专利名称：：用于rna干扰的寡核苷酸及其生物学应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及对RNA干扰有用的新的双链寡核苷酸(dsON)，还涉及将它们应用于递送寡核苷酸到培养的真核细胞或动物进行生物学和治疗性应用。
背景技术：
：RNA干扰(RNAi)是现在在早期基因功能水平即mRNA水平上进行基因沉默的技术(Fireetal，1999;Tuschletal.，1999)。该技术提供序列特异性的mRNA降解和蛋白质生成抑制(Yangetal，2000，Zamoreetal，2000，Hammondetal,2000，Parrish2000)。RNAi是高效的，因为其是可预先设计的有活性的dsRNA(siRNA,用于小的干扰RM)和耙向mRNA。当siRNA双链通过用载体转染并^皮递送到细胞质时，RNAi在多种哺乳细胞中显示出有效地沉默内源性和外源性基因(Elbashiretal，2001)。介导RNAi所需的传统dsRNA的结构特征表明优选具有19-25个核普酸(参见专利WO0244321，WO01/075164A3,EP20010985833)，特别是19-23个核苷酸长度的短dsRNA在哺乳细胞培养系统中有RNAi活性(Parrishetal.，2000;Elbashiretal.，2001;Tuschl，2001)。短的19-25个核苷酸(当碱基配对并且带有未配对的3，突出端)担当着指导序列特异性mRM降解的作用。当两端均是平末端(O个核苷酸突出端)或当1条链是平末端时，有可能观察到RNAi。即使siRNA未配对的突出端的序列对靶目标RNA的裂解不是关键的，但3，突出端的存在对优化RNAi和siRNA的稳定性显示出关键性。优选地，至少一条链具有1-5个核苷酸的3，突出端，特别是1-3个核苷酸的3，突出端。该RNA链优选具有3，-羟基基团和优选在5，末端包含磷酸基团，没有5，突出端。最有效的短dsRNA包含配对的各有21个核苷酸的2条链，这样使l-3个，特别是2核苷酸的3，突出端呈现在dsRNA的两个末端(Elbashiretal.，2001)。RNA双链的长度显示出可以被延长到27-28聚体(Siolasetal.，2005;Kimetal.，2005)，且可以耐受多种化学和/或骨架修饰(Kurreck,2003)。RNAi的成功依赖于两点双链RNA的长度、序列、化学结构以及细胞递送的载体。与反义核苷酸或核酶技术相比较，靶mRNA的二级结构对于siRNA进行基因沉默不是一个很强的限制因素。对于给定的mRNA靶，多种siRNA序列可能是有效的。因而，siRNA双链的稳定性和生物学利用度以及递送到细胞中的dsRNA数量依然是有效沉默的限制因素，而不是siRNA对靶的易接近性。本发明人已发现当使用相同的递送系统进行导入时，和传统的短dsRNA获得的结果相比较，具有能使双链寡核苷酸互相粘合的特定结构特征的dsON在真核细胞中具有高的RNA干扰活性和能够提供更高的基因沉默效率。由于能够更好地耐受降解，更长的寡核苷酸比传统的短dsRNA展示更高的稳定性。
发明内容本发明的一个目标就是提供新的组合物，该组合物包含dsON,当被导入到哺乳细胞中时所述dsON是RNAi的序列特异的介导者。进而本发明描述了dsON进行基因沉默的好处，该dsON包含能介导1个或多个靼基因的序列特异性RNA干扰的多个拷贝的短dsON。本发明还涉及基于合成载体的多种转染递送系统以及它们在生物学上的应用。本发明的组合物包含具有序列或长度相同或不同的双链寡核苷酸，所述寡核苷酸具有序列3'线...N卜艮..N,，其中-3'Ni...N/'是19-28聚体的双链寡核苷酸序列的一半，其互补于存在于活细胞中的靶核苷酸序列，和」'Nl.，U'是3-50聚体的突出端序列，其允许所述双链寡核苷酸寡聚化。所述组合物所优选的dsON很方便地具有19-21个核苷酸的序列3'Ni...Nj5',和/或包含5至8个核苷酸的序列3'N..Ni'。如实施例所表明的，当碱基与未配对的3，突出端配对并在长dsON中寡聚化时，短dsON作为序列特异性的mRNA降解的指导者发挥作用。根据本发明的实施方案，序列3'N,...N"'可能对降解是稳定的，例如对核酸酶的降解没有显著的活性损失。适当的稳定基团选自被修饰的类似物例如脱氧核糖核苷酸取代的嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸，和/或修饰的核苷酸类似物例如糖或骨架修饰的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在另外的实施方案中，任选地与任一前述特征的组合，本发明的该组合物包含至少一种在一个或两个5，末端带有5，磷酸或羟基的dsON。在根据本发明的组合物的dsON中，寡核苷酸序列含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物(VermaandEckstein,1998)、例如甲基膦酸酯(Mi1ler，1991)、磷酰二胺吗啉，石克代磷酸酯(ZonandGeiser,1991)、PM(JepsonandWengel，2004)、LNA、2，烷基核苷酸类似物(Kurreck，2003)。有效的病毒或非病毒载体在把寡核苷酸导入到细胞中是有用的。病毒递送系统依然遭受着在临床条件下的免疫原性及潜在的危险性。相反，用合成系统的核苷酸转染是通用的方法，该方法显示出适应性且没有免疫原性。非病毒载体的寡核苷酸转染对将dsON递送到细胞质是有用的。目前非病毒载体主要基于阳离子脂质介导的转染，例如Oligofectamin、TRANSIT-TKO、UpofectAmine2000、SiGuide、RNAiFect、或jetSi、或者基于阳离子聚合物介导的转染，例如Superfect、jetPEI或X-T國Gene。本发明因而也涉及转染组合物，该组合物包含至少一种例如如前定义的寡核苷酸组合物和转染试剂或制剂。该转染试剂或制剂更具体地是非病毒递送系统，该系统适合于把dsON导入活细胞中，并且释放dsON以介导细胞内RNAi。非病毒载体系统有利地包含阳离子脂质或聚合物或以肽为基础的递送试剂。该非病毒载体系统是这样的制剂，其包含至少递送试剂和其它组分，该组分使制剂稳定，靶向细胞、组织或器官，或增大转染效率。在导入细胞前，当和转染试剂复合时，分子间的相互作用促进了短dsON的寡聚化，其中分子间的相互作用是由于3，突出端-3，突出端的相互作用或者使用能与dsON3，突出端相作用的连接子。有多种连接子可以使用，例如包含互补于能够介导RNAi的dsON的3，突出端的核苷酸序列的寡核苷酸。其它的连接子可以是i)具有末端寡聚化结构域的发夹样结构，该末端寡聚化结构域识别介导RNAi的dsON的3，突出端；ii)在每条链的末端具有5，-或3，-突出端的短双链核酸，5，-或3，-突出端能够识别介导RNAi的dsON3，突出端。连接子也可以是介导序列特异性或非特异性RNAi的一种或几种dsON(或者多种dsON)，并含有与通过RNAi介导基因沉默的dsON3，突出端相作用的突出端。本发明还涉及到制备例如上述定义的寡核苷酸组合物的方法，所述方法包括-通过化学或酶催化途径合成具有如上定义的序列3X...N/'和3乂...Nw"的寡核苷酸链;-退火由此获得的合成的寡核苷酸。根据本实施方案，所述方法进一步包含在所述寡核苷酸退火步骤之后加入连接子，所述连接子具有互补于序列3、..U'的核苷酸序列末端。所述连接子被方便地选自寡核苷酸、单链寡核苷酸、发夹样结构、具有3，或5，突出端的短双链核苷酸、双链寡核苷酸。所述连接子选自脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物。本发明还涉及在体外和体内抑制基因表达的方法，其包括使用例如如上定义的寡核苷酸组合物或转染组合物。所述组合物和方法对治疗应用是特别有用的，所述治疗应用例如治疗癌症、如膀胱癌(Urban-Kleinetal.，2004)、前列腺癌(Paletal.，2005)或白血病(Guanelal..2005);或病毒性感染，比如HIV、肝炎病毒或传染性病毒感染(Geetal.，2004)。本发明的其它特点和优势将在如下给出并参考图1至图7，其分别如下展示。图1:通过复合两种主要分类的转染试剂代表物的传统的siRNA双链进行的RM干扰，两种主要的转染试剂是阳离子脂质为基础的和以聚合物为基础的转染试剂(分别是jetSi-ENDO和jetPEI)。细胞混合有jetSi-ENDOTM及jetPEITM的GL3LucsiRNA(SEQN。1)转染稳定表达GL3荧光素酶基因的A549-GL3Luc，以评价转染试剂的效果。在24小时(a)和48小时(b)温育期后测定荧光素酶基因的表达。通过使用商品化试剂盒(Promega)对细胞裂解物的荧火虫荧光素酶的表达进行评估。作为非特异性对照，和GL2荧光素酶序列匹配的siRNA(SEQN。2)以同样条件被转染。实验重复三次，并通过对细胞裂解物中的蛋白质含量标准化的非转染AS49-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平对GL3荧光酶沉默效果进行评价。图2:通过复合有阳离子聚合物递送试剂jetPEI的(dA)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)双链进行RNA干扰。A549-GL3Luc细胞被转染，在温育24小时(a)和48小时(b)的时间后测定焚光素酶基因的表达。用标准的GL3LucsiRNA(SEQN。1)作为对照。实验重复三次，通过被细胞裂解物中的蛋白质含量标准化的非转染A549-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平对荧光酶沉默效果进行评价。图3:通过(dA)广GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)双链介导序列特异性RM干扰进行的RNA干扰。A549-GL3Luc细胞被复合有jetPEI的下述双链转染，(dA)「GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)(在(dA)「GL3Luc-(dT)5位置9突变的序列(dA)「GL3Luc-(dT)5MutdsRM(SEQN。4))和(dA)广GL2Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。5)的双链。温育48小时后测定焚光素酶基因的表达。实验重复三次，通过对细胞裂解物中的蛋白质含量标准化的非转染A549-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平对荧光酶沉默效果进行评价。图4:具有能诱导它们分子间寡聚化的3，突出端的双链RNA当和jetPE尸复合时介导高的GL3荧光素酶沉默。用与jetPEI复合的(dA)5-GL3Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。3)和(dA)「GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。7)的双链转染A549-GL3Luc细胞。在48小时温育期后测定荧光素酶基因表达。由于双链RM不能通过它们的3，突出端促进它们分子间寡聚化，(dT)5-GL3Luc-(dT)sdsRM(SEQN。6)和(dT)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。8)的双链在与用jetPElTM的相同条件下被转染。实验重复三次，通过用细胞裂解物中的蛋白质含量标准化的非转染A549-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平对荧光酶沉默效果进行评价。图5:当具有能诱导它们分子间寡聚化的3，突出端的双链RNA与jetPErM复合时介导序列特异性GL3荧光素酶沉默。用与jetPEI复合的(dA)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)和(dA)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。7)的双链转染A549-GL3Luc细胞。在48小时温育期后，测定荧光素酶基因表达。作为非特异性对照，用(dA)5-GL2Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。5)和(dA)8-GL2Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。9)在与用jetPErM的相同条件下进行转染。实验重复三次，通过用细胞裂解物中的蛋白质含量标准化的非转染A549-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平对荧光酶沉默效果进行评价。图6:当和jetPElTM复合时，dsMA的寡聚化介导有效的GL3荧光素酶沉默，dsRM寡聚化是通过使用与dsRNAs双链的对称的3，突出端相结互作用的连接子产生的分子间相互作用而促进的。A549-GL3Luc细胞被复合有jetPEI的(dT)5—GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。6)和(dT)「GL3Luc-(dT)8(isRNA(SEQN。8)双链转染，所述双链分别为不具有或具有(dA)"(SEQN°12)和(dA)"(SEQN°13)连接子,在温育48小时后，测定荧光素酶基因表达。实验重复三次，且通过用细胞裂解物中的蛋白质含量标准化的非转染A549-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平对荧光酶沉默效果进行评价。图7:当与例如jetS卜END0頂或RNAiFect的阳离子脂质制剂复合时，dsRNA的寡聚化介导有效的GL3荧光素酶沉默。dsRNA寡聚化是通过使用与dsRMs双链的对称的3，突出端相互作用的连接子产生分子间相互作用而促进的。A549-GL3Luc细胞分别被复合有jetSi-ENDO(a)和RNAiFect(b)的下述双链转染，双链(dT)厂GL3Luc-(dT)2siRNA(SEQN°l)，(dT)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。6)，和(dT)8-GL3Luc—(dT)8dsRNA(SEQN。8)，其中序歹'JN°6和8分别带有连接子(dA)"(SEQN°12)和(dA)24(SEQN。13)。在温育48小时后，测定荧光素酶基因的表达。实验重复三次，通过同细胞裂觯物中的蛋白质含量标准化的非转染A549-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平对荧光酶沉默效果进行评价。材料和方法化学试剂和寡核苷酸化学合成寡核苷酸并由Eurogentec(Belgium)进行PAGE纯化。寡核苷酸在lx退火緩沖液(50mM醋酸钾，50mM醋酸镁)(Eurogentec)中95。C，2分钟进行退火，然后在室温温育2—小时。jetSi-ENDO(用于siRNA转染的阳离子脂质试剂)和jetPEI(用于核酸转染的阳离子聚合物、线性聚乙烯亚胺衍生物)来自于Polyplus-Transfection(法国)。RNAifect来自于Qiagen(美国)。细胞培养在pGL3Luc质粒(Clontech)的稳定转染后，获得了稳定表达GL3荧光素酶(SV40元件控制下的荧火虫(photinuspyralis)荧光素酶)的A549细胞(人肺癌细胞，ATCC编号CCL-185)。A549-GL3Luc细胞生长在RPMI(Eurobio，France)培养基中，RPMI中补充入10%胎牛血清(FBS,Perbio，France)、2mM谷氨酰胺(E訓bio)，IOO单位/ml青霉素(Eurobio)、100jug/ml链霉素(Eurobio)和0.8jug/mlG418(Promega)。在37°C含有5%C02的潮湿气氛中维持细胞。转染试验转染前一天，将2.5xl(T个细胞接种在含有10%FBS的lml新鲜的完全培养基的24孔组织培养板上。在转染前，准备好dsRNA/转染试剂的混合物。把期望的量的寡核苷酸(带有或不带有寡核苷酸连接子的dsRNA)和转染试剂为jetSi-end0tm而稀释到150jal的无血清培养基中，或为了jetPEr而稀释到150|il的150mMNaCl中(供三次试验用)。每微克dsON分别使用3jj1和2jj1的jetSi-ENDO和jetPEITM。溶液在振荡器上混合10秒，然后置室温10分钟。转染试剂加到dsRNA溶液中，在振荡器上混匀10秒，然后置室温30分钟。在加入转染复合物之前，移去含有血清的完全培养液，并用().smi无血清培养液更换。然后，每孔加入lOO)a1复合物溶液，并置培养板于37匸。温育2小时后，移去完全培养液并置换上lml含有10%血清的完全培养液。对于RNAifect，期望的量的dsRNA和寡核苷酸连接子被稀释在300ja1的无血清培养液中(用于三次试验)。然后，转染试剂被加入到siRNA混合物中(每iagds0N使用3ji1RNAifect)。用振荡器混合该溶液10秒，然后置室温15分钟。在加入转染复合物之前，移去含有血清的完全培养液，置换上0.3ml带有血清的完全培养液。每孔加入100|a1复合液，置培养板于37C温育。24小时后，移去培养液，置换上0.5ml含10%血清的完全培养液。对于所有的转染方案，培养板在37。C再温育24小时或48小时。荧光素酶和蛋白质分析荧光素酶基因的表达用商品化试剂盒(Promega，France)进行测定。在移去完全培养液后，用lmlPBS溶液洗3次。然后，每孔加入IOOjj1lx裂解緩冲液，培养板置室温温育30分钟。收集裂解物并在14000g离心5分钟。用5/jl注入100iu1荧光素溶液后的裂解物进行荧光素酶分析。用光度计(Berthold，France)监测积分(integration)10秒以上的发光(RLU)。结果表达为每毫克细胞蛋白积分10秒以上的光亮单位(RLU)，用BCA方法测定细胞蛋白质(Pierce,France)。结果作为内源性基因的靶模型，我们使用了能稳定表达GL3荧光素酶(在SV40元件控制下的萤火虫荧光素酶)的A549细胞。一种很好地定义了的化学合成的直接针对GL3荧光素酶mRNA的siRNA(在siRNA的纳摩尔浓度范围内)和典型的阳离子脂质为基础的递送试剂(jetSi-ENDOTM)及典型的阳离子聚合物为基础的递送试剂(jetPEI)一起被转染。这个序列特异性的经典GL3LucsiRNA是一个19个核苷酸的短dsRNA，其和GL3LucmRNA相匹配，并且才艮据哺乳细胞中介导RMi的优选siRNA的定义(Elbashiretal.，2001),该短dsRNA含有相同的(例如，不互补)2个脱氧核糖核苷酸(dT)的3，突出端。当用jetSi-END(T和75nM的siRNA进行转染时，显示在图1中的GL3荧光素酶的沉默效率在转染后24小时和48小时可分别达到70%和高于80%。用作非相关序列的GL2LucsiRNA的低沉默水平证实了序列特异性的RNAi。当用jetPElTM进行转染时，尽管比用阳离子脂质衍生物进行转染有低一些的效率和持续时间，还是观察到了GL3荧光素酶的序列特异性沉默。为了改进介导RNAi的dsRNA的沉默效率，我们使用了一种和GL3LucmRM相匹配的具有19个核苷酸的dsRM(SEQN°3),该dsRM含有在反义链末端具有5个脱氧胸腺嗜啶核苷酸的3，突出端，还含有在正义链末端具有5个脱氧鸟嘌呤核苷酸的3，突出端。这些3，突出端可以促进3，突出端-3，突出端的相互作用从而导致dsRNA分子间寡聚化为长的dsRNA。在用复合有jetPEITM的(dA)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。3)转染A549-GL3Luc细胞后(图2),可以观察到较高的荧光素酶沉默(转染24和48小时后，dsRNA浓度为50-75nM时大于80%)。(dA)5-GULuc-(dT)5dsRNA(SEQN°3)比用jetSi-END(T和jetPErM两种试剂转染的标准siRNA能更好地介导荧光素酶基因沉默。使用所用的任一递送试剂导入细胞时，在10nm浓度转染48小时后，用(dA)广GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN°3)引起的基因沉默是特别有效的，而GL3LucsiRNA不能够沉默荧光素酶的表达(图2)。序列特异的(dA)5-GL3Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。3)9号位置(在反义链上A对G)—个单一的核苷酸替换用来废除GL3LucmRNA靶的特异性识别。这个单一突变的序列，(dA)「GL3Luc-(dT)5-MutdsRNA(SEQN°4),用jetPE"转染到A549-GL3Luc细胞。在5-50nM的浓度范围内,转染48小时后，不能沉默荧光素酶的表达(图3)。作为其它的选择性对照，和不相关的GL2荧光素酶相匹配的(dA)5-GL2Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。3)被转染，也不能沉默荧光素酶表达(图3)通过使用双链3，端的5个或8个核苷酸对寡聚化的dsRNAs的3'突出端的长度进行了研究。用jetPEI把(dA)5-GL3Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。3)和(dA)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。7)两者转染到A549-GL3Luc细胞中，转染48小时后，两者显示出有效的而且可比较的沉默水平(图4)。作为对照，使用不能促进它们自己寡聚化的(dT)5-GL3Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。6)和(dT)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。8),与能够寡聚化的dsRNAsSEQN。3和7获得的结果相比较，对照对沉默荧光素酶表达是非常低效的(图4)。一种沉默选择性对照通过使用可以寡聚化的dsRNA来进行。该dsRNA除了和GL2序列相匹配，在双链的每条链的3，端具有5个或8个核苷酸。(dA)5-GL2Luc-(dT)5dsRNA(SEQN。5)和(dA)8-GL3Luc-(dT)8dsRM(SEQN。9)两者是不能够沉默内源性表达的GL3荧光素酶(图5)。通过碱基配对识别dsON双链3，突出端的一种寡核苷酸连接子可以促进介导RNAi的短dsON的寡聚化。作为一个模型，在poly(dA)核苷酸存在或不存在的情况下，使用jetPErM把(dT)5-GL3Luc-(dT)sdsRNA(SEQN。6)和(dT)8-GL3Luc-(dT)8dsRNA(SEQN。8)转染到A549-G13Luc细胞中。长度上含有15(SEQN。12)和24(SEQN。13)个核苷酸的poly(dA)被分别用来促进双链SEQN。6和8的寡聚化。和不具有poly(dA)连接子获得的沉默效率相比较，poly(dA)连接子存在时，两种dsRNA双链的荧光素酶沉默效率是高效的(图6)。在这个实施方案中，在(dA)"连接子存在时，具有5个核苷酸长度的3，突出端的dsRNA显示出最好的沉默能力(图6)。具有寡核苷酸连接子的介导RNAi的dsRNA的寡聚化因而增强了它的效率。含有dsON的組合物在A549-GL3Luc细胞中介导特异的GL3荧光素酶基因沉默，其中该dsON被一个通过碱基配对识别该dsON双链3，突出端的寡核苷酸连接子寡聚化，并被递送试剂例如基于jetSi-END0TM或RMiFect的阳离子脂质的转染试剂递送到细胞中。Poly(dA)被用来作为长度上包含有15(SEQN。12)和24(SEQN°13)个核苷酸的连接子，以分别促进双链SEQN°6和8的寡聚化。和使用典型的GL3LucsiRNA(SEQN。1)获得的沉默效率相比较，当poly(dA)连接子存在时，两个dsRMA双链在纳摩尔水平上的荧光素酶沉默是非常高效的(图7)。当用阳离子脂质为基础的递送系统导入细胞时，和使用siRM的传统策略相比较，具有寡核苷酸连接子的介导RNAi的dsRNA的寡聚化增强了所述基因的沉默效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>参考文献Elbashii.、SMe/o/.(20(M)Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinmammaliance"culture.Nature41.1:494-498，Elbashir，SM(2001)RNAinterferenceismediatedby2and22ntRNAs.Genes&Dev.15:188-200.Fii'e.A.(1999)RNA-triggeredgenesilencing.7Vewrfi.IS,358-363.Ge.Qc吖(2004)h，hibhionofinfluenzavirusproductioninvirusinfectedmicebyRNAm,erference.PNAS101.867^8681.Guan.H.(2005)AsmallinterferingRNAtargetingvascularendothelialgrowthfactorinhibitsEwing'ssarcomagrowthinaxenograftmousemodel,C7/wCawcerWes7，2662-2669，Hammond,SMc//.(2000)AnRNA*directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosopl，ilacells.404>363-366.JepsenJS、Wengel丄(2004)LNA'antisenserivalssiRNAforgenesilencing,CzwO;/"Z>wgD/.vcovZ^ve/.7(2):188-94.Kim，DHetal.(2005)SyntheticdsRNfADicersubstratesenhanceRNAipotencyandefficacy.NatureBiotech.23,222-226.Ku，TeckJ.(2003)Antisensetechnologies.Improvementthroughnovelchemicalmodifications.￡wrJjS/'ocAw,.270(8):162844.MillerPS,(1991)Oligonucleosidemethylphosphonatesasantisensereagents.历0/ec/7"0/0gy(W>99(4):358-62.Pal,A.e/(2005)SystemicdeliveryifRafsiRNAusingcationiccardiolipinliposomessilencesRaf-1expressionandinhibitstumorgrowthinxenograftmodelofhumanprostatecaiicer，/"/JO"co/,26，1087-91Parrish，S,etal.(2000)FunctionalanatomyofadsRNAtrigger:differentialrequirementfortl，etwoniggerstrandinRNAinterference.M/Ce〃.6,1077-1087.Siolas，Detal.(2005)SyntheticshRNAsaspotentRNAitriggers.23，227-231.Tuschl,丁.(2001)RNAinterfeienceandsmallinterferingRNAs.CAemfc/oc^ew.2，239-245,丁uscl，l，T.etal.(1999)TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNAinvitro'Genes&Dev.13，391-3197.Urban-Klein,B.e,(2004)RNAi-mediatedgene-targetingthroughsystemicapplicationofpolyethykm'mine(PEI)-complexedsiRNAinvivo,Gewe7Tera;少23,1-6VermaS、Eckstein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