劳森菌疫苗及其使用方法

专利名称：：劳森菌疫苗及其使用方法
技术领域：
：本发明广泛涉及用于对抗猪增殖性肠炎(称为回肠炎)的免疫的改良接种方法，该肠炎由专性细胞内细菌胞内劳森菌(丄mwom'a/Wrace〃w/an'力引起。具体的说，本发明提供分别藉由接种怀孕母猪、接种怀孕母猪且随后接种其出生后约三周内的幼仔猪、及接种出生25或26天内的幼仔猪来提供增强抗胞内劳森菌的保护力的方法。现有技术猪的增殖性肠炎(PPE)是天然发生的疾病，其可影响断乳至幼成年(youngadult)期的猪。已经证实病原体为胞内劳森菌一一种专性的胞内革兰氏阴性细菌，其无法藉由常规细菌学方法在常用的无细胞培养基中培养，且被认为其需要细胞而生长。S.McOrist等人于InfectionandImmunity,第61巻，第19期，4286-4292(1993)及G.Lawson等人于J.ofClinicalMicrobiology,第31巻，培养瓶中培养胞内劳森菌。美国专利第5,714,375及5,885,823号中描述在悬浮的宿主细胞中培养胞内劳森菌，其均以全文引用方式并入本文。月包内劳森菌的致病及非致病减毒菌林为
技术领域：
中所熟知。举例而言，WO96/39629及WO05/011731描述胞内劳森菌的非致病减毒菌抹。自WO02/26250及WO03/00665中可知更多的胞内劳森菌的减毒细菌抹。此等参考文献各自的教导及内容以引用方式并入本文。该疾病的特征是，首先有肉眼及显微可见的病理学，随后在受感染的细胞内证实有胞内细菌。该疾病的病理特征是，位于回肠(小肠的末端部分)、大肠或二者的隐窝(crypt)中的未成熟上皮细胞增殖。受染组织的切片的特征为，具有类似"园艺软管(gardenhose)，，的变红增厚粘膜及肠病灶。此增厚的肠道最终防碍正常的肠道功能、吸收能力及营养传递。该疾病的临床影响包括，慢性体重减轻、不壮实、腹泻及死亡。该疾病由于在受感染动物中因动物死亡造成损失、增加医药开销、增重不佳及降低受染动物的伺料换肉率(foddconversion)而具有经济上的重要性。最常见的临床回肠炎案例发现于6-20周龄的猪。然而，近已证实(藉由PCR),在新断乳的猪(3-4周龄)中出现胞内劳森菌，提示哺乳(nursery)期间接触了胞内劳森菌，且可能来源于劳森菌阳性母畜(Mauch及Bilkei(2004)VetRec155:532;Marstelle等人(2003).SwineHealthProd11:127-130;Stege等人(2004).VetMicro104:197-206)。此等观察结果强调在生产系统中较早施行疫苗接种等预防策略的重要性。目前用于抗回肠炎的免疫中的疫苗接种策略包括，^吏三周龄.以上的未感染(naiVe)劳森菌的猪口服疫苗，因为低于此年龄组的仔猪由于先前接触母猪或疫苗接种而可具有胞内劳森菌阳性母体抗体。在本发明方法之前认为，母体抗体或其它催乳因子的存在可能干扰该等仔猪中疫苗接种的功效，因为母体抗体在仔猪免疫系统能识别疫苗、并开始分泌其自身抗体之前就具有中和该疫苗的能力。因此，当具有母体免疫时，应避免幼年仔猪接种疫苗。发明概述本发明克服先前技术的缺点，提供增强猪抗回肠炎的保护力的新方法。具体的说，本发明提供一种对母猪及/或出生后数周内的幼仔猪施用免疫有效量的疫苗以使其具备对抗回肠炎的免疫的方法。此前发现，由接种过或接触过劳森菌的母猪传递到仔猪中的母体免疫力，给出生后至少6周的仔猪提供了一定程度的抗回肠炎的保护力。然而除非经过接种，否则仔猪很快变得易患该疾病。本发明的该等方法证实，在怀孕动物中重复使用高剂量疫苗，以及甚至在怀孕第二或第三阶段施用，对于提供母体免疫而言，具有惊人的安全性及有效性。因此本发明大体涉及一种给怀孕动物(较佳为猪)进行对抗胞内劳森菌感染的疫苗接种的方法，其中用胞内劳森菌抗原给该等怀孕动物接种。根据另一方面，用高剂量及/或多次施用的胞内劳森菌抗原进行疫苗接种。根据另一方面，本发明涉及一种给怀孕动物(较佳为猪)进行对抗胞内劳森菌感染的疫苗接种的方法，其中给该等怀孕动物在怀孕第二或第三阶段中进行接种疫苗，较佳为用高剂量及/或多次施用的胞内劳森菌抗原给彼等怀孕动物接种。在一较佳实施方案中，提供一种藉由对一怀孕母猪在分娩之前至少一次、较佳为在分娩之前两次且最佳为在分娩之前三次("重复剂量")施用劳森菌疫苗来给猪接种疫苗对抗回肠炎的方法。在某些形式中，用高剂量的胞内劳森菌抗原给该等怀孕母猪接种。当三次对母猪施用疫苗时，第一次施用应发生在分娩之前50至60天之间、较佳为在分娩之前52与58天之间且最佳为在分娩之前54与56天之间。第二次施用应发生在分娩之前30与40天之间、较佳为在分娩之前32与38天之间且最佳为在分娩之前34与36天之间。最后施用应发生在分娩之前10与20天之间、较佳为在分娩之前12与18天之间且最佳为在分娩之前14与16天之间。母猪生产之后，在仔猪断乳之后直至屠宰、但较佳为在达到三周龄之前，在任何情况下，在年龄分别至少在10至25及26天内(较佳为年龄在16至26天之间)、更佳为年龄在10至21天之间、甚至更佳为年龄在15至21天之间、且最佳为年龄在19与21天之间对每一仔猪施用疫苗。在本方法另一实施方案中，在26日龄之前、较佳为年龄在16至26天之间、更佳为年龄在18至24天之间、更佳为年龄在19至22天之间且最佳为年龄在21天时对每一仔猪施用疫苗。因此，在另一实施方案中，本发明提供一种给怀孕母猪以及所产仔猪接种疫苗的方法。给该等怀孕母猪及所产仔猪较佳如上文所描述接种疫苗。进一步发现母体免疫出乎意料地不千扰给出生后不久的仔猪成功接种疫苗，且事实上如本文所描述出生后约三周内接种的仔猪与未经接种的仔猪相比具有较少的与疾病相关的整体病理(grosspathology)。因此本发明涉及一种给幼年动物(较佳为幼仔猪)在出生后约三周内接种疫苗对抗胞内劳森菌感染的方法。较佳为，给彼等幼年动物(较佳为幼仔猪)在年龄为21±5天内接种疫苗。甚至更佳为给彼等幼年动物(较佳为幼仔猪)分别在年龄为10至25及26天内接种疫苗。甚至更佳为给彼等幼年动物(较佳为幼仔猪)在年龄为10至21天内接种疫苗。甚至更佳为给彼等幼年动物(较佳为幼仔猪)分别在年龄为12至21天内接种疫苗。甚至更佳为给彼等幼年动物(较佳为幼仔猪)在年龄为15至21天内、最佳为年龄在19至21天内接种疫苗。在本方法的另一实施方案中，在26日龄之前、较佳为年龄在16至26天之间、更佳为年龄在18至24天之间、更佳为年龄在19至22天之间且最佳为年龄在21天时对每一仔猪施用疫苗。根据本发明适合使用的疫苗可以是任何提供抗胞内劳森菌保护的疫苗。疫苗较佳为活病毒胞内劳森菌疫苗。疫苗更佳为EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)。以任何常用的方式、最佳为经口灌服对动物、较佳为哺乳动物及更佳为猪施用疫苗。待施用剂量将视特定状况而定，但在任何情况下，该量足以诱发对抗回肠炎的保护性抗体及/或细胞介导的免疫反应。合适的剂量可藉由本领域已知的方式而无需过多实验决定，且常常主要将视所用的特定疫苗而定。在许多状况下，合适的剂量范围为O.lml至10ml,且较佳为约lml至5ml。在Enteriso膨回肠炎的状况下，剂量较佳为每头猪至少2ml。对于无水疫苗接种而言亦可在每头猪重的干重基础上计算剂量。进行如下实施例中所述的研究以评估在接触胞内劳森菌及劳森菌-阴性的母猪所生的猪中的疫苗功效。此外，该等研究评估是否存在任何由疫苗接种三周龄的仔猪导致的母体干扰。
发明内容如本文所用的术语"疫苗接种"("vaccination"或"vaccinating")意谓(但不限于)一种包括对动物施用胞内劳森菌抗原的方法，其中该胞内劳森菌抗原在施用于该动物时在该动物中引发或能够引发对抗胞内劳森菌的免疫反应。如本文中所用的术语"动物，，意谓但不限于鸟、鱼及诸如牛、猪、马的哺乳动物及灵长类。然而，根据本发明的一个较佳实施方案，动物为猪、较佳为年龄分别为10至25及26天之间、较佳为年龄在10至21天之间、甚至更佳为年龄在15至21天之间且最佳为年龄在19与21天之间的仔猪。在另一较佳实施方案中，仔猪不足26日龄、较佳为年龄在16至26天之间、更佳为年龄在18至24天之间、更佳为年龄在19至22天之间且最佳为21日龄。如本文所用的术语"有效剂量，，("aneffectivedose"或"e伍caciousdose，，)意谓(但不限于)在施用该有效剂量的胞内劳森菌抗原至动物时，引发或能够引发动物免疫反应的抗原量。对组合物或疫苗的"免疫学或免疫反应"是在宿主中对所需组合物或疫苗发生细胞及/或抗体介导的免疫反应。因此，术语"引发或能够引发免疫反应，，意谓(但不限于)宿主中的免疫学过程，其特征在于该宿主发生对所需组合物或疫苗的细胞及/或抗体介导的免疫反应。通常，"免疫反应"包括(但不限于)下列作用之一或多种产生或激活抗体、B纟曰胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞，及/或细胞毒素T细胞及/或ydT细胞，所述细胞特异性针对包括在所需组合物或疫苗中的抗原。宿主较佳将显示治疗或保护性免疫学反应以便增强对新感染的抵抗力及/或降低该疾病的临床严重性。藉由降低(包括降低严重性)或缺乏与如上文所述的与宿主感染相关的症状证实了该保护。在动物中有效的引发免疫反应或能够引发免疫反应的抗原量视疫苗成份及施用时间表而定。一般而言，当灭活的细菌抗原用于疫苗中时，疫苗含有每剂约103至约109个细菌、较佳为每剂约104至约108个细菌且更佳为每剂105至约106个细菌的量。具体的说，当将弱毒(modified)活胞内劳森菌用于该等疫苗中时，例如命名为B3903(ATCC保藏号PTA-4926)及命名为N34NP40wk(ATCC保藏号55783)的细菌分离物(二者均在WO96/39629及WO05/011731中描述)，对易感动物所施用的推荐剂量较佳为约3.0TCIDsQ(组织培养感染剂量50。/。终点)/剂至约6.0TCIDso/剂且最佳为约4.0TCID5o/剂至约5.0TCIDW剂。在一个较佳实施方案中，如藉由TissueCultureInfectiveDose50%终点稀释检定法(TCID5o)所测定的疫苗滴度为约4.9TCIDm)/刑。通常以每剂至少0.2吗抗原、较佳为约0.2至约400吗/剂、更佳为约0.3至约200吗/剂、甚至更佳为约0.35至约100吗/剂、更佳为约0.4至约50jig/剂、甚至更佳为约0.45至约30iig/剂、更佳为约0.6至约15iig/剂、甚至更佳为约0.75至约8昭/剂、甚至更佳为约1.0至约6ng/剂且更佳为约1.3至约3.0昭/剂的抗原包含水平施用亚单位疫苗。一般而言，抗原量在5与5000微克之间，且当使用纯化细菌时在10"与109QTCID5。之间、较佳在1030与1060TCID5o之间且更佳在10"与1050TCID50之间。如本文所用，术语"高剂量"一般意谓通常用于成年动物疫苗接种的单一剂量的抗原的至少三倍量。具体的说，对于活的弱毒胞内劳森菌，术语"高剂量"意谓至少3xlO"至3x1090TCID5o、较佳为约3xl()45至3x1060TCIDso的量。具体的说，对于灭活的胞内劳森菌抗原，术语"高剂量"意谓至少3xlO"至3xlO"个生物体或细菌、较佳为约3xlO"至3xlO^个生物体或细菌的量。具体的说，对于任何亚单位胞内劳森菌抗原，术语"高剂量"意谓至少3x0.2至约3x400(0.6至约1200)吗/剂的量。在本申请案中，对怀孕母猪施用高剂量的胞内劳森菌抗原以在怀孕母猪中诱发增强的免疫学反应，该免疫反应将传递至后代且对所产仔猪提供一定水平的免疫性。如本文所用，术语"多次施用，，意谓至少两次、较佳为三次施用胞内劳森菌抗原。上文中给出以"多次施用，，给怀孕母猪接种疫苗的疗法的例子。如本文所用术语"增强保护"意谓(但不限于)在一经接种动物组中对一未经接种的对照动物组中，与胞内劳森菌感染相关的一或多种临床症状及/或损伤发展的严重性或频率(例如藉由该方法及根据实施例l中所定义的标准所判定的交叉损伤频率等)在统计学上显著减少。术语"临床症状的统计学上显著减少"意谓但不限于在用传染性胞内劳森菌攻击后，经接种动物组中至少一种临床症状的发生及/或损伤发展频率比未经接种的对照组低至少20%、较佳为30%、甚至更佳为40。/。、更佳为50%、甚至更佳为60%、更佳为70%、甚至更佳为80%、更佳为90%且最佳为95%。如本文所用，术语"胞内劳森菌"或"劳森菌"意谓由各自以全文引用方式并入本文的C.Gebhart等人，Int'l.J.ofSystemicBacteriology,第43巻，第3期，533-538(1993)及S.McOrist等人，Int'l.J.ofSystemicBacteriology,第45巻，第4期，820-825(1995)详细描述的细胞内的、弯曲的革兰氏阴性细菌，且包括(但不限于)WO96/39629及WO05/011731中所描述的分离物。具体的说，术语"胞内劳森菌"亦意谓但不限于按照《布达佩斯条约》(BudapestTreaty)在10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209的美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)保藏及给予ATCC保藏号PTA4926或ATCC保藏号55783的分离物。两种分离物均在WO96/39629及WO05/011731中分别描述。术语"胞内劳森菌，，亦意谓(但不限于)任何其它胞内劳森菌抹或分离物，所述菌抹或分离物较佳具有WO96/39629及WO05/011731中所述的至少一种胞内劳森菌抹的免疫原性性质，尤其具有按照《布达佩斯条约》在10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209的美国典型培养物保藏中心保藏及给予ATCC保藏号PTA4926或ATCC保藏号55783的分离物中至少一种的免疫原性性质。在WO06/01294中所描述的检测试验中，当一种菌抹或分离物至少用也在WO06/01294中所描述的抗-胞内劳森菌特异性抗体之一可检测时，其具有WO96/39629及WO05/011731中所描述的至少一种胞内劳森菌林的、尤其如ATCC保藏号PTA4926或ATCC保藏号55783所保藏的分离物中至少一种的"免疫原性性质"。彼等抗体较佳选自具有参考值301:39、287:6、268:29、110:9、113:2及268:18的抗体。检测试验较佳为如WO06/12949的实施例2及3中所描述的夹心ELISA法，然而抗体110:9用作捕获抗体而抗体268:29用作偶联抗体。WO06/12949中公开的所有抗体都是藉由杂交瘤细胞产生的，0JG，Uk的CentreforAppliedMicrobiologyandResearch(CAMR)及EuropeanCollectionofCellCultures(ECACC)。保藏日期为2004年5月II日。杂交瘤细胞系(HYBRIDOMACELLLINE)110:9成功地以ECACC保藏号第04092204号保藏。杂交瘤细胞系(HYBRIDOMACELLLINE)113:2成功地以ECACC保藏号第04092201号保藏。杂交瘤细胞系(HYBRIDOMACELLLINE)268:18成功地以ECACC保藏号第04092202号保藏。杂交瘤细胞系(HYBRIDOMACELLLINE)268:29成功地以ECACC保藏号第04092206号保藏。杂交瘤细胞系(HYBRIDOMACELLLINE)287:6成功地以ECACC保藏号第04092203号保藏。杂交瘤细胞系(HYBRIDOMACELLLINE)301:39成功地以ECACC保藏号第04092205号保藏。如本文所用的术语"胞内劳森菌抗原"意谓(但不限于)任何包含至少一种抗原的物质的组合物，该抗原在施用动物时可诱发、刺激或增强对抗胞内劳森菌引起的感染的免疫反应。该胞内劳森菌抗原较佳为完整的胞内劳森菌，具体为灭活形式(所谓死菌)、弱毒的活的或减毒的胞内劳森菌(所谓MLB)、胞内劳森菌的任何亚单位、多肽或组分，或任何嵌合载体，其各自包含胞内劳森菌的至少一个免疫原性氨基酸序列。如本文所用的术语"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽，，或"免疫原性氨基酸序列"系指在宿主中引发对抗病原体的免疫反应的任何氨基酸序列，所述病原体包含该免疫原性蛋白、免疫原性多肽或免疫原性氨基酸序列。具体的说，胞内劳森菌的"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽，，或"免疫原性氨基酸序列，，意谓在施用该"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列，，的宿主中引发对抗胞内劳森菌的免疫学反应的抗原的任意编码氨基酸序列。如本文所用的"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"包括(但不限于)任何蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。术语"免疫原性片段，，意谓蛋白质片段，其包括一或多个抗原决定簇且因此引发对抗相关病原体的免疫反应。可使用任何几种本领域公知的抗原决定簇定位technique)来鉴定该等片|殳。参见例如EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66巻(GlennE.Morris,Ed.,1996)HumanaPress,Totowa,NewJersey。(其教示及内容以引用方式并入本文)。举例而言，藉由在固体载体上同时合成大量肽(该等肽对应蛋白质分子的部分)及当该等肽仍附在该等载体上时使该等肽与抗体反应，可测定线性抗原决定簇。该等技术在本领域中是已知的，且在例如美国专利第4,708，871号、Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002及Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715中进行描述。(其教示及内容以引用方式并入本文)。类似地，藉由测定氨基酸的部分构象(诸如藉由例如X光晶体照相术及二维核磁共振)来容易地鉴别构象抗原决定簇。参见EpitopeMappingProtocol,出处同上。在定义中亦包括合成抗原，例如多抗原决定簇、侧翼抗原决定簇及其它重组或合成的衍生抗原。参见例如，Bergmann等人(1993)Eur.丄Immunol.23:2777-2781、Bergmann等人(1996)，J.Immunol.157:3242-3249、Suhrbier,A.(1997)，Immunol及CellBiol.75:402-408;及Gardner等人，(1998)12thWorldAIDSConference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日-7月3日。(其教示及内容以引用方式并入本文)。合适的胞内劳森菌抗原包括(但不限于)彼等在EP1219711、US6,605,696、WO96/39629、WO97/20050、WO00/69903、WO00/69904、WO00/69905、WO00/69906、WO02/38594、WO02/26250、WO03/006665、WO04/033631、WO05/026200及WO05/011731中所描述的抗原。因此，根据本发明使用的疫苗包括任何如上文所述引发或能够引发对抗胞内劳森菌的免疫反应的胞内劳森菌抗原。该疫苗较佳至少提供增强的对抗胞内劳森菌的保护。因此根据另一方面，本发明涉及一种给幼年动物接种疫苗对抗胞内劳森菌感染的方法，其包含对该约3周龄内的幼年动物施用有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤，其中该胞内劳森菌抗原选自由活的弱毒胞内劳森菌、胞内劳森菌死菌或一或多种胞内劳森茵的亚单位组成的组。如上文为一个实施方案所提及，该疫苗接种较佳发生在年龄为10天与26天之间、更佳为年龄在12天与21天之间、甚至更佳为年龄在15天至21天之间且最佳为年龄在19天与21天之间。对于另一实施方案，疫苗接种较佳发生在26日龄之前、较佳在年龄在16至26天之间、更佳在年龄在18至24天之间、更佳在年龄在19至22天之间且最佳在21日龄时。较佳地，该疫苗包含修饰的胞内劳森菌活菌。更佳地，疫苗为Enteriso1⑧IleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.)。根据另一方面，本发明涉及一种给较佳为幼仔猪的幼年动物接种疫苗对抗胞内劳森菌感染的方法，其包含下列步骤对所述该幼年动物在年龄在IO天与26天之间、更佳为年龄在12天与2i天之间、甚至更佳为年龄在15天与21天之间且最佳为年龄在19天与21天之间时开始施用，或给幼年动物在26曰龄之前、较佳为年龄在16至26天之间、更佳为年龄在18至24天之间、更佳为年龄在19至22天之间且最佳为年龄在21天时施用约3.0TCID5o至约6.0TCID50剂量的活的弱毒胞内劳森菌。较佳地，该细菌/为疫苗EnterisoKDIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)中所包4舌的疫苗。根据另一方面，本发明涉及一种给较佳为幼仔猪的幼年动物接种疫苗对抗胞内劳森菌感染的方法，其包含下列步骤对所述幼年动物在年龄在10天与26天之间、更佳为年龄在12天与21天之间、甚至更佳为年龄在15天至21天之间且最佳为年龄在19天至21天之间时开始施用或给幼年动物在26日龄之前、较佳为年龄在16至26天之间、更佳为年龄在18至24天之间、更佳为年龄在19至22天之间且最佳为年龄在21天时的幼年动物施用有效剂量的胞内劳森菌抗原，其中该幼年动物为胞内劳森菌及抗-胞内劳森菌母体抗体双阴性的。根据另一方面，本发明亦涉及使用有效量的胞内劳森菌抗原用于制备药物(较佳为疫苗组合物)的新新医疗用途，所述药物用于年龄在10天与26天之间、更佳为年龄在12天与21天之间、甚至更佳为年龄在15天与21天之间且最佳为年龄在19天与21天之间或年龄在26天之前、较佳为年龄在16至26天之间、更佳为年龄在18至24天之间、更佳为年龄在19至22天之间且最佳为年龄在21天时的幼年动物(较佳为幼仔猪)的疫苗接种。根据上文所描述医疗用途的另一方面，胞内劳森菌抗原选自由活的弱毒胞内劳森菌、胞内劳森菌死菌或一或多种胞内劳森菌的亚单位组成的组。较佳地，该胞内劳森菌抗原为活的弱毒胞内劳森菌。更佳地，给该幼年动物施用约3.0TCID5o至约6.0TCIDso的剂量的活的弱毒胞内劳森菌。制造包含胞内劳森菌抗原的疫苗组合物在现有技术发展水平中是常用的且为熟练技术者所知。举例而言，本领域熟练技术者能够知道可包含在该组合物中的额外组分(亦参见Remington，sPharmaceuticalSciences.(1990).第18版MackPubl"Easton)。专业人员可使用已知的可注射、生理学上可接受的无菌溶液。对于制备肠胃外注射或灌注的现成可用(ready-to-use)溶液而言，可容易地获得诸如盐水或相应的血浆蛋白溶液的等张水溶液。该等疫苗组合物可以冻干态或千燥制剂形式存在，其可在使用之前在无菌条件下(例如作为组配试剂盒)直接用已知的可注射溶液来重建。此外，本发明的免疫原性及疫苗组合物可包括一或多种兽用(veterinary-acceptable)载体。如本文所用，"兽用载体"包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣(coating)、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂及其类似物。"稀释剂，，可包括水、盐水、葡萄糖(dextrose)、乙醇、甘油及其类似物。其中等渗剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱性盐，等等。如本文所用的"佐剂"可包括氢氧化铝及磷酸铝，例如QuiIA、QS-21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)等皂香类，油包水乳液，水包油乳液，或水包油包水乳液。该乳液可特别基于下列物质轻质液态石蜡(lightliquidpara伤noil)(欧洲药典型)；诸如角鲨烷或角鲨烯的类异戊二烯油；得自烯烃尤其是异丁烯或癸烯的低聚反应的油；含有直链烷基的酸类或醇类的酯类，尤其是植物油类、油酸乙酯、二-(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三-(辛酸/癸酸)甘油酯或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯类，尤其是异硬脂酸酯类。油与乳化剂组合使用以形成乳液。该等乳化剂较佳为非离子表面活性剂，尤其为脱水山梨糖醇酯、二缩甘露醇酯(例如无水甘露醇油酸酯)、乙二醇酯、聚乙二醇酯、丙二醇酯，及油酸、异硬脂酸、蓖麻酸或羟基硬脂酸的酯类，该等酯类任选是乙氧基化的酯类，及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其为Pluronic产物，尤其是L12I)。参见Hunter等人TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Stewart-Tull编，D.E.S.)。JohnWiley及Sons,NY,第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine15:564-570(1997)。(其教示及内容以引用方式并入本文)。举例而言，可能使用M.Powell及M.Newman所编的"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach",PlenumPress,1995的第147页上所描述的SPT乳液及同一本书第183页上所描述的乳液MF59。(其内容引入本文做参考)。佐剂的另一实施方案为选自丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物及顺丁烯二酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物为交联的丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物，所述聚合物尤其与糖类或多元醇类的多烯基醚类(polyalkenylethers)交联。此等化合物以术语卡波姆(carbomer)而知名(Phameuropa第8巻，第2期，1996年6月)。本领域技术者亦可参考美国专利第2，909，462号，其描述该等与多羟基化合物交联的丙烯酸聚合物，所述多羟基化合物具有至少3个、较佳为不超过8个羟基，其中至少三个羟基的氬原子一皮具有至少2个碳原子的不饱和脂肪基团取代。较佳的基团为彼等含有自2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、丙烯基及其它烯系不饱和基团。该等不饱和基团本身可含有诸如曱基的其它取代基。该等产物特别适合以卡巴浦尔(CarbopoI)(BFGoodrich,Ohio,美国)为名称出售。所述产物与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中，可提及卡巴浦尔974P、934P及971P。最佳为使用卡巴浦尔971P。在顺丁烯二酸酐与烯基衍生物的共聚物中，有共聚物EMA(Monsanto),其为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物。此等聚合物在水溶解产生酸性溶液，其将被中和，较佳中和至生理pH值，以产生佐剂溶液，该佐剂溶液中将加入免疫原性的、免疫学的或疫苗的组合物自身。其中，更合适的佐剂包括(但不限于)RIBI佐剂系统(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGA)、SAF-M(Chiron，EmeryvilleCA)、单磷酸类脂A、阿夫立定(Avrkiine)月旨类-胺佐剂、来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素(重组的或其它的)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽。较佳地，以每剂约100(ig至约10mg的量添加佐剂。甚至更佳地，以每剂约100昭至约10mg的量添加佐剂。甚至更佳地，以每剂约S00吗至约5mg的量添加佐剂。甚至更佳地，以每剂约750叱至约2.5mg的量添加佐剂。最佳地，以每剂约lmg的量添加佐剂。疫苗组合物可进一步包括一或多种其它免疫调节剂，诸如白细胞介素、干扰素或其它细胞因子。疫苗组合物亦可包括庆大霉素(Gentamicin)及硫柳汞(Merthiolate)。虽然熟练技术者可容易地确定可用于本发明范围中的佐剂及添加剂的量及浓度，但本发明预期的组合物包含自约50吗至约2000昭佐剂及较佳为约250昭/ml剂量的疫苗组合物。在另一较佳实施方案中，本发明预期的疫苗组合物包含自约l昭/ml至约60)ig/ml的抗生素及更佳为少于约30昭/ml的抗生素。15以任何常用的方式、最佳为经口灌服给动物、较佳为哺乳动物且更佳为猪施用疫苗。待施用的剂量将视特定状况而定，但在任何情况下，其为足以诱发对抗回肠炎的保护性抗体或细胞介导的免疫反应的量。根据本发明的另一方面，以一个剂量或多次施用用于幼年动物(较佳为幼仔猪)的疫苗接种的胞内劳森菌疫苗。可在最初疫苗接种之后以2至4周间隔施用1或2次活的或死的疫苗。对于经减毒的活疫苗而言，一剂为较佳的。较佳地，如上文所述在年龄为16至26天、更佳为年龄在18至24天、甚至更佳为年龄在19至22天且最佳为年龄在21天时进行，或在年龄为10天与26天之间、较佳为年龄在12天与21天之间、甚至更佳为年龄在15天与21天之间且最佳为年龄在19天与21天之间开始进行第一次或单次施用。若需要或必需第二次施用，则在第一次施用疫苗之后约1至约4周进行第二次施用。根据另一方面，在任何先前疫苗接种的施用之后隔3至12个月进行再次疫苗接种。较佳为在6个月至一年基础上完成随后疫苗剂量的施用。实施例下列实施例为本发明较佳实施方案的代表。应理解不应将本文中任何内容视为对本发明全部范畴的限制。实施例l此实施例评估劳森菌疫苗在产自经劳森菌接种及未经接种的母猪的三周龄仔猪中的功效，确定对母猪接种疫苗是否导致干扰母体免疫而阻止仔猪对疫苗接种的反应，该结果藉由用有毒力的纯培养物攻击经接种及未经接种的仔猪之后疾病诱发率的降低来测量。用于测量功效的主要研究参数为肉眼观察及显微镜检看到的回肠及结肠损伤。此外，此实施例评估劳森菌疫苗在对怀孕第二及第三阶段的母猪以单剂量及多次施用时的安全性。材料及方法在盲法(blinded)研究中，将16头健康、怀孕且劳森菌血清阴性的母猪随机分成A和B这2组，每组8头母猪。A组在第-55、-35天及-14天经口灌服3剂EnterisolIleitisB3903,以试图在分娩之前诱发高水平的母体免疫。B组母猪在分娩之前接受安慰剂，作为阴性对照。这些母猪首先喂以未加药的市售孕期曰粮(ration)，之后转变为未加药的哺乳期饮食。努力使所有母猪具有相同的受孕及分娩日期，但分娩时间仍有偏差(10天)。为防止多次疫苗接种及攻击天数不同带来的差异，将分娩日期的中值确定为实验第O天。在疫苗接种时(第21天)，本研究的疫苗及攻击部分中所用的所有仔猪为21士5日龄。首先给仔猪喂食未加药的断奶初期日粮(starterration),接着喂食未加药的哺乳期曰粮(nurseryration),然后喂食未加药的生长肥育期日粮(grow-fmishration)。在实际出生日、7日龄及14日龄采集猪的血清学样品，以确保精确测量母体抗体(如果有的话)。在母猪分娩之前采其血清。此外，在第22天对母猪进行尸检，藉由肉眼观察来评估其回肠及结肠组织的病理状况，藉由PCR来评估其回肠、结肠、肠系膜淋巴结及扁桃体，藉由PCR来检测死产的猪，藉由记录分娩当日活产(live-born)、死产(stillborn)或干尸化(mummy)的猪来评估该等母猪的一冩产仔率(reproductivelitterperformance)。分娩之后(在研究的第21天)，将100头健康仔猪以窝(litter)隔开，再随机分配到6个处理组中，各组在整个研究期间分开圈养。将经过接种的母猪(A组)所产的仔猪随机分配到处理组l-3。将未经接种的母猪(B组)所产的仔猪随机分配到处理组4-6。在第21天，处理组1及4(每组各20头仔猪)直接经口灌服2ml剂量(lx105。1ogK)TCID5o/剂)的Enteriso1IleitisB3903疫苗。处理组2及5(每组各20头仔猪)直接经口灌服一剂2ml剂量的安慰剂。处理组3及6(每组各IO头仔猪)不接受治疗，作为严格对照(strictcontrol),以验证该猪源对劳森菌感染的易感性。在疫苗接种之三周后(研究的第42天)，处理组l、2、4及5中的被测仔猪藉由胃饲法接受一剂IOm剂量(lx1073og,。TCID5。/剂)的有毒力、低传代、纯培养、劳森菌异源分离物N101494而受到攻击。然而，任何其它感染性的野生型或低传代型胞内劳森菌分离物都可用作攻击细菌。在研究的第63天(攻击的三周后)，对所有处理组(l-6)实施安乐死，尸检，藉由肉眼观察和显微镜检来分析PPE损伤。确定EnterisolIleitisB3903疫苗在仔猪中抗异源、有毒力的纯培养物攻击的效力时，主要标准是，利用肉眼观察及显微镜检来评估回肠及结肠的损伤，从而观察损伤的进展。研究结束时，评估回肠、回肠/盲肠连接处、结肠的切片中肉眼可见的损伤。根据肠损伤的严重程度对其分等级，另从该组织的任何受染部位采集样品来进行PCR、IHC及H&E分析。损伤的严重程度由回肠内壁(kububgoftheileum)的粘膜增厚程度来确定。损伤分值0表示无粘膜增厚、水肺、粘膜隆起(ridges)/折叠、或明显的浆膜网状化的迹象。损伤分值l表示轻微增厚，包括粘膜中有小隆起/折叠、粘膜壁有轻微水肿、及在一些情况中有充血。损伤分值2是指中度增厚及/或发炎。其表现为，粘膜中显著的深度隆起/折叠、粘膜壁的中度水肿、浆膜表面的网状化、及在一些情况中的充血。损伤分值3表示严重增厚及/或发炎，其表现为粘膜中严重及深度隆起/折叠、粘膜壁的中度水肿、浆膜表面的网状化、及在一些情况中有充血。损伤分值4表示严重增厚及/或发炎及/或见血。此损伤分值表现为粘膜中严重及深度隆起/折叠、粘膜壁的中度水肺、浆膜表面的网状化、在一些情况中为充血、及有带血的内容物及/或血块。最后，损伤分值5表示坏死，其表现为粘膜表面的严重损伤，以致出现坏死，或在一些情况中，整个粘膜表面因损伤严重而脱落或分离。由劳森菌引起的显微镜检损伤是PPE特有的。该疾病的组织病理损伤包括上皮增生，尤其在明显不存在杯状细胞的粘膜隐窝中的上皮增生。通常在粘膜隐窝中正在增殖的上皮细胞内发现劳森菌。将约2-4cm长的回肠切片放于福尔马林缓沖液中，用苏木精-伊红染色(H&E)及IHC染色进行组织检验。H&E染色检出劳森菌感染所致隐窝增生，而IHC染色利用抗劳森菌单克隆抗体的特异性来证实这种细菌的存在、以及受染组织中由显微镜检观察到的损伤进展。抗劳森菌单克隆抗体特异性检测劳森菌完整细胞，这是藉由靶向所有劳森菌分离物都有的外膜蛋白来实现的。这种单克隆抗体来自苏格兰爱丁堡大学(UniversityofEdinburg,Scotland)研究人员开发的杂交瘤细胞抹VPM53。劳森菌的存在、及回肠切片IHC染色所确定的显微镜检损伤严重程度用下述分值来评分分值O表示未发现增殖性肠细胞(损伤)，分值l表示轻微的病灶性损伤，分值2表示中度的扩散性损伤，分值3表示重度的扩散性损伤。IHC评分系统对劳森菌的存在进行如下评分分值0指不存在该菌，分值l指该菌少量、局灶性(focal)存在，分值2指该菌中等量、扩散性存在，分值3指该菌大量、扩散性存在。第二个衡量标准是，临床症状的观察结果，粪便拭子及组织的劳森菌PCI^佥测，日增重均值(ADWG)，以及，因仔猪暴露于劳森菌所致的血清阳转(IFAT)。每日健康观察始于研究开始之日，直至每一动物被攻击之日。自攻击之日(第42天)至终止日的前一日(第62天)，每天对包括腹泻、行为及身体状态在内的临床健康参数进行评分。该分值反映疾病的严重程度。对于腹泻而言，分值l表示正常粪便，分值2表示无血的半固体粪便，分值3表示水样但无血的粪便或黑色粪便，分值4表示微染血的(blood-tinged)稀便或成型便。行为分值l表示正常行为，分值2表示轻微至中度抑郁行为(独自站立)，分值3表示严重抑郁或伏卧(recumbent)行为。身体状态分值l表示正常身体状态，分值2表示轻度至中度消瘦(gaunt)的身体状态，分值3表示严重消瘦的身体状态。在本研究的第-55，-35，-14，21,28,35,42，49，56及63天，用ldtisPCR(f-PCR)测试粪便拭子，评估劳森菌经粪便排出的情况。粪便拭子用PCR进行测试，以确定粪便中是否存在劳森菌DNA。当本研究在第63天结束时，获得每一被测动物的新鲜组织切片。对第63天的回肠、结肠、扁桃体及肠系膜淋巴结，用IleitisPCR(t-PCR)和组织学评估来定性分析组织中的劳森菌含量。所述PCR由Jones等人开发，其利用两个寡核苷酸引物(各20个碱基对)的特异性自劳森菌基因组DNA产生319bp的片段。此等引物靶向先前确定的劳森菌特异性的基因组DNA序列。PCR期间产生的DNA片段与回肠炎阳性及回肠炎阴性DNA提取物及PCR^应对照物进行比较，以确认"阳性"或"非阳性"结果。所述阳性DNA提取物对照是，劳森菌完整细胞及受感染的McCoy细胞的lx磷酸盐緩冲液(PBS)溶液(200(il/管)。所述阴性DNA提取物对照是，未感染的McCoy细胞的lxPBS溶液(200pl/管)。IleitisPCR反应对照物是从细胞培养收获物(劳森菌+McCoy细胞)中纯化得到的劳森菌基因组DNA，而阴性对照物是不含RNA酶的水(Amresco，Solon,Ohio)。劳森菌DNA阳性的被测样品产生与两种IleitisPCR阳性对照物(提取物对照及反应对照)相同大小的DNA片段(319bp)，而阴性样品不产生此大小的片段。用ISO-QUICKDNA提取试剂盒(ORCAResearch,Inc.,Bothell,Washington)从每一种被测样品获得DNA提取物。用PCR结果来确定，以EnterisolIleitisB3903接种的仔猪及/或以劳森菌异源分离物N101494攻击的仔猪中劳森菌的排出情况。在疫苗接种日(第21天)、攻击日(第42天)及研究结束日(第63天)称重，计算每一处理组的日增重均值(ADWG)。对每一组，比较接种疫苗后及攻击后的ADWG。体重用电子称重杆秤系统(Weigh-Tronix，Weigh-Tronix,Inc.,Fairmont,Minnesota)确定，在每次使用前及使用后，用合乎标准的测试砝码来校准。用间接荧光抗体试验(IndirectFluorescentAntibodyTest,IFAT)检测被测动物血清中的抗-劳森菌抗体。用真空采血管(vacutainertube)耳又静脉全血，具体是，对处在本研究第-55、-35天、-14天的母猪采血，对所有0、7及14曰龄的所有被测动物采血，及在本研究的第21、28、35、42、49、56及63天采血。使血液凝结，之后离心，取血清并冷冻。接着用IFAT筛选所述猪血清中的抗劳森菌IgG分子。抗劳森菌抗体附在劳森菌完整细胞的外膜抗原上，完全覆盖该菌，而该菌则固定在96孔微滴板各孔底部。然后加入抗-IgGFITC-标记的(tagged)第二抗体偶联物，以结合各孔内的任何IgG-抗原复合物。此等结合FITC的复合物在紫外光下发出绿色荧光。阳性的被测样品有多个亮绿色的小弯曲杆，象是劳森菌或含多个劳森菌的受感染McCoy细胞。IFAT阴性的被测样品显示McCoy细胞的灰暗(暗淡)绿色背景。用所述IFAT结果来观察接种疫苗及/或接受毒力攻击的组中的血清阳转变化，从而指示被测动物暴露于劳森菌的情况。对本研究的第21天施用给被测仔猪的每一疫苗剂量的代表性样品进行丁CIDso终点检定。将接种疫苗和进行攻击之前及之后获得的平行5份代表性被测样品，用添加了Ham，sF12的Dulbecco改良型必需培养基(Dulbecco'sModifiedEssentialMedia)(DMEMF12)稀释十倍(10"至1(T6),所述培养基还含有5。/。热灭活的新生牛血清(NBS)(JRHBiosciences,Lenexa,Kansas)。检测所述稀释样品，以确定每一被测样品中的劳森菌活菌量。计算接种疫苗前后及攻击前后的平行5份样品的平均滴度，将其乘以给予各仔猪的被测物质的体积，从而确定出每剂的总logIO劳森菌。根据接种或攻击的前后平均滴定结果(2个滴度)，确定接种或攻击的总平均滴度(logwTCIDso/剂)。对各个处理组进行比较，具体是，分析疫苗接种后和攻击后的ADWG数据、临床分值、血清阳转率(IFAT)、定植情况(colonization)(t-PCR)、粪便排出情况(f-PCR)、肉眼可见的损伤、及用免疫组织化学(Imunohistochemistry,IHC)经显微镜检观察到的损伤的进展。3头仔猪(1头来自第1组，2头来自第5组)在接种疫苗后、研究结束前死亡。对第l组的该仔猪进行劳森菌感染分析，确定死亡原因是高水平大肠杆菌引起的休克/败血病。第5组的两头死仔猪具有劳森菌感染典型的严重肉眼损伤及显微镜检损伤，估计死亡是劳森菌造成的。结果本研究中所收集的粪便及血清样品的评估显示A组或B组母猪在其粪便或在回肠或结肠中均无可检测的劳森菌。A组母猪在研究期间至少一个时间点于8头动物中有5头具有可检测的IFAT滴度。同期的B组母猪均无可检测的IFAT滴度。此等数据汇总在下表l中。表l:母猪数据对母猪的处理肉眼可见的回肠损伤肉眼可见的结肠损伤组织PCR(回肠/结肠/MLN/扁桃体)IFA活产猪均数/窝A-接种组0/80/80/85/89.4B-未接种组0/80/80/80/87,6对所有母猪进行尸检，评估劳森菌感染典型的肉眼可见的损伤。但无一母猪显示有肉眼可见的损伤或t-PCRi全测为阳性。尽管在怀孕的第2及第3个三月期均施用了疫苗，但在临床实验期间，所有母猪都无异常的总体健康观察结果的记录。A组母猪与B组母猪的分娩结果亦非常类似，分别有平均9.4及7.6头活产仔猪。A组母猪每窝平均产1.8只死产猪，无干尸或分娩死亡的猪。B组母猪每窝平均产0.9头死产、O.l头干尸及0.1头分娩时死亡的猪。此等死产猪的诊断评估显示，其为劳森菌阴性，且在正常生育损失范围内。血清学结果与预计的一样，即未经接种的母猪保持血清阴性，而A组中发现一些血清阳性猪。A组母猪每窝产猪数高于未接种的对照组。此结果显示，疫苗接种方法或接种物并无负面影响。此数据在上表1中汇总。对每一被测动物在研究结束时其回肠及结肠中与PPE有关的肉眼可见的损伤进行评估并评分，来确定肉眼可见的仔猪损伤进展。第1组及第4组的仔猪的最低回肠分值分别为0.16及0.15。此等数据无显著差异，它们表明接种过的母猪和未经接种的母猪所产的猪中的疫苗功效。第2组及第5组的回肠损伤分值分别为0.85及2.35。此等数据有显著差异(P0.05)，并表明母猪接种疫苗确实提供了一定程度的母体保护(第2组)，而未感染的动物对毒力攻击是敏感的(第5组)。第4与第5组亦具有显著不同的回肠分值(P0.05)，它们表明所述疫苗在未感染的接种仔猪中的功效。第1与第2组的回肠分值亦有显著差异(P<0.05),表明对劳森菌阳性母猪所产的猪接种疫苗确实提供了超过母体免疫力的显著益处(P0.05)。由回肠样品得到的阳性动物百分比(阳性数/组总数)有相同趋势及显著性。第5组的猪80。/。发现回肠损伤。而第1及4组的猪只有不到16%发现回肠损伤。关于肉眼可见的结肠损伤分值及阳性动物百分比，仅在第4及第5组之间由显著差异(P〈0.05)。在各个处理组之间不存在其它显著差异。严格对照(第3及第6组)的回肠及结肠中未发现肉眼可见的损伤，藉此证实本研究是有效的。此测试的结果在下表2中提供。表2:各处理组中猪的肉眼可见的损伤分值汇总第1及第2组的比较有显著差异(P0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>第1及第4组的比较有显著差异(P0.05)。'第2及第5组的比较有显著差异(P0.05)。第4及第5组的比较有显著差异(PO.Q5)。f不包括在实验方案所指出的统计分析中的组。用IHC及H&E方法评估仔猪的显微镜检损伤进展。在研究结束时(第63天)收集扁桃体、肠系膜淋巴结、末端回肠及结肠的2-4cm切片，将其置于10%緩冲福尔马林中，以备IHC分析。IHC染色未在任何处理组的研究结束时的扁桃体切片中检测到劳森菌。第5组的20份肠系膜淋巴结样品有2份检测到劳森菌。所有其它组中的所有其它肠系膜淋巴结样品为阴性，且肠系膜淋巴结测试在组间无显著差异。第1及第4组分别有显微镜检回肠分值0.35及0.15,且差异不显著。第5组有最高显微镜检回肠分值2.42,与第2及第4处理组相比有显著(PO.05)差异。此证明，第2组有一定程度的母体免疫力，且这种疫苗确实在未感染的经接种猪中产生功效。对有显微镜检损伤的回肠样品百分比进行评估，结果显示，第5组中95%的猪有损伤，且此组再次显著(PO.05)不同于第2及4组。第5组的平均显微镜检结肠分值为1.35,且此组中60。/。的猪为劳森菌损伤阳性表现。此结果显著(P〈0.05)高于第2及第4处理组。这些肉眼资料在表3中汇总。表3:研究结束时猪组织中显微镜检损伤的汇总<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>d第2与第5组的比较有显著差异(P〈0.05)。e第4与第5组的比较有显著差异(P0.05)。f不包括在实验方案所指出的统计分析中的组。*1样品有严重坏死及脱皮，不可藉由IHC读取。为了用f-PCR评估劳森菌经仔猪粪便排出的情况，每周收集每一处理组中所有被测动物的粪便拭子，用IleitisPCR测试本研究的第21、28、35、42、49、56及63天是否存在胞内劳森菌。在第21、28及35天，所有处理组的仔猪为胞内劳森菌f-PCR阴性。第l组的仔猪第42天经检测为f-PCR阳性，且保持阳性直至第63天，这期间所述仔猪有11-16%为测试阳性。第2组仔猪第49天经检测为f-PCR阳性，且保持阳性直至第63天，这期间所述仔猪有5-25%为测试阳性。第4组仔猪第42天经检测为f-PCR阳性，且保持阳性直至第63天，这期间所述仔猪有5-25%为测试阳性。第5組仔猪第49天经检测为f-PCR阳性，且保持阳性直至第63天，这期间所述仔猪有15-72%为测试阳性。整个测试期间，第3及第6组仔猪一直为f-PCR阴性。对上述数据进行卡方分析，结果表明，在第42天第4组与第5组之间、在第63天第2组与第5组之间、及在第63天第4组与第5组之间有差异显著((P0.05)。粪便排出数据汇总在表4中。从粪便排出胞内劳森菌的情况汇总组<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>'藉由卡方检验进行第2与第5组的比较，有显著差异(P0.05)。:藉由卡方检验进行第4与第5组的比较，有显著差异(P0.05)。不包括在实验方案所指出的统计分析中的组。在研究结束时(第63天)藉由PCR测试末端回肠、结肠、扁桃体及肠系膜淋巴结的组织切片来评估猪中的劳森菌组织定植(t-PCR)。严格对照(第3及第扁桃体样品为t-PCR阴性的。在5-10%仔猪测试阳性的情况下，仅第5组结肠及肠系膜淋巴结样品为阳性的。来自第1及第2组仔猪的回肠样品分别具有20。/。及25。/。的t-PCR阳性试验结果。相比而言，来自第4及第5组的仔猪分别具有5。/。及45。/。的t-PCR阳性试验结果。所有来自第3及第6组的回肠样品为t-PCR阴性的。卡方分析表明处理组之间在扁桃体、肠系膜淋巴结或结肠样品中无显著差异。在第5组在试验中具有最高阳性百分比的情况下，第4与第5组的回肠的t-PCR结果存在显著差异(P0.05)。来自此测试的数据汇总在表5中。表5:猪处理组中的胞内劳森菌组织定植的汇总(P曰性/组总数)组对组的处理扁桃体t-PCR肠系膜淋巴结回肠t-PCR结肠t-PCR阳性t-PCR阳性阳性阳性1母猪A-仔猪接种0/20a0/20a4/200/20a2母猪A-仔猪给安慰剂0/20a0/20a5/200/20a3母猪A-严格对照0/10f0/10f0/10f0/10f4母猪B-仔猪接种0/20a0/20al/20e0/20a母猪B-仔猪给安慰剂0/20a2/20a9/20el/20a6母猪B-严格对照0/10f0/10f0/10f0/10f'藉由卡方检验进行全面比较，无显著差异。濕由卡方检验进行第4与第5组的比较，有显著差异(P0.05)。不包括在实验方案所指出的统计分析中的组。自疫苗接种时间(第21天)至施用攻击(第42天)、至研究结束(第63天)、及在攻击(第42天)与研究结束(第63天)之间计算ADWG。在疫苗接种日(第21天)，在处理组之间不存在显著差异。类似地，疫苗接种之后自第21天至第42天不存在显著差异。该结果证实疫苗为安全的且如藉由增重所测量的确不影响表现。毒力攻击之后，第1与第4组、第2与第5组及第4与第5组之间在ADWG方面存在显著(PO,05)差异。第5组在研究中具有为0.88磅/日(lb/day)的最低ADWG。自疫苗接种经攻击直至研究结束时的时期的卡方评估亦显示第1组与第4组及第4组与第5组之间的显著差异(P0.05)。下文在表6中汇总此数据。表6:猪的日增重均值(ADWG)组对组的处理第21天的ADWGADWG总ADWG平均初始(第21-42天)(磅)(第42-63天)(磅)(第21-63天)(磅)重量(磅)接种攻击接种直至攻击1母猪A-仔猪接种14.4a0.90a0.99c0.94c2母猪A-仔猪给安慰剂14.0a0.88a1.01d0/943母猪A-严格对照14.8f1.01f1.14f1.08f4母猪B-仔猪接种14.2a0,97a1.12c'e1.05c'e25<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>藉由卡方检验进行全面比较，无显著差异。c藉由卡方检验进行第1与第4组的比较，有显著差异(P0.05)。d藉由卡方检验进行第2与第5组的比较，有显著差异(P〈0.05)。e藉由卡方检验进行第4与第5组的比较，有显著差异(P〈0.05)。f不包括在实验方案所指出的统计分析中的组对于每一动物自攻击之日(第42天)至研究结束(第63天)在每日基础上记录该等仔猪的临床观察结果。计算临床分值以获得平均日临床分值，其反映处理组中由于毒力劳森菌分离物攻击导致的疾病严重性及持续时间。分值3表示正常、健康的动物。在毒力攻击之后在任一组中几乎没有除"3，，以外的临床分值，且任何处理组之间无显著差异。每一处理组的平均临床分值汇总在下文表7中。表7:猪的平均临床分值<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>全面比较差异不显著。f不包括在实验方案所指出的统计分析中的组。在每周自所有被测动物收集的血清样品上进行经由IFAT测试是否存在抗-劳森菌IgG抗体的仔猪血清学评估。在第O、7、14、21、28、35、42、49、56及63天收集血清样品。在攻击之前，第l-3组中的某些仔猪为抗劳森菌血清阳性的，藉此证实在母猪疫苗接种期间诱发一些母体免疫。反之，第4-6组中的所有仔猪为抗劳森菌血清阴性的。与第4组相比，第l组中的仔猪在分娩日及在第7及14天具有数目显著较多(PO.05)的血清阳性动物。在实验第63天第l组中的仔猪亦显著不同(PO.05)于第2组。与第5组相比，第2组在第7、14及28天具有数目显著较多(PO.05)的血清阳性动物。在第l-3组中母体抗体检测持续到直至第28天。在第35天之前第l-3组中的所有动物为血清阴性的。毒力攻击之后，在第l、2、4及5组中检测到某些血清阳转。在试验的第56天注意到第1与第4组之间存在显著差异(P0.05)。各组的血清阳转率汇总在下文表8中。表8:猪处理组中的血清阳转率的汇总<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>藉由卡方检验进行全面比较，无显著差异。b藉由卡方检验进行第1与第2組的比较，有显著差异(PO,05)。c藉由卡方检验进行第1与第4组的比较，有显著差异(PO.05)。d藉由卡方检验进行第2与第5组的比较，有显著差异(P<0.05)。f不包括在实验方案所指出的统计分析中的组。'在此处理组中出现动物死亡。讨论"此研究评估劳森菌疫苗在母猪怀孕第二及第三阶段中在高滴度、多次施用的疫苗(其用于诱发高水平的母体抗体反应)接种之后的安全性。藉由IHC、t-PCR或如藉由经接种的母猪中任一者的整体病理学所测得的劳森菌感染指征，在该等组织中检测不到劳森菌。此外，在经接种的母猪的任一头中检测不到排出劳森菌的粪便。最后，经接种的母猪生产了数目较多的活的健康仔猪。因此，所有迹象表明该疫苗在怀孕动物中为安全的。此综合研究包含劳森菌阳性(A组)及劳森菌阴性(B组)母猪，随后其所分娩的仔猪经过接种(第1及4组)或未经接种(第2及5组)。第3及6组中的仔猪用作严格对照且不接受任何治疗或暴露于攻击。藉由比较仅单一变量变化的处理组(仔猪疫苗接种或母猪疫苗接种)进行数据分析并随后得出结论。未感染的仔猪中的疫苗功效证实猪来源为易感的且对此等仔猪的疫苗接种提供对抗毒力异源物攻击的功效。此需要第4组(经接种)与第5组(未经接种)的比较(二组均由劳森菌阴性母猪所生)。该数据显示第4组在平均整体回肠分值、平均整体结肠分值、粪便排出(f-PCR)、回肠的组织定植(t-PCR)及ADWG方面显著不同于第5组(P〈0.05)。作为边注，此研究亦证实EnterisolIleitisB3903在单次施用之后提供有效的保护。其进一步确认且证实试验中所用猪的来源易接触到异源物毒力攻击。第2组(A组母猪所产仔猪)与第5组(B组母猪所产仔猪)的比较允许评估得自疫苗接种母猪的可能的母体保护。数据显示第2組与第5组之间在平均整体回肠分值、平均肠系膜回肠及结肠分值、粪4更排出(f-PCR)、ADWG及血清学方面存在显著差异(P0.05)。此数据亦显示存在某些形式的母体免疫，其在出生后至少六周提供对抗接触毒力攻击的保护。该研究进一步测量血清学(IFA)且发现自分娩之日直至第28天可在第l-3组中检出血清阳性仔猪。令人感兴趣的注意到，在攻击之日，所有组中的所有猪用IFA检定都为血清阴性的，可能暗示此试验中所用的此种检定的确不提供对抗有毒力的劳森菌暴露的免疫性的准确指示。给定作为粘膜病原体的病原体的性质及无毒力活疫苗的用途，可能某些形式的细胞免疫性可为一种因子。此研究的另一目标为确定在面临母体免疫的情况下能否藉由在常规推荐或做法之前接种仔猪来完成有效的疫苗接种。对于此测试而言，确认疫苗接种16-26日龄的仔猪是有效的。藉由比较第1组(A组母猪所产的经接种的仔猪)与第2组(A组母猪所产的未经接种的仔猪)进行此确认。用于比较的主要参数为与回肠及结肠相关的肉眼(整体)及显微镜检损伤。第1及第2组的平均整体回肠分值分别为0.16及0.85,其为显著差异的(P〈0.05)。第1及第2组的具有肉眼可见的损伤的回肠样品的百分数分别为16%及45%,且此数据亦为显著差异的(P0.05)。第l组仔猪亦有数字上(虽然非统计学)差异的较低的整体结肠分值、较低回肠及结肠的显微镜检损伤及较少的组织定植(t-PCR)。总而言上文所讨论的其它组比较中除一个以外的所有均以单一研究变量(母猪疫苗接种或小猪疫苗接种)而非二者为基础。第1与第5组之间的比较要求面对两个研究变量(母猪疫苗接种及仔猪疫苗接种)评估数据。注意到第2与第5组在某些参数上有统计学差异(PO.05)且在若千其它参数方面数值较低。可合理地假设如第2与第5组一样，第1与第5组在大多数研究参数上有统计学差异。总之，第1与第5组经确定在包括整体回肠分值、显微镜检回肠分值及显微镜检结肠分值的主要研究参数的许多参数上有显著差异(P0.05)。最后，第3与第6组(严格对照组)证实猪关于劳森菌的状态且证实猪来源。此等组不包括在统计分析中。所测量及评估的所有参数均证实此等动物为劳森菌阴性的，只有来自第6组的一头仔猪的显微镜检分值是例外，被记录为劳森菌阳性的。基于来自所有其它参数的累积数据，相信此例外的数据为一个错误。权利要求1.对动物增强抗胞内劳森菌感染的保护力的方法，其包括如下步骤在所述动物出生后26天内给该动物施用有效剂量的胞内劳森菌疫苗。2.权利要求l的方法，所述胞内劳森菌疫苗包含胞内劳森菌抗原。3.权利要求1或2的方法，所述有效剂量在每剂中包含约103到约109的胞内劳森菌。4.权利要求l-3任一项的方法，该有效剂量在每剂中包含3.0TCID5o到约6.0TCID5o的胞内劳森菌。5.权利要求l-4任一项的方法，该动物为猪。6.权利要求l-5任一项的方法，所述疫苗被施用给出生后16-26天的所述动物。7.权利要求l-6任一项的方法，所述疫苗被施用给出生后19-22天的所述动物。8.权利要求l-7任一项的方法，所述疫苗包含单剂量的所述疫苗。9.权利要求l-8任一项的方法，所述施用为经口灌药。10.权利要求l-9任一项的方法，其进一步包括在该动物的母亲怀有该动物时给该母亲接种所述疫苗的步骤。11.权利要求10的方法，在怀有该动物的怀孕第二或第三阶段接种所述疫苗。12.权利要求10或11的方法，在该母亲分娩该动物之前多次接种疫苗。13.权利要求12的方法，该母亲接受三次疫苗接种，且该第一次疫苗接种发生在分娩该动物之前50到60天之间。14.权利要求13的方法，该第二次疫苗接种发生在分娩该动物之前30到40天之间。15.权利要求13或14的方法，该第三次疫苗接种发生在分娩该动物之前10到20天之间。16.权利要求10-15任一项的方法，所述疫苗接种使用高剂量的胞内劳森菌抗原。17.权利要求16的方法，所述高剂量包含比劳森菌抗原的常规疫苗用量至少高三倍的胞内劳森菌抗原量。18.权利要求10-17任一项的方法，所述抗原选自由修饰的胞内劳森菌活菌、胞内劳森菌死菌、胞内劳森菌一或多种亚单位、及其组合组成的组。19.权利要求18的方法，所述修饰的胞内劳森菌活菌选自由ATCCPTA-4926、ATCC55783、及其组合组成的组。20.对仔猪增强抗回肠炎的保护力的方法，其包括给怀有此仔猪的母猪接种有效剂量的抗胞内劳森菌感染的疫苗，所迷接种发生在怀孕第二或第三阶段。21.权利要求20的方法，所述疫苗在分娩该仔猪之前的60天以内接种。22.权利要求20或21的方法，所述母猪在分娩该仔猪前多次接种疫苗。23.权利要求20-22任一项的方法，该母猪接受三次疫苗接种，且该第一次疫苗接种发生在分娩该仔猪前50-60天之间。24.权利要求23的方法，该第二次疫苗接种发生在分娩该仔猪前30-40天之间。25.权利要求23或24的方法，该第三次疫苗接种发生在分娩该仔猪前10-20天之间。26.权利要求20-25任一项的方法，所述疫苗接种使用高剂量的胞内劳森菌抗原。27.权利要求26的方法，所述高剂量包含比劳森菌抗原的常规疫苗用量至少高三倍的胞内劳森菌抗原量。28.权利要求20-27任一项的方法，所述抗原选自由修饰的胞内劳森菌活菌、胞内劳森菌死菌、胞内劳森菌一或多种亚单位、及其组合组成的组。29.权利要求28的方法，所述修饰的胞内劳森菌活菌选自由ATCCPTA-4926、ATCC55783、及其组合组成的组。30.有效量的胞内劳森菌抗原在制备药物中的用途，所述药物用于以有效剂量的疫苗对幼年动物进行疫苗接种，以有效增强抗胞内劳森菌感染的保护力，所述幼年动物是10-26日龄的动物。31.权利要求30的用途，该幼年动物包括仔猪。32.权利要求30或31的用途，所述有效剂量的每剂含约103到约109的所述细菌。33.权利要求30-32任一项的用途，所述有效剂量的每剂包含3.0TCID50至iJ纟勺6.0TCIDso。34.权利要求30-33任一项的用途，该幼年动物为仔猪。35.权利要求30-34任一项的用途，所述疫苗是给出生后16到26天的幼年动物施用的疫苗。36.权利要求30-35任一项的用途，所述疫苗是给出生后19到22天的幼年动物施用的疫苗。37.权利要求30-36任一项的用途，所述疫苗接种包括施用单剂量的所述疫苗。38.权利要求30-37任一项的用途，所述疫苗接种包括经口灌药施用所述疫苗。39.权利要求30-38任一项的用途，所述药物还包括在该幼年动物的母亲怀有该幼年动物时给该母亲接种的药物。40.权利要求39的用途，所述疫苗在怀有此幼年动物的怀孕第二或第三阶段接种。41.权利要求39-40任一项的用途，该母亲在分娩该幼年动物之前多次接种疫苗。42.权利要求39-41任一项的用途，该母亲接受三次疫苗接种，且该第一次疫苗接种发生在分娩该幼年动物之前50-60天之间。43.权利要求42的用途，该第二次疫苗接种发生在分娩该幼年动物之前30-40天之间。44.权利要求42或43的用途，该第三次疫苗接种发生在分娩该幼年动物之前10-20天之间。45.权利要求39-44任一项的用途，该疫苗接种使用高剂量的胞内劳森菌抗原。46.权利要求45的用途，所述高剂量包含比劳森菌抗原的常规疫苗用量至少高三倍的胞内劳森菌抗原量。47.权利要求46的用途，所述抗原选自由修饰的胞内劳森菌活菌、胞内劳森菌死菌、胞内劳森菌一或多种亚单位、及其组合组成的组。48.权利要求47的用途，所述修饰的胞内劳森菌活菌选自由ATCCPTA-4926、ATCC55783、及其组合组成的组。全文摘要本发明提供一种用于增强对抗回肠炎的保护力的经改良的疫苗接种方法。该等方法提供对幼年动物，较佳为10与26日龄之间的仔猪的疫苗接种，对怀孕母猪在怀孕第二或第三阶段的疫苗接种，及此等方法的组合。在分娩之前可用重复及/或高剂量的劳森菌抗原对该等怀孕母猪进行接种。文档编号A61K39/02GK101262882SQ200680025941公开日2008年9月10日申请日期2006年7月17日优先权日2005年7月15日发明者杰里米·J·克罗尔,迈克尔·B·鲁夫申请人:贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司