治疗吉非替尼耐药性癌症的方法

专利名称：治疗吉非替尼耐药性癌症的方法
治疗吉非替尼耐药性癌症的方法 发明背景
上皮细胞癌，例如，前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、脾癌、睾丸癌、胸腺癌等，是以上皮细胞的异常加速生长为特;(正的疾病。此加速生长最初引起肺瘤形成。最后，也 可发生转移至不同的器官部位置。虽然在多种癌症的诊断和治疗方 面已取得进展，但是这些疾病仍然导致显著的死亡率。
肺癌是工业国家中导致癌症死亡的首要原因。开始在肺中 的癌症，依据细胞在显微镜下的表现，被分为两种主要类型，非小 细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌(鳞片细胞癌、腺癌和大细胞 癌症)扩散至其它器官一般比小细胞肺癌慢。约75。/。的肺癌病例被归 类为非小细胞肺癌(如，腺癌)，而其它25%的肺癌病例为小细胞肺癌。 非小细胞肺癌(NSCLC)为美国、日本和西欧癌症致死的主要原因。对 于晚期疾病的患者而言，化学疗法在生存率方面提供适度的帮助， 但是付出显著毒性的代价，强烈需要特异性地靶向涉及肿瘤生长的 关键基因损伤的治疗剂(Schiller JH等，N Engl J Med, 346: 92-98, 2002)。
表皮生长因子受体(EGFR)为在上皮细胞表面表达的170千 道尔顿(kDa)膜结合蛋白质。EGFR为许多蛋白质酪氨酸激酶(一组细 胞周期调节分子)的生长因子受体家族。(W.丄Gullick等，1986, Cancer Res., 46:285-292)。当EGFR的配体(或者EGF或者TGF-ot)结合至胞 外域时，使EGFR活化，导致受体的细胞内酪氨酸激酶结构域自动 磷酸化(S. Cohen等，1980, J. Biol. Chem., 255:4834-4842; A. B. Schreiber等，1983, J. Biol. Chem., 258:846-853)。
EGFR为生长促进致癌基因，erbB或ErbBl的蛋白质产物， 其为家族即原癌基因(protooncogenes)的ERBB家族的一个成员，相 信在人类许多癌症的发生和发展中起关键作用。尤其是，在乳腺癌、 膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中观察到EGFR 增强的表达。致癌基因的ERBB家族编码四种结构上相关的跨膜受 体，即EGFR、 HER-2/neu(erbB2)、 HER-3 (erbB3)和HER-4 (erbB4)。 临床上，已有报告肿瘤中的ERBB致癌基因扩增和/或受体过度表达 与疾病复发和患者预后差相关，以及与疗法的响应相关。(L. Harris 等，1999, Int. J. Biol. Markers, 14:8-15;和J, Mendelsohn和J. Baselga, 2000, Oncogene, 19:6550-6565)。
EGFR由以下三个基本结构域组成，即胞外域(ECD,其为 糖基化的(glycosylated)并且含具有两个富含半胱氨酸区域的配体-结 合袋(binding pocket);短跨膜结构域和具有内在酪氨酸激酶活性的细 胞内结构域。跨膜区域将配体-结合结构域与细胞内结构域连接。氨 基酸和DNA序列分析以及EGFR的非糖基化形式的研究表明，EGFR 蛋白质主链质量为132kDa,具有1186个氨基酸残基(A. L. Ullrich等， 1984, Nature, 307:418-425; I Downward等，1984, Nature, 307:521-527; C. R. Carlm等，1986, Mol. Cell. Biol.， 6:257-264;和F丄V. Mayes 和M. D. Waterfield, 1984, The EMBO J., 3:531-537)。
EGF或TGF-a与EGFR的结合激活信号转导通路并且导致 细胞增殖。EGFR分子的二聚、构象变化和内化(mternalization)起传 导细胞内信号的作用，引起细胞生长调节(G. Carpenter和S. Cohen, 1979， Ann. Rev. Biochem., 48:193-216)。影响生长因子受体功能调节 或导致受体和/或配体过度表达的遗传学改变，引起细胞增殖。另夕卜， 已确定EGFR在细胞分化、细胞运动性的增强、蛋白质分泌、新血 管形成、癌症细胞对化学治疗剂和放射线的入侵、转移和耐药性方 面起作用。(M,J. Oh等，2000, Clin. Cancer Res., 6:4760-4763)。
已经鉴定多种EGFR抑制剂，包括一些已经正在进行临床 试验的用于治疗各种癌症的EGFR抑制剂。至于近期的概要，参见de Bono,丄S.和Rowinsky, E. K. (2002)， "The ErbB Receptor Family: A Therapeutic Target For Cancer"， 7>￡"必i"Mo/ecw/flrMe<iic/we， 8, S 19-26。
—批在癌症治疗中用于治疗千涉的有前景的标靶，包括 HER-激酶轴的成员。它们在实体上皮肿瘤例如前列腺、肺和乳腺肿 瘤中经常向上调节，在成胶质细胞瘤中也向上调节。表皮生长因子 受体(EGFR)是HER-激酶轴的一个成员，并且已经是开发多种不同的 癌症疗法的选择目标。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)在这些 疗法当中，因为酪氨酸残基的可逆性磷酸化为EGFR通路激活所必 需。换言之，EGFR-TKIs阻滞细胞表面受体是造成引起肿瘤细胞生 长和分化的触发和/或维持细胞信号通路的原因。特别是，相信这些 抑制剂干扰EGFR激酶结构域，称为HER-I。在更有前景的EGFR-TKIs 中，有三个系列的化合物喹唑啉、吡啶并嘧啶和他咯并嘧咬。(由AstraZenecaUKLtd.开发的化合物ZD 1839;可以IRESSA的商 标名获得；以下称"IRESSA")和埃罗替尼(Erlotmib)(由Genentech, Inc. 和OSI Pharmaceuticals, Inc.开发的化合物OSI-774,可以TARCEVA 的商标名获得；以下称"TARCEVA");两者均产生令人鼓舞的临床结 果。以IRESSA和TARCEVA两者进行的常规癌症治疗包括每天分 别口服给予不超过500 mg化合物。在2003年5月，IRESSA是这些 产物中第 一个进入美国市场的药物，此时它被批准用于晚期非小细 胞肺癌患者的治疗。
IRESSA为通过直接抑制在EGFR分子上酪氨酸激酶磷酸 化发挥功效的口服活性喹唑啉。其竟争三磷酸腺苷(ATP)结合位点， 导致HER-激酶轴的抑制。IRESSA反应的确切机制尚不完全明白， 然而，研究提示，EGFR的存在是是其作用的必要的先决条件。
在使用这些化合物中显著的局限是，其接受者可在最初 对疗法的反应之后产生对它们治疗效应的耐药，或它们可不对EGFR-TKIs起任何可检测到级别的反应。对于EGFR-TKIs的反应率 在不同人种组别中各异。在低端EGFR-TKI反应者，在某些人群中， 仅百分之10-15%的晚期非小细胞肺癌患者对EGFR激酶抑制剂有反 应。因此，对IRESSA和TARCEVA潜在敏感的分子学机制的更好 的理解，将非常有益于对那些最有可能从这样疗法中获益的患者的 輩巴向疗法。
本领域明显需要对癌症，且特别是上皮细胞癌的满意治 疗，所述癌症有例如肺癌、卯巢癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌和前列 腺癌，其整合TKI疗法的利益并克服由患者表现出的无应答。这样 的治疗可对患者，且尤其是老年患者(他们中癌症特别常见)的健康产 生极大的影响。发明简述
本发明的发明人惊奇地发现，不可逆性EGFR抑制剂在 对吉非— 齐尼和/或埃罗替尼疗法不再响应的患者中有效治疗癌症。因 此，在一个实施方案中，本发明提供治疗吉非替尼和/或埃罗替尼耐 药性癌症的方法。在该实施方案中，在初始给予吉非替尼和/或埃罗 替尼治疗之后的时间点监测患者癌症的发展。癌症的发展是对吉非 替尼和/或埃罗替尼治疗耐药的癌症的指示，并且给予患者包含不可 逆性表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的药用组合物。
在优选的实施方案中，不可逆性EGFR抑制剂为EKB-569、 HKI-272或HKI-357。或者，不可逆性EGFR抑制剂可为结合 至EGFR (SEQ ID NO: l)的半胱氨酸773的任何化合物。
可采用本领域技术人员熟知的方法监测癌症的发展。例 如，可通过对癌症的目测(visual inspection)诸如，X-线、CT扫描或MRI监测其发展。或者，可通过检测肿瘤生物标记物监测癌症的发展。
在一个实施方案中，在整个癌症治疗的多个时间点监测 患者。例如，通过分析第二时间点癌症的发展并将此分析与第一时 间点的分析比较，可监测癌症的发展。第一时间点可在吉非—奈尼和/ 或埃罗替尼初始治疗之前或之后，而第二时间点在第一点之后。癌 症的增大的生长表示癌症的发展。
在一个实施方案中，通过分析癌症的大小监测癌症的发 展。在一个实施方案中，经由采用X-线、CT扫描或MRI对癌症进 行目测，分析癌症的大小。在一个实施方案中，通过检测肿瘤生物 标记物监测癌症的大小。
在一个实施方案中，癌症是上皮细胞癌。在一个实施方 案中，癌症是胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、食道 癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌症、肾癌、碎见网膜癌、皮肤 癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌症和膀胱癌。
在一个实施方案中，在其它的时间点监测癌症的大小， 并且其它的时间点是在第二时间点之后。
在一个实施方案中，较晚的时间点在之前的时间点至少2 个月之后。在一个实施方案中，较晚的时间点在前面的时间点至少6 个月之后。在一个实施方案中，较晚的时间点在前面的时间点之后 至少10个月。在一个实施方案中，l交晚的时间点在前面的时间点之 后至少一年。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，所 述方法包括给予患者包含不可逆性EGFR抑制剂的药用组合物，所 述患者在EGFR上有突变，即在SEQ ID. NO. 1的790位置(T790M) 上的苏氨酸被曱硫氨酸置换。T790M突变赋予对吉非替尼和/或埃罗 替尼治疗的耐药性。
图的简述


图1A-1B显示来自两名获得性吉非替尼耐药的NSCLC 患者的复发转移损伤中的EGFR序列分析。图1A显示病例1的序列 分析。EGFR中的T790M突变存在于发展临床吉非替尼耐药之后的 复发肝损伤。(左)在诊断时在原发性肺损伤中没有检测到突变。(右) 原发性肺肿瘤和复发肝损伤均包含(harbor) L858R吉非替尼-敏感性突 变。值得注意的是，L858R突变以期望的杂合的突变比例存在于原 发性和复发损伤两者中，然而与野生型等位基因比较，T790M在低 水平上是可检测的。在同样的描记图象(tracing)中显示多型性(G/A)证 明非克隆PCR产物中的两个等位基因的等价物再现。图1B显示病 例2的序列分析。T790M突变存在于少数吉非替尼-耐药细胞中。(左) T790M突变或者在肺原发性胂瘤中或者在来自该病例的八个复发肝 损伤中，用测序非克隆PCR产物未能检测。在邻近多型性(G/A)的杂 合性证实来自这些样本的两个EGFR等位基因的扩增。杂合的吉非 替尼-敏感性突变，L861Q,在原发性肺胂瘤以及八个复发肝损伤中 的每 一个以期望的比例被检测到。
图2A-2C显示支气管肺泡癌细胞系中获得对吉非替尼性 耐药和对不可逆性ERBB家族抑制剂的持续敏感性。图2A显示由酪 氨酸激酶抑制剂对支气管肺泡癌症细胞系增殖的抑制，该细胞系具 有野生型EGFR (NCI-H1 666)(其在EGFR (NCI-H1 650)中激活 delE746-A750突变)或NCI-H1 650 (G7和Cl l)的两个代表性的吉非替 尼-耐药亚克隆。可逆性抑制剂吉非替尼与不可逆性抑制剂HKI-357 的作用比较。用其它不可逆性抑制剂观测到可比性结果。通过在暴 露于指定的药物浓度72h后，于5%FCS中和100 ng/ml EGFR—起 培养后，经结晶紫染色，测定细胞数量。每一数据点代表四个样本 的平均值。图2B显示EGFR可逆性抑制剂吉非替尼、EGFR不可逆 性抑制剂EKB-569和两个EGFR和ERBB2不可逆性双重抑制剂 HKI-272和HKI-3"的化学结构。图2C显示在以不同浓度的吉非替 尼或不可逆性ERBB抑制剂EKB-569处理之后产生的药物-耐药性 NCI-HI 650细胞。在抑制剂存在下培养12天之后集落染色。
图3A-3D显示对吉非替尼-耐药细胞中的EGFR和ERBB2 信号转导和改变的受体转运的持续依赖。图3A显示在带有野生型 EGFR (NCI-H1 666)的支气管肺泡细胞系中、EGFR和ERBB2的 siRNA-介导的敲除后的细胞生存能力，与在EGFR (NCI-H1 650)中具 有激活的delE746-A750突变和两个吉非替尼-耐药的衍生物(G7和Cl l)的细胞的生存能力进行比较。用双链RNA处理72h之后计数存活 的细胞，显示为用非特性siRNA处理的细胞相关的分数，按一式三 份样本计算标准差。图3B显示在用递增浓度的吉非替尼或不可逆性 抑制剂HKI-357处理、P逸后用EGF进行2-h脉冲的细胞中，抑制下 游效应器AKT和MAPK (ERK)的'EGFR自动磷酸化(Y1 068)和磷酸 化。将亲代细胞系NCI-H1 650与代表性的吉非替尼-耐药系G7比较。 总的AKT和MAPK作为对照显示；对于在这些细胞中检测的较低限 的总EGFR水平，使用微管蛋白作为荷载对照。图3C显示与敏感性 NCI-H1 650亲代细胞系比较，在吉非替尼-耐药NCI-H 1650 (G7)细胞 中的改变的EGFR内化现象。在加入配体后5和20min时，使用若 丹明标记的EGF标记EGFR。在NCI画H1 650 (G7)细胞中EGFR的增 强的内化现象在20min时最明显(Zeiss显微镜，x63放大倍率)。图 3D显示自NCI-H1 650亲代细胞内化的EGFR以及经生物素化和追踪 (chase)超过20 min脉冲标记细胞表面蛋白之后的耐药衍生物G7的免 疫印迹。将NCI-H1 650 (G7)细胞中的增强的细胞内EGFR与不改变 的铁转运蛋白受体(TR)内化现象进行比较。
图4A-4B显示不可逆性ERBB抑制剂在抑制T790M EGFR 突变体中的效力。图4A显示吉非替尼和两个不可逆性抑制剂(HKI-357 和HKI-272)抑制EGFR自动磷酸化(Y1 068)和NCI-H1 975支气管肺 泡细胞系(包含致敏性突变(L858R)和与耐药相关联的突变(T790M)两 EGFR、 AKT和MAPK显示为荷载对照。图4B显示与吉非替尼比较， 用三个不可逆性ERBB家族抑制剂对包含L858R和T790M突变的 NCI-H1 975细胞增殖的抑制。
图5显示EGFR的核苷酸序列(SEQIDN0: 2)和氨基酸 序列(SEQIDNO: 1)。
图6显示如同吉非替尼，HKI 357和EKB 569 (标识为 "Wyeth")被证明对包含EGFR突变的NSCLC细胞的增强的细胞杀伤 能力，但又不同于吉非替尼，在体外不易于产生对这些药物耐药的 克隆并且它们保留其对抗吉非替尼-耐药克隆的效力。发明详述 耐吉非替尼和埃罗替尼的癌症
吉非替尼(由AstraZeneca UK Ltd.开发的化合物ZD 1839; 可以IRESSA的商标名获得)和埃罗替尼(由Genentech, Inc.和OSI Pharmaceuticals, Inc.开发的化合物OSI-774,可以TARCEVA的商标 名获得)，在非小细胞肺癌(NSCLCs)的病例中，产生令人惊奇的临床 反应，所述癌在EGF受体(EGFR) (l-3)中包含激活性突变，为这些ATP 结合的竟争性抑制剂的标靶(4, 5)。这些酪氨酸激酶抑制剂的效力既 可由与这些突变相关的ATP裂解(cleft)的改变(该突变导致这些药物 增强对突变体激酶的抑制作用)引起，又可由这些癌症细胞对于由突 变体受体转导的增强的生存信号的生物学依赖性(一种被描述为"致癌基因依赖(addiction)"的现象引起(6, 7)。
虽然对于吉非替尼和埃罗替尼两者的治疗反应可持续长 达2-3年，在大多数NSCLC病例中的反应平均持续时期仅6-8个月 (8-10)。获得性药物耐药的潜在的机制尚不很清楚。以此类推，用伊 马替尼(imatinib) (GLEEVEC)抑制涉及慢性髓细胞白血病(CMLs)的 BCR-ABL激酶、牵涉胃肠道基质瘤(GISTs)的C-KIT激酶和特发性 嗜酸粒细胞增多综合征(HES)的FIP1L1 -PDGFR-a激酶，继发性激酶 结构域突变可有效地抑制药物结合(11-16)。然而，复发性NSCLC不 易于进行活组织检查；因此，仅有限的临床标本可用于分析。最近， 报告吉非替尼或埃罗替尼疗法之后六例复发疾病的三个病例中，在 EGFR激酶结构域中出现单一继发性突变，T790M(17, 18)。类似于密码子7卯的5Ci -」B丄的密码子315，在伊马替尼-耐药CML 中经常突变(ll, 12),和C-XJr (密码子WO)和F/P/L/-PDGi^-a (密码 子674)中相应的残基突变分别与伊马替尼-耐药的GIST和HES相关 (l5, 16)。早期体外对EGFR抑制剂耐药的模型表明，野生型受体中 的密码子790突变将类似地抑制由EGFR酪氨酸激酶抑制剂的抑制 作用(19)。最近，含激活性突变的转染的EGFR蛋白与T790M取代 作用一起显示降低由吉非替尼和埃罗替尼的抑制作用(17, 18)。虽然 T790M突变似乎对在一些NSCLC病例中的获得性耐药产生作用， 但是其在缺乏继发性EGFR突变的病例中的治疗失败的潜在机制仍 然不清楚。
与细胞质激酶BCR-ABL对比，由膜结合EGFR的信号 转导涉及复杂的配体结合通路、受体与ERBB2和其它家族成员的同 源二聚现象(homodimerization)和杂源二聚现象(heterodimerization), 随后是内化现象和配体-结合受体的再循环或泛素(ubiquitin)介导的受 体降解(20)。认为在内化过程发生重要的EGF-依赖信号转导，其也 与在细胞内嚢泡中低pH下的EGFR复合体的离解相关。这样，多重 因素调节由受体进行的信号转导的强度和质量，并且EGFR运输的 改变与EGF-依赖细胞性反应的调节密切关联(20)。
本发明基于以下发现，即吉非替尼耐药性癌症可包括那 些其中T790MEGFR突变仅存在于耐药肿瘤细胞亚组和那些其中没 有观察到T790M突变，但观察到增强的EGFR内化现象的癌症。本 发明还基于以下发现，即与受体共价交联的不可逆性EGFR抑制剂 在抑制伴T790M突变的癌症中有效，以及在具有可使这样的癌症对 用吉非替尼和/或埃罗替尼治疗耐药的改变的EGFR传输的癌症中有
效。因此，本发明提供包括给予不可逆性EGFR抑制剂的治疗吉非 替尼和/或埃罗替尼耐药性癌症的方法。治疗患者的方法
在一个实施方案中，本发明提供治疗吉非替尼/埃罗替尼 耐药性癌症的方法。该方法包括给予需要此种治疗的患者有效量的 某些不可逆性EGFR抑制剂，包括EKB-569 (4-苯胺基喹啉-3-腈； Greenberger等，11th NCI- EORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy,阿姆斯特丹，2000年11月7-10日，摘要388; Wyeth)、 HKI-357 (4-苯胺基唾啉-3-腈的衍生物；Tsou等，J. Med. Chem. 2005, 48: 1107-1131; Wyeth)和/或HKI-272 (4-苯胺基壹啉-3-腈的衍生物； Rabindran等，Cancer Res. 2004, 64, 3958-3965; Wyeth)。在一个优选 的实施方案中，本发明提供包括给予需要此种治疗的患者有效量的 EKB-569的方法。在一个优选的实施方案中，本发明提供包括给予 需要此种治疗的患者有效量的HKI-357的方法。
该治疗还可包括治疗的组合，包括，但不限于酪氨酸激 酶抑制剂与其它的酪氨酸激酶抑制剂、化学疗法、放射疗法等的组 合。
采用在Lynch等，2004; 350:2129-2139描述中的方法， 可将癌症最初诊断为吉非替尼/埃罗替尼敏感性或预测为吉非替尼/埃 罗替尼敏感性。通过存在于肺瘤的EGFR突变，包括，例如，与750 (丙 氨酸)中突变结合的残基747 (赖氨酸)至749 (谷氨酸)的缺失、残基747 (赖氨酸)至750 (丙氨酸)的缺失、于残基858处的精氨酸代替亮氨酸、 于残基861处的谷酰胺代替亮氨酸，可预测吉非替尼/埃罗替尼敏感 性。
在用吉非替尼和/或埃罗替尼开始治疗后，可将癌症诊断 为吉非替尼和/或埃罗替尼耐药。或者，在用这些化合物初始治疗之 前，可将癌症诊断为吉非替尼和/或埃罗替尼耐药。肺瘤中的吉非替 尼和/或埃罗替尼耐药性可发生在吉非替尼和/或埃罗替尼治疗之后，
如，6个月或更长时间。或者，在用吉非替尼和/或埃罗替尼开始治疗不到6个月之后，可诊断肿瘤的吉非替尼和/或埃罗替尼耐药。通过在吉非替尼和/或埃罗替尼治疗期间监测肿瘤的发展，可完成吉非 替尼和/或埃罗替尼耐药的诊断。通过比较开始治疗后各时间点之间 的肿瘤状况，或通过比较开始治疗后时间点与吉非替尼和/或埃罗替 尼初始治疗之前时间点之间的胂瘤状况，可确定肿瘤的发展。在用 吉非替尼和/或埃罗替尼治疗期间，可通过目测，例如，采用放射线照相术，例如，X-线、CT扫描或技术人员已知的其它监测方法，包 括癌症的心悸或监测肿瘤生物标记物水平的方法，监测肿瘤的发展。 在用吉非替尼和/或埃罗替尼治疗期间的癌症的发展，表明对吉非替 尼和/或埃罗替尼耐药。肿瘤生物标记物水平的提高，表明肿瘤发展。 因而，在用吉非替尼和/或埃罗替尼治疗期间肿瘤生物标记物水平提 高，表明对吉非替尼和/或埃罗替尼耐药。检测到新的肿瘤或检测到 转移，表明肿瘤发展。肿瘤收缩停止，表明肿瘤发展。癌症的生长 由例如，胂瘤尺寸增大、转移或检测到新的癌症和/或肿瘤生物标记 物水平提高表示。
通过测试来自患者循环或其它体液的、在循环中的肿瘤 细胞的与吉非替尼和/或埃罗替尼耐药相关的突变存在，可监测吉非 替尼和/或埃罗替尼耐药的发生。来自患者紳瘤细胞中的与吉非替尼 和/或埃罗替尼耐药相关的突变的存在，是吉非替尼和/或埃罗替尼耐 药肺瘤的指示。
在一个实施方案中，患者的肿瘤包含指示吉非替尼和/或 埃罗替尼敏感性的突变，然而它对吉非替尼和/或埃罗替尼治疗是耐 药的。在一个实施方案中，患者的胂瘤包含指示吉非替尼和/或埃罗 替尼敏感性的突变，和包含指示吉非替尼和/或埃罗替尼耐药的突变, 如，T790M突变，即在EGFR中，甲硫氨酸(methione)残基取代天然 的苏氨酸残基，如增强的EGFR内化现象。在一个实施方案中，患 者的肿瘤不包含指示吉非替尼和/或埃罗替尼敏感性的突变和不包含 指示吉非替尼和/或埃罗替尼耐药的突变，如，EGFR中的T790M突 变，如，增强的EGFR内化现象。
当与药物的给予相连时，"有效量"指对至少统计学上 有显著意义的部分患者导致有益效应的量，所述效应为诸如症状的 改善、治愈、减轻疾病负担、缩减肺块或细胞数量、延长生命、改 善生活质量或通常由熟悉治疗特殊类型的疾病或病症的医生确认为 积极的其它效应。
所使用活性成分的有效剂量可依具体使用的化合物、给 药模式、和被治疗的病症的严重程度不同而异。技术人员注意到用 于每一个患者的有效剂量可依疾病严重程度、个体遗传变异或代谢 速率不同而变化。然而，通常，当以约0.5-约1000mg/kg体重的每 天剂量，任选一天2-4次分剂量或以緩释形式给予本发明化合物时， 得到满意的结果。计划每天总剂量约1-1000 mg,可优选约2-500 mg。适宜于内服的的剂型包括与药学上可接受的固体或液体载体紧密混 合的约0.5-1000 mg的活性化合物。可调整该给药方案以提供最佳的 治疗效应。例如，可每天给予多次分剂量或可依治疗情形的紧急情 况的指示按比例减少剂量。
给药途径可为静脉内(I.V.)、肌肉内(I.M.)、皮下(S.C)、皮 内(I.D.)、腹腔(I.P.)、鞘内(I.T.)、胸膜内、子宫内、直肠、阴道、局 部、肿瘤内等。通过注射或整个时间渐进输液和可通过蠕动方式传 输可胃肠外给予本发明化合物。
可通过透过粘膜或透皮方式给药。对于透过粘膜或透皮 给药，在配方中应用适当的渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常 为本领域所知，并且包括，例如，用于透过粘膜给药的胆汁盐类和 梭链孢酸(fusidicacid)衍生物。再有，可应用清洁剂以促进渗透。透 过粘膜给药可通过鼻喷雾剂，例如，或使用栓剂。对于口服给药， 将本发明化合物配制成常规的口服给药形式诸如胶嚢剂、片剂和滋 补剂。对于局部给药，将药用组合物(激酶活性抑制剂)配制成本 领域通常已知的软膏剂、药膏、凝胶剂或乳膏剂。
本发明的治疗用组合物，如不可逆性EGFR抑制剂，例 如，如通过单位剂量注射经常规静脉给药。当用于指本发明的治疗 用组合物时，术语"单位剂量"指适宜作为单一剂量给患者的物理 上不连续的单位，每一单位含经计算产生预想治疗效应的预定量的 活性物质以及与之组合的所需的稀释剂，即载体或媒介物。
以与剂型相协调的方式以及以有效治疗量给予组合物。 将要给予的量和次数取决于被治疗患者、利用活性成分的患者系统 的容量和想要的治疗效应的程度。需要给予的活性成分的精确量取 决于执业医师的判断并且根据每一个体而不同。
本文描述了用于实施本发明方法的治疗用组合物，如， 不可逆性EGFR抑制剂。可应用通常为本领域技术人员已知的任何 制剂或药物传递系统，其含有适合预定用途的活性成分。对于口服、 直肠、局部或胃肠外(包括吸入、皮下、腹腔、肌肉内和静脉内)给药 的适宜的药学上可接受的载体为本领域技术人员已知。所述载体必 须为药学上可接受的，其意思是与制剂中的其它成分适配并且对其 接受者没有害处。
如本文所使用的，术语"药学上可接受的"、"生理学 上可耐受的"及其文法上的变化，在它们指组合物、载体、稀释剂 和反应剂时，交替使用并且代表该物质能够是给予的，或者对于哺 乳动物不产生不想要的生理效应。
适宜胃肠外给药的制剂便利地包括活性化合物灭菌水溶 液制剂，其优选为与接受者的血液等渗。因而，这样的制剂可^f更利 地含蒸馏水、在蒸馏水或盐水中的5%右旋糖。有用的制剂还包括含 化合物的浓缩溶液或固体，其用适当的溶剂稀释得到上述适宜胃肠 外给药的溶液剂。
对于肠道给药，可以不连续的单位将化合物与惰性载体混合，例如胶嚢剂、扁嚢剂、片剂或糖锭剂，每一个含预定量的活性化合物；如粉剂或颗粒剂；或含水的或不含水的液体混悬剂或溶 液剂，如，糖浆剂、酏剂、乳剂或顿服剂(draught)。适宜载体可为淀 粉或糖粉和包括滑润剂、矫味剂、粘合剂及其它相同性质的原料。
可任选与一种或多种助剂一起，通过压制或模制，制备 片剂。通过使以自由流动形式如粉状或颗粒状存在的活性化合物， 任选与助剂如粘合剂、滑润剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂 混合，在适宜的机器中压制，可制备压制片剂。通过将粉状的活性 化合物与任何适宜载体的混合物，在适宜的机器中模制，可制备模 制片剂。
通过加入活性化合物至浓缩的糖，如蔗糖的水溶液中， 可制备糖浆剂或混悬剂，其中还可加入任何助剂。这样的助剂可包 括矫味剂、阻止糖结晶的试剂或增加任何其它成分溶解的试剂，如 多元醇，例如，丙三醇或山梨醇。
用于直肠给药的制剂可作为伴有作为栓剂基质的常规的 栽体，如可可月旨或Witepsol S55 (Dynamite Nobel Chemical, Germany的商标)的栓剂形式存在。
用于口服给药的制剂可含有增强剂。口服可接受的吸收增强剂包括表面活性剂诸如十二烷基硫酸钠、棕榈酰肉毒碱、聚乙 二醇单十二醚-9、磷脂酰胆^5成、环糊精及其衍生物；胆汁盐类诸如脱 氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸盐和夫西地酸钠；螯合剂包括 EDTA、柠檬酸和水杨酸盐；和脂肪酸(如，油酸、十二酸、酰基肉 毒碱、单和双甘油酯)。其它口服吸收的增强剂包括苯扎氯铵、千索 氯铵、CHAPS (3-(3-胆酰氨基丙基)-二曱铵基-l-丙磺酸盐)、Big-CHAPS (N,N-双(3-D-葡糖酰氨基丙基)-胆胺)、三氯叔丁醇、辛苯昔 醇-9、节醇、苯酚类、曱酚和烷基醇。用于本发明的特别优选的口服 吸收的增强剂是十二烷基硫酸钠。
或者，可以脂质体或微球(或微粒)的形式给予本化合物。 制备用于向患者给药的脂质体或孩"求的方法为本领域技术人员熟知。美国专利号4,789,734描述了脂质体中包嚢生物原料的方法，其 内容通过引用结合于本文。重要的是，将所述原料溶解于水溶液中， 加入适当的磷脂和脂质，如果需要再加上表面活性剂，并且需要时 对原料进行透析或超声处理。已知的方法的综述由G. Gregoriadis,第 14章，"Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine,第287-341 页(Academic出版社，1979)提供。
由聚合体或蛋白质形成的微球为本领域技术人员熟悉， 并且其可被定制适合于通过胃肠道直接进入血流。或者，可将该化 合物整合(incorporated),并且将^[效球或微球合成物植入，以用于在数 天至数月的时期内緩慢释放。参见，例如，美国专利号4,906,474、 4,925,673和3,625,214和Jein, TIPS 19:155-157 (1998),其内容通过引 用结合于本文。
在一个实施方案中，可将本发明的酪氨酸激酶抑制剂配 制成适合尺寸的脂质体或孩t粒，以在静脉给药后聚集在毛细血管床。 当将脂质体或微粒放入缺血组织周围的毛细血管床时，可局部给予 药物至可为最有效的位点。靶向缺血组织的适宜的脂质体一般小于 约200纳米并且也典型地为单层嚢泡脂质体(vesicle),如在例如 Baldescliweiler的题目为"Liposomal targeting of ischemic tissue"的美国 专利号5,593,688中所公开的，其内容通过引用结合于本文。
优选的孩i粒为从生物可降解的聚合体，诸如聚乙醇酸 (poiyglycolide)、聚乳酸及其共聚物制备的微粒。本领域技术人员依 据包括想要的药物释放速率和想要的剂量的各种因素可易于确定适 当的载体系统。
在一个实施方案中，经由导管(catheter)将制剂直接给药 到血管内部。可例如，通过导管的孔给药。在那些其中活性化合物 具有相对长的半衰期(大约1天至1周或更长)的实施方案中，制剂可
纳入生物可降解的聚合性水凝胶，诸如那些在Hubbell等的美国专利 号5,410,016中公开的那样。可将这些聚合性水凝胶传递至组织内腔 里并且在聚合体降解时活性化合物随时间推移而释放。如果需要， 聚合性水凝胶可具有包含分散在其中的活性化合物的孩i粒或脂质 体，除非有另 一个机制提供活性化合物的控制释放。
该制剂可便利地以单位剂型存在并且可用制药领域熟悉 的任何方法制备。所有方法均包括将活性化合物与组成一种或多种 助剂的载体混合的步骤。通常，通过将活性化合物与液体载体或细 樣么粉碎的固体载体均匀地和密切地混合，然后，如果需要，将所述 产物定型为想要的单位剂型，制备该制剂。
该制剂还可包含一个或多个应用于药物制剂领域的任选 的助剂，如，稀释剂、緩冲剂、矫味剂、粘合剂、表面活性剂、增 稠剂、滑润剂、助悬剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。道给药的形式如鼻吸剂或气雾剂或用于喷雾器的溶液剂或如用于吹 入的细微粉末存在，其单独或与惰性载体诸如乳糖混合。在这样的 情况下，活性化合物的粒子适宜具有小于50微米，优选小于10微 米，更优选为2-5微米的直径。
—般用于鼻腔给药时，弱酸pH将是优选的。优选本发明 组合物的pH为约3-5，更优选为约3.5-约3.9和最优选为3.7。通过 加入适当的酸诸如盐酸实现pH的调节。
含溶解或分散于其中的活性成分的药用组合物的制剂， 为本领域熟知的且不需限于制剂。典型地这样的组合物被制备成可 注射的或者液体溶液剂或者混悬剂，然而，也可制备适宜用于溶液 剂或者混悬剂的固体形式，其在使用之前溶于液体。也可^f吏制剂乳 化。
可将活性成分以适宜用于本文描述的治疗方法的量，与 药学上可接受的并且与活性成分适配的赋形剂混合。适宜赋形剂为，例如，水、盐水、右旋糖、丙三醇、乙醇等及其组合。再有，如果 需要，组合物可含少量的增强活性成分效力的辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH緩冲剂等。
本发明不可逆性激酶抑制剂可包括其成分的药学上可接 受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸诸如，例如，盐酸或-痺酸， 或诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸这样的有机酸等形成的酸加成盐(与多 肽的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱，例如， 氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氬氧化钙或氢氧化铁和诸如异丙 胺、三曱胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等此类有机碱。
生理学上可耐受的载体为本领域所熟悉。作为实例的液 体载体为不含除活性成分和水之外物质的灭菌水溶液，或含緩沖液 诸如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者，诸如磷酸盐-緩沖盐水 的灭菌水溶液。再有，水性载体可含一种以上的緩沖盐，以及盐例 如氯化钠和氯化钾、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质。
液体组合物还可含除水之外的以及排斥水的液相。作为 实例的这样的其它液相为丙三醇、植物油诸如棉子油和水-油乳状液。定义
术语"ErbBl"、"表皮生长因子受体"和"EGFR"可 在本文中交互使用，并且指的是如在，例如在Carpenter等.Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)中公开的天然序列EGFR,包括其变体(如 在Humphrey等.PNAS ( USA) 87:4207-4211 (1990)中的删除突变体 EGFR)。 erbBl指编码EGFR蛋白质产物的基因。如本文所使用的， EGFR蛋白已作为由erbBl基因(GenBank检索号NM—005228 (SEQ ID NO: 2))编码的GenBank检索号NP—005219 (SEQ ID NO.: l)公开。erbBl /EGFR的核苷酸和氨基酸序列可在图5中找到。
如本文所使用的术语"激酶活性增加的核酸变异"指基 因的核苷酸序列中的变异(即突变)导致激酶活性增强。增强的激酶活 性是在核酸中变异的直接结果并且与基因所编码的蛋白质相关。
如本文所使用的术语"药物"或"化合物，，，指给予患者以治疗或预防或控制疾病或病症的化学实体或生物制品，或化学 实体或生物制品的组合。化学实体或生物制品优选，但不必是低分 子量化合物，而是也可为较大的化合物，例如，核酸、氨基酸的低聚体或碳水化合物包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、 糖蛋白、siRNAs、脂蛋白、适体、其修饰体及其组合。
如本文所^吏用的，术语"有效的"和"效力"包括药理 学效应和生理学上安全两者。药理学效应指在患者中产生所需生物 学效应的治疗能力。生理学上安全指由给予治疗导致的在细胞、器 官和/或生物水平的毒性水平或其它不利的生理学上效应(通常指副作 用)。"较差效应"意指治疗导致在治疗学上显著较低水平的药理学 效应和/或在治疗学上较高水平的不利的生理学上效应。
可采用本领域熟悉的任何多种方法，从特殊的生物样本 分离核酸分子，所选择的具体分离过程与特定的生物样本相适应。 例如，应用冻融(freeze-thaw)和碱裂解法，可从固体材料得到核酸分 子；应用加热和碱裂解法，可从尿中得到核酸分子；以及可应用蛋 白酶K提取法从血液中得到核酸(Rolff, A等.PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)。
如本文所使用的，在受治疗者或患者中的"癌症"指存 在具有特征性的典型致癌细胞的细胞，诸如不受控制的增殖、不死性(immortality)、具转移潜力、快速生长和增殖率和某些特征性形态 学特征。在某些情况下，癌症细胞将以肿瘤形式存在，或这样的细 胞可局部存在于动物体内或作为独立细胞在血流中循环。 实施例
化合物。本文使用的化合物，包括如在以下文献中描述 的EKB-569、 HKI-357和HKI-272:美国专利号6，002,008; Greenberger 等，Proc. 11th NCI- EORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy ， Clinical. Cancer Res. Vol. 6 Supplement, Nov. 2000, ISSN
1078-0432; Rabindran等，Cancer Res. 64: 3958- 3965 (2004); Holbro和 Hynes, Ann. Rev. Pharm. Tox. 44:195-217 (2004);和Tejpar等，J.Clin. Oncol. ASCO Annual Meeting Proc. Vol. 22, No. 14S: 3579 (2004)。
复发NSCLC分析和吉非替尼-耐药NCI-HI 650细胞产生。征得适当同意后，将尸体解剖得到复发NSCLC临床样本。分析 非克隆PCR产物之后，对EGFR的完整激酶结构域进行测序。对外 显子20的多重克隆测序以检测密码子790。通过采用染料终止剂化 学(BIGDYE版本1.1， Applied Biosystems)的单个外显子自动测序和用 双向测序的侧翼内含子(flanking intromc)序列(PCR条件按要求可得 到)，对吉非替尼-耐药克隆中的EGFR(夕卜显子1-28)、 ERBB2(外显 子1-24)、 PTEN(夕卜显子(Qxo似)1-9)、 Kias (密码子12、 13和61)和p53 (外显子5-S)以及亲代NCI-Hl650细胞系进行突变分析。在ABB100 测序仪(Applied Biosystems)上进行测序反应和通过采用SEQUENCE NAVIGATOR和FACTURA软件(Applied Biosystems)分析电泳图。
为产生NCI-H1 650细胞的耐药亚克隆，用甲磺酸乙酯 (EMS;600jig/ml)处理这些细胞，使恢复72 h,然后接种于20 吉 非替尼中，密度为每10-cm2盘6xl04个细胞。与不可逆性抑制剂比 较，这些细胞对吉非替尼相对耐药，这可通过在不同药物浓度存在 下，将5 x 104个细胞接种于5% FCS和100 ng/ml EGF (Sigma)的六 孔盘中实现，随后在用4%曱醛固定细胞7211后，用0.1%结晶紫染 色,用Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)对细胞群定量。对于微小干预RNA(siRNA)敲除实验，用靶向 EGFR、 ERBB2 (两个SMART库(pool)来自Dharmacon, Lafayette, CO) 的双链RNA寡核苦酸转染细胞，或使用X-treme基因转染反应剂 (Roche Applied Science)进行非特异性控制(LRT旧)。72h后,细胞经 结晶紫染色，并用Odyssey红外线扫描仪分析。
免疫印迹和信号传导研究。由增加吉非替尼或不可逆性 抑制剂浓度对EGFR信号传导的抑制通过以下实验确定将9 x 104 个细胞接种于24-孔盘，将药物加入含5。/oFCS的培养基中15min, 随后用100ng/mlEGF脉冲2-h,收获溶解产物。于2x凝胶i肯栽緩 冲液中制备溶解产物，经超声波处理，煮沸，然后用10%SDS/PAGE 分离，随后通过电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜并进行免疫印迹。 所用的抗体为磷酸化-EGFR Yl 068和磷酸化促有丝分裂原活4b蛋白 激酶(MAPK) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)、石舞fl臾]匕-AKT (BioSource International, Camarillo, CA)和总EGFR、 MAPK、 AKT和 微管蛋白(Santa Cruz Biotechnology)。
EGFR内化现象分析。为了用荧光显微镜方法i正明EGFR 的内化现象，将细胞生长在盖玻片上并与lng/ml重组人(rh)EGF(分 子探针，Eugene, OR)—起培养多个时间间隔，之后固定于4%多聚曱 醛中10min。用PBS洗涤盖玻片并用ProLong Gold抗衰咸(antifade) 反应剂(分子探针)封片(mounted)。为通过细胞表面生物素化4吏EGFR 内化现象量化，将细胞生长至融合，用环己酰胺(cyclohexamide)预处 理，于冰上用磺基琥珀酰亚氨基-2-(生物素基酰氨基(biotmamido))乙 基-l,3-二硫代丙酸酯(磺基(sulfo)-NHS-SS-生物素；Pierce) 1.5 mg/ml 培养1 h,并用封闭緩冲液(50 nMNH4CL/l mMMgCl2A) ImM CaCl2 在PBS中)洗涤以猝灭游离的磺基-NHS-SS-生物素，然后再用PBS 洗涤数次。然后将细胞于37^C培养基中培养多个时间间隔以使生物 素化的分子内化，于冰上用谷胱甘肽溶液(50 mM谷胱甘月大/75 mM NaCl/75 mM NaOH/1% BSA)洗涤两次20 min,从细胞表面剥离所有 生物素基团，然后刮下细胞并将其溶解于用NaF、正钒酸凌内和蛋白 酶抑制剂补充的500卩iM放射免疫沉淀测定(RIPA)緩冲液(25 mM Tris-HCl,pH7.4,用150 mM NaCL/0.1% SDS/1% Triton X-l 00)。将 细胞提取液离心，将上清液与链霉抗生物素珠(Sigma)孵育以收集生 物素化的蛋白，然后通过SDS/PAGE和免疫印迹，用抗-EGFR抗体 (SC-03, Santa Cruz Biotechnology)或抗转4失蛋白受体抗体(Santa Cruz Biotechnology),对生物素化的蛋白进行分析。
结果和讨论
对吉非替尼获得性耐药的复发性肺癌的分析。在两个患 者中发生复发的对吉非替尼-耐药的NSCLC,其肿瘤在诊断时已经包 含EGFR激酶的激活的突变并且已经显示引人注目的对药物的最初 临床反应(l)。在两个病例中，初始治疗后l-2年，在肝中发展的转 移疾病导致患者死亡。在病例l中，尸检时得到大部肝转移的分析 表明，致敏EGFR突变(L858R)的持续以及存在新的获得性T790M 突变(图IA)。有趣的是，非克隆的PCR产物的分析显示，最初L8S8R突变以与存在于所有肿瘤细胞中的杂合突变相一致的丰度存在，而 在约五分之一丰度的相应的野生型等位基因见到继发性T7卯M突变。因而，这种与耐药相关的突变似乎仅存在于在复发肿瘤的部分 细胞中。
病例2涉及吉非替尼疗法失败后的八个在肝中明显的复 发转移。在所有这些独立的损伤中，致敏的L861QEGFR突变以期 望的杂合突变的比率存在。通过对来自任何这些转移的非克隆PCR 产物的分析，未检测到继发性EGFR突变。然而，在PCR产物亚克 隆之后，发现在四个转移肺瘤分析中的两个(T7卯M，自损伤l测序 的50个克隆中的2个和自损伤2测序的56个克隆中的1个)中，T790M突变以非常低的频率存在，但从两个其它复发转移(自损伤3测序的 55个克隆中的0个和自损伤4测序的59个克隆中的0个)或原发性 肿瘤(75个克隆中的0个)中未能发现(图W和表l)。总之，这些结果 与之前T790M突变存在于某些但不是所有的获得性吉非替尼耐药(7 个肿瘤中的3个；参见参考文献H、 18和21)病例的报告一致。此 外，如前所指出的(18),即使在某些具有这种耐药相关突变的病例中， 似乎仅存在于小部分复发损伤中的肿瘤细胞中。这些观察提示，耐 药的其它的机制涉及到没有继发性EGFR突变的病例中，并且这样 的机制与在其它病例中的T790M突变共同存在。
吉非替尼-耐药细胞依赖于EGFR和ERBB2表达。为了洞察吉非替尼耐药性的获得和对不可逆性抑制剂的持续敏感性的机 制，本申请人首先确定是否对于它们的生存能力而言，耐药细胞系 依然依赖于EGFR。本申请人之前已经表明，siRNA-介导的EGFR 的敲除在包含突变体EGFRs的细胞中触发细胞凋亡，但是不在具野 生型等位基因的细胞中触发细胞凋亡(6)。有显著意义的是，在用 siRNA耙向的EGFR转染之后，亲代NCI-H1 650细胞及其吉非替尼-耐药衍生物显示可比性地降低细胞生存力(图3A)。因而，吉非替尼-耐药的获得不包括下游效应器的不依赖EGFR的激活。因为HKI-272 和HKI-357耙向EGFR和ERBB2两者，本申请人还试验此相关受体 的抑制。NCI-H1 650及其吉非替尼-耐药衍生物中的ERBB2的敲除 还引起生存能力的丧失(图3A),提示EGFR-ERBB2杂二聚体在包含 EGFR突变的肿瘤细胞中转导基本生存信号中的作用。仅由不可逆性如被主要靶向EGFR的EKB-569的效力所证明(26)。然而，鉴于通 过使用siRNA耙向EGFR和ERBB2的潜在补充效应和靶向这些家族 成员的不可逆性抑制剂的可用性，双重抑制的潜在利益得到考虑。
经由介导其增殖和生存通路的EGFR的下游效应器，本 申请人:比较吉非替尼和不可逆性ERBB家族抑制剂对抑制信号传导 的能力。在抑制EGFR自动磷酸化(在残基Y1068检测)中，和包含 delE746-A750 EGFR突变的亲4、 NCI-H1 650细胞中的AKT和MAPK 磷酸化中，HKI-357的效力未吉非替尼的IO倍(图3B)。在吉非替尼-耐药衍生物，NCI-H1650(G7)中，吉非替尼表现出相当地降低抑制AKT 磷酸化的效应， 一种关联吉非^,尼响应的关键EGFR信号传导效应 器(6),相反，HKI-357被证明具有持续活性(图3B)。
吉非替尼-耐药克隆中的改变的EGFR内化现象。鉴于 EGFR中的继发性突变的缺乏和吉非替尼-耐药细胞对siRNA-介导的 EGFR的抑制的持续易感性，本申请人试验在吉非替尼-耐药细胞中 由可逆性和不可逆性抑制剂对EGFR信号传导的分化抑制的潜在机制是否可能与受体传输的改变相关，这种传输已被充分证明为EGFR-依赖信号传导调节器(20)。确实，与药物-敏感性亲代细胞比较，如 采用荧光素-标记的EGF内化现象(图3C)和细胞质生物素化EGFR的 定量)两者所检测的，NCI-H1 650-衍化的耐药细胞的EGFR传输的分 析证明与EGFR内化现象的增强一致(图3D。这样的效应没有在转铁 蛋白受体中观察到，提示此不是来自在所有受体过程(receptor processing)中普遍改变的结果。尽管需要进行进一 步的工作阐释EGFR 传输中此种改变的准确机制，但该复杂过程中已经牵涉到许多调节 蛋白，这些结果提示吉非替尼抑制EGFR激活的能力危及这些细胞， 而不可逆性抑制剂的作用为可不可检测地受到影响。
由不可逆性抑制剂引起的T790M EGFR信号传导的抑制 和增强的细胞杀伤力。由不可逆性ERBB抑制剂的对EGFR信号传 导增强的抑制产生这样的可能性，即这些药物也可在包含EGFR中 的T790M继发性突变的细胞的情况中表现持续活性。因此本申请人 测试这些抑制剂对包含EGFR中的L858R和T790M突变的NCI-HI 975支气管肺泡癌细胞系的效应(18)。有意义的是，该细胞系源自没 有用EGFR抑制剂治疗的患者，表明该突变不是独特地与获得性药 物抵抗相关。在抑制配体-引起的￡Gf7 自动磷酸化及其下游信号传 导中，当通过AKT和MAPK磷酸化测定时，HKI-357和HKI-272均 比吉非替尼明显地更为有效(图AA)。类似地，所有三个不可逆性抑 制剂在该细胞系中，在其对吉非替尼耐药的条件下抑制增殖(图4B)。 因而，不可逆性ERBB抑制剂似乎在包含T790M EGFR的细胞中以 及在伴有野生型受体的改变的传输的细胞中有效。
本申请人的结果确认EGFR中的TWOM突变作为继发性 突变的报告，该突变之前发生于包含激活性突变的敏感性NSCLCs 中，与获得性耐药的出现相关(17, 18)。然而，该突变仅存在于一个 亚组病例中，即使包含T790M突变的肿瘤可仅包含一小部分具有该
突变的细胞。这些观察意味着多重耐药机制可共同存在于最初对吉非替尼或类似的可逆性EGFR抑制剂有反应之后的复发肿瘤中。此 外，这些发现提示不依赖T790M的耐药机制，如果不比在赋予药物 抵抗中的T790M取代本身更有效，也可能是相同的，并可解释为什 么复发肿瘤几乎不表现对于T790M的克隆状态(clonality) (17, 18)。 获得性吉非替尼耐药的体外机制不显著频繁涉及继发性EGFR突变， 而是与改变的受体传输相关。然而，应该指出的是，本申请人没有 测试在所有本申请人体外建立的耐药克隆中的EGFR传输，并且可 能在某些克隆中存在可对吉非替尼耐药起作用的另外的机制。虽然 如此，事实上所有吉非替尼-耐药克隆表现出对不可逆性ERBB抑制 剂的可比较的敏感性。
本申请人的结果表明竟争性EGFR抑制剂诸如吉非替尼 (其效力受到体外耐药性快速发展的限制)与不可逆性抑制剂(对其的 获得性耐药似乎很少见)之间显著不同(图2C)。本申请人推测耐药细 胞中的配体-结合的EGFR的增强内化现象，可与在细胞内嚢泡的低 pH下吉非替尼-EGFR复合体的离解(dissociation)关联。与此对照' 受体的不可逆性交联将不受这样的受体传输的改变的影响。在缺乏 药物情况下细胞经过传代最多至20代后，对吉非替尼的获得性耐药 稳定持续，提示调节EGFR转换(turaover)的基因的遗传或外遗传的 改变可解释此现象。因为受体传输不容易通过采用可用的临床样本 进行研究，所以在可能的临床相关性之前进行这样的基因改变的鉴 定可能是必须的。虽然如此，这样的机制可对EGFR中不具有继发性突变的复发疾病患者体内获得性吉非替尼-耐药起作用。
不可逆性ERBB抑制剂还似乎在克服由T790M突变介导的吉非替尼耐药性中有效，所迷突变推测为不论这种重要残基的改 变与否，因维护抑制剂结合所传输的效应。当在进行此工作时，另 一种EGFR不可逆性抑制剂[CL-387,785, Calbiochem (27)]显示抑制 T790MEGFR突变体的激酶活性(17)。在T790M的条件下的CL-387,785的效力被认为是在苯胺基团3号位置上缺乏氯(chloride)的结 果，所述基团存在于吉非替尼中并且推定在空间上阻碍对在密码子 790上突变体曱硫氨酸的结合。然而，EKB-569、 HKI-272和HKI-357 均在苯胺环的该位置上具有氯部分，提示它们的共享的对EGFR不 可逆结合能力或许解释它们的效力，而不是缺乏与T790M的特异性 空间上相互作用(24-26)。因而，除了T790M突变外，可证明这些不 可逆性抑制剂在包括多种耐药机制中也是广泛有效的。表1. EGFRT790M突变在病例2的复发肿瘤中以非常低的频率存在克隆数T790M突变体 野生型肿瘤原发性 0 复发1 2 复发2 1 复发3 0 复发4 0
大量克隆的PCR产物测序揭示: 少数等位基因含T790M突变。[OO卯]本说曰j 合于本文。75 48 55 55 59四例肝损伤中的两例的
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权利要求
1.一种治疗吉非替尼和/或埃罗替尼耐药性癌症的方法，所述方法包括以下步骤a.在起先用吉非替尼和/或埃罗替尼治疗患者后的时间点上，监测患者癌症的发展，其中所述癌症的发展为对吉非替尼和/或埃罗替尼治疗耐药的癌症的指征；和b.给予对吉非替尼和/或埃罗替尼治疗耐药的癌症患者含不可逆性表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的药用组合物。
2. 权利要求l的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制剂选自 EKB-569、 HKI-272和HKI-357。
3. 权利要求1的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制剂结合于 EGFR的半胱氨酸773 (SEQIDNO: 1)。
4. 权利要求l的方法，其中所述癌症的发展通过对癌症的目测 来监测。
5. 权利要求4的方法，其中所述癌症的目测通过X-线、CT扫 描或MRI进行。
6. 权利要求l的方法，其中所述癌症的发展通过肿瘤生物标记 物检测来监测。
7. 权利要求l的方法，其中监测癌症的发展包括将第二时间点 的癌症与第一时间点的癌症对比，其中第二时间点在第 一时间点之 后，其中第一时间点在起先用吉非替尼和/或埃罗替尼治疗之前或之 后，其中癌症的生长增加指示癌症的发展。
8. 权利要求7的方法，其中其它的时间点的癌症与之前的时间 点的癌症作比辟交。
9. 权利要求l的方法，其中所述癌症是上皮细胞癌。
10. 权利要求l的方法，其中所述癌症是胃肠癌、前列腺癌、 卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、食道癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系 统癌症、肾癌、4见网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌 症和力旁"光癌。
11. 一种治疗癌症的方法，所述方法包括以下步芬聚a. 给予癌症患者吉非替尼和/或埃罗替尼；b. 监测患者的癌症发展；和c. 一旦表明癌症发展，择给予患者不可逆性EGFR抑制剂。
12. 权利要求ll的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制剂选自 EKB-569、 HKI-272和HKI画357。
13. 权利要求ll的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制剂结合 EGFR的半胱氨酸773 (SEQIDNO: 1)。
14. 权利要求ll的方法，其中所述癌症的发展通过对癌症的目 测来监测。
15. 权利要求14的方法，其中对癌症的目测采用X-线、CT扫 描或MRI进行。
16. 权利要求ll的方法，其中所述癌症的发展通过肿瘤生物标 记物检测来监测。
17. 权利要求ll的方法，其中监测癌症的发展包括将笫二时间 点的癌症与第一时间点的癌症对比，其中第二时间点在第一时间点 之后，其中第 一 时间点在起先用吉非替尼和/或埃罗替尼治疗之前或 之后，其中癌症的生长增加指示癌症的发展。
18. 权利要求17的方法，其中其它的时间点的癌症与之前的时 间点的癌症作比專交。
19. 权利要求ll的方法，其中所述癌症是上皮细胞癌。
20. 权利要求ll的方法，其中所述癌症是胃肠癌、前列腺癌、 卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、食道癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系 统癌症、肾癌、碎见网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌 症和膀胱癌。
21. 权利要求11的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制剂与可 逆性EGFR抑制剂同时给予。
22. 权利要求21的方法，其中所述可逆性EGFR抑制剂是吉非 替尼或埃罗替尼。
23. —种治疗癌症的方法，所述方法包括给予癌症患者含不可 逆性EGFR抑制剂的药用组合物，所述患者在EGFR(SEQIDNO: 1) 上有突变，其中所述突变为在790位置上的苏氨酸被曱硫氨酸置换。
24. 权利要求23的方法，其中所述EGFR抑制剂选自EKB-569、 HKI-272和HKI-357。
25. 权利要求23的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制剂结合 至EGFR(SEQIDNO: 1)的半胱氨酸773上。
26. 权利要求23的方法，其中所述癌症是上皮细胞癌。
27. 权利要求23的方法，其中所述癌症是胃肠癌、前列腺癌、 卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、食道癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系 统癌症、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌 症和力旁力光癌。
全文摘要
本发明涉及治疗吉非替尼和/或埃罗替尼耐药性癌症的方法。在用吉非替尼和/或埃罗替尼治疗后监测癌症患者的癌症发展。癌症的发展指示癌症对吉非替尼和/或埃罗替尼耐药。一旦表明癌症在发展，则给予患者含不可逆性表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的药用组合物。在优选的实施方案中，不可逆性EGFR抑制剂是EKB-569、HKI-272和HKI-357。
文档编号A61K31/00GK101155579SQ200680011003
公开日2008年4月2日 申请日期2006年2月2日 优先权日2005年2月3日
发明者D·W·贝尔, D·哈伯, E·L·夸克, J·E·塞特尔曼, N·G·戈丁-海曼, R·索尔德拉, S·K·拉宾兰 申请人:综合医院公司;惠氏公司