专利名称：：复合抗原制剂及其使用方法复合抗原制剂及其使用方法引言本申请是2004年1月14日提交、序列号为10/757,692的美国专利申请的部分继续申请，该申请要求2003年1月16日提交的、序列号为60/441,374的美国临时申请的优先权，各以其全部内容合并在本文中作为参考。本发明是在过敏与传染病国立研究院(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDisease)资助的研究(NIAID基金编号AI-46457和AI-13989)过程中产生的。美国政府对本发明拥有确定的权利。
背景技术：
：在A型流感病毒体和病毒感染细胞的膜上表达有三类跨膜蛋白。血凝素和神经氨酸苷酶是分别具有510和420个氨基酸较大胞外域的糖蛋白。血凝素是作为同型三聚体进行装配的，而神经氨酸苷酶则是作为同型四聚体进行装配的，其在病毒包膜和病毒成熟的细胞位置上形成了13-14nm长、短杆状表面凸起的致密层。目前的流感病毒疫苗旨在诱导针对于这些糖蛋白，尤其是血凝素的强烈抗体反应，因为公知这类抗体对感染具有较高的保护作用。而问题在于A型流感病毒对于改变这些保护性抗体所识别的决定簇具有高度的倾向性，这就使得必须重复接种能够反映这些抗原变化的更新疫苗株。相反，第三种病毒跨膜蛋白，基质蛋白2(M2)，含有在人流感病毒株系中保守的胞外域(M2e)。已经研究过使用M2对抗A型流感病毒感染的广谱保护性免疫性(Sl印ushkin，等人，(1995)Vaccine13:1399-1402;Frace，等人，(1999)Vaccine17:2237-44;Neirynck，等人，(1999)NatureMed.5:1157-63;Okuda，等人，(2001)Vaccine19:3681-91)。M2是甲型流感病毒的一种97个氨基酸长的跨膜蛋白(Lamb，等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:4170-4174;Lamb，等人，(1985)Cell40:627-633)。该成熟蛋白形成同型四聚体(Holsinger和Lamb(1991)Virology183:32-43;Sugme禾BHay(1991)，Virology180:617-624)，其具有pH可诱导的离子通道活性(Pinto，等人，(1992)Cell69:517-528;Sugrue和Hay(1991)如上文所引)。M2四聚体在被感染细胞的质膜上高密度表达，但相对排除在病毒成熟的位置以外，因而仅以低频率得以整合到成熟病毒颗粒的包膜中(Takeda，等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:14610-14617;Zebedee禾PLamb(1988)J.Virol.62:2762-2772)。M2(M2e)的24个氨基酸长度胞外域序列在人类流行性病毒株中仍是保守的(Macken，等人，(2001)InOptionsfortheControlofInfluenza.IV.Osterhaus等人编，pi03-106.ElsevierScience，Amsterdam)。从1918年以来所分离到的大多数人类流行性病毒株都具有相同的M2e蛋白序列。除此之外，若干对小鼠的研究表明M2e-特异性抗体能够限制流感病毒的复制并且降低发病率和死亡率(Fan，等人，(2004)Vaccine22:2993-3003;Liu，等人，(2004)Immunol.Lett.93:131-136;Mozdzanowska，等人，(2003)J.Virol.77:8322-8328;Neirynck，等人，(1999)如上文所弓l;Treanor，等人，(1990)J.Virol.64:1375-1377)。此外，在雪貂，其被认为是对人类流感最具预测性的动物模型中，M2e-特异性免疫的保护活性得以证明(Fan，等人，(2004)如上文所引)，而且来自于用M2e-载体轭合物免疫恒河猴所得的血清转入小鼠时也表现出了保护活性(Fan，等人，(2004)如上文所引)。因此，除了对猪进行的研究以外，其表明了M2e-特异性免疫能够增强而不是缓解疾病(Heinen，等人，(2002)J.Gen,Virol.83:1851-1859)，动物模型的证据都表明M2e-特异性免疫能够提供显著水平的保护，其旨在对抗明显保守的病毒靶。M2e中结构变异的程度低的确部分归因于其与Ml遗传关系所产生的限制，Ml是该病毒中最保守的蛋白(Ito，等人，(1991)J.Virol.65:5491-5498)。M2是由病毒基因片段7的剪接RNA编码的，该片段还编码Ml(Lamb，等人，(1985)如上文所引)。所述剪接事件去除了编码Ml的大部分核苷酸(nt27-714)，除了26个最5'端和42个最3'端的核苷酸(Lamb，等人，(1985)如上文所引)。因此，编码基本上完整M2e的M2核苷酸l-68是双顺反子的，从1-26是相同的而从27-68则是不同的阅读框。可以预期，M2e和Ml之间的这种遗传关系在显著限制了M2e中的变异性程度。有助于在人类流感病毒株中M2e所见的改变程度低的其他因素还可以是M2e-特异性抗体的缺乏并由此压制改变。对从自然感染的急性和恢复期阶段所获得的17对人血清进行的小规模研究发现，M2-特异性抗体在来自急性阶段的血清中是缺乏的，且仅在6例恢复期的样本中得以检测到(Black，等人，(1993)J.Gen.Virol.74(Pt1):143-146)。这与核蛋白-特异性抗体滴度相反，其在17例恢复期血清的15例中得以升高，从而确证了所述供体的近期流感感染(Black，等人，(1993)如上文所引)。另一个研究发现，在对病毒特异性抗体表现出一个为阳性里另一个为阴性的两组较大的未配对血清中，并没有发现M2e-特异性抗体滴度的差异(Liu，等人，(2003)FEMSImmunol.Med.Microbiol.35:141-146)。这些数据说明，虽然人体内的感染能够导致可检测的针对于M2的抗体反应，所述反应也并非是一致产生的，而且作用小且持续短。在小鼠模型中可获得类似的观察结果，其中用具有相同M2e的病毒株进行的两次重复感染仅诱导了低滴度的M2e-特异性抗体(Mozdzanowska,等人，(2003)Vaccine21:2616-2626)。因为M2是纯化病毒中的少量组分(0.5%)(Zebedee和Lamb(1988)J.Virol.62:2762-2772)，因此同样也不能预期当前所使用的灭活流感病毒疫苗能够诱导M2e-特异性免疫。M2e-特异性单克隆抗体14C2在体外并不能预防病毒感染，但当被整合入培养基或琼脂覆盖物时却能降低病毒产量和噬菌斑尺寸(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引；Hughey，等人，(1995)Virology212:411-21)。并非所有M2e-特异性抗体都表现出这种活性(Hughey，等人，(1995)如上文所引)，并且也并非所有病毒株都对其具有易感性(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引)。在体内，被动的单克隆抗体14C2类似地降低了病毒生长(Treanor，等人，(1990)J.Virol.64:1375-7)并且还有效对抗PR8(Mozdzanowska，等人，(1999)Virology254:138-46)，其在体外对抗体介导的生长限制不易感(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引；Mozdza謂ska,等人，(1999)如上文所引)，说明在体外和体内抗体介导的病毒生长抑制是通过不同的机制发生的。还发现含有连有辅助T细胞决定簇的M2e的复合抗原制剂是诱导病毒保护的有效疫苗。M2e-MAA与霍乱毒素(CT)和具有刺激性CpG基序的合成性寡聚脱氧核苷酸(ODN)—起，在小鼠血清中诱导强烈的M2e-特异性抗体滴度并产生针对抗流感病毒攻击的显著保护。发明概述本发明是一种复合抗原制剂(MAA)，结构为<formula>seeoriginaldocumentpage7</formula>式I(SEQIDNO:l)其中，Ri为含有Cys或GlyM，S卜氨基酸残基或核酸序列；m为至少l;n为至少l;Xaa,为含有&或Gly的0-1个氨基酸残基；R2，R3和R4可独立地为B细胞决定簇，T细胞决定簇，或靶分子；而Rs为氨基酸，肽，或核酸序列。在一个实施方案中，当m大于l时，每个R2可独立为B细胞决定簇，T细胞决定簇，或耙分子；而当n大于l时，每个R3可独立为B细胞决定簇，T细胞决定簇，或靶分子。在特定实施方案中，所述B细胞决定簇是基质蛋白2的胞外域，或其片段或同源物。在另一个实施方案中，位于第一MAAN-末端上的Cys残基通过二硫键与式I的第二MAAN-末端上的第二Cys残基共价连接，产生式I的MAA二聚体。本发明还是含有MAA和药物可接受载体的组合物。在一个实施方案中，含有所述MAA和药物可接受载体的组合物还可以含有佐剂。这样的组合物可用来预防或治疗病毒感染。因此，本发明还提供了预防或治疗病毒感染的方法，其包括向具有易感对象或表现出病毒感染征兆或症状的个体施用有效量的本发明组合物，以预防或治疗病毒感染的征兆或症状。在特定的实施方案中，所述病毒感染是A型流感病毒。本发明的这些以及其他方面将在本发明的以下说明中得到更加详细的阐述。书图1显示了M2e-MAA的剂量对M2e抗体滴度的影响。使用具有指定剂量的在佐剂中含有4种M2e24B细胞决定簇和的MAA，通过i.n.免疫BALB/c小鼠。每次免疫之后3周测定M2e-特异性的血清抗体滴度。所示为得自两次独立试验的平均值。图2显示了使用(4)M2e-MAA免疫诱导的反应的特异性。在图2A中，通过i.n.，s.c.，或i.p.途径，使用在佐剂中相同剂量的(4)M2e25-MAA免疫四只小鼠的数组。通过ELISA的方法，在第一次加强免疫之后21天(b21)，第二次加强免疫之后14天(2bl4)，以及第二次加强免疫之后90天(2b90),对第一次和第二次加强免疫之后所得血清的抗体滴度特异性进行检测。通过与使用纯化抗-M2e单克隆抗体所见的结合进行比较，来定量与每一种免疫吸附剂的结合。在图2B中，通过i.n.方式用佐剂中的(4)M2e24-MAP或(4)M^15-MAP对四只小鼠的数组进行免疫，血清的特异性检测如图2B所示。发明详述现己发现，使用含有多种B细胞决定簇和T辅助细胞(Th)决定簇的复合抗原制剂(MAA)接种的动物，表现出对随后的传染性病毒攻击具有显著的抵抗力。如本说明书所定义的，复合抗原剂是含有超过一种肽或核酸部分的试剂，其能够在动物中诱导特异性的免疫反应。所述B细胞决定簇能够诱导抗体反应，并同样能够诱导T细胞反应。在本说明书中MAA所提供的益处在于可有许多抗原侧链与核心肽相连，其含有Lys-Gly重复，从而能够呈现若干结构性相连的决定簇。除此之外，当Cys残基在核心肽的N-末端上连接时，两种核心肽可以通过二硫键共价相连从而有效地将抗原性侧链的数量翻倍，并由此增强哺乳动物体内的免疫反应。此外，由于本说明书所提供的MAA可方便地通过化学方法合成，所述MAA的制备是可以被高度控制的，污染物也将最少化。因此，本发明是具有下列结构的MAA:<formula>seeoriginaldocumentpage9</formula>式I(SEQIDNO:1),其中，m为至少1且n为至少1。在一个实施方案中，m和n的加和为约10至30。在又一个实施方案中，m和n的加和为约10。在式I所述的MAA中，所述氨基酸部分Xaa,是0工「l基酸残基，其中，当Xaa'为l个氨基酸残基时，所述氨基酸是A《或Gly。在特定的实施方案中，Xaa,为Gly。在式I所述的MAA中，R,部分为0-2个氨基酸残基或核酸序列，例如具有刺激性CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)。在一个实施方案中，R,部分为0个氨基酸残基。在另一个实施方案中，R,部分为l个氨基酸残基。当&为1个氨基酸残基时，所述氨基酸残基可以是Gly或Cys。在又一个实施方案中，R,是二肽Cys-Gly。当第一MAA的N-末端氨基酸是Cys-Gly二肽时，所述Cys残基可如愿共价连接于式I所示第二MAAN-末端的第二Cys残基。在所述第一和第二半胱氨酸残基之间的二硫键连接生成了共价连接的式I的MAA二聚体。本发明预期所述二聚体的肽在Lys-Gly重复的数量(gP，m和n的数量)、Xaa!、R2、R3、R4或R5上可以是相同的或不同的。在式I所述的MAA中，连接于赖氨酸f-氨基基团上的R2、113和R4取代基可以独立地为B细胞决定簇、T细胞决定簇、或靶分子。在一个实施方案中，在式I所述的MAA中存在有至少一种B细胞决定簇和一种T细胞决定簇。在另一实施方案中，式I所述的MAA具有至少两种B细胞决定簇。在又一实施方案中，式I所述的MAA具有至少四种B细胞决定簇。有益的是，式I所述的MAA可具有来自多种来源(例如，来自不同病毒科或血清型)的多种组合和数量的B细胞决定簇、T细胞决定簇、或靶分子。为了举例说明，本发明的单体MAA可含有5种B细胞决定簇，2种T细胞决定簇和2种耙分子侧链。或者，本发明的单体MAA可以，例如，含有8种B细胞决定簇、1种T'细胞决定簇和1种靶分子侧链。所述组合没有特定限制，并且可随着所选择的B细胞决定簇、T细胞决定簇或靶分子而改变。此外，m或n长度中Lys-Gly重复的个体R基团也会发生改变。例如，如果m=3，第一个Lys-Gly重复的R2可以是B细胞决定簇，第二个Lys-Gly重复的112可以是T细胞决定簇，而第三个Lys-Gly重复的R2可以是靶分子。B细胞决定簇，正如本文所使用，可如愿引起可量度的B细胞应答，其是通过，例如测定针对天然病毒蛋白所产生的抗体。可用于式I所述MAA中的B细胞决定簇包括那些本领域中公知的以及任何其他抗原，例如多糖，多肽，或引起B细胞反应的核酸。在一个实施方案中，抗原得自于具有包膜或无包膜的病毒。在另一个实施方案中，得自病毒的抗原包括，但不限于，来自腺病毒科，沙粒病毒科(例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)，动脉炎病毒属(例如，马动脉炎病毒)，星状病毒科(人星状病毒1),双节段RNA病毒科(例如，传染性胰坏死病毒，传染性法氏囊病病毒)，布尼亚病毒科例如，加利福尼亚脑炎病毒类型)，杯状病毒科(例如，杯状病毒)，冠状病毒科(例如，人冠状病毒299E和OC43)，丁型肝炎病毒属(Deltavirus)(例如，丁型肝炎病毒)，纤丝病毒科(例如，马尔堡病毒，埃博拉病毒扎伊尔型)，黄病毒科(例如，黄热病病毒类型，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，疱疹病毒科(例如，Epstein-Bar病毒，单纯疱疹病毒属，水痘病毒属，巨细胞病毒属，玫瑰疹病毒属，淋巴滤泡病毒属，猴病毒属)，正粘病毒科(例如，流感病毒A、B和C)，乳头多瘤空泡病毒科(例如，乳头瘤病毒)，副粘病毒科(例如，副粘病毒，例如人副流感病毒l,麻疹病毒属，例如麻疹病毒，腮腺炎病毒属，例如腮腺炎病毒，肺病毒属，例如人呼吸道合胞病毒)，小RNA病毒科(例如，鼻病毒属，例如人鼻病毒1A，肝病毒，例如人甲肝病毒，人脊髓灰质炎病毒，心病毒属，例如脑炎心肌炎病毒，口疮病毒属，例如口蹄疫病毒O型，柯萨奇病毒)，痘病毒科(例如，正痘病毒属，例如类天花病毒)，呼肠孤病毒科(例如，轮状病毒，例如轮状病毒类型A-F)，逆转录病毒科(灵长类慢病毒属类型，例如人免疫缺陷病毒1和2)，弹状病毒科(例如，狂犬病病毒)以及披膜病毒科(例如，风疹病毒属，例如风疹病毒)等科的抗原。可用于式I所述MAA的示例性B细胞决定簇包括，但不限于，M2的胞外域，或其片段或同源物。在一个实施方案中，式I所述MAA的B细胞决定簇是得自在此用SEQIDNO:ll表述的A型流感病毒。在特定的实施方案中，式I所述MAA的B细胞决定簇是SEQIDNO:12表述的M2e片段。在又一实施方案中，式I所述MAA的B细胞决定簇是得自病毒跨膜蛋白，例如B型流感病毒的NB或C型流感病毒的CM2中的M2e的同源物。T细胞决定簇旨在包括Th和细胞毒性T细胞决定簇。T细胞反应的引发可以测定，例如，按照本文的示例或通过测定产生的细胞因子，例如INF-Y，IL-2，IL-4，IL-5或IL-IO。可用于式I所述MAA的示例性T细胞决定簇包括，但不限于，血凝素T细胞决定簇和限制于人MHCII类蛋白的T细胞决定簇，优选为广谱范围的单倍型。与抗原共价连接作为R2、R3或R4部分的靶分子通常是碳水化合物，脂类，肽或寡核苷酸，其能够将抗原递送至所希望的位点。可整合入本发明MAA中的耙分子包括，但不限于，霍乱毒素，具有刺激性CpG基序的ODN(参见，例如，Shirota，等人，(2001)J.Immunol.167(1):66-74)，以及内源性人免疫调节物，例如IL-2，IL-12和GM-CSF。式I所述MAA的R5部分没有特别的限制，且其可以是任意的氨基酸(例如，^-连接的丙氨酸)，肽，或核酸序列，例如具有刺激性CpG基序的ODN。可按照本文所示例的方法或其他任何适合的化学合成肽及肽轭合物的方法制备式I所述的MAA。其中核酸序列得以整合入式I，所述核酸序列可通过间隔区或接头分子例如羟基羧基酸进行连接。本文所提供的实施例公开了在小鼠中诱导免疫反应的式I所述MAA的多种衍生物(参见表1)，并旨在举例说明而并非对本发明的范围进行限制。在其他方面，本发明范围以内的优点和修饰对于本发明所属领域的技术人员都是显而易见的。可通过鼻内(i.n.)途径以50/xL的剂量向麻醉的小鼠给药M2e-MAA。初次和加强接种都包含了3ptgMAA，3pg硫代磷酸化的(phosphorothionated)寡脱氧核苷酸(ODN)1826，其含有免疫刺激性的CpG基序，以及存在于磷酸缓冲盐水(PBS)中的0.5pg霍乱毒素(CT)，并以4-5周的间隔给药。i.n.接种只有ODN禾nCT或者传染性病毒的小鼠被分别用作阴性对照和阳性对照。在后一种情况下，第一次感染使用的是PRS，而第二次使用的则是PR8-SEQ14，其是一种变异体，与PR8的区别在于，在被保护性单克隆抗体所识别的血凝素-决定簇中有14个氨基酸取代，并且其能够在PR8-免疫的小鼠中轻易地诱导感染。在加强之后的10-30天，对来自纵隔淋巴结(MedLN)的细胞测定了其对游离S1肽，血凝素和M2e产生应答进行增殖的能力。来自脾脏和导引上呼吸道淋巴结的细胞给出了较小的反应且并未进行深入研究。M2e-MAA免疫小鼠的反应也始终超过那些釆用佐剂初次处理的对照小鼠的反应。只有2套数据在统计学基础上超过了对照小鼠的反应(配对t检验，p≥0.05)。然而，作为一个组，M2e-MAA免疫的小鼠表现出了显著大于对照小鼠的Sl-和血凝素特异性反应(非配对t检验，p≥0.05)。M2e-MAA免疫小鼠的血凝素特异性反应在程度上与感染免疫小鼠的反应类似，但在精细的特异性上有差别，其中在M2e-MAA免疫的小鼠中检测到了Sl-特异性Th，但在感染免疫的小鼠中却没有。在体内，甘露糖化的MAA并未比非甘露糖化的MAA在诱导Sl-特异性Th反应方面具有优势，这与其在体外更强烈的刺激效力明显相反。此外，M2e-MAA免疫而不是感染免疫的小鼠含有M2e-特异性的增殖性T细胞，说明M2e本身含有至少一种H2d-限制的Th决定簇。没有证据表明M2e-MAA诱导MHCI类限制的细胞毒性记忆T(Tc)反应，这与M2e中缺乏特征性的Kd-限制、Dd-限制或Ld-限制基序相一致(Engelhard(1994)Curr.Opin.Immunol.6:13-23;Corr，等人(1993)J.Exp.Med.178:1877-92)。记忆Tc在感染-免疫的小鼠中是容易检测到的。M2e-特异性血清抗体滴度是通过ELISA在(l)M2e24-MAA的固相免疫吸附剂和JAP-MDCK细胞单层上测定的。通过纯化M2e-特异性单克隆抗体14C2的伴随滴定对每一次分析进行标准化和定量，并将检测样本中的抗体滴度定义为等Mg的M2e-特异性抗体/毫升血清。将来自四次独立免疫实验的数据组合，其中小鼠在初次免疫后2周和4周、第二次之后2周和4-5周采血、第三次之后2周和5周采血，提供了来自不同免疫实验的组滴度的平均数和SEM。这些数据表明，含有4种B细胞决定簇的构建体(例如，(4)M2e24-MAA)比含有2种B细胞决定簇的构建体(例如，(2)M2e24-MAA)诱导更迅速和强烈的反应，而后者比含有1种B细胞决定簇的构建体(例如，(1)M2e24-MAA)效果更好。出乎意料地，且与体外Th细胞的增强刺激相反，甘露糖化降低了MAA在体内诱导抗体反应的能力。这可适用于对含有一种M2e24(即，(l)M2e24-MAA)的构建体和JAP-MDCK细胞的抗体滴度检测。使用含有4种M2e24B细胞决定簇的构建体进行免疫可一致地在第二次免疫两周之后诱导显著的抗体滴度，而有时则可在初次免疫4周之后马上诱导显著的反应(在4次独立实验中，第一次免疫4周之后平均滴度为1.0，2.0，4.6和1035pg/mL)。这一发现说明通过促进M2e-特异性B细胞上膜Ig的交联，M2e的多聚体提呈增强了B细胞反应(Bachmann禾卩Zinkernagel(1997)Annu.Rev.Immunol.15:235-70)。与0.1，0.6和15μg的剂量相比，与佐剂一起通过i.n.给药3μgM2e-MAA的剂量诱导了最佳的M应。所述3μg剂量能够诱导最低的初次反应，但却是显著的第二次和第三次抗体反应(图1)。第三次反应在滴度方面比第二次反应更加具有一致性，并且持续时间较长(>60周)。然而，低至0.6μg的剂量也能够诱导程度相当大的第二次抗体反应(图1)。所述数据还说明，来自M2e-MAA免疫小鼠的血清一致表现出对抗M2e-MAA的滴度高于对抗JAP-MDCK细胞的滴度。血清中M2e-MAA与JAP-MDCK反应性抗体的比值显示平均为10,并且在个体的血清中从2-31不等。这说明在M2e-MAA免疫之后抗体反应的特异性在个体小鼠中是不同的，并且平均~10%的M2e-MAA特异性抗体与感染细胞上病毒诱导的M2e交叉反应。剩余抗体可被导向Th决定簇、脚手架肽、未被病毒诱导M2-四聚体共有的合成性M2e-肽上的决定簇、或这些结构的组合。针对M2e-MAA的ELISA还说明，来自病毒感染小鼠的血清还含有极低的M2e-特异性抗体滴度。针对JAP-MDCK的ELISA检测到了对应于许多病毒蛋白的抗体，因此不能用来定量感染免疫小鼠中的^2-特异性反应。唯一的例外是一组经过三次连续感染免疫的小鼠，第一次用PR8，第二次用JAP且第三次用X31，其表现出了30μg/ml的M2e-MAA-特异性滴度，这与用(4)M2e24-MAA免疫的小鼠中所见到的病毒M2e-特异性抗体滴度处在相同的范围(与JAP-MDCK相比)。该数据说明在诱导M2e-特异性抗体反应中，(4)M2e24-MAA比病毒感染更有效。在两次连续感染免疫的小鼠中，M2e-特异性免疫效应器实际上是不存在的。考虑到M2在感染细胞的质膜上是以高密度表达的(Lamb，等人，(1985)如上文所引；Zebedee和Lamb(1988)如上文所引)，且大多数上皮细胞都在整个呼吸道感染的过程中受到感染(Yilma，等人，(1979)J.Inf.Disease139:458-64)，这种情况是预料之外的。这一发现说明可通过感染和M2e-特异性接种诱导的效应器的伴随诱导，来增强异源亚型(heterosubtypic)保护的强度。在第二次免疫之后4-5周，用X31攻击小鼠，并在3天之后测定鼻、气管和肺组织的病毒滴度。此时，因为初次接受免疫的严重联合免疫缺陷型(SCID)和具有免疫活性的小鼠的病毒滴度在攻击之后的这一时间点上并未表现出差异，所以病毒滴度几乎完全受到先天和现存的记忆防御活性的影响。与仅使用佐剂进行初次免疫的小鼠相比，使用含有单独M2e、有或没有甘露糖的MAA进行免疫的小鼠对鼻和肺组织中的病毒复制并未表现出明显的抵抗力(ns，p〉0.01学生t检验)，但却在气管中表现出病毒复制降低。相反，与仅使用佐剂免疫的小鼠相比，在使用(4)M2e24-MAA进行初次和加强的小鼠中，在总呼吸道攻击3天之后，鼻、气管和肺中的病毒滴度平均下降了10-100倍。在加强免疫之后4周进行评价时，鼻和气管中的保护强度类似于在感染-免疫小鼠中所见到的情况，但却比肺中的保护强度要弱一些。然而，因为感染-诱导的保护主要是记忆T细胞，且表现的比抗体-介导的保护持续时间短，所以M2e-MAA-诱导的保护可以比感染-诱导的保护持续更长的时间。与单独使用(4)M2e24-MAA或感染免疫的小鼠相比，(4)M2e24-MAA与传染性病毒的共给药导致了在鼻和气管而并非肺中保护的轻度增加。然而，尽管感染增加了G2a抗体的分数，但却降低了血清中总M2e-特异性抗体反应的程度；而公知血清抗体在肺的保护中具有重要的作用而在鼻和气管中作用较小。在单个小鼠中为病毒滴度的相关性测定了M2e-特异性血清抗体滴度。在(4)M2e-MAA-免疫小鼠中，抗体滴度与鼻和肺、而不是气管的病毒滴度呈逆相关(相关系数，R2，对鼻和肺分别为0.53和0.51，pO.OOl)。然而，所述相关在很大程度上是由于单个突出的含有9C^g抗-M2e抗体/ml血清的小鼠。将其排除在外使得在鼻中的抗体和病毒滴度之间的相关性降低至lj了不显著的值，但不是肺中，肺中仍保持显著性(R20.41，p=0.002)。在气管和感染免疫小鼠中未观察到M2e-特异性抗体与病毒滴度之间的相关性。使用佐剂中的(4)M2e24-MAA进行鼻内免疫可诱导三种主要特异性的抗体与天然M2e交叉反应的M2e-特异性抗体；不能与天然M2e反应的M2e-肽-特异性抗体，以及除M2e夕卜，对M2e-MAA的决定簇具有特异性的抗体。这些反应可在针对下述物质的ELISA中评价(2)M2e24-MAP，其提供了对总反应的测定；Cys-M2e24，其提供了对M2e-和骨架特异性反应的估计；病毒感染的MDCK细胞，其测定了针对天然M2e的抗体滴度；以及Cys-bb，其测定了针对MAA骨架(和分析背景)的反应。平均而言，三分之一的所述反应是针对Th决定簇和背景的，三分之二(66土17。/。)是对M2e具有特异性的，而大约五分之一(17±11%，SD;n-12)是针对天然M2e的。可使用与肺外免疫途径(图2A)以及C-末端截断的M2e-MAA(图2B)，进一步提高针对天然M2e的反应。使用(4)M2e24-MAA通过i.n.免疫诱导的M2e-特异性抗体反应的同种型组合物是由IgGl所支配的，IgGl是在M2e-特异性抗体的情况下比IgG2a的保护性要弱一些的同种型。M2e-MAA与100TCID5Q的传染性PR8(或PR8-Seql4)病毒相伴给药，导致了G2a的升高和Gl同种型的降低；然而所述反应的总程度也相伴降低。这些结果表明，使用佐剂中的M2e-MAA进行的i.n.免疫提供了显著的保护，其与两次连续总呼吸道感染所引起的异源亚型保护强度几乎一样。除此之外，还可以通过增加抗体滴度(即，三次注射代替二次注射)、提高天然M2e-特异性抗体的分数(即，C-末端截断以及肺外免疫途径)以及通过将同种型组合物偏向于G2a，来进一步增强M2e-特异性保护。给出这些结果之后，本发明还是一种将MAA用作治疗和预防剂用于治疗或预防病毒感染的方法。总之，这会涉及向具有易感性的对象或表现出病毒感染征兆或症状的个体施用有效量的适当形式的一种或多种本发明所述的MAA。本领域所属技术人员应当体会，用于式I所述MAA的B细胞决定簇的选择依赖于待预防或治疗的病毒感染。例如，为了预防或治疗流感病毒感染，应该从流感病毒(例如，M2e)中获得式I所述MAA的B细胞决定簇。在使用同源B细胞决定簇时，应该预期到式I所述的MAA可有效地产生针对包膜或未包膜的病毒的免疫反应，所述病毒包括，但不限于来自腺病毒科，沙粒病毒科(例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)，动脉炎病毒属(例如，马动脉炎病毒)，星状病毒科(人星状病毒1)，双节段RNA病毒科(例如，传染性胰坏死病毒，传染性法氏囊病病毒)，布尼亚病毒科(例如，加利福尼亚脑炎病毒类型)，杯状病毒科(例如，杯状病毒属)，冠状病毒科(例如，人冠状病毒299E和OC43)，丁型肝炎病毒科(例如，丁型肝炎病毒)，纤丝病毒科(例如，马尔堡病毒，埃博拉病毒扎伊尔型)，黄病毒科(例如，黄热病病毒类型，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，疱疹病毒科(例如，Epstein-Barr病毒，单纯疱疹病毒属，水痘病毒属，巨细胞病毒属，玫瑰疹病毒滤泡，淋巴滤泡病毒滤泡，猴病毒属)，正粘病毒科(例如，流感病毒A、B和C)，乳头多瘤空泡病毒科(例如，乳头瘤病毒)，副粘病毒科(例如，副粘病毒，例如人副流感病毒1，麻疹病毒属，例如麻疹病毒，腮腺炎病毒属，例如腮腺炎病毒，肺病毒属，例如人呼吸道合胞病毒)，小RNA病毒科(例如，鼻病毒属，例如人鼻病毒1A，肝病毒属，例如人甲肝病毒，人脊髓灰质炎病毒，心病毒属，例如脑炎心肌炎病毒，口蹄疫病毒属，例如口蹄疫病毒O型，柯萨奇病毒)，痘病毒科(例如，正痘病毒属，例如类天花病毒)，呼肠孤病毒科(例如，轮状病毒，例如轮状病毒类型A-F)，逆转录病毒科(灵长类慢病毒属类型，例如人免疫缺陷病毒1和2)，弹状病毒科(例如，狂犬病病毒)以及披膜病毒科(例如，风疹病毒属，例如风疹病毒)等科的病毒。对患有病毒感染个体的治疗涉及鉴定表现有病毒感染征兆或症状的对象，以及向所述对象给药有效量的本发明所述式I的MAA,从而与未接受治疗的对象相比，减轻与病毒感染相关的征兆或症状或縮短病毒感染的持续时间。病毒感染的征兆或症状通常取决于具体的病毒，这是有经验的临床医生所熟知的。例如，病毒感染的典型症状包括，但不限于，发烧，剧痛(severeaches)和疼痛，头疼以及咽喉痛。用于治疗病毒感染的MAA可作为混合物进行使用或给药，例如以等量，或连续单独提供，或一次全部给药，并且可以用足以有效减轻病毒感染征兆或症状的量口服、局部或肠胃外给药。此外，本发明的MAA还可与其他公知的抗原、疫苗或佐剂共同给药。同样，对于病毒感染进行预防或保护的有效免疫涉及施用一种或多种作为疫苗组分的MAA。接种可通过足以使得接受对象能够产生针对目的病毒的保护性免疫的量口服、局部或肠胃外进行，从而预防病毒感染的征兆或症状。如果所述MAA的剂量、给药途径等足以影响这样的反应，那么就说该量足以预防病毒感染的征兆或症状。可通过分析患者的生命征象或监测抗体滴度，可以测定对MAA给药的反应。适于给药的MAA组合物是能够为接受对象所耐受的组合物。这样的MAA组合物可根据生产制剂的已知方法来制备，由此所述MAA可与药物可接受的载体混合组合。药物可接受的载体可见于，例如，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,AlfonsoR.'Gennaro，editor,20版.LippingcottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA，2000。为了形成适合给药的MAA组合物，这样的组合物应该含有有效量的MAA以及适合量的载体、赋形剂或稳定剂，所述载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下，对暴露于其中的细胞或哺乳动物是没有毒性的。一般地，制剂可含有MAA的终浓度范围为0.2//g/ml-2mg/ml，或更希望的5/zg/ml-500Mg/ml。通常所述载体是水性pH缓冲溶液。药物可接受载体的示例包括缓冲液，例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰氨，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA;糖醇，例如甘露醇或山梨醇；盐形成反离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN,聚乙二醇(PEG)以及PLURONICS。MAA，或含有本发明所述MAA的组合物或制剂还可含有佐剂以增强对象针对抗原的T细胞反应。这类佐剂的示例包括，但不限于，铝盐；弗氏不完全佐剂；胞壁酰二肽的苏氨酰和正丁基衍生物；胞壁酰三肽的亲脂衍生物；单磷酰脂质A;3'-脱氧乙酰单磷酰脂质A;霍乱毒素；具有CpG基序的硫代磷酸化的寡脱氧核苷酸；以及如美国专利No.6,558,670号中所公开的佐剂。本文所公开的、对MAA或含有MAA的组合物或制剂的给药可通过任何适合的方法进行，包括肠胃外注射(例如腹膜内，皮下或肌肉注射)，口服，或将所述MAA(通常为药物制剂所承载)向气道表面进行局部施用。对注射而言，所述载体通常是液体，例如灭菌的无热原水，无热原磷酸缓冲盐水溶液，抑菌水，或Cremophor(BASF，Parsippany，N丄)。对其他给药方法而言，所述载体可以是固体或液体。向气道表面局部施用MAA可通过鼻内给药(例如，通过使用鼻内沉积药物制剂的的点滴器、棉签或吸入器)来实现。向气道表面局部施用MAA还可通过吸入给药来实现，例如通过将含有所述MAA的药物制剂的可呼吸性颗粒(包括固体颗粒和液体颗粒)构建成气溶胶悬浮剂，然后使对象吸入所述可呼吸性颗粒。药物制剂可呼吸性颗粒的给药方法和装置是公知的，并且可采用任何的常规技术。口服给药可以是溶液，悬液，片剂，丸剂，胶囊，缓释制剂或粉剂的形式，并含有10%-95%的活性成分，优选为25%-70%。对象口服给药的胶囊、片剂或丸剂可以带有肠溶性包衣，所述包衣包括，例如，甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚物，醋酸纤维素，邻苯二甲酸乙酸纤维素或羟丙基甲基纤维素。本发明的组合物可以用与剂型相匹配的方式、并以能够具有预防禾口/或治疗有效性的量给药。拟施用的量，通常范围为0.1/μg-25CμgMAA/剂，取决于待治疗的对象、该患者免疫系统合成抗体的能力、以及所希望的保护程度。优选的范围为约0.5μg至约20μg/剂。适合的剂量大小为约0.5ml。因此，用于肌肉注射的剂量，例如，应该包括0.5ml含有与0.5%佐剂混合的5μgMAA。确切的剂量应由熟练的医师根据需要治疗的对象的有关因素决定。可对剂量和给药进行调节，从而提供足够水平的活性MAA或维持预防或降低病毒征兆或症状的预期效果，或降低病毒感染的严重性。可供考虑的因素包括疾病状态的严重性，对象的一般健康情况，对象的年龄、体重和性别，膳食，给药的时间与频率，联合用药，反应敏感性，以及对治疗的耐受/反应性。所述组合物可以用单剂量计划，或期望多剂量计划给药。多剂量日程表计划是在给药的第一阶段可以釆用l-10个分别的剂量，然后在随后需要维持和/或增强免疫反应的时间段来给予其他剂量，例如，在l-4个月用第二剂量，并且如果需要的话，在若干个月后继续给药。给药方案也将，至少部分，根据个体的需要来确定并要根据医师的判断。本发明将通过下述非限制性的实施例更加详细地描述。实施例1:复合抗原剂构建体(MAA)的合成如表1所示的式I的示例性MAA构建体的固相合成是根据公知方法(Kragol和Otvos(2001)Tetrahedron57:957-66)，使用三种拟正交(quasi-orthogonally)可去除氨保护基团的组合实施的。表1<table>Complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>Man-甘露糖T细胞决定簇Sl=Ser-Phe-Glu-Arg-Phe-Glu-Ⅱe-Phe-Pro-Lys-Glu(SEQIDNO:9);T细胞决定簇S2=His-Asn-Thr-Asn-Gly-Val-Thr-Ala-Ala-Ser-Ser-His-Glu(SEQIDNO:10);B细胞决定簇M2e24=Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Pro(SEQIDNO:1l);且B细胞决定簇M2el5=Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-(Pro/His/Leu)-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly(SEQIDNO:12)。在M2el5构建体中，括号中的残基或者是脯氨酸、组氨酸，或者是亮氨酸。携带有4拷贝M2e24以及各2拷贝辅助T细胞决定簇Sl和S2的二硫键连接的八聚体肽构建体(4)M2e24-MAA，是通过溶液中游离的含巯基半胱氨酸衍生物的分子间二硫键形成而制备的(Kragol，等人，(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11:1417-20)。在测定针对于MAA骨架抗体滴度的ELISA中用作免疫吸附剂的肽构建体和M2e24构建体分别包括由Cys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-/3-Ala(SEQIDNO:13)组成的Cys-骨架构建体，以及由<formula>seeoriginaldocumentpage23</formula>(SEQIDNO:14)组成的Cys-M2e24构建体。这些构建体是使用传统的Fmoc化学技术(Fields和Noble(1990)Int.J.Pept.ProteinRes.35:161-214)，在连续流自动肽合成仪Miligen9050上装配的。所使用的是初上样量为0.3mmol/g的FmocTENTAGELSRAM树脂(AdvancedChemTech,Louisville,KY)。对链延伸而言，使用HATU对过量的4摩尔氨基酸进行原位活化。根据肽伴侣算法(PeptideCompanionAlgorkhm)(Windowchem，Fairfield,CA)预测的轭合难度，轭合时间可从1-2.5小时。在肽构建体Cys-骨架的合成过程中，Cys的N-末端氨基基团是使用Boc基团进行保护的，与此同时Lys侧链的氨基基团则具有Aloc保护。通过催化加氢，，然后通过两种M2e24肽的同时肽链装配，选择性去除Aloc基团，得到了完全保护的肽构建体Cys-M2e24。在存在有5%苯甲硫醚和5%水的情况下，通过三氟乙酸将所述肽从树脂上解离下来，并通过RP-HPLC进行纯化。通过RP-HPLC和MALDI质谱对所述肽的纯度进行确证。可通过两种方法之一制备肽-DNA嵌合体。一种方法涉及使用常规的Fmoc-化学以及适合的羟基-羧酸接头，对肽或核酸片段进行共合成(Soukchareun，等人，(1995)BioconjugateChemistry6:43-53)。第二禾中方法涉及使用含有巯基的双官能偶联的试剂进行化学连接(Soukchareun，等人，(1998)BioconjugateChemistry9:466-475;Stetsenko和Gait(2000)J.Org.Chem.65:4900-4908)。实施例2:培养基和溶液ISC-CM是由添加了0.05mM2-巯基乙醇，0.005mg/ml转铁蛋白(Sigma,St.Louis，MO)，2mM谷氨酰胺(JRHBiosciences,Lenexa，KS)以及0.05mg/ml庆大霉素(Mediatech，Herndon，VA)的Iscove'sDulbecco's培养基(LifeTechnologies,Gaithersburg'MD)组成的。按照指示，ISC-CM还补充了胎牛血清(FCS)(HyCloneLaboratories,Logan,UT)或牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，St.Louis，MO)。pH7.2的磷酸盐缓冲盐水补充了3mMNaN3(PBSN)。实施例3:病毒PR8(A/PR/8/34(HlNl))是小鼠适应株。PR8-SEQ14是选自连续存在14个不同PR8(HA)-特异性单克隆抗体中的PR8的逃离突变体。X31是含有除了那些编码H3和N2之外全部PR8衍生基因的重组病毒，其来自(A/Aichi/68(H3N2))(Kilbourne(1969)Bull.WHO41:643-5)。JAP是(A/日本/305/57(H2N2))而B/LEE是B型流感病毒株B/Lee/40。实施例4:M2e24-特异性杂交瘤的制备三种M2e24-特异性杂交瘤(M2-56，M2-80，M2-86)得自用两次连续感染攻击的BALB/c小鼠，第一次用PR8，而第二次用X31。在融合前3天，小鼠静脉(i.v.)注射5/xg(4)M2e24-MAA的PBS溶液，并将脾脏细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。两种杂交瘤(M2-1，M2-15)源自从三次连续异源亚型感染(第一次用PR8，第二次用X31，第三次用JAP)恢复、并用5pg(4)M2e24-MAA连同3pg硫代磷酸化的寡脱氧核苷酸(ODN)cl826和0.5/_ig霍乱毒素(CT)一起，对其进行鼻内(i.n.)加强的小鼠。三天后对来自导引淋巴结(颈浅淋巴结和纵隔淋巴结)的细胞进行融合。筛査杂交培养物中分泌的抗体，所述抗体能在ELISA中与(1)M2e24-MAA禾口/或JAP-感染的MadinDarby狗肾(MDCK)细胞反应。所有通过这些方案产生的M2e24-特异性杂交瘤都可以与M2e24-MAA和JAP-感染的MDCK细胞以几乎等摩尔的量进行交叉反应，说明M2e-MAA与天然的M2e共有若干B细胞决定簇。杂交瘤14C2是本领域所公知的(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引)。实施例5:使用ELISA测定抗体通过使用25/xl溶于PBSN的0.5pg/ml的构建体，在室温下过夜孵育(覆盖以防止蒸发)，用(l)M2e24-MAA对Coastarserocluster的圆底、聚乙烯板的小孔进行包被。在进行分析之前，使用含有1。/。BSA的PBSN对板封闭1至2小时。JAP-MDCKELISA板的制备如下通常通过向小孔中接种含有4x104MDCK细胞的100^1含有5%FCS的ISC-CM,MDCK细胞在FALCON⑧的微检测、平底、96孔、聚苯乙烯tc板中生长至汇合。孵育(37'C，6%C02)—天之后，使用PBS洗涤单层从而去除血清成分，并使用含有106TCID5()JAP病毒的50/ilISC-CM孵育(37。C)以进行感染。一小时后，向每个小孔中加入含有5%FCS的100plISC-CM，并如上所述继续孵育6-7小时。然后使用PBS洗涤单层，使用5%缓冲的FORMALDE-FRESH(FisherChemicaI，Pittsburgh,PA)在室温孵育5分钟进行固定，用PBSN洗涤，用含有1%BSA的PBSN在4T进行封闭和储存。在ELISA中，所有的检测样本和试剂都稀释于含有1%BSA的PBSN中，用量为25/xl/圆底小孔或50/xl/平底小孔，并在室温孵育90分钟。通常可使用生物素偶联的大鼠抗小鼠Ck单克隆抗体187.1，然后使用抗生物素蛋白链菌素-AP(Sigma，St.Louis，MO)和pNPP(Sigma，St.Louis，MO)，检测结合的小鼠抗体。在每个圆底和平底的小孔中，pNPP溶液分别使用50/d和100/xl。使用EMAX读板仪(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)测定吸附，通常在孵育30-25分钟之后，记录OD4。5和OD750之间的差异(OD405—750)。全部分析包括对特异性适合的纯化单克隆抗体进行滴定，用于对检测样本定量。ELISA数据用SOFTMAXPRC^软件(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)进行分析。在ELISA中，结构不同的M2e24-MAA在反应性上并未表现出与M2e-特异性单克隆抗体有显著的差异。所有单克隆抗体都与等摩尔量的含有(4)M2e24-MAA的MAA禾n在10位上具有脯氨酸的(4)M2el5-MAP的反应同样好，说明天然的与合成性M2e所共有的相关B细胞决定簇是通过M2e的N-末端区域形成的。实施例6:CD4+T细胞反应的分析从首次用于试验的BLAB/c小鼠脾脏制备抗原提呈细胞(APC)。向细胞悬液中加入PERCOLLtm(PHARMACIA⑧，Uppsala,瑞典)，使终浓度为33%。所述悬液的下面铺有少量的70%PERCOLLTM并进行离心(10分钟，600g，室温)以去除细胞碎片和红细胞。收集在33%/70%界面上的细胞，洗涤，辐射处理(2200rad)并以5x106细胞/ml悬浮在ISC-CM中。向平底的组织培养板的每个小孔中分配100pl。每个小孔中加入50^1体积的ISC-CM中的抗原。每个小孔中加入50/xl响应细胞悬液，通常是ISC-CM中10totheseventhpower/mlMedLN细胞或4x10tothefifthpower/mlTh克隆。在孵育的第三(Th克隆)或第四天(LN效应细胞)，加入1μCi的H、胸苷。然后将板冻融一次，用Skatron细胞收集器(SkatronInstrumentsInc.，Sterling，VA)将所述细胞收集到过滤垫(SkatronInstrumentsInc.，Sterling,VA)上。将过滤垫上打孔出来的小片转移至闪烁液中并进行放射性计数。在摩尔基础上，M2e24-MAA在刺激Sl-特异性Th细胞上表现出了与游离SI肽类似的效力，除了一个明显的意外即甘露糖化的MAP((l)M2e24-Man-MAA)在体外表现出了比游离SI肽和非甘露糖化MAA高100-1000倍的刺激效力。所述刺激效力可与纯化的完整HA具有可比性，所述HA在完整HA1多肽的成分中含有S1决定簇并还含有甘露糖化的烃侧链。实施例7:CD8+记忆T细胞反应的分析在所提供的33%/70%PERCOLLtm梯度上对得自免疫小鼠的脾脏细胞进行纯化，并将其用作效应细胞。使用PRS(106TCID5Q/106A20，37°C,1小时)感染A20细胞(H2d，MHCII类阳性)，用4400rad进行辐射，洗涤并将其用作刺激物。在FALCON⑧培养瓶中建立培养物(6ml)，并在含有5%FCS的ISC-CM中含有25x106效应细胞和106刺激细胞。在孵育(静止，向上)5天之后，在33%/70%PERC0L1JM梯度上纯化存活的细胞，计数，并使用标准方法(Mozdzanowska,等人，(1997)Virology239:217-25)检测其在4小时孵育阶段内诱导Cr51从PR8和B/LEE感染的P1.HTR耙细胞中释放的能力。实施例8:免疫方案将总体积为50jd的M2e-MAA和佐剂放置于被麻醉小鼠(分别以70mg/kg和7mg/kg体重向腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪)的鼻孔，可导致将其吸入呼吸道中。50jLd的一剂含有3jugM2e-MAA，3pgODN1826(Krieg，等人，(1995)Nature374:546-9;Yi，等人，(1998)J.Immunol.160:4755-61)和0.5pgCT(Sigma，St.Louis，MO)。佐剂组合以及给药剂量基于标准方法(Mozdzanowska，等人，(1999)，如上文所引)。加强接种以4至5周的间隔给药。接受没有M2e-MAA的佐剂溶液的小鼠用作阴性对照，而接受了两次连续呼吸道感染的小鼠，第一次使用PR8，第二次使用PR8-SEQ14，用作阳性对照。实施例9:病毒攻击实验通过用~103MIDso(50。/。小鼠感染剂量)的X31i.n.攻击小鼠来检测疫苗-诱导保护的强度。3天之后，将小鼠麻醉，心脏穿刺放血，并切片收集鼻、气管和肺组织。使用标准方法，通过滴定MDCK细胞培养物或鸡胚的组织匀浆物来测定感染病毒的滴度(McCluskie和Davis(2000)如上文所引)。实施例10:对MAA免疫反应的体外分析为了诱导对天然病毒性M2e的Th-依赖性抗体反应，M2e-MAA与天然病毒诱导的M2e共有B细胞表位并含有能够提呈至Th细胞的决定簇。在ELISA中，比较了JAP-MDCK细胞和M2e-MAA对若干M2e-特异性单克隆抗体的反应。从使用纯化病毒M2免疫的小鼠中生成了14C2单克隆抗体(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引)；所有其他抗体是从连续感染A型流感病毒中恢复并在融合前3天使用(4)M2e24-MAA加强的小鼠中分离得到的。进行(4)M2e24-MAA的最终加强是为了提高M2e-特异性杂交瘤的分离频率。全部的6种M2e-特异性单克隆抗体都可与M2e-MAA和JAP-MDCK反应良好，尽管4种在与JAP-MDCK的结合上比与1.5ng/小孔(1)M2e24-MAA包被的小孔结合上要略好一些，而另外2种则稍弱一些。这些数据说明M2e-MAA有效地模拟了天然病毒-诱导四聚体M2e的若干B细胞决定簇。当以等摩尔的M2e浓度进行使用时，结构不同的M2e-MAA并未表现出与M2e-特异性单克隆抗体的反应有明显差异。为了优化Th介导的辅助，向MAA中整合了两种不同的Th决定簇，一种(SO表示为Ed，另一种(S2)表示为Ad。这些决定簇可被鉴定为BALB/c(H-2d)小鼠的HA(PR8)-特异性Th反应的两种免疫显性耙(Gerhard，等人，(1991)J.Virol.65:364-72)。Sl相应于所述HA区域的110-120而S2相应于126-138。然而，通过用丝氨酸替换135位上的半胱氨酸以避免了S2与所述M2e肽中所含半胱氨酸之间形成二硫键，本构建体中的S2肽与天然的S2相比是有所改变的。所述MAA刺激Sl-和S2-特异性Th克隆的效力是在含有辐射BALB/c脾脏细胞作为APC、Sl-或S2-特异性Th克隆作为效应器以及各种浓度的游离Sl和S2肽、M2e-MAA或纯化HA的培养基中得以确定的。Th克隆的增殖通过在培养第三天的3H-胸苷的整合进行评价。所有的M2e-MAA都以与游离Sl肽相等或更高的效力刺激Sl特异性Th克隆V2.1。观察到所述甘露糖化的MAA具有高出100倍的刺激效力，最有可能是由于通过APC上表达的甘露糖受体改善这种MAA的捕获(Engering，等人，(1997)Eur.J.Immunol.27:2417-2;Tan，等人，(1997)Eur.J.Immunol.27:2426-35)。在摩尔基础上，这种MAA的刺激活性类似于同样含有甘露糖化烃侧链的HA分子的活性(Keil,等人，(1985)EMBOJ.4:2711-20)。相反，没有一种MAA能够刺激S2-特异性的Th克隆5.1-5R6。这种Th克隆对分离的天然S2肽和完整HA的刺激具有良好的反应，因此Cys(135)向Ser的改变就降低了其对于这种Th克隆的刺激效力。对两种其他的、克隆不相关的S2-特异性Th克隆进行了检测，也不能对MAA有反应。因为Cys(135)~>Ser并没有影响肽对于Ad的结合能力(Sette，等人，(1989)J.Immunol.142:35-40)，所以可以形成具有新抗原性的Th决定簇，其不能为天然S2决定簇的Th特异性识别。对S2/Ad复合物的晶体结构分析表明在135位上的氨基酸不是锚定残基(Scott，等人，(1998)Immunity8:319-29)。因此，体外分析表明，所述M2e-MAA模拟了天然病毒-诱导的M2e的B细胞决定簇并含有至少一个官能性Th决定簇。权利要求1.复合抗原剂，其包括id="icf0001"file="A2006800108690002C1.gif"wi="83"he="20"top="37"left="35"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式Iid="icf0002"file="A2006800108690002C2.gif"wi="147"he="15"top="67"left="21"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>个氨基酸残基；R2，R3和R4独立地为B细胞决定簇，T细胞决定簇，或靶分子；而R5为任一的氨基酸，肽或核酸序列。2.权利要求1的复合抗原剂，其中当m大于1时，每个R2可独立地为B细胞决定簇，T细胞决定簇，或靶分子；而当n大于l时，每个R3可独立地为B细胞决定簇，T细胞决定簇或靶分子。3.权利要求1的复合抗原剂，其中所述B细胞决定簇包括基质蛋白2的胞外域或其片段或同源物。4.权利要求1的复合抗原剂，其中第一和第二复合抗原剂的R1为Cys-Gly，且所述第一和第二复合抗原剂的所述Cys残基共价连接产生二聚体。5.—种组合物，包括权利要求1的复合抗原剂和药物可接受的载体。6.权利要求5的组合物，其中所述组合物还包括佐剂。7.权利要求5的组合物，其中所述组合物包括疫苗。8.权利要求6的组合物，其中所述组合物包括疫苗。9.预防或治疗病毒感染的方法，包括向对象施用有效量的权利要求5的组合物来预防或治疗病毒感染的征兆或症状。10.预防或治疗病毒感染的方法，包括向对象施用有效量的权利要求6的组合物来预防或治疗病毒感染的征兆或症状。11.预防或治疗病毒感染的方法，包括向对象施用有效量的权利要求7的组合物来预防或治疗病毒感染的征兆或症状。12.预防或治疗病毒感染的方法，包括向对象施用有效量的权利要求S的组合物来预防或治疗病毒感染的征兆或症状。13.权利要求9的方法，其中所述病毒感染包括A型流感病毒。14.权利要求10的方法，其中所述病毒感染包括A型流感病毒。15.权利要求ll的方法，其中所述病毒感染包括A型流感病毒。16.权利要求12的方法，其中所述病毒感染包括A型流感病毒。全文摘要本发明提供了复合抗原制剂组合物，及其预防或治疗病毒感染的应用。文档编号A61K39/385GK101208105SQ200680010869公开日2008年6月25日申请日期2006年3月13日优先权日2005年3月29日发明者拉斯洛·厄特沃什,沃尔特·格哈德申请人:威斯特研究所