用用于蛋白质重折叠的众所周知的技术再生活性构象。
摩衷这,农付标记
可以标记本发明的核酸、蛋白质和抗体。本文所说的"标记的"意思 是指化合物至少具有连接的一个元件、同位素或化合物使得能够检测化合 物。通常，标记为一下三类a)同位素标记，其可以是放射性的或者重金 属同位素；b)免疫标记，其可以是抗体或者抗原；以及c)生色或荧光染料。
位置中。
^发的^夢,兰
多肽或其片段不但通过重组方法产生，而且还可使用本领域众所周知 的化学方法产生。固相肽合成可以在分批或连续流动加工过程中开展，其 中在该过程中通过连接基团向不溶性多肽支持物相继加入a-M和侧链保 护的氨基酸n。连接基团如甲胺衍生化聚乙二醇连接至聚(苯乙烯-共-二乙烯苯)形成支持物树脂。氨基酸残基是被酸敏感Boc(叔丁氧^S0或碱
敏感Fmoc(9-药甲氧aiO进行N 保护的。被保护氣基酸的氣基与连接基 团的胺偶联，将残1^锚定在固相支持物树脂上。三氟乙酸或腺吱分别用于 去除Boc或Fmoc保护基。使用偶联剂或预先活化的M酸衍生物，将每 一个额外JtJ^酸加入到锚定残基上，洗涤树脂。通过连续的脱保护、衍生 化氨基酸的偶联以及用二氯曱烷和/或N，N-二甲基曱酰胺洗涤合成全长肽。 在肽羧基端和连接基之间将肽水解下来，得到肽酸或酰胺。Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook (San Diego ， Calif.)第 S1-S20页。还可在机器如ABI431A肽合成仪(Applied Biosystems)上自动
合成。多肽或其片段可以是通过制备型高效、;M目色谱纯化的，并且其组成
成分是通过^^酸分析或测序证实的(Creighton T.E. Proteins, Structures and Molecular Properties (W H Freeman) ，New York N.Y.， 1984)。
在多种环境中天然多肽的变体是期望的。例如，某些变体可能会降低 不良副作用，特别是当与副作用活性相关的部分与多肽的目的活性部分不 同时。在一些表达系统中，天然多肽易受蛋白酶的降解。在此情况下，所 选择的改变易感序列的氨基酸的替代和/或缺失可明显增加产量。通过消除 对氧化、酰基化、烷基化或其它化学修饰敏感的氛基酸，变体还可以提高 纯化过程的产量和/或提高蛋白质的货架期。优选地，此类变体包括(i)构象
中性的改变，即将它们诏:计成与天然多^M目比变体多肽的三级结构变化最 小，以及(ii)抗原性中性的改变，即将它们设计成与天然多W目比变体多肽 的抗原决定簇变化最小。
本Jt坊麟,途
可根据本发明将上述多肽用于制造治疗细胞过度增殖相关疾病或病 症、特别是癌症、更加特别是结肠直肠癌的药物。
本发明的另一方面提供了用于治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的方 法，所述方法包括向患有疾病或病症的包括人在内的哺乳动物施用有效量
的多肽，其中多肽选自a) GPA71 (SEQ. ID NO:l或SEQ ID NO:2)或 GPA71片段；b)与(a)中任意一个多肽的^J^^列具有至少50%同一性
的生物活性多肽；或者c)(a)或(b)的任意一个多肽的生物活性变体。因此， 可以施用如上所述的多肽。多肽优选包含GPA71或其片段。
用于治疗目的的"哺乳动物"指作为哺乳动物(包括人、家养动物和农 场动物)以及动物园动物、体育动物或宠物动物(例如狗、马、猫、绵羊、 猪、牛等)分类的任何动物。优选地，哺乳动物是人。
术语"治疗"指治疗性治疗和预防性或防御性措施。需要治疗者是已 经患有疾病或者预防其发生疾病的那些。
"疾病"或"病症"是将从上面所定义以及下面进一步定义的GPA71 或GPA71片段受益的任何状况。这包括慢性和急性疾病和病症，以及倾 向于所述疾病或病症的那些病理状况。
病，特别是癌症，并且更加特别地是结肠直肠癌。过度增殖疾病的实例包 括但不限于位于下列部位的肿瘤结肠、腹、骨、乳房、消化系统、肝脏、 胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、 甲状腺)、眼、头颈部、神经(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组 织、脾、胸和泌尿生殖器。其它过度增殖性疾病、紊乱和/或病症包括但不 限于高丙种球蛋白血症；淋巴增生性疾病、紊乱和/或病症；副球蛋白血 症；紫癜；结节病；塞泽里综合症；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；戈谢病； 组织细胞增多病.其它过度增殖性疾病是医学领域技术人员已知的。
在本发明的另一方面，GPA71或GPA71片段作为适宜治疗细胞过度 增殖相关疾病或病症的治疗剂提供，所述治疗包括向患有该疾病的包括人 在内的哺乳动物施用有效量的GPA71或其片段。
药物组合物可用于前述治疗方法中。此类组合物优选是无菌的并M 适宜向患者施用的单位重量或体积内包含用于诱导目的反应的有效量的 GPA71或其片段或者编码多肽或其片段的核酸.
GPA71或其片段、化合物或药物组合物的"有效量"是足以产生有利 结果或目的结果，包括如细胞增殖性疾病的临床结果的量。此量也将取决 于健康从业者已知的待治疗特定病症、病症的严重性、各个患者>#*包括
年龄、身体状况、个体大小和体重、治疗持续时间、同时治疗(如果有的话) 的种类、特定施用途径等因素。这些因素是医学领域普通技术人员众所周 知的，并且仅通过常规实验即可找到。
有效量可一次施用或者多次施用，并且可以与或不与另一药物、化合 物或药物组合物联合施用达到。因此，在施用一种或多种治疗剂的情况下 可以考虑"有效量"，并且如果单一药剂与一种或多种其它药剂联合实现 了目的结果，则认为所给出的单一药剂的量是有效量。
有效量的包含单独的本发明多肽或者包含本发明多肽以及其它药物、
化合物或药物组合物的GPA71或GPA71片段或者药物组合物可通过任何 常规途径施用，包括注射或者随时间逐渐灌注。施用可以是例如口服、静 脉内、皿内、肌内、腔内、皮下、局部或经皮施用。
当施用时，本发明的药物组合物以可药用制刑的形式施用。如本文所 使用的术语"可药用栽体"意思是指适宜向包括人在内的哺乳动物施用的 一种或多种兼容的固体或液体填充物、稀释剂或包封物质。术语"栽体" 表示活性成分与之结合以利于使用的天然或合成的有机或无机成分。
术语"可药用"意思是指不干扰活性成分的生物学活性效力的无毒物 质。此制剂可常规包含可药用浓度的盐、緩冲剂、防腐剂、兼容的载体、 辅助免疫增强剂如佐剂和细胞因子以及任选的其它治疗剂。
在医药中使用的盐应该是可药用盐，但是非药用盐可常规用于制备可 药用盐，因此并不排除在本发明范围之外。
药物组合物可以包含适宜的緩冲剂，包括盐中的醋酸、盐中的柠檬酸、 盐中的硼酸以及盐中的磷酸.
药物组合物还可任选包含适宜的防腐剂，例如勤L氯铵、氯丁醇、对 羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
向受试者施用的多肽或编码多肽的核酸的剂量可以仿i&不同的参数选 择，特别是依据所施用的方式和受试者的状态选择。其它因素包括目的治 疗阶段。在所应用的最初剂量不足以使受试者产生反应的情况下，可应用 患者耐受所允许的较高的剂量(或者是通过更加局部化的不同递送途径施
用的有效的较高剂量)。
药物组合物常规为单位剂量形式，并且可以通过药剂学领域众所周知 的4壬意方法制备。所有方法均包括将活性剂与构成一种或多种辅助成分的 栽体混合的步骤。通常，将活性化合物与液体栽体、细碎固体栽体或者两 者均一且均匀地混合然后(如果需要)将产品成型来制备组合物。
适宜口月Mfe用的组合物可以是不连续的单位形式，例如胶嚢剂、片剂、 锭剂，其中每一种包含预定量的活性化合物。其它组合物包括水液体或非 水液体混悬剂，例如糖浆剂、酏剂或乳剂。
适宜肠胃外施用的组合物包括多肽或编码多肽的核酸的无菌水制剂或 无菌非水制剂，其优选地与接受者的血液是等渗的。该制剂可以根据众所 周知的方法使用适宜分軟剂或润湿剂以及混悬剂配制。无菌注射制剂还可
以是无毒的肠胃外用稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，如1，3-丁 二醇溶液。可以采用的可用媒介物和溶剂是水、Ringer，s溶液和氯化钠溶 液。此外，无菌的非挥发油常规用作溶剂或悬浮介质。对于该目的，可采 用任何刺激性小的不挥发油，包括合成的单或双甘油酯。此外，脂肪酸如 油酸可用于制备注射剂。
适宜口服、皮下、静脉内、肌内等施用的栽体制剂可在Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. ， Easton, PA.)中找到。
本发明的另一方面提供了细胞过度增殖相关疾病或病症的预后或诊断 方法，包括检测来自幹*断受试者的生物学样品中的GPA71或其片段水 平，其中水平改变预示者存在细胞过度增殖相关疾病或病症，本发明的一 个实施方面提供了对受试者中细胞过度增殖相关疾病或病症的预后或诊断 方法，包括步骤(i)检测来自受试者的生物学样品中的GPA71或其片段的 水平，得到第一个数值；和(ii)将第一个数值与来自无疾病或无病症受试 者的GPA71或其片段的水平相比较，其中与来自无疾病受试者样品中的 GPA71或其片段的水平相比，来自受试者的生物学样品中GPA71或其片 段水平的改变预示者受试者易患或者患有细胞过度增殖相关疾病或病症，
此类生物学样品包括血液、血浆或组织样品.适宜的组织样品包括全
血、精液、唾液、眼泪、尿、排泄物、汗、口腔涂片、皮肤、特定器官组 织如肌肉、脑或神经组织的活组织检查以及毛发。最优选地，适宜的生物 学样品包括血液或血浆。组织样品还包括从此生物学样品中分离的细胞和
多种类型细胞。根据本发明优选的实施方案，GPA71或其片段水平的改变 包括与未患有细胞过度增殖相关疾病或病症的个体血浆中本发明GPA71 或GPA71片段水平相比，GPA71或其片段的血浆水平提高.提高优选至 少1.2倍、更优选至少1.5倍、2倍、3倍、5倍或10倍。
根据进一步的方面，本发明提供了细胞过度增殖相关疾病或病症的预 后或诊断方法，包括i)检测自受试者得到的适宜组织样品中至少一个在图 1中所确定基因的表达水平，得到第一个数值；和ii)将第一个数值与来 自无疾病受试者的所述基因的表达水平相比较，其中与来自无疾病受试者 的样品相比，受试者样品中表达水平更高或更低预示者受试者易患或者患 有细胞过度增殖相关疾病或病症.基因表达可在mRNA或蛋白质水平检 测。适宜的组织包括但不限于肝脏、心脏、肠如十二指肠、脾、骨號。MRNA 表达水平可以通过任何适宜技木险测，例如微阵列分析、Northern印迹分 析、反转录PCR以及实时定量PCR。同样，蛋白质水平可通过任何适宜 技本险测，例如通过利用蛋白质特异性标记探针的western印迹。
在上述方面的优选实施方案中，基因选自表l所列的被上调或下调的 基因。优选地，基因选自表1所列的上调1.2倍或更高、1.3倍或更高或者 1.5、 1.7、 1.8、 1.9倍或更高的基因；或者选自表1所列的下调0.8倍或更 低、0.7倍或itf氐或0.6倍或更低的基因。在上述方面的另一个优选实施方 案中，测量了至少1、 2、 3、 4、 5、 10、 20、 30个基因的表达。在本发明 的另一个实施方案中，测量了选自表l的至少40、 50或60个基因的表达。 在本发明的另一实施方案中，确定了选自表l的大多数基因的表达，例如 确定了至少65、 70、 80、 90、 IOO或至少110个或者表1所列4^P基因的 表达，
本发明的另一方面提供了鉴定细胞过度增殖相关疾病或病症的调节物 的方法，包括步骤i)将测试化合物与GPA71或其片段在允许发挥GPA71
或GPA71片段的至少一种生物学活性的样品条件下接触；ii)测定GPA71 /GPA71片段的所述至少一种生物学活性水平；iii)将所述水平与缺乏所述 测试化合物的对照样品的水平相比较。在优选实施方案中，选择导致所述 水平变化的所述测试化合物，进一步测试其能否作为预防性和/或治疗性治 疗细胞过度增殖相关疾病或病症的GPA71或GPA71片段调节物。在优选 的实施方案中，通过检测一个或多个或者多数个基因，如表l所列的至少 61、 70或100个基因的表达水平，测量GPA71或GPA71片段的生物学活 性水平。
细胞过度增殖相关疾病或病症的调节物的实例包括但不限于反义核苷 酸、核酶、双链RNA和拮抗剂。
至少一个编码本发明多肽的核酸的"双链RNA"，即正义-反义RNA 可用于干扰至少一个所公开基因的表达。已经在多种生物中表现出通过双 链RNA千扰内源基因的功能和表达，例如秀丽隐杆线虫(C. elegans)，如 Fire等，Nature 391: 806-811 (1998)中所述；果蝇，如Kennerdell等，Cell 95(7): 1017-1026 (1998)中所述；以及小鼠胚胎，如Wianni等，Nat. Cell Biol. 2(2): 70-75 (2000)所述。此双链RNA可以如下合成以两个方向从^t板上 体外转录成单链RNA，将有义链和反义链RNA体外退火，双链RNA还 可从cDNA栽体构建体合成，其中以相反的方向将目的基因克隆入构建体 中，通过倒转重复隔开。在转染细胞之后，RNA被转录并且互#^重新退 火。
术语"拮抗剂"指当结合本发明多肽或其片段时降低或抑制所述多肽 的至少一种生物学活性的分子。拮抗剂可以包括但不限于肽、蛋白质、糖 类和小分子。
在特别有用的实施方案中，拮抗剂是磷脂酶A2特异性抗体。抗体还 可缀合试剂，如化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、 百曰咳毒素等，并且还可作为靶向剂起作用。
在另一实施方案中，拮抗剂用作治疗细胞过度增殖相关疾病或病症， 如癌症，更加特别地是结肠直肠癌的治疗剂。
术语"分离的"核酸分子意思是指核酸分子离开其最初环境(例如，天 然环境(如果其是天然存在的话))。例如，不分离天然存在的核酸分子，而 是分离与天然系统中的 一些或全部共存物质分开的同 一核酸分子，即便是 随后再将其引入天然系统中也是如此。此类核酸分子可以是栽体的部分或
者组合物的部分，并且仍然是分离的，因为此载体或组合物不是其天然环 境的部分。
关于用核酶或双链RNA分子进行治疗，方法包括施用治疗有效量的 编码核酶或双链RNA分子的核苷酸序列，其中编码核酶/双链RNA分子 的核苷酸序列具有降低GPA71或其片段转录/翻译的能力。
包含反义核苷酸、编码核酶的核普酸序列、双链RNA的分离的核酸 分子或者拮抗剂的"治疗有效量"是这些治疗剂足以治疗细胞过度增殖相 关疾病或病症的量。
对治疗有效量的确定是本领域技术人员力所能及的，对于任何治疗剂， 可以在细胞培养分析中或者动物模型中，通常为小鼠、兔、狗或猪中初步 评估.动物模型还可用于确定合适的浓度范围以及施用途径，然后，此类 信息可用于确定向人施用时的剂量和途径。
对于治疗应用，反义核普酸、编码核酶的核苷酸序列、双链RNA(不 管是包在脂质体中还是位于病毒栽体上)以及抗体优选作为包含治疗剂和 一种或多种可药用栽体的药物组合物施用。组合物可单独施用，或者与至 少一种其它试剂如稳定化合物一起施用，其可以在任何无菌的生物相容性 药物栽体中施用，所述栽体包括但不限于盐、緩冲盐、葡萄糖和水。组合 物可以单独向受试者施用，或者与其它试剂、药物或激素组合向受试者施 用，
本文引用的所有参考文献在此全文引用作为参考并适用于任何目的， 这与每一单独出版物、专利或专利申请被明确且单独指出全文引用作为参 考并适用于任何目的相同。
本申请不限于本申请所述的特定实施方案，这些实施方案旨在单个说 明本发明的各个方面。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发
明做出许多修改和改变，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。根据 前述描述，除了本文所列举的那些之外，本发明范围内的功能等效方法和 装置对于本领域技术人员而言是显而易见的。此类修改和改变处于后附权 利要求书范围内。本发明仅通过后附权利要求书以及此权利要求的全部等 效范围来限制。
权利要求
1.GPA071多肽用于制造治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的药物的用途，其中多肽包含具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2的序列的肽或其生物活性片段。
2. 权利要求l所述多肽的用途，其中细胞过度增殖相关疾病或病症是 癌症。
3. 权利要求2所述多肽的用途，其中细胞过度增殖相关疾病或病症是 结肠直肠癌。
4. 治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的方法，包括向患有细胞过度增 殖相关疾病或病症的哺乳动物施用有效量的多肽，所述多肽包含具有选自 SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2的序列的肽或其生物活性片段。
5. 权利要求4所述的方法，其中细胞过度增殖相关疾病或病症是癌症。
6. 权利要求4所述的方法，其中细胞过度增殖相关疾病或病症是结肠 直肠癌。
7. 权利要求4所述的方法，其中静脉内、肌内、皮下、口服或局部 施用有效量的多肽。
8. 对受试者中细胞过度增殖相关疾病或病症的预后或诊断方法，包括 步骤(i) 检测来自受试者的生物学样品中的GPA71或其片段的水平， 得到第一个数值；和(ii) 将第一个lt值与来自无疾病或无病症受试者的GPA71或其片 段的水平相比较，其中与来自无疾病受试者样品中的GPA71 或其片段的水平相比，来自受试者的生物学样品中GPA71或 其片段水平的改变预示者受试者易患或者患有细胞过度增殖相 关疾病或病症。
9. 权利要求8所述的方法，其中生物学样品是血浆.
10. 权利要求8所述的方法，其中检测表1所确定的一个或多个基因 的表达水平。
11. 权利要求8所述的方法，其中检测表1所确定的大多ltt因的表 达水平。
12. 鉴定细胞过度增殖相关疾病或病症的调节物的方法，包括步骤(i) 将测试化合物与GPA71或其片段在允许发挥GPA71或 GPA71片段的至少一种生物学活性的样品条件下接触；(ii) 测定GPA71或GPA71片段的所述至少一种生物学活性水 平；(iii) 将所述水平与缺乏所述测试化合物的对照样品的水平相比较； 和(iv) 选择导致所述水平变化的测试化合物，进一步测试其能否作为预防性和/或治疗性治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的GPA71调节物。
13. 权利要求12所述的方法，其中通过确定表l所列一个或多个基 因的表达水平测量GPA71或GPA71片段的生物学活性水平。
14. 权利要求12所述的方法，其中检测表1所确定的大多lt^因的 表达水平。
全文摘要
已经在人血浆中检测到并且合成了磷脂酶A2的肽。将肽注射入小鼠，并且开展了许多器官的基因表达谱分析。磷脂酶A2对肝脏中基因表达的调节具有显著作用。所影响的基因是整联蛋白信号途径、wnt途径以及PTEN途径的成员。基因表达的改变通常预示着，磷脂酶A2对细胞的增殖和侵袭具有积极作用，经基因注释指向了结肠直肠癌。
文档编号A61P35/00GK101102790SQ200680002407
公开日2008年1月9日 申请日期2006年1月12日 优先权日2005年1月14日
发明者A·舍尔, R·帕波颜 申请人:诺瓦提斯公司