专利名称：：稳定化的病毒样颗粒和表位展示系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫学和多肽工程学的交叉领域，具体涉及经基因工程改造的嵌合多肽和其超分子组装体，用来减少核酸结合、增强稳定性和展示免疫原性表位。
背景技术：
：尽管病毒颗粒通常由一个或多个不同的多肽组成，但它们能比其分离的成份触发更强的免疫反应。对B细胞反应，已知病毒颗粒免疫原性的一个重要因素可为表面表位的重复性和顺序。多数病毒颗粒表面包含以整齐的、对称准晶体方式的多肽，展示出规则排列的表位，从而使B细胞的表位-特异性免疫球蛋白充分地交联[Bachmann等，(1996)Immuno1.Today17:553-558]。这种B细胞免疫球蛋白的表面交联是强激活信号，直接诱导细胞循环进程和IgM抗体的产生。另外，这种激发的B细胞能激活T辅助细胞，该细胞进一步诱导B细胞中产生IgM至产生IgG抗体的转换，产生长寿B细胞记忆——任何接种的目标[Bachmann等，(1997)Ann.Rev.Immunol.15:235-270]。病毒结构甚至与自身免疫疾病中抗抗体的产生有相关性，并作为对病原体自然反应的一部分[见Fehr等，(1997)J.Exp.Med.185:1785-1792]。因此，病毒颗粒上有序和重复排列的抗原为高度免疫原性的，因为其可直接激活B细胞。除强的B细胞反应之外，病毒颗粒也诱导细胞毒性T细胞反应(免疫系统的另一个重要武器)。细胞毒性T细胞对清除非细胞病变病毒如HIV或乙肝病毒和消灭肿瘤是特别重要的。细胞毒性T细胞不识别天然抗原，但识别其与MHC类别I分子相关的降解产物[Townsend等，7(1989)Ann.Rev.Immunol.7:601-624]。巨噬细胞和树突状细胞能吸收和处理外源性病毒颗粒(而不是其溶解的、分离的成份)，将产生的降解产物呈递给细胞毒性T细胞，使其活化和增殖[Kovacsovics画Bankowski等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:4942-4946;Bachmann等，(1996)Eur.J.Immunol.26:2595-2600]。一些新疫苗策略利用病毒固有的免疫原性。这些方法中的一些集中于病毒颗粒的微粒特性；例如见Harding等，(1994)J.Immunol.153:4925-33，其中7〉开了包含抗原包衣乳胶珠的疫苗；Kovacsovics-Bankowski等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:4942-4946,其中公开了包含氧化铁珠和抗原的疫苗；美国专利第5,334,394号(Kossovsky等)，其中公开了以抗原包衣的颗粒；美国专利第5,871,747号(Gengoux-Sedlik)，其中公开了表面载有一个或多个以共价键结合于其上的多肽的合成多聚体颗粒；用非共价键包衣的颗粒，其中至少部分覆盖此颗粒表面，至少一种生物学活性成份与所述包衣的颗粒连接(见，例如，WO94/15585)。病毒样颗粒(VLP)为由一种或多种类型的多个多肽分子以有序的和几何规则方式构建的结构。由于包含不止一种分子，VLP可称为超分子。VLP无病毒基因组，因此无感染性。VLP可通过异源表达大量生产，并可容易地纯化。VLP的几何形状通常类似源(source)病毒颗粒的几何形状，因此对如下讨论的多数情况而言，几何形状有二十面体或伪二十面体对称。VLP因其结构特性、容易大规模制备和纯化，以及其无感染性特性，已在疫苗生产领域得以开发应用。VLP的实例包含以下病毒的衣壳或核衣壳多肽的自组装乙肝病毒[WO92/11291,Ulrich，等,(1998)VirusRes.50:141-182]、风渗病毒[Warnes，等，(1995)Gene160:173-178]、辛德毕斯病毒[Tellinghuisen等，(1999)J.Virol.73:5309-5319]、丙肝病毒[Baumbert(1998)J.Virol.72:3827-3836]、轮状病毒[美国专利第5,071,651号，Sahara,等和第5,374,426号，Sahara等]、口蹄疫病毒[Twomey,等,(1995)疫苗13:1603-1610]、诺瓦克病毒[Jiang等，Science(1990)250:1580-1583;Matsui等，J.Clin.Invest.(1991)87:1456-1461]、逆转录病毒[WO96/30523;美国专利第6,602,705号，Barnett等]、反转录转座子(retrotmnsposons)[侈'B口,Typolypeptidepl，inAl-Khayat等,(1999)J,Mol.Biol.292:65-73和美国专利第6,060,064号，Adams等]和人类乳头状瘤病毒[WO98/15631]。植物感染病毒衣壳多肽也在体外和体内自组装形成VLP[见，例如，马铃薯Y病毒，Jagadish等，(簡)J.Gen.ViroL72:1543-1550;紫花苜蓿花叶病毒(alfalfamosaic),Yusibov等,(1996)J.Gen.Virol.77:567-573]。病毒颗粒结构亚单位和其同源VLP下文称为"衣壳，，多肽。有许多衣壳多肽自组装形成非普通病毒粒子结构的结构的实例。例如，轮状病毒[Lepault等，(2001)EMBOJ.20:1498-1507]、乳头瘤病毒属和多瘤病毒[Schwartz等，(2000)Virology.268:461-470]衣壳多肽各自形成各种颗粒和管形结构，一些衣壳多肽甚至组装成有序的二维阵列，依赖于组装条件[Lane(1981)HandbookofPlantvirusInfectionsandComparativeDiagnosis,ed.Kurstak，E.(Elsevier/North-Holland,Amsterdam)pages334-376]。然而，这些组装均显示了衣壳多肽的排列中的几何学规律，易于使用X射线衍射分析、电子显微镜和其它方法观察。尽管这些病毒衣壳多肽的组装体通常包含超过约30个亚单位，但也有得自负链RNA病毒的更小的VLP组装体。环形VLP已被描述为包含大约9拷贝的流感A病毒核衣壳蛋白[Portela(2002)J.Gen.Virol.83:723-734]，环形的VLP包含10±1个拷贝狂犬病毒(rabies)核蛋白已描述于Iseni(2002)J.Gen.Virol.19:2909-2919。有义RNA烟草花叶病毒衣壳多肽自组装形成VLP，该VLP为两层圓盘结构(disks),包含34个拷贝的衣壳多肽(每层17个拷贝)。[Bhyravbhatla(1998)Biophys.J,74:604-615]。异源表位与衣壳多肽融合使VLP带有那些如上描述和本领域已知的表位。展示表位的其它多聚超分子结构也被公开，其目的同样是用作疫苗。例如，WO00/69907中Hill等公开了使用4吕伴蛋白七聚体(chaperoninheptamers)和双七聚体(doubleheptamers)，例如大肠杆菌的GroES和GroEL和同源物作为蛋白骨架，其中可插入异源多肽。该系统提供了另一超分子结构以多价递呈(presentation)插入的多肽，但未公开或提示除天然亚单位相互作用和排列外的高级结构和稳定化特征。杆形(Rod-shaped)病毒(例如，烟草花叶病毒)、可弯曲的(flexuous)病毒(例如，马铃薯X和Y病毒；埃博拉病毒)和可弯曲的病毒亚结构(例如，fflV、流感A和狂犬病病毒核衣壳)为螺旋的；它们均为辐射对称。因此几何规则组装体和结构不论球形还是二十面体均涵盖于术语"病毒样颗粒，，(VLP)中。实际上，管形结构，与二十面结构类似，已被Ghosh等证明在体内是有效的和保护性的免疫原，(2002)Virology302:383-392。全长病毒-衍生的衣壳多肽通常结合存在于表达衣壳多肽的细胞中的核酸。这反映衣壳多肽的自然生物学功能，即与病毒基因组相结合，包装并递送病毒基因组。自组装后，包含未改变的衣壳多肽的VLP，通常包含存在于表达衣壳多肽的细胞内的核酸，包括衣壳多肽信使RNA以及其它分子核酸[见例如，Iseni等，(1998)J.Gen.Virol.,79:2909-2919;Krol等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.96:13650-13655;和Yu等，(2001)J.Virol.75:2753-2764]。当VLP用作疫苗时，核酸结合是不需要的(与用作基因传递系统相反，如美国专利第5,869,287号，Price等)，因为不希望引入外来DNA或RNA至被免疫的动物或人。通常会携带这种外来核酸，并存在随之而来的异源表达。核酸结合通常与衣壳多肽的不连续碎片相关，可除去不连续碎片得到减少的或基本无核酸结合的衣壳多肽，[例如，Choi等，(2000)Virology270:377-385]。然而，在一些情况下，除去衣壳多肽的核酸结合域导致颗粒不稳定或妨碍颗粒组装，因为核心-核酸相互作用促进颗粒稳定性[Schmitz等，(1998)Virology248:323-331;—般而言，见Harrison(2001)"PrinciplesofVirusStructure(病毒结构的原理)"inFields'Virology,第4版。Lippincot,[Philadelphia]第53-86页，和其参考文献]。实际上，核酸对病毒颗粒的结构上的贡献是规定性的而不是个别性的，因此在不存在核酸的情况下通常需要补偿性特征来稳定VLP。为展示免疫原性表位而设计的VLP是本领域已知的，已从多种类型病毒的结构多肽设计出了多种VLP,包括感染细菌(噬菌体)、植物和动物的病毒，包括感染人类的病毒。Wolf等在WO96/30523中描述了使用HIV-1的改变的pr55Gag作为非感染性反转录病毒样颗粒载体用于呈递(presentation)免疫学重要的表位。Nagesha等已开发了用作表位载体的嵌杯样病毒(1999)Arch.Virol.144:2429-2439。Porta等综述了得自植物感染病毒用作表位载体的用途，见(1998)Rev.Med.Virol.8:25-41。Brown等(2002)Intervirology45:371-380描述了细菌感染病毒作为表位载体的用途。示例性肽表位的非封闭性列表提供于下文的表1。然而，这种工程化的或改变的衣壳多肽自组装能力会有所降低[见例如，Schmitz等，Virology(1998)248:323-331]。当用电子显微镜分析时，由内部带有插入(片段)的嵌合乙肝病毒(HB)衣壳多肽组成的VLP,其通常的结构有序性低于缺少插入的异源表位的VLP[SchSdel等(1994)J.Exp.Med.，180:1037-1046]。在一些情况下，异源表位与C末端截短的HB衣壳多肽的连接有显著的去稳定化作用杂合的VLP不能在衣壳多肽表达后回收[Schodd等(1994)Infect.Immunol.,62:1669-1676]。因此，许多工程化的HBVLP如此不稳定，以至不能形成，纯化时裂解甚至不可回收或显示非常差的稳定性特征,使其疫苗开发存在问题。这种不稳定性也被Fehr等用噬菌体Q-beta加以证明[(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95:9477-9481]。因此，阻止颗粒组装的具体表位插入也阻止插入表位的免疫原性识别，增强疫苗设计中VLP的稳定性的重要性。Ulrich等，Adv.VirusRes"vol.50(1998)AcademicPress,(纽约)第141-182页报导了C-末端截短和插入外来序列的乙型肝炎衣壳多肽(HBc)的颗粒稳定性缺失。结果是，促进或重建VLP稳定性，而放弃全长衣壳多肽的核酸结合能力并允许结合异源表位，这种结构特征将在疫苗开发中大有益处。这通过示例性抗原传输系统很好理解，该系统使用乙型肝炎和其它肝炎病毒的衣壳多肽。同样在此论文中，Ulrich等提到3个使用这些嵌合体于人类疫苗中潜在的、待解决的问题。第一个潜在的问题是不慎将嵌合疫苗中核酸转移至接种宿主。第二潜在的问题是先前存在的免疫性对HB的干扰。第三个潜在的问题涉及也可经受长期储存的完整嵌合颗粒的重复制备要求。Pumpens等，(1995)Intervirology,38:63-74报导了形成自C-末端截短的HB衣壳多肽的VLP比形成自全长蛋白的VLP不稳定。当用电子显微镜分析时，C-末端截短的HBc嵌合体(HBc序列包含插入)的结构有序性通常比缺乏异源表位的颗粒的差[Schodd等，(1994)J.Exp.Med.,180:1037-1046]。在一些情况下，插入异源表位至C-末端截短的HBc颗粒有显著的去稳定作用，使杂合颗粒不能在异源表达后回收[Schodel等(1994)Infect.Immunol.,62:1669-1676]。因此，许多嵌合HBc颗粒如此不稳定，以至于在纯化时分离成不可收回或显示非常差的稳定性特征，使其在疫苗开发中存在问题。稳定性降低通常认为是工程VLP用作疫苗的主要障碍，解决方法也进行了探索。例如，Peabody(1997)Arch,Biochem.Biophys.347:85-92显示了带有插入肽的噬菌体MS2衣壳多肽的自组装是有缺陷的。然而，在该具体情况下，随着两个修饰的衣壳多肽通过基因工程改造(并因此，共价地)连在一起而使自组装得以恢复，融合两个这样的修饰衣壳多肽稳定二聚体衣壳内相互作用。由于VLP结构和蛋白相互作用的多棒法，这种方法未被推广；不是所有VLP具有二聚体结构，因此要求的衣壳多肽间相互作用会被这种蛋白-蛋白融合破坏。甚至当从二聚体构建VLP时，这种头至尾的共价结合造成的结构限制可妨碍正确的组装。自结合肽序列存在于所谓的亮氨酸拉链蛋白。示例性的亮氨酸拉链序列存在于已知的GCN4、jun、fos、c-Myc、Max和C/EBP蛋白中。这些序列中，GCN4序列研究的较为深入，研究表明其形成平行二聚体，然而GCN4的突变体已显示形成平行二聚体、三聚体和四聚体[Harbury等，(1993)Science，262:1401-1407]。这些肽，通过其自组装，已被用于功能性替换天然的自身相互作用蛋白区域和/或蛋白间相互作用。在一种情况下，鉴别了高度保守的细胞质区域在离子通道组装中的作用，因为其被亮氨酸拉链功能性置换[Zerangue等，(2000)Pro.Nat.Acad.Sci.97:3591-3595]。在另一种情况下，亮氨酸拉链肽在HIVp55(gag)结构多聚蛋白的缺失变体中，可取代与核衣壳及其与衣壳蛋白的相互作用相关的组装活性；也就是说，取代由内部核衣壳蛋白组织的使外部核衣壳蛋白有序的相互作用[见，例如，Accola等，(2002)J.Virol.74:5395-5402和Zhang等，(1998)J。Virol,72:1782-1789]。最近，辛德毕斯病毒核衣壳蛋白的N-末端螺旋区域被肝病毒中的二聚体-形成而不是三聚体-形成亮氨酸拉链功能性替换。[Perera等，(2003)J.Virol.77:8345-8353]。所有上述报导使用亮氨酸拉链作为功能性定义所替换区域活性的工具。这些论文既未公开或表明使用自结合肽如上所述来稳定VLP，也未公开或表明经这种方法稳定的VLP可用于表位传输和/或免疫接种。使用其它自结合肽来生成相对小的人工超分子结构也是本领域已知的。因此，Th0gerson等在WO98/56906中公开了产生携带衍生自四粘联蛋白蛋白家族的结构元件的融合多肽的三聚体的系统。此系统产生稳定的同源-或异源-二聚体和三聚体，但不产生更高级的结构。另外，四粘联蛋白三聚化区域富含赖氨酸，可加强而不是减少核酸结合。WO96/37621中，Pack等公开了哺乳动物p53、血小板因子4、COMP或组蛋白衍生的多聚化区域产生新的具有通用结构(功能域l)-(多聚化域)-(功能域2)的融合多肽的同源-和异源-四聚体和五聚体的用途。然而，此出版物未说明用多聚化区域稳定高级结构或预先存在结构的用途。另外，这些结构(除COMP夕卜)有抗-平行排列，即，多个多聚化域在多聚体中相互呈头-尾关系排列。WO02〃4795中，DeFilette等公开了包含与流感抗原多肽融合的亮氨酸拉链自组装域的重组、多价流感疫苗。其中，衍生自天然低聚蛋白复合物抗原与寡聚化域融合。未提示此寡聚化域有稳定源蛋白复合物或任何高级超分子结构(例如VLP),或结构大于所讨论的四聚体的作用。相反地，寡聚化区域据称能够推动寡聚化并控制寡聚化程度。每个其它本文讨论的公开出版物的情况也是如此。另一示例性自结合肽为流感A病毒M2蛋白。流感A病毒M2蛋白是小的离子通道蛋白，在膜表面自聚合成同源-四聚体。四聚体通过非必需的分子间二硫键而稳定，该键在位置17和19的半胱氨酸间形成[Holsinger等，(1991)Virology183:32-43]。尽管发现当结合至VLP或自结合肽时，M2蛋白的此区域在各种重组流感疫苗中可用作抗原[见例如Neirynck等，(1999)Nat,Med.,5(10):1157-1163和WO99/07839，和W002〃4795,DeFilette等和其引用],但先前未见报导其有利于稳定VLP,并且相当出人意料的是，这种稳定化不需要相应于位置17和19之间的二石危键。自结合肽不需从已知或天然蛋白衍生，相反可以是首次得到鉴别的(t/e",)。[Zhang等，(1999)Curr.Biol.9:417-420]。当引入合适的金属离子时，自组装肽也可设计成能在溶液中组装。[Ghadiri等，(1992)J.Am.Chem.Soc.114:4000-4002]。例如，具使用单字母表示的序列的N-乙酰化的(在下列序列中标为"Ac-")肽14Ac-G-Ij-A-Q-K-Ij-1i-EHQ-K-A-Ii-A-CONH2(SEQ工DNO:1)在合适的金属离子存在时，自组装形成平行的四-螺旋。N-乙酰化肽的序列为Ac-G-E-L-A-E-Q-K-L-E-Q-A-L-Q-K-l-A-CONH2(SEQIDNo:2)自组装形成平行的三-螺旋[美国专利第5,408,036号(Ghadiri)]。其它本领域已知的自结合肽可依据其具体特性选择，包括期望的免疫原性、源微生物、优选多聚体状态和结合强度。例如，当将疫苗(或存在其它连接的表位)给予人类时，人类蛋白的自结合肽能使对自结合肽的免疫反应最小化。如下文所公开的，本发明提供一种解决VLP衍生疫苗相关问题的方法，并提供的这种疫苗基本不含偶然发生的核酸结合和不稳定性，同时保留VLP使用上的优点，例如生产的简便和灵活性、佐剂-样免疫原性增强作用。发明简述超分子组装体例如病毒样颗粒(VLP)的稳定性，和由此而来的材料的用途，例如作为疫苗，可通过将自结合肽加入到病毒蛋白(多肽)链亚单位中而得到很大程度的改善。这种解决VLP不稳定性的方法是通用的，可用于稳定各种衍生自感染动物、植物、真菌和细菌的病毒的VLP。精心设计的稳定化方法也对稳定其它大的、重复的和对称的超分子组装体有用。可稳定化的非病毒VLP(超分子组装体)的实例包括真核生物和原核生物的已知的丙酮酸脱氢酶的60亚单位二十面酶复合体[Lessard等(1998)EMBOJ.258:491-501;Stoops等(1997)J.Biol.Chem.272:5757-5764;Wagenknecht等(1991)J.Biol.Chem.266:24650-24656]和原核生物的2,4-二氧四氢蝶啶(lumazine)合酶。[Fischer等(2003)Eur.J.Biochem.270:1025-1032;Mortl等(1996)J.BiolChem.271:33201-33207]。与病毒衍生的VLP—样，这些二十面颗粒对疫苗或其它免疫原中表位呈递和传输有用。本文中各种语法形式的短语"超分子组装体"用来涵盖所有病毒相关(或衍生的)VLP;即，由病毒基因组或人工改变的病毒基因组编码的VLP,和相似的非病毒来源的颗粒。术语"VLP"通常用于形成自病毒基因或人工改变的病毒基因的颗粒，但也交互用于超分子组装体，因为其较为常见并易于使用。本发明精心设计的嵌合超分子组装体(或VLP)包含多个多肽亚单位，该亚单位包含连接的自組装肽序列。因此，精心设计的嵌合体包含(i)第一多肽部分，自组装形成包含至少约9亚单位的有序、重复、超分子结构，共价连接于(ii)第二肽部分，包含长度约15-约80个氨基酸残基的异源肽。第二部分肽，当未如此共价连接于第一部分，自组装形成平行多聚体，如下文所讨论。精心设计的嵌合多肽形成的颗粒比形成自第一多肽的颗粒更稳定，该第一多肽除缺少共价连接的第二多肽部分自结合肽序列外，序列的其他部分相同。其稳定性可使用分析型分子排阻色谱法洗脱测定。精心设计的嵌合超分子组装体(VLP)通过免疫接种哺乳动物宿主优选地诱导对一种或多种超分子组装体多肽序列(融合于异源多肽超分子组装体的多肽序列或连接的半抗原)的免疫原性。更准确地说，本发明精心设计的超分子组装体包含嵌合多肽，其本身包含(i)第一多肽部分，自组装形成包含至少约9多肽亚单位的有序、重复、超分子结构，和(ii)共价连接的第二肽部分，包含长度约15-约80个氨基酸残基的多肽(即优选对第一部分多肽异源的)。第二部分肽，(a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH7,0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，(b)当在至少10pmd/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或(c)为自组装的流感AM2多肽的细胞外域，条件是第二部分不是N-末端结合于第一部分即HBc多肽的包含0、1或2个半胱氨酸的细胞外M2区域。因此，在优选的实施方案中，第二部分肽定义为(a)或(b)或(c)之一。第二部分肽特别优选如(a)和(c)中所定义。当以有效量给予哺乳动物时，嵌合多肽优选引发对一种或多种VLP多肽序列(对VLP多肽序列或连接的半抗原异源的多肽)的免疫反应。在一个优选的实施方案中，本发明精心设计的嵌合多肽包含(i)第一部分，具有全部或部分病毒衣壳蛋白的序列，或为病毒衣壳蛋白(如下文所定义)的衍生物，共价连接于(ii)第二部分，包含长度约15-约80个氨基酸残基的肽。第二部分的肽，(a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH7.0、浓度为约1Ommol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，(b)当在至少10lamol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或(c)为自组装的流感AM2多肽的细胞外域，条件是第二部分不是N-末端结合于第一部分即HBc多肽的包含0、1或2个半胱氨酸的细胞外M2区域。当以有效量给予宿主动物时，嵌合多肽优选引发免疫反应。在一些实施方案中，第一部分衍生自或相似于病毒的衣壳多肽，病毒选自感染动物病毒、感染植物病毒、感染真菌病毒和感染细菌病毒。在一些实施方案中，发明包含接头残基、异源表位或两者都包含于第一多肽部分的嵌合多肽。在另一实施方案中，发明涉及自嵌合多肽形成的有序的、自组装超分子颗粒。附图简述在构成本公开一部分的图形中，图l,显示在图1A和图1B两个组图中提供了6个已公开序列(来自6个病毒的哺乳动物HBc蛋白)的序列比对。第一人类病毒序列(SEQIDNO:3)为a戸亚型，由Galibert等公开于(1983)Nature,281:646-650;第二人类病毒序列(SEQIDNO:^，为Ww亚型，由Ono等公开于(1983)NucleicAcidsRes.,11(6):1747-1757;第三个人类病毒序列(SEQIDNO:5)，为advv2亚型，由Valenzuela等公开于AnimalVirusGenetics,Field等，eds"AcademicPress,NewYork(1980)第57-70页；第四个人类病毒序列(SEQIDNO:6)，为a力w亚型，公开于Pasek等(1979)Nature,282:575-579;第五个序列(SEQIDNO:7)，为woodchuck病毒，公开于Galibert等(1982)J.Virol"41:51-65;第六个哺乳动物序列(SEQIDNO:8),为groundsquirrel,公开于Seeger等(1984)J.Virol"51:367-375。图2图示使用了编码一种流感AM2外部区域(位置2-24)版本的DNA,在该外部区域中半胱氨酸突变为丝氨酸(CV-1895,V7.M2e(2C>2S)(SEQIDNO:9)，该DNA克隆入位于工程的、截短的包含前149HBc残基的HBc基因(HBcl49)的C-末端的EcoRI和Hindlll位点。图3显示命名为CV-1048的颗粒的分析型分子排阻色语法洗脱特征图。组装的颗粒的洗脱体积为约8mL，其中低级结构洗脱于后续峰。样品于20mM磷酸钠、pH6.8和0.02%叠氮化纳中在Superose6HR(Pharmacia)上运行。在280nm的吸光度见纵坐标，体积(mL)见横坐标。图4显示了CV-1895颗粒如图3显示的分析型分子排阻色谱法洗脱特征图。此处，稳定化的颗粒洗脱时间为约7分钟，基本未观察到低级结构。图5，根据美国专利第6,231,864号，示例说明了反应方案(方案1)，该方案显示两个反应序列(1)使用磺基-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基曱基)-环己烷1-曱酸酯(磺基-SMCC)形成活化的载体来将半抗原悬挂(pendent)连接于病毒样颗粒(VLP)，然后(II)将巯基-结尾的(半胱氨酸-结尾的)半抗原连接于活化的载体而形成缀合颗粒。VLP被描述为有单个悬挂氨基的盒子(为了清楚地说明该图)，而巯基-结尾的半抗原则被描述为末端为SH基团的链。本发明具有一些好处和优点。本发明的一个好处是自嵌合衣壳多肽(包含自结合肽部分)形成的病毒样颗粒比缺少自结合肽部分的相似序列的颗粒在含水组合物中的储存稳定性更高。本发明的某些实施方案的优点是，一些嵌合衣壳多肽表现出天然病毒样颗粒的自组装特征，并且表现出非常强烈的的倾向，即基本不出现核酸与那些天然病毒样颗粒间的结合。因为二十面体酶复合体不适于包被病毒基因组，所以衍生自二十面酶复合体亚单位的VLP不需要特别修饰就缺少与核酸的结合力。本发明的用途通过能够形成至少二聚体-、三聚体-和五聚体-自结合肽而增强。二十面病毒和VLP有2-、3-和5-倍(fold)对称性，因此VLP稳定化可通过增强2-倍(二聚体)、3-倍(三聚体)和/或5-倍(五聚体)衣壳多肽相互作用而优化。四聚体有2-倍对称性，六聚体有2-和3-倍对称性。然而，不希望被理论束缚，2-、3-和5-倍对称性的二十面体提供给本领域技术人员稳定2-、3-或5-倍衣壳多肽内相互作用的选择，反之亦然。非限制性的自结合肽示例列表提供于下文表2中。本发明的另一个好处是形成自嵌合衣壳多肽的病毒样颗粒可显示出极好的B细胞和T细胞免疫原性。本发明VLP的另一个优点是制备收率高于缺少自结合肽部分的相似颗粒。发明的另一个好处是带有连接的表位的精心设计VLP比缺少自结合肽部分的相似缀合物通常更有免疫原性。这种增强的免疫原性归性。发明的另一个优点是可使用衍生自大范围病毒的衣壳多肽。发明的另一个优点为自结合肽部分与VLP序列的连接提供了解决VLP稳定性问题的通用方法。19本发明的另外的好处和优点在如下公开中对本领域技术人员是显而易见的。定义表位表位定义为通常通过结合于抗体的互补位或结合于T细胞受体从而可以被免疫识别的物质，包括小分子例如在免疫学领域一般称为半抗原(例如，二硝基苯酚，药物例如烟碱或可卡因)的小分子，以及B-细胞表位、T-细胞表位、抗原、抗原决定簇、单克隆抗体结合位点、肽、低聚糖、核酸和其它本领域已知的化学和生物学实体。表位不同于衣壳多肽和自结合肽。嵌合多肽嵌合多肽为不会自然发生的多肽，通常包括一个或多个连接部分例如其它多肽、肽、接头残基或部分，和/或其它分子。本文中多数情况下该术语指多肽，所述多肽包含通过共价键连接的第一和第二多肽部分。本文中多数情况下该术语进一步指一种来源(source)或遗传背景(geneticheritage)的多肽通过肽4建连接至另一个来源或遗传背景的多肽，该肽键通过基因工程蛋白编码序列表达。然而如其它地方提及的，本领域技术人员可以利用现有技术在体外完全通过非生物化学全合成或部分合成来合成嵌合多肽。VLPVLP为病毒样颗粒的缩写，指有序的、重复的通过自组装形成的超分子结构和复合物，通常为病毒衣壳多肽。在一些情况下，VLP不是得自病毒衣壳多肽；即，无病毒衣壳蛋白氨基S银列，但是得自(有其序列)另一自組装多肽例如丙酮酸脱氢酶E2多肽和2,4-二氧四氢蝶p定合酶多肽。VLP可以包含也可以不包含任何核酸成份。得自病毒衣壳多肽的VLP包含至少9个衣壳多肽。得自其它自组装多肽的VLP包含至少约30个亚单位。VLP形态包括二十面体、二十面或类似-二十面对称的颗粒、球形的、管形的和丝状的结构，和平面排列。与天然病毒一样，VLP显示至少一些区域带有2-倍、3-倍、5-倍或》文射对称。可通过多种技术容易地观察这种局部或整体对称，包括X射线衍射和电子显微镜(无论是否有另外的影像分析)。VLP,如此处所定义，明确包括不类似于最终衍生衣壳多肽的病毒或颗粒的形态学和组装体。衣壳多肽衣壳多肽为多肽，显示出能够自组装形成VLP。本文精心设计的衣壳多肽可为病毒颗粒的天然多肽亚单位、非病毒颗粒多肽亚单位(如下讨论的)，或非天然衍生物。病毒颗粒的结构性蛋白亚单位和其同源VLP包含衣壳多肽。衣壳多肽可包括另外的部分例如自结合肽、接头序列或表位，因此也为嵌合多肽。衣壳多肽不同于和相对异源于表位和自结合肽。当连接至异源表位时，衣壳多肽自身优选不亏1发免疫反应，但是也可以引发(butmayneverthelessdoso)。术语"衣壳多肽"的含义中明确包括天然和人工的病毒颗粒结构蛋白类似物和衍生物。衣壳多肽包括本领域已知的肽如核壳体蛋白和核心蛋白。衣壳多肽不仅指存在于源病毒或VLP的多肽。衣壳多肽明确包括其它不是病毒来源的自组装多肽，例如丙酮酸脱氢酶酶复合体的E2亚单位，和2,4-二氧四氢蝶咬合酶多肽，每种均形成包含60个亚单位的二十面对称颗粒。衍生的衣壳多肽有至少约80%氨基酸序列相同于病毒衣壳多肽序列。不同的是，当与一种或多种天然衣壳多肽同源区域(从其衍生出衍生物)比较时，精心设计的衣壳多肽可至多有约20%氨基酸残基发生取代。当序列在N-或C-末端为截短的，或包含一个或多个另外的残基或序列中的存在缺失，这些区域不计入取代百分比中，因为序列改变与天然衣壳多肽无同源序列。自组装在衣壳多肽和VLP中，自组装指在体内或体外，有或无人工干扰时，从衣壳多肽(或类似物)开始的病毒粒子或VLP组装。自組装也指从其它不是病毒来源(例如2,4-二氧四氢蝶咬合酶和丙酮酸脱氬酶酶复合体的E2亚单位)的形成颗粒的嵌合多肽形成有序、重复、超分子结构的组装。在自结合肽(下文讨论的)中，自组装指单个嵌合多肽在溶液中结合成多聚体，或当存在于溶液中时，形成至少约9个多肽亚单位的聚合体。嵌合多肽一般自组装为球状亚单位实体，拥有单个二级和三级蛋白结构并一起形成包含至少9个亚单位的孩t粒实体。自结合肽自结合肽连接于衣壳多肽，通过肽间相互作用来稳定颗粒内多肽相互作用。自结合肽包括这样的肽当以N-乙酰化肽形式存在，在pH7.0,浓度约10mmol/L的PBS水溶液中自发地聚在一起形成平行多聚体的肽；当存在于浓度至少10pmol/L溶液中，存在5-倍摩尔过量的可接受多价金属离子时，自组装形成平行多聚体的肽，和本公开中确定的能稳定VLP的约16至约24个氨基酸残基的流感M2蛋白细胞外域。自结合肽不同于并且相对异源于嵌合多肽和表位，尽管肽可包含一个或多个表位且被包含于嵌合多肽序列中。自结合肽优选不引发免疫反应，但是也可以引发。本文精心设计的自结合肽形成包含少于9个单元的平行多聚体，通常含有其作为多聚体会具有的结构，无论是二级和/或三级结构。另外，自结合肽相互结合而不形成肽间共价键。病毒术语"病毒"和病毒的分类学的使用依据第七次国际病毒分类学委员会^艮告，vanRegenmortel，M.H.V.ed.(SanDiego)学术会议2000。这样一来，不存在细胞外相对部分或水平转移性的物质就明确包括于其中，同理，噬菌体也包括于其中(例如，酿酒酵母的Tyl反转录转座子和L-A病毒，各自在体内形成颗粒，颗粒从不离开细胞感染其它个体细胞，但从母体转移至子代)。残基和氨基酸残基术语"残基"与短语氨基酸残基交换使用。所有本文确定的氨基酸残基为天然的或L-构型，除非特别指明为D-型。与标准多肽命名法一致，[J.Biol.Chem.,243:3557-59(1969)]，氨基酸残基的简写见下列对照表。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>稳定性当用于指超分子组装体(包括VLP)，稳定性指颗粒的结构和生物化学完整性。稳定性可直接测量，例如，通过分析型分子排阻色谱然后分析所得洗脱曲线特征、电子显微镜、天然和非天然凝胶电泳技术加各种检测方法学(包括染色和免疫检测、速率区带离心、核酸酶保护测定法(测定壳体化核酸超分子组装体(VLP))、光散射，或其它本领域已知的生物物理和生物化学技术。本发明的超分子组装体(VLP)是稳定化的，当超分子组装体(VLP)制剂中未组装的嵌合衣壳多肽的量减少至少约25%时(相对于其它部分相同的超分子组装体(VLP)制剂(作为整个嵌合多肽的分数)中的缺少连接的自结合肽的未组装衣壳多肽的量)。使用分析型分子排阻色谱，例如，未装配的衣壳多肽以慢速洗脱多肽的曲线下面积除以快速和慢速洗脱多肽两者的曲线下面积之和来测量。出现以下情况的时候，则认为该制剂是稳定化的超分子组装体未组装嵌合衣壳多肽(带有连接的自结合肽)占第一超分子组装体(VLP)制剂总体的比例比第二超分子组装体(VLP)制剂(除衣壳多肽缺少连接的自结合肽外，其它与第一相同)小至少约25%。大多数分析技术可对未组装衣壳多肽占超分子组装体(VLP)制剂总体的比例得出相同的定量结果。类似物如本文所用，肽或多肽类似物指与对照肽或多肽至少约50%相同的肽或多肽。类似物也指与对照肽或多肽类似的物质。核酸序列类似物编码肽或多肽，该肽或多肽至少约50%相同于对照核酸序列编码的肽或多肽。照这样，考虑到已知的基因编码冗余，类似物核酸不需有50%或更多序列相同于对照核酸，也不需除编码区域外有任何相似性。发明详述本发明提供由嵌合多肽组成的超分子组装体，所述嵌合多肽具有两个部分第一部分和共价连接的第二部分。不管第二部分是否存在，第一部分都会自组装成颗粒。第二部分包含长度约15至约80个氨基酸残基，优选约15至约35个残基的自结合肽序列。该肽a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，b)当在至少10(amol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或c)是流感AM2多肽的自组装胞外域，条件是M2肽第二部分不存在于作为第一多肽部分的HBc的N末端。嵌合多肽形成的有组织重复超分子结构比只从所述第一部分形成的结构更加稳定。也就是说，所精心设计的嵌合多肽所形成的颗粒，比在序列上其它方面相同但缺乏共价连接的自结合第二肽序列的多肽(即只有第一部分的序列的多肽)所形成的颗粒更加稳定(在本文别处定义)。在一些实施方案中，嵌合多肽基本上没有核酸结合特性，而在其它实施方案中，嵌合多肽能结合核酸。嵌合多肽或超分子组装体(VLP)可包括一个或多个连接的异源表位(半抗原或融合多肽序列)。为撰写方便起见，下文使用首字母缩略词VLP代表超分子组装体，除非用词上下文表明指的是一种或多种具体的病毒相关VLP。所公开的稳定化VLP和带有连接的异源表位的稳定化VLP，可面。本发明还通过将异源表位连接到具有自结合肽成分的衣壳多肽，来提供稳定化、有序、重复表位排列。在一个优选的实施方案中，本发明提供包含第一部分和第二自结合肽部分这两个部分的嵌合多肽组合物，所述第一部分能自组装成具有至少约9个多肽亚单位的有组织重复多肽超分子结构，其中这些部分通过至少一个共价键连接。在本发明的一些优选实施方案中，所述两个部分通过肽键连接。在这些实施方案中的一些中，嵌合多聚蛋白的第一部分与第二部分的肽键连接是这样发生的将编码第一部分的核苷酸框内融合到编码第二部分的核苷酸，然后将所得的多核苷酸在宿主细胞中表达，从而在宿主细胞中表达时形成融合多肽。在其它实施方案中，所述两个部分通过双功能连接剂作用于接头残基如赖氨酸和半胱氨酸而连接。合适的双功能试剂包括SMCC、MBS和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)等，它们在PierceBiotechnology,Inc.Rockford，IL的2001-2002商品目录中提到。双功能试剂通常包含能通过胺基团形成键的基团和能形成二硫键或石克醚4建的基团。巯基可以以N末端和/或C末端Cys残基形式来提供，或者通过使氨基官能团与2-亚氨基硫杂环戊烷或者3-(3-二硫吡咬基)丙酸或S-乙酰硫代乙醇酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来提供。在与S-乙酰硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA)反应后，用例如羟胺使SATA脱乙酰化产生游离-SH基团。在需要游离氨基的情况下，可通过遗传工程、蛋白质连接或其它方法来提供赖氨酸。a-氨基酸之外的氨基酸如卩-丙氨酸、Y-氨基丁酸和e-己酸也可用作接头。在一个优选的实施方案中，嵌合多肽的第二自结合肽部分连接到第一部分的N末端或C末端。在又一个优选的实施方案中，这样使自结合肽连接到第一部分的N末端或C末端将适当的核S臾序列进行遗传融合并共表达，使得嵌合多肽作为第一部分和第二部分的融合体表达，第一部分和第二部分通过肽^:共价连接。在另一个优选的实施方案中，第一部分在其N末端或C末端处或附近提供有适于连接自结合肽的接头残基。应指出的是，"第一部分"和"第二部分"的说法只是出于方^更起见。因此，在精心设计的嵌合多肽中，"第二部分"自结合肽可位于"第一部分"多肽前面，即在"第一部分"的N末端。在另一个实施方案中，嵌合多肽第一部分包含完整或截短形式的病毒衣壳多肽。在一些实施方案中，不计异源表位或异源表位的接头，所存在的第一部分的氨基酸残基序列与病毒衣壳多肽有大于约50%、优选大于约75%、更优选大于约90%、最优选大于约95%的同一性。因此，在第一部分包含病毒蛋白序列如乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白的残基1-149的情况下，第一部分中存在的序列与病毒序列有100%同一性。但是，残基1-149代表HBc的截短版本，因为缺少了残基150-183。能自组装成含有至少约9个多肽亚单位和显示上述与病毒衣壳多肽序列等位基因的同一性百分数的有组织重复超分子结构的第一部分，在本文中定义为病毒衣壳类似多肽序列。在本发明的更多优选实施方案中，嵌合多肽的第一部分是病毒衣壳多肽或病毒衣壳多肽的类似物，所述病毒可以是感染动物的病毒、感染植物的病毒、感染真菌的病毒或感染细菌的病毒。在优选的实施方案中，能形成VLP的病毒衣壳多肽是以下病毒科的成员的衣壳多肽或其类似物小RNA病毒牙牛(Pz'cowavzWt/ae)、嵌杯才羊病毒牙+(Ca//cz'vzW<iae)、才皮月篦病毒牙牛(JbgavzW(ifle)、黄病毒牙牛(F/aWWn'ciae)、5单状病毒科(i/2o^ov/r油e)、副粘病毒科(尸"ra，x謂'r油e)、正粘病毒科(Ow/zomyxoWn'dae)、呼肠孑瓜病毒；f牛(7eoWnV/ae)、逆4争录病毒-牛(iefrav/n.obe)、多瘤病毒科(Po(yomaWnWae)、乳头瘤病毒科(尸a/7〃/owav/n't/ae)、腺病毒科(v4c/e"ov/n.(iae)、乳头多玄病毒科(尸arpovavz,n'fibe)、嗜肝DNA病毒-牛(77e;a(iw(3VzW(iae)、罗达病毒一牛(AW"vzV油e)、四病毒科(re/rav/Wd—、番痴丛矮病毒科(7bw6wwW(iae)、虹豆花叶病毒牙牛(Cowov/n'dae)、雀麦花叶病毒-牛(Bro附ovzW(iag)、马铃薯Y病毒一牛(Po/)/v7W(iae)、丝形病毒牙牛(/"ov,/^/(ae)、光滑病毒科(丄ev/v/,油e)、微病毒科(Mfcrov/r油e)、假病毒科(尸化w^vzW^e)和球状真菌病毒科(rWWr/^e)。在其它优选的实施方案中，能形成VLP的病毒衣壳多肽是烟草花叶病毒属(7bkmoWms)、马铃薯x病毒属CPofejcvz'm)或芜菁黄花叶病毒属(7)^oWmy)病毒的成员的衣壳多肽或者这种病毒的衣壳的类似物。在其它优选的实施方案中，嵌合多肽的第一部分包含二十面酶复合物的能自组装、能形成二十面体的多肽。在一些优选的方面，第一部分包含丙酮酸脱氢酶复合物的E2亚单位。在其它优选的方面，第一部分包含2，4-二氧四氢蝶啶合酶多肽。就上述病毒衣壳氨基酸残基序列而言，在一些方面，笫一部分包含二十面酶复合物多肽的类似物，且不计异源表位或异源表位的接头，第一部分的氨基酸序列与二十面酶复合物亚单位多肽有大于约50%、优选大于约75%、更优选大于约90%、最优选大于约95%的同一性。在一些优选的实施方案中，嵌合多肽的第一部分基本上没有核酸结合特性。这里，在一些实施方案中，嵌合多肽的第一部分基本上没.有核酸结合特性且包含第一连接位点，带有第二连接位点的表位可通过一个或多个共价或非共价一建连接到该第一连接位点。其它实施方案可包括能结合核酸且还包含供表位连接的第一连接位点的嵌合多肽。被结合的核酸通常是在用以表达该蛋白质的生物体的细胞中原始存在的寡聚和/或多聚DNA和RNA物质。是存在核酸结合还是基本上没有核酸结合，可容易地通过比4史嵌合颗粒在水溶液中于280和260nm处测量时的吸光度(即280/260吸光度比)进行确定。被结合核酸在260nm处显示某个吸光度，在280nm处显示校对较低的吸光度，而没有结合核酸的蛋白质在260nm处吸光度相对较低，在280nm吸光度相对较高。因此，在残基位置150-183(或150-185)含有一些或所有富精氨酸序列的、能结合核酸的示例性重组表达嵌合乙型肝炎核心或衣壳(HBc)颗粒，显示出约0.8的280nm处吸光度与260nm处吸光度之比(280:260吸光度比)，而没有天然HBc的富精氨酸核酸结合区域的类似颗粒，如所含精氨酸残基或所含赖氨酸残基或所含相互靠近的精氨酸和赖氨酸残基少于四个的颗粒，或者从其天然或嵌合序列在大约HBc残基位置140至位置149终止的单体多肽嵌合分子组装而成的HBc颗粒，显示出约1.2至约1.6的280:260吸光度比。HBc多肽和/人HBc自組装的颗粒在本文中常常作示例性使用。本发明的基本上没有核酸结合特性的嵌合颗粒，显示出约1.2至约1.7、更通常约1.4至约1.6的280:260吸光度比。一个优选的实施方案精心设计了包含这样的多肽的稳定化VLP,该多肽的第一部分是如上所述的病毒衣壳多肽或其类似物，这个第一部分连接到包含异源自结合肽的第二部分。在另一个优选的实施方案中，本发明精心设计了这样的嵌合多肽的稳定化VLP，该多肽包含的第一部分是包含可连接上表位的接头残基的病毒衣壳多肽或其类似物，第二部分包含异源自结合肽。在又一个优选的实施方案中，本发明是包含这样的嵌合多肽的稳定化VLP，该多肽的第一部分是连接有异源表位的病毒衣壳多肽或其类似物，第二部分包含异源自结合肽。再一个优选的实施方案精心设计了这样的稳定化VLP,其第一部分包含在约氨基酸139至约位置165、优选至约156、更优选至约149(从N末端算起)发生截短的HBc多肽，第二部分包含上文所述的和下文作更详细描述的自结合肽。在本发明的另一个优选实施方案中，VLP第一部分包含或就是以下病毒的衣壳多肽的类似物MS2噬菌体、JC病毒、Tyl反转录转座28子、HIV、禽兽棚病毒(flockhousevirus)、松皇蛾Q病毒、雀麦花叶病毒、番茄丛矮病毒、芜菁皱病毒、HPV16、诺瓦克病毒、B19病毒、马铃薯X病毒、辛德毕斯病毒(sindbisvirus)、Physalismottle病毒、fd噬菌体、phiX174噬菌体、轮状病毒、烟草花叶病毒、豇豆花叶病毒、呼肠3瓜病毒、丙型肝炎病毒、麻渗病毒、流感A病毒、A，病毒、L-A病毒和脊髓灰质炎病毒。示例性和优选的能形成VLP的重组嵌合体包含长度最长为约570个氨基酸残基的乙型肝炎核酸(HBc)蛋白分子，该蛋白分子(a)含有HBc分子的N末端150个氨基酸残基中的至少约135个残基组成的序列，所述残基包括肽键结合的异源表位或供连接HBc免疫显性环中存在的缀合表位的异源接头残基，或者N末端150个HBc氨基酸残基中的至少约135个残基组成的序列，(b)含有长度为约15个至约35个氨基酸残基的C末端自结合序列，和(c)含有从HBc位置135至HBcC末端的至少5个氨基酸残基的序列。该自结合序列a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，b)当在至少10nmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或c)是流感AM2多肽的自组装胞外域。该嵌合分子含有不超过10%的HBc序列中的保守置换氨基酸残基。所述颗粒比从缺乏C末端自结合序列的但其它方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒更加稳定。所述颗粒优选自组装成基本上不会结合核酸的颗粒。本发明特别排除其中含0、1或2个半胱氨酸残基的M2多肽第二部分存在于HBc第一部分多肽的N末端的嵌合体。另一方面，特别优选所含HBc第一部分的C末端连接有含0、1或2个半胱氨酸的M2第二部分的嵌合体。在其它实施方案中，嵌合多肽的第一部分是丙酮酸脱氢酶复合体的能自组装的El多肽或其类似物，或者是能自組装的2,4-二氧四氢蝶咬合酶多肽或其类似物。自结合肽所精心设计的嵌合多肽的第二自结合肽部分是长度约15至约80个氨基酸、更优选约15至约35个氨基酸的序列。嵌合多肽的第二自结合肽部分当以N-乙酰化肽形式存在，在pH7.0、浓度约10毫摩尔/升的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体。在另一个优选的实施方案中，自结合肽当以N-乙酰化肽形式存在且提供有适当的金属离子时，会形成平行多聚体。在又一个优选的实施方案中，自结合肽是流感AM2蛋白的N末端约24个氨基酸。在另一个优选的实施方案中，嵌合多肽的第二自结合肽部分包含GCN4-pl[O'Shea等，(1989)5We"ce243:538-542]亮氨酸拉链肽。在另一个实施方案中，自结合肽部分包含工程改造的(engineered)亮氨酸拉链肽GCN4-H、GCN4-IL、GCN4-LI、GCN4-LV、GCM4-VL或GCN4-LL。[Harbury等，(1993)化/ewce262:1401-1407]。在另一个优选的实施方案中，自结合肽是软骨寡聚基质蛋白质(COMP)的五聚化肽。[Ozbek.(2002)/21(22),5960-5968]。在另一个优选的实施方案中，自结合肽是四臂粘联蛋白的右手螺旋四聚自结合序列。[Stetefeld(2000)躯&亂脇.7:772-776]。在另一个方面，自结合肽衍自人蛋白质序列。因此，例证性地说，自结合肽是选自Mad、Max、c-Myc、N-Myc、Li-Myc、AF4和USF的人蛋白质序列的亮氨酸拉链。[Canne等，(199"J!」m.CAem.Soc.117:2998和Blackwood等，(1991)5W置e251:1211-1217]。例证性的第二部分自结合肽的示例性氨基酸残基序列在下表I中列出，同时列出的还有它们各自的肽名称、序列编号和引文。表I自结合肽肽名称序列SEQIDNO引文GCplAc-RMKQLKDKVEEIjIjSKNym-BNEVAJRLKKLVGBRMaxYQYMRKNHTHQQDIDDIJKRQNALI)-SMaxRKKCQDIDDIjKRQNMiL-c-MycniSVQAEEQKJJISEEDIjIj-RKRREQLKHKLEQLN-MycYHSVQAEEHQIjIjLEKEKL-QARQQQIiIjKJaEHAL-MycLQALWAEKRMATEKRQi-USFIQE咖S卿I)QLDNDVL-RQQVBDLKNKNLLL-ENE工战LKKLVGERGCN4-IIAc-BIKQIEDKIEEILSKIYHI*ENEIARIKKLVG服101112131415IS171813GCN4—VIGCW4-Vlj金属连接物RTCCcomp(m)COMP(hu)M2(2-24/C17S,C1幼Ac-RLKQVEDKTiBKVLSKIiYHV-AC-GIiAQIOiIiEAIjQKALA-C0Nlt>Ac陽GEIi卿KLBQALQKLA-CO叫DDRYBSLKNIjitlrad-RliEMIINDWVSTILASITFLKNTVMBCDACQDVRDWLRQQVRE工-TFIiKNTVMECDACsrskbssdel20212223242526272829301.O'Sheae匕al.(l卯9)Science"3:538、542,2'Carmeetal.《1995)J，氛Chem，加cr.m::mB,3-Blackwoodetal.Science251i:UU-:u;L7.4.Harburyetal,(l柳》Sei節ce2S2:1401-:U07,5.Ghadirietal,,(1992〉J，Am,Ch柳，￡foc.114:4000"002.6)Stetefeld(2000》胸t,Struc,afoJ,7:772-776,7)Ozbek,(2002)忍MBOJ,21(22),5968.8)Newton(1934)Geiiom:lcs24:435-4",9〉本公开说明书在本发明的一些实施方案中，第一部分包含有第一连接位点，该第一连接位点供连接具有至少一个第二连接位点的异源表位。第一和第二连接位点通过至少一个共价或非共价键结合在一起。因此，表位和嵌合多肽通过第一和第二连接位点的结合而连接在一起。例如，可使生物素结合序列(下文提到)与第一部分共表达成融合多肽。可将连接到生物素的异源表位与从融合多肽形成的稳定化VLP混合在一起，使得生物素连接的表位结合到VLP的生物素结合序列。第一连接位点可以是适于与上述双功能连接剂反应的接头残基，第二连接位点也可以适于与相同的双功能连接剂反应。第二连接位点可包含相同或不同的接头残基，如赖氨酸或半胱氨酸残基、半抗原或其它免疫原的游离氨基或游离巯基。作为第一部分的一部分存在的第一连接位点在图5的方案1中显示，同时显示的还有存在于异源表位上的第二连接位点。另参见美国专利6,231,864。在本发明的另一个实施方案中，第一部分包括供异源表位连接的第一连接位点，该表位适于通过非共价相互作用连接到某表位上的第二连接位点。实例包括这样的嵌合多肽，其包含工程改造的位点如赖氨酸或半胱氨酸残基作为第一连接位点，该第一连接位点能与生物素或诸如3-(马来酰亚胺丙酰)生物素的化合物反应形成生物素化第一多肽部分，该嵌合多肽还包含具有连接的亲和素、链霉亲和素或中性低分子量亲和素类似物(如在Marttila等，(2000年2月)i^AS467(1):31-36中所公开并被称为NeutraLiteTM亲和素)作为第二连接位点的表位。在其它实施方案中，连接是通过本领域公知的配体/受体相互作用进行的。在本发明的一些优选实施方案中，表位是异源于VLP的氨基酸残基序列。通常存在于人或动物病原体或癌蛋白的例证性序列，在所精心设计的稳定化VLP的嵌合多肽中，在长度短于表位所在的天然蛋白质的序列中存在。这种本身没有免疫原性、但一旦连接到载体蛋白如所精心设计的稳定化VLP时变成具有免疫原性的缩短肽序列和其它小分子，被称为半抗原。示例性的异源序列可含有最多约245个异源于(外来于)VLP的氨基酸残基。在某些实施方案中，表位包含存在于选自以下的病原体的氨基酸残基序列依波拉(Ebola)病毒、HIV-1、HIV-2、口蹄疫病毒(FMDV)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流感A病毒、人乳头瘤病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒、月市炎M^求菌(5^e/7tococcM/wewwow/a)、小3求隐孢子虫(Q7/tospon'(i/wwparvwm)、霍乱瓜菌(r/6n'oc/w/erae)、鼠疫4干菌(Feraz'w.";es"力、流感嗜血斥f菌(//^附0//71if"/7we"zae)、卡"f也莫4立氏菌(7Woraxe〃acato^r/zafe)、牙逸艮p卜啉单月包菌(Po/7/2;^omowayg/"g/v(3/Z力、才古氏4偉虫(7Vypartasowacn/z/)、恶'f生疾原虫(_P/aymo<i/ww々/c/parww)、间日疰原虫(尸/a^s7wo力'MWv/wa)、伯氏症原虫(尸/aswo(iz'wmZerg/z/)、约氏症原、虫(P/oswodYw附少oe〃〖)、远纟彖链3求菌((Streptococciso6n'"w力、-畐氏志贺氏菌(幼/ge〃a、炭疽芽胞杆菌(5ac/〃ws""//zrac/s)、溶组织内阿米巴C&7towoe6a/7&to/j^ca)、日本血吸虫(5"c/^toyowa乂(3/o"/cMW)、曼氏血吸虫(;S"c/^,ow附amarao"/)和月卤膜炎奈瑟氏菌(Vehen'"mem'"g衍(i&)。在一些其它实施方案中，表位是衍自癌抗原的肽。在其它实施方案中，表位是寡糖、脂多糖、脂蛋白、糖蛋白或蛋白聚糖半抗原。例证性的B细胞和T细胞肽表位在以下表A和B中列出，同时列出的是从中获得该序列的基因的普通名称，所公布的表位的文献或专利引文以及SEQIDNO。这些肽表位可融合到第一部分多肽的序列中，或者如上所述可作为单独键接的半抗原表位存在。糖半抗原在下文论述。表AB细胞表位微_生物肺炎链球菌基因序列KLBELSDICIDELDAE,QK,EDQKKTEE-KAALEKAASEEM-引文，SEQ工DNO3132小球隐孢子虫HIVP23GP120RKRIHIGPGR-AFYITKNKSIRIQRGPC3-RAFVTIGKIG-NMRQAHCNISC333343535<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>卿GCRCNDSSDS5NEWGSRSKDSSD56卵WGCRC即SSD-EIiIiGW圃I57NEWGARANDSSD58NEWGCRAHDSSD59NEW(3ARCWDSSD60,GCRSNDSSD61MSLLTEVETPIR-NEW<3SRCNDSSdS2SLIiTEVETPIRN柳QS-BSNDSSDS1jIiTEVET-SLLTEVETPI咖EWGS-及SNDSSDSIiLTEVETPIR-NEWGSRSNDSSDSliI/TEV-ETPIRNBW咖SNDSSD"SSDSLIiTOVETPIRKEWG-ARANDSSD65SMjTEVBTPIRN迈WGA-NEWGRRAND3SDSLLTEV-ETPIRNBWGARAHDSSD66EVBTPIRNEWGSRCMDSSD67EVETPIRNEWGSRCHDSSDEV-ETPIRNEWGSRCNDSSDS8EVETPIRNEWGSRCNDSSDEV-ETPIRNEWGSRCNDSSDE-VBTPIRK抓GSRCNDSSD69X15X16X17X18X13X2(TX21X22X23X24703^X2X3X4X5X6X7X8TPIRHE-X15XisX17Xi8X19X20X21X22-TPIRWEXiSXlsX17XiBX19-37b型鼠疫杆菌NBM2乂20X21X22X33X2471X15X1SX17X18X19X20X21"X20X21X22X23X24X1X2X3X4-X5XSX7XBTPIRNKC1SX16X17-x18x:i3x20x2:Lx22x23x2472X1X2X3X4XSX6X7X8TX10X11R_X13x14x15x16X17x18X:i3_X20X21X22X23X2473X13X14X15X1SX17X18X19X20-X21X22X23X24X1X2X3X4X5X6_x13x14x15x15x17x18x19x20_X17X18X19X20X21X22X23X24-x20x21x22x23x2475NWATPNYTNWPISHIR7SVAgDIIiKVIVDSMNHH-ODARSKLKEELAE-IjTABIjKIYSVIQA-EIN咖SSSGTIN-YGYTOEEIFKASA-QVDGSEKKIVS工K-DPIjGSSNKRTGAI!-流感嗜血杆菌pBOMPCSSSNNDAA-NKLC5TVS咖JB10798081B2卡他莫拉氏菌copB牙龈吟啉单胞菌ha枯氏锥虫ld工skdkkk-LDIEKNKKK-RTEAEIiQAB-GVSPKVCKDVTV-RIQSTWRQKTV、APAKAATAPA12148384858S8788恶性痴原虫cs(NANP)3NVDP(NANP>3NWVDPWANP)3NVnpnvdp-(NAUP)3lfVDPNPHVDP(NANP)3-KVDPNAWVDP(NANP〉3NVDPDP(N顺)3NVdp(w\np)3nvd;pNVDP1SJA24B99091929395963899100101102间日痴原虫cs伯氏痴原虫约氏痴原虫远缘链球菌呼吸道合胞病毒(RSV)溶组织内阿米巴日本血吸虫曼氏血吸虫CScsGDRADGQPAG-RADDRAAGQP-AGDGQPAGANGADDQPGANGADDQPG.APGANQ咖AA-APQMOEGGAAAgl/IlAKADYEAK-LAQYEKDIi福氏志贺氏菌侵&fCSICSNNPT-CWAICK凝集素paravecabtvc:qndn-scpiiadvekcnqDliOSEISliSIiE-ESLASELQRRVDDIjQSEISIjSIjE-NSELIRRAKAA-202728IS18132122221031041051061071081031101U112113114115m118119牛抑制素依波拉病毒大肠杆菌阿尔兹海默病脑膜炎奈瑟菌ac亚单位RPP咖AA膜锚定糖蛋白ATQVEQHHRR-TDNDSTAHNTPVm>D-ISEATQVEGKLGIjITNTI-AGVAVIjISTCCEJIiCCYPACAGCUNTFYCCELCC-YPACAGCNSSNYCCELCC-YPACAGCNp-淀粉样VHHQKLVFFAB-DVGSUKGAIIG-LMVGGWIADAB卿DSGYB-VHHQKIiEDVGSNKGAIIDAEFRHDSGYE-VHHQKLVF咖-DVGSNKGAIIGDAEFRHDSGYE-VHH卿VFFAE-DVGSNKGMI303131313333333444HWVNNKVATHVPPLQNIQPQVTKRAQAANGOAASGQVKVTKVTKAYVDEQSKYHAKPSSTUAKTONKVEVTKAYVDEKKKMVHAHYTRQ咖ADVFVPPPQKNQ3QPWTKAPPSK6QPQVKVTKAQPQTAKT卿GKVKVTKAQPQVTNGVQGNQVKVTKAPPSJCSQGKTGNQVKVTKA120121122124125126127128129130131132133134135136137138139140141142143144145146147148].49150151PPSXSQGTNWWQVKVTKAPPS卿PGQVKVTKVTKASMTPAHVYVDNKVAKHVAQVXVTKAKSR工RTiaT3jVPAWGKP。SD1521531541551561571581591601611621641S51"N日pA免疫球蛋白EC3KVWTVKWVRSGELSAGVRVKGKVNTVKNVRSGELSVGVRVKAPEWPOSRDKRTLEP。QVMDVDGGGHFPPTPGTIWII舰GYWV咖CIN战GYWVCGDPAMEDGQVMDVDMSTTQEGTBliMGHTFEDSTKKMGGGHFPPTMFTPPT1671"163170171172173174175176177178173180181182:U3184185l日61B71883LB3乙型肝炎表面PreSlPrsS2SWWTSLWF48PLGFFPDHMQ卿STAFHQ-37MQWSTAFHQ-190131194195136炭疽芽胞杆菌钩虫ALQDPQDPRVRDPKVRG-DPRVRG-保护性抗原IVTKENTII-NPSBNGDTS-383940421971981"200Asp-EDRPGEIi水疱性口腔炎病毒(vsWG糖蛋白牛呼吸道合胞病毒(BRSV)F蛋白DKKLIiPKVN-NHDCQISU-工ATVIEFQQ人呼吸道合胞病毒(RSV>人鼻病毒脊髓灰质炎病毒VP1VP1F蛋白KQSCSISU-QQSCRISN-FPSDEFPATGIDNHRBWCLDSASTKNKDKL434848484B48505120120220320420520S207208所公开的表位的引文在以下表B中提供。对于SEQIDNO:72的流感AM2多肽序列XiX2X3X4X5X6X7X8丁XioX11RXi3X14X15X16X17X1gXi9X20X21X22X23X24:残基X,至Xg不存在或存在，当存在时是天然存在于M2蛋白序列的残基，分别为甲硫氨酸、丝氨酸、亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸或脯氨酸、谷氨酸、缬氨酸和谷氨酸，条件是当一个带下标X残基存在时，任何其余的下标数大于它直至为8的带下标X残基也存在，Xk)存在，为脯氨酸、亮氨酸或组氨酸，Xu存在，为异亮氨酸或苏氨酸，Xu存在，为天冬酰胺或丝氨酸，Xm存在，为谷氨酸或甘氨酸，残基Xu和X,6存在或不存在，当存在时分别为色氨酸和甘氨酸或谷氨酸，残基Xn和X,9存在或不存在，当存在时独立为半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸，残基Xj8存在或不存在，当存在时为精氨酸或赖氨酸，残基X2。至X24不存在或存在，当存在时是天然存在于M2蛋白序列的残基，分别为天冬酰胺或丝氨酸、天冬氨酸或甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，条件是当一个带下标X残基存在时，任何其余的下标数小于它直至为15的带下标X残基也存在。类似地，在优选的上述SEQIDNO:70流感AM2序列中残基X,至Xg不存在或存在，当存在时是天然存在于M2蛋白序列的残基，分别为曱硫氨酸、丝氨酸、亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、缬氨酸和谷氨酸，条件是当一个带下标X残基存在时，任何其余的下标数大于它直至为8的带下标X残基也存在，残基X。和X,6存在或不存在，当存在时分别为色氨酸和甘氨酸，残基Xn和X!9存在或不存在，当存在时独立为半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸，残基X^存在或不存在，当存在时为精氨酸，残基X加至X24不存在或存在，当存在时是天然存在于M2蛋白序列的残基，分别为天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，条件是当一个带下标X残基存在时，任何其余的下标数小于它直至为15的带下标X残基也存在。44表B微生物hiv基因P24白喉棒状杆菌毒素博氏疏螺旋体流感病毒A0/PR8HAup枯氏锥虫恶性痴原虫MSP1间曰疟原虫约氏疟原虫远缘链球菌Agl/Illcmv('淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)序列^引文SEQ工dNO3fqwhnsyn-5210211HjSKHISKSG-一7212s213IjIDALIjODPcT3221432215fwrgengr5trs-3s21sayermcn:ilkgkIjRVIjSFIRGTKV-3S217slvo:tdpfk卿-36218NSQWSIjIRPavkgvgtmvmel-219工rmikrgindrnshmftlvasvii-EEAPSGNT￡13220is221222psdkhieqykki-*"23咖isc22325咖SPCSVT224yldkvratvgte-WTPCSVT22s鹏qcsvt226aqnqkcis227qyekdl￡22b223破伤风梭菌QYIKANSKFIG-20脑膜炎奈瑟菌PorB乙型肝炎OpaBOpac表面核心MWQ卿KASIJV3TDS(3WCHWSQTBVAATLAYRPGNVCRFGNAWRIsy旭GFDPICIGNYTQINAASVCHjRCsgsvqpvpaqnsksacIiGr:tgdddkakgtdpcsvqwp鄉sksjwkcNYAyKYAKHflNVGRDCGV0XDFSKRTSA工VSC即DMPVSVRTOSPOTCTGMJNTSTVSDYITRNRITCIYDPKLNDKFDKFKPYIGCmotklsvph-37,41MQWNSTAFHQ-37TLQDPRVRG-MQ肪TAFHQ-TL卿MQWNSTALHQ-QDPRVR38MD工DPYKEFGAT-45咖LDTASALYR-45EALESPEHCSPHH雷GVNIiKDPAS-45WSYVNTNMGIj-45KP卿i^wraisci/TB1-45IiLWFHISCl/TF-45VSFGVWi;RTPP-4523023123223323433523623723B233240241242243244245246247248249250251252253254255256257258259260251262263265266257258263270VSFGVWIRTPPAWIRTPPAYRPP议*带下划线的C(Q不是来自天然序列。引文1-EPO785521A,2,WO98/07320.3.USWo,5,633,854,4.USW。.4,544,500,5.6，etal.J\:r鹏imoi、，157,12:5436,7.2Jicrngetal.Eur,J*.工咖unca',26,8，al,I卿unotec加o;io9y,2,2:35.9,Hilletal.(l"7)TiiJfecfc.JT卿un.,6S,11:4476,10.,"222011,WO3日/0SB5:i,12.Kellyal.(1997)CMin,鄉，工卿unol.,m,2:285.13.Kahnetal.(1397》J,JjnmiU3a1,,153,9:4"4.14,、15,Ohtaetal.U397》Arc*,AZJergyJ;nmunc2，,114,1:15.16,Staffilenoetal.(1930)Arch,OralSioL,35:Suppl.17，Saronetal*("")JProc'WatJ.Acad.Sci,鹏,94,7:331418*al,(i"6》Sio！,Chem,,271，52:33670，Bast丄enal,(1397)ViroJL,234,l:UB,20，Yangetal.U3S7)Vaccine,IS,4:377,21，，(1"7>J.Kxp,Med，,185,10:1733.22,Waraetal，(1937)vaccine工s,1-73,23，U.S.No.4,88S,782.24，,(1985)Sci抑ce,228J1436.25*Schodelal，(1394)J,卿er,胸d，，180:1037.26，Calvo-Calleetal,(IS")CT,JT卿tmp;i，159,3:1362,27-Qarietal.(l柳)McQ，Sioch柳，Parasitca.,55U-2)"OS.28*Qarietal，(1933)i3Z3"fc,3"(8848):780,29，Neirync)cetal*(Octl"3)J/atiure*df,,5(10》；;U57-1163,30,Thompsonetal，(13")芯or,iT.Siocheiu,22$(3):751-7化31，W:Usonetal,(2000)ideme,287:1"4-1S"，32,Browne仁al,(1393)J\Virol,,67(5):2887-.4S454S2712"7227327433,34,35.35,37.38,33.40'41.42,43,化45.45.47,48,49,50U,S>No,4,8日…"3.Schenketal.(Jul8,1999)船仁ure,400(5740):116-117-Slepushkinetal.("兆)7accri加,13(15);13"-1402,BrettetiT，Tuimimol,,:U7(3):984-991,Neurathetal,,F,Brownetal,7acci加s55,ColdSpringHarbor!Laborato;cy,ColdSpringHarbor,NewYork,pp.:L85-lS3.Kentetal，,(1387)F,Brownetal,eds,,VaccinesColdSpringHarborLaboratory,coldSpringHarbor,NewYor3c,pp-365-369.Milichetal*,(1387》F，Brownal,ecis.,Viacclnes",ColdSparingHarborLaboratory,coldSpiringHarbor,NewYork,pp，377-382,Thorntonetal.,U987)F,Brownetal,ed曰.,VacclnefirColdSpringHarborlaboratory,coldSpringHarbor,NewYork,pp，77-80,Milichet(1987》P,Brownetal.ed曰，,VaccdnesS7,ColdSpringHarborIiaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,pp,50-55,Iiittle"，,(1"$)Aficxubicaogy142:707-715.ProvidedbyDr.PeterHotez,GeorgeWashingtonUniversity,Morganetal.,(2000)胸ture408:3B2-9B5,t7，S.PatentNo.4,882,US,AJexanderetal.,(1934》Immunity1:751-7".Muyangaetal.,(2001)Arch,WroL146(3):1S67-1679，TJ,S,"tentNo,6,171,53:1,U.S.PatentNo.S,OGO,O化U.S.PatentNo,S,U0,4",另一种有用的T细胞表位是称为PADRE表位的合成序列(参见Sette等的美国专利6，413，517)。一种示例性的表位是Alexander等，(1994)//;wmm々，5:751-761所7>开的表位，其具有序列AKFVAAWTLKAAA(SEQIDNO:275)。在某些实施方案中，表位包含半抗原性小药物分子及其衍生物或类似物。在一些实施方案中，表位是滥用药物或者滥用药物的类似物或衍生物，如尼古丁、乙醇、可卡因、海洛因、吗啡、芬太尼、曱基芬太尼、苯丙胺、曱基苯丙胺、苯环利定、哌甲酯和亚甲基二氧基甲基苯丙胺。示例性的这种物质是美国专利6，383,490中描述的可卡因类似物，它们适用于共价连接到免疫原性载体。在其它实施方案中，表位是糖。例证性的糖化合物包括NTHi或Mcaf.的脂寡糖(LOS)[Sun等，(2000)2W0，18(13):1264-1272和Jiao等，(2002)/w/e".//wm/""70(11):5982-5989]。LOS由疏水性月旨质A部分和亲水性核心寡糖部分组成，是革兰氏阴性细菌的外膜的主要成分之一。去毒的LOS(dLOS)分子是de-O-酰基化的或de-N-酰基化的，或者这两种情况都是，且按Hochstein(1990)ClinicalapplicationoftheLimulusamoebocytelysatetest,R.B.Prior(编辑)，CRCPress,Inc.:BocaRaton,FL,第38-49页中的描述进行鲎变形细胞溶解物(LAL)测定发现，该分子所显示的内毒性(endotoxicity)比起始LOS减少约100至约10,000倍。本领域公知有许多方法可将载体蛋白偶联到多肽。可在寡糖或相对较小的多糖的还原端上[Anderson(1983)/w/e"./mwww.,39:233-238;Jennings等，(1981)J/ww柳o/.,127:1011-1018;Poren等，(1985)Mo/,/wmwo/.,22:907画919]或末端上[Anderson等，(1986)/wmw"o/"137:118-1186;Beuvery等，(1986)Dev.历o.>Samc/.，65:197-204]制备醛基，该醛基可通过还原性胺化连接到载体蛋白。另外，用高碘酸盐离子对各邻近羟基进行氧化，然后用硼氢化氰对胺进行还原性烷基化，这对于在其免疫原性环中加入了能提供s-胺的赖氨酸残基的那些HBc嵌合分子来说特别有用。大的多糖可通过末端活化[Anderson等，(1986)//m肌仍o/.,137:1181-1186]或通过对多糖链上的几个官能团的随机活化[Chu等,(1983)/"/ecf./mww".,40:245-256;Gordon的美国专利4,619,828(1986);Marburg的美国专利4,882,317(1989)]进行缀合。对多糖链上的几个官能团的随机活化，可因多糖链上的随机连键而产生高度交联的缀合物。多糖与载体蛋白的最佳比例取决于具体的多糖、载体蛋白和所用的缀合物。有关将糖缀合到载体蛋白的方法的详细综述可在以下文献中找到Dick等，ContributionstoMicrobiology和Immunology,第10巻:Cruse等(编辑)，(S.Karger:1989),第48-114页；Jennings等:Neoglycocon.jugates:Preparation和Applications,Lee等(编辑):(AcademicPress:1994)，第325-371页；Aplin等，(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.,10:259-306和Stowell等，(1980)Adv.Carbohydr.Chetn.Biochem.,37:225-281。碳水化合物本身可通过本领域公知的方法合成，例如通过Witte等，(1997)J力肌C/zem.5Vc,119:2114-2118描述的酶促糖蛋白合成法来合成。在以下各段节内容中论述到几种作为寡糖实例的合成、半合成和天然寡糖，这些寡糖是所精心设计的用于制备本发明HBc缀合物的半抗原。适合制备用于治疗b型流感嗜血杆菌(H.ib)的疫苗的寡糖半抗原由2-20个D-核糖-D-核糖醇-磷酸(I,见下)、D-核糖醇-磷酸-D-核糖(II，见下)或磷酸-D-核糖-D-核糖醇(III，见下)重复单元所组成。EduardC.Beuvery等，EP-O276516-B1。迈^0OHOH5,a-o69MPIO;cHH一ooooo="ro50美国专利4,220,717还公开了b型流感嗜血杆菌的多聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)半抗原。Peterson等，(1998)/"/e"/wmw".'66(8):3848-3855公开了三糖半抗原aKdo(2—8)aKdo(2—4)aKdo,该半抗原能提供针对C/z/am;^'"/weM附cw/ae的<呆护作用。月申炎衣原体(C7z/am;^fe!f/wewwom'ae)是/人咽炎到致命性肺炎的人呼吸道感染的原因。Kdo是3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸G。Andersson等的EP-O126043-A1公开了可用于治疗、预防或诊断月t炎链球菌(5V/^/7tococdpwewmow/"e)所引起的细菌感染的糖。一类有用的糖是衍自二糖GlcNAc(31—3Gal。上述Andersson等还报道说Gal(31—4GlcNAc卩l-3Gal卩1—4Glc-Cer这一新乳糖四酰神经酰胺(neolactotetraosylceramide)是有用的。McKenney等，(1999)Sc/e"ce,284:1523-1527公开了聚-N-琥賴酰(31—pGlcN(PNSG)这种多糖，它能提供针对金黄色葡萄球菌(Stop/ococcwawrew)的保护作用。金黄色葡萄球菌是包括心内膜炎、骨髓炎(osetemylitis)、化脓性关节炎(septicarthritis)、肺炎和脓肺在内的社区获得性感染的共因。欧洲专利0157899-Bl公开了肺炎球菌多糖的分离，该多糖可用于本发明。下表列出了能产生在本发明中可用作半抗原的荚膜多糖的肺炎球菌培养物类型。多糖半抗原来源<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>卡也莫4立(布4立汉)菌(^braxe〃a("Sraw/(3we〃a)cata/r/2afc)才居才艮道是儿童中耳炎和窦炎及成人下呼吸道感染的原因。该细菌的脂寡糖表面抗原(LOS)的脂质A部分在3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸-葡糖胺连键处被切割。将切割产物用温和的碱或肼处理除去酯连接的脂肪酸，同时保持酰胺连接的脂肪酸，以产生来自卡他莫拉(布拉汉)菌的去毒脂寡糖(dLOS)。该dLOS直到它连接到蛋白载体时才有免疫原性。Xin-XingGu等，(1998)/"/e"./mmw".,66(5):1891-1897。B組链球菌(GBS)是人类脓毒病、脑膜炎和相关神经疾病的原因。荚膜多糖特异性抗体已知能保护婴儿免受感染。Jennings等的美国专利5,795,580。GBSII型荚膜多糖的重复单元是—4)-卩-D-GlcpNAc-(1—3)-[卩-D-Gal;(1—6)]-卩-D-Galp(l—4)-卩-D-Glcp-(1—3)_P-D-Glc,(l—2)-[a-D-Neu/NAc(2一3)〗-卩-D-Gal;-(1—,其中括弧括住部分是连接到紧接的非括弧括住亚单位的支链。GBSV型荚膜多糖的重复单元是—4)-[a-D-Neu;NAc-(2—3)-卩画D-Galp-(l—4)-卩-D-Glc/NAc-(1—6)]-a-D-Glcp画(1—4)-[卩-D画Glc/-(l—3)]-卩-D-Gal,(l44)-卩-D陽Glcp-(1—。Brade的欧洲专利申请EU-0641568-A1公开了从沙眼衣原体(C/2/函j^Z/afrac/zo應他)、月申炎衣原体(C7z/膽yW"，e謂om'ae)和婴乌鵡热衣原体(CWaw^fe/w"toc/)获得梯子样带型抗原的方法。Slovin等，(1999)iVa".^4cadt/.S.A,96(10):5710-5715报道了连接到KLH的合成寡糖globoH作为用于制备抗前列腺癌疫苗的载体的用途。类似地，Helling等，(1995年7月)C""cwi^y.，55:2783-2788报道了KLH连接的GM2在治疗黑素瘤患者的疫苗中的用途。后一疫苗是这样制备的用臭氧切割GM2的神经酰胺双一建，引入醛基并还原性烷基化到KLH上。类似的程序可用于所精心设计的嵌合颗粒。存在于其它肿瘤细胞及正常细胞如黑素瘤、成神经细胞瘤和健康脑细胞的表面上的鞘脂寡糖部分如红细胞糖苷脂和神经节普脂，在本发明中同样可用作半抗原。红细胞糖苷脂globoH的寡糖部分具有以下结构Fuca-(1—2)-Gal卩(1—3)-GalNAc卩-(1—3)-Gak-(1—4)-Gal(3-(l—4)Glc，而神经节苷脂的糖部分GM2、Gml和GDla分别具有以下结构GalNAc(3-(1—4)-[NeuAca-(2—3)]-Gal(3-(1—4)-Glc;Gal卩-(1—3)-GalNAc卩-(1—4)-[NeuAca-(2—3)]-Gal卩-(1—4)-Glc和NeuAc-(2—3)-Gaip-(1~>3)-Ga脆c(3-(1—4)-[NeuAca-(2—3)]-Gaip-(1—4)-Glc。美国专利4,356,170公开了有用的多糖的制备，将多糖还原然后氧化形成具有末端醛基的化合物，后者可还原性胺化到载体蛋白如破伤风类毒素和白喉类毒素的游离胺基团上，发生或不发生显著的交联。示例性的有用细菌多糖包括j3-溶血性链球菌、流感嗜血杆菌(Z/aewc^/zZ/z^/^/7we"加)、脑膜炎双球菌、肺炎双球菌和大肠杆菌(Eco//)多糖。可以不将颗粒进行还原性胺化，而是将接头臂(linkerarm)如s-氨基C2-C8烷基羧酸提供的接头臂还原性胺化到多糖上，然后用水溶性碳二亚胺连接到颗粒。另外有用的既非B细胞表位也非T细胞表位的序列能结合得生物素，并可表达成能自组装成VLP的嵌合多肽的一部分。美国专利6,380，364中公开了两个这种序列GGGCSWAPPFKASC(SEQIDNO:276)和GGGRGEFTGTYITAVT(SEQIDNO:277)。这两个序列可类似地与前述的能形成VLP的多肽一起共表达成融合多肽。本发明又一个优选的实施方案是使VLP稳定化的方法。VLP是这样稳定化的将自结合肽第二部分通过共价键连接到自组装多肽第一部分。在一些实施方案中，连接是通过肽^:来进行。在一些实施方案中，肽键进行的连接是通过将编码自结合肽部分的DNA遗传融合到自组装多肽第二部分的DNA编码序列来实现。在某些实施方案中，第一部分和第二部分例如通过双功能连接剂或通过蛋白质连接(proteinligation)在体外进行连接。本发明的又一个实施方案是使可通过一个或多个共价或非共价^建连接上异源表位的VLP稳定化的方法。本领域技术人员认识到，稳定化的VLP会在医学领域之外的技术中具有用途。本领域技术人员认识到，结合到稳定化VLP的表位也会在医学领域之外的技术中具有用途。参见例如Mao等，iVoc.A/f.jcad(2003)100:6946-51。另参见Wang(2002)CT^m./"A五A41:459-62，在该文献中工程改造的病毒颗粒被描述为"可寻址纳米尺度结构单元(addressablenanoscalebuildingblocks)"。本领域技术人员认识到，在生物系统中来进行本发明的生产(例如通过编码本发明嵌合多肽的重组DNA表达该多肽的一个或多个部分，该DNA存在于对宿主来说适当的表达载体中，该载体引入到适当的宿主细胞中(在本文别处描述))，这只是产生嵌合多肽的任何或所有部分、稳定性肽和/或表位的一种方式，且只为方便起见在下文实施例中使用。可采用体外蛋白质连接和其它本领域公知的化学技术，来完全从体外合成的多肽和其它前体通过共价键构建本发明多肽和VLP。[有关多亚单位聚蛋白的半合成方法参见例如Muir等，(1998)iVoc.Ato/.v4c^/.5W.，95:6705-6710;总合成方法参见例如Canne等，(1995)/爿m.C7zew,6bc"117:2998-3004]。本领域技术人员还清楚，有一些实施方案将不可能在体内或在所有细胞类型中构建。例如，如Carerra等，(2000)尸rac.A^/.Jcad5W.，98:1988-1992所教导，在体外将小分子连接到嵌合多肽的接头残基上。本领域技术人员会认识到，上述的将表位共价和非共价连接到嵌合衣壳多肽的第一部分的具体实例，只出于示例性说明目的，还有许多其它连接方法是本领域公知的，这些方法容易适用于在体内或体外进行这种连接。编码所精心设计的嵌合多肽或嵌合多肽的一部分("嵌合类似物")的类似核酸(DNA或RNA)序列，也精心设计为属本发明的一部分。嵌合类似核酸序列或其互补核酸序列所编码的氨基酸残基序列，与嵌合多肽的第一部分有至少50%、更优选70%、甚至更优选80%、还甚至更优选至少90%、最优选至少95%同一性。这种DNA或RNA在本文中称为编码病毒衣壳多肽或自组装多肽(包括但不限于以下实施例所列举的多肽)的核酸的序列的"类似物，，，或者称为"类似序列，，。编码类似序列的核酸在合适的转染和表达时，也产生所精心设计的嵌合55多肽的第一部分。可以利用遗传密码的简并性来编码嵌合多肽的第一部分，这样可避免与例如基因组病毒衣壳多肽基因或编码相同氨基酸序列或其互补序列的基因片段的基本上同一性(substantialidentity)。因此，有用的类似DNA序列并不需要能例如与病毒衣壳多肽编码序列的核苷酸序列或其互补序列在中严格条件下杂交，但仍能提供所精心设计的嵌合分子；也就是说，有许多核酸序列可编码相同的多肽。出于这些原因和下述原因，最适当的相似性量度标准是氨基酸序列之间而不是核酸序列之间的相似性。不同的宿主生物具有不同的密码子偏好性，也就是说，它们优先使用特定的密码子来编码特定的氨基酸残基。这种密码子偏好性是公知的，编码所需的嵌合序列的DNA序列可例如用体外诱变加以变更，使得当要表达多肽时宿主偏好的密码子得到利用。这种变更是本领域的常规操作，因为优化的编码序列能导致要从特定表达宿主表达的蛋白质的数量和质量更高。本发明还精心设计了包含载体、外源核酸区段(例如DNA区段或序列)、启动子的重组核酸分子如DNA分子，该载体操作性连接到该外源核酸区段，该外源核酸区段确定了编码上述所精心设计的嵌合多肽的一部分的基因，该启动子适合于指导该基因在相容宿主生物中的表达。更具体的说，本发明还精心设计了这样的重组DNA分子，其所包含的载体含有启动子和DNA区段，该启动子被操作性连接到该DNA区段，指导所精心设计的嵌合多肽的一部分在宿主生物细胞中的表达，该DNA区段确定了嵌合多肽的第一部分的基因或与所精心设计的嵌合多肽有至少50%氨基酸同一性的DNA变体。还精心设计到这样的重组DNA分子，其所包含的载体含有启动子和DNA区段，该启动子被操作性连接到该DNA区段，控制嵌合多肽部分在宿主生物细胞中的表达，该DNA区段是编码第一部分的氨基酸残基序列的类似核目交序列，该氨基酸残基序列与所精心设计的嵌合多肽的序列的第一部分有至少50%、更优选70%、更优选80%、更优选90%、最优选至少95%同一性。该重组DNA分子在合适地进4亍宿主细胞转染和表达时，能提供所精心设计的嵌合分子。应指出的是，本发明第一多肽部分的一些实施方案包括异源表位氨基酸残基或序列和/或接头残基或序列。这些异源序列和/或它们的编码核酸序列和/或和/或它们的互补序列，并不纳入在上述序列同一性百分数和比较中。同样，从嵌合多肽的第一部分截短以消除核酸结合特性的序列(相对于例如最终衍生它的病毒衣壳多肽，例如N末端或C末端序列)，也不纳入同一性计算和比较中。因此，只有存在于嵌合分子的第一部分的碱基或残基，而不计异源接头和/或表位，才纳入同一性百分数计算和比较中并与所比对的核酸或氨基酸残基序列进行比较。例证性的乙型肝炎病毒衍生VLP的基因的编码序列，在图1的SEQIDNO:3、4、5、6、7和8中例示。分离的核酸区段，优选DNA序列及其变体和类似物，可通过体外诱变进行制备，这是本领域公知的，在CurrentProtocolsInMolecularBiology,Ausabel等(编辑)，JohnWiley&Sons(NewYork:1987)第8.1.1-8.1.6页中也有论述，它是在基因的起始ATG密码子处开始，在每个基因的终止密码子处或紧接的下游处结束。因此，可将所需的限制位点工程加入在起始密码子处或其上游以及终止密码子处或其下游，使得其它基因可得以制备、切除和分离。然后使用本领域公知的方法，在技术上可以做到几乎任何一组核酸序列的乙醇融合和/或操作性连接(operationallinkage)。本领域公知，只要存在所需的核酸(例如DNA序列)(包括起始和终止信号)，在这个核酸区段的任一端通常可存在另外的碱基对，而这个区段仍可用来表达蛋白质。这当然假定了该区段中没有操作性连接着具有以下作用的DNA序列抑制表达，能表达会消耗所需的表达产物的另外产物，能表达会消耗由所需酶产生的所需反应产物的产物，或者能以別的方式干扰该DNA区段的基因的表达或功能。57因此，只要DNA区段没有这种干扰性DNA序列，本发明的DNA区段长度可为说500至约100,000个碱基对，包括载体序列在内。重组DNA分子特别是表达载体的最大大小，主要受制于方便性和一旦复制和表达所需的所有最小DNA序列都存在时宿主细胞所能容纳的载体大小。最小表达载体及其大小是公知的。长DNA区段和大载体不优选但可使用。编码前述嵌合多肽部分或其类似物的DNA区段，可完全通过非生物化学技术，例如Matteucci等，(1981)/爿w.C7ze肌&c.，103:3185的磷酸三酯方法进行合成，这一点有提到。当然，通过化学法合成遗传序列，可简单地通过用适当的碱基置换编码天然氨基酸残基序列的碱基，作出任何所需的修饰。但是，优选的是包括前述序列的DNA区段。所精心设计的嵌合多肽可在多种转化宿主系统中产生(表达)，主要是在宿主细胞中表达，但也精心设计到在无细胞体外系统中的表达。这些宿主细胞系统包括但不限于微生物如转化有重组噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体的细菌；转化有酵母表达载体的酵母；转染有病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒；alpha病毒、杆状病毒、fd)或者转化有细菌表达载体(例如Ti质粒)的植物、动物或细菌细胞系统；或者适当转化的动物细胞系统如CHO、VERO或COS细胞。同样下文提到，本发明既不受所采用的宿主细胞系统的限制或限定，也不受控制和指导表达的遗传元件的性质的限制或限定。含有编码例如HB衣壳多肽的基因的DNA区段，优选从含有该基因的重组DNA分子(质粒载体)获得。能够指导这种基因的表达从而导致该序列的转录(以及对于本文所述的编码多肽来说其随后的翻译)的载体，在本文中称为"表达载体"。表达载体含有包括启动子在内的表达控制元件。将嵌合多肽部分的编码序列操作性连接到表达载体，以让启动子序列指导嵌合多肽部分的编码基因的RNA聚合酶结合和表达。可用于表达多肽编码序列的启动子是诱导型型启动子、病毒启动子、组成型启动子(Poszkowski等，(1989)3:2719和Odell等，(1985)A^w^，313:810对此有描述)，以及暂时调节性启动子、空间调节性启动子和时空调节性启动子(Chua等，(1989)SWe"ce,244:174-181对此有描述)。一种优选的用于原核生物细胞如大肠杆菌的启动子，是可被外源供应的萘啶酸诱导的Rec7启动子。更优选的启动子存在于质粒载体JHEX25(可获自PromegaCorp.,Madison,WI),其可被外源供应的异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。还更优选的启动子即tac启动子存在于这里载体pKK223-3,它也可被外源供应的IPTG诱导。使用约25至约100pMIPTG进行诱导，可成功地在多林大肠杆菌林如XL-1、TB1、BL21和BLR中表达pKK223-3质粒。出人意料的是，已发现浓度约25至约50(iMIPTG在2L摇瓶和发酵罐中能提供最佳结果。在其它细胞类型和生物中进行表达，可能需要本领域公知的其它启动子和遗传调节元件。已开发出多种方法来通过互补粘性末端或平端将DNA操作性连接到载体。例如，可将互补均聚序列段(complementaryhomopolymertract)加到待插入到载体DNA中的DNA区段。然后将载体和DNA区H通过互补均聚尾(complementaryhomopolymerictail)之间的氪4建进行连接，以形成重组DNA分子。或者如前所述，可^f吏用含有一个或多个限制性内切核酸酶位点的合成接头，将DNA区段连接到表达载体。合成的接头是这样连接到平端DNA区段将平端DNA区段与大大过量的合成接头分子，在能够催化平端DNA分子的连接的酶如噬菌体T4DNA连接酶的存在下进行温育。因此，反应的产物是在其末端携带有合成接头序列的DNA区段。然后将这些DNA区段用适当的限制性内切核酸酶切割，并连接到已用能产生与合成接头末端相容的末端的酶进行过切割的表达载体中。含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头可从多个来源市售获得,包括NewEnglandBioLabs，Beverly,MA。所需的DNA区段也可用PCR技术获得，其中的正向引物和反向引物含有在扩增后可切割的所需限制位点，使得基因能插入到载体中。或者，可将PCR产物直接克隆到含有T突出端的载体(PromegaCorp.,A3600,Madison,WI)中，这是本领域公知的。本领域公知，几乎任何所需的遗传序列都可通过体外合成、PCR扩增和操作、定点诱变或它们的组合或者本领域Z^知的其它技术来产生。实际上，完全合成的定制遗传构建物可市售获得(例如获自Aptagen、Herndon、VAUSA、Sigma-GenosysTheWoodlands、TXUSA、GenScriptCorp.Edison，NJUSA及许多其它供应商)。此外，不同的宿主生物(除了上述密码子偏好性外)还使用各不相同的遗传序列来控制和指导基因表达，因此精心设计到编码本发明嵌合多肽或其部分的表达载体能适应于多种可能的宿主生物中的一种或多种，它们仍落入要求权力的本发明的范围内。考虑到遗传密码简并性、各生物之间各不相同的密码子偏好性、完全定制的遗传构建物的市售可获得性、从遗传构建物表达蛋白质的系统的多样性以及其它天然和非天然来源的遗传变异这些方面的组合，可以看出，两个多肽或其编码基因之间的相似性的最具功能意义的决定因素，是受编码氨基酸序列而不是编码它们的核酸。接种物和疫苗在本发明的又一个实施方案中，将HBc嵌合颗粒或HBc嵌合颗粒与半抗原的缀合物作为接种物(inoculum)或疫苗的免疫原，用于人患者或合适的动物宿主如黑猩猩、小鼠、大鼠、马、绵羊等。接种物能诱导B细胞或T细胞应答(刺激)，如能与免疫原性表位或半抗原发生免疫反应的抗体的产生或者T细胞激活，而疫苗能通过B细胞或T细作用。T细胞激活可通过多种技术进行测量。在平常实践中，给宿主动物接种上所精心设计的HBC嵌合颗粒疫苗或接种物，之后收集外周血单核细胞(PMBC)。然后将这些PMBC在体外在T细胞免疫原存在下培养约3-5天的时间。然后测定所培养的PMBC的细胞因子如IL-2、GM-CSF或IFN-y的增殖或分泌情况。T细胞激活的测定是本领域公知都参见例如美国专利5,478,726及其中引述的技术。以抗体组成物(antibodyformation)为例，所精心设计的接种物或疫苗包含免疫有效量的HBc嵌合颗粒或嵌合颗粒缀合物，该颗粒或缀合物溶于或分散于药物可接受的稀释组合物，该组合物通常还含有水。接种物当给予需要进行免疫或者需要在其体内诱导抗体的宿主动物如哺乳动物(例如小鼠、狗、山羊、绵羊、马、牛、猴、猿或人)或者鸟类(例如鸡、火鸡、鸭或鵝)时，能诱导产生能与遗传连接的或缀合的(悬挂连接的)半抗原发生免疫反应的抗体。这些抗体还优选能结合B细胞免疫原的蛋白质或糖。每次免疫所用的重组HBc嵌合免疫原的量称为免疫有效量，该量如下所述依重组HBc嵌合免疫原、所免疫患者和疫苗中佐剂的存在等因素而定可在很大范围内变动。疫苗和接种物的免疫有效量能分别提供前述的保护作用和抗体活性。疫苗和接种物通常含有约1微克至约1毫克/次接种(单位剂量)的重组HBc嵌合免疫原浓度，优选约10微克至约50毫克/单位剂量。术语"单位剂量"在本发明的疫苗或接种物上，是指适合作为单元剂量用于动物的物理上分立的单位，每个单位含有预定量的活性物质及与其结合的所需稀释剂(即载体或介质)，该预定量经计算能单独地或共同地产生所需的免疫原性作用。疫苗或接种物通常是这样从回收的重组HBc嵌合免疫原制备将免疫原优选以颗粒形式分散于生理上可耐受(可接受)的稀释介质如水、盐水、磷酸緩沖盐水(PBS)、乙酸緩冲盐水(ABS)、林格溶液等中，形成含水组合物。稀释介质也可包括油质材料如花生油、角鲨烷或角聖烯，下文有论述。含有蛋白质材料作为活性成分的的接种物和疫苗的制备也是本领域公知的。通常，这种接种物或疫苗制备成液体溶液剂或混悬剂形式的胃肠外药；也可制备成适合于在临注射时溶于或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可进行乳化，这是特别优选的。往往将在免疫原性上有活性的成分与药物可接受的且与该活性成分相容的赋形剂混合在一起。合适的赋形剂有例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。另外，如果需要，接种物或疫苗可含有少量的能增强组合物的免疫原性效率的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH緩冲剂。所精心设计的疫苗或接种物优选还包含佐剂。用于本发明疫苗和接种物的合适佐剂，包括能够增强抗体对嵌合体中所含B细胞表位的应答的那些佐剂，以及能够增强细胞介导的对嵌合体中所含T细胞表位的应答的那些表位。佐剂是本领域公知的(参见例如VaccineDesign-TheSubunit和AdjuvantAuoroach,1995，PharmaceuticalBiotechnology,第6巻，Powell、M.F.和Newman,MJ.(编辑)，PlenumPress,NewYork和London,ISBN0-306-44867-X)。示例性的佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA，不用于人类)、不完全弗氏佐剂(IFA)、角鲨烯、角鲨烷和明矾[等AlhydrogelTM(Superfos，丹麦)]，它们是本领域公知的材料，可从几个来源市售获得。优选的用于本发明免疫原的佐剂包括铝盐或钙盐(例如氢氧化物盐或磷酸盐)。特别优选的用于本发明的的佐剂是氢氧化铝凝胶如AlhydrogelTM。对于请氧化铝凝胶，将嵌合蛋白与这种佐剂混合，使得每剂量存在50-800微克的铝，优选存在400-600微克的铝。另一种特别优选的佐剂是磷酸铝，可从丹麦SuperfosBiosector公司获得，商标为Adju-Phos。原始(primary)磷酸铝颗粒具有片状形态，直径约50至约100nm,在产品中最终颗粒大小为约0.5至约10|i。磷酸4丐納米颗粒(CAP)是Biosante,Inc(Lincolnshire,IL)正在开发的一种佐剂。可将目的免疫原包被到颗粒的外面，或者包埋在颗粒的内部(encapsulatedinsideontheinside)([He等,(Nov,2000年11月)C7/".D/ag".丄W./mw,o/.，7(6):899-903]。另一种特别优选的用于本发明免疫原的佐剂是乳液。所精心设计的乳液可以是水包油型乳液或油包水型乳液。除了免疫原性嵌合蛋白外，这种乳液还包含角鲨烯、角鲨烷、花生油等这些公知的油相和分散剂。优选非离子型分散剂，这种材料包括脱水山梨糖醇和二缩甘露醇的单-和二-d2-C24-脂肪酸酯，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯和二缩甘露醇单油酸酯。含有免疫原的乳液作为乳剂给药。优选地，这种乳液是包含角鲨烯和二缩甘露醇单油酸酯的油包水型乳液(ArlacelTMA),其任选包含角鲨烷，用水相中的嵌合蛋白乳化。这种乳液的公知实例包括MontanideISA-720和MontanideISA703(Seppic,Castres，法国)，它们每一个据认为都同时含有角鲨烯和角鲨烷，其中角鲨烯在每一个中都占主要，但在MontanideISA703较少些。最优选使用MontanideISA-720,且使用7:3(w/w)的油-水中描述的那些佐剂。本发明还精心设计到使用小分子佐剂。可用于本发明的一类小分子佐剂是美国专利4,539,205、4,643,992、5，011，828和5，093，318中描述的7-取代-8-氧代-或8-硫代-鸟芬衍生物。在这些物质当中，特别优选的是7-烯丙基-8-氧代鸟苷(洛索立宾)。该分子已证实能特别有效地诱导抗原(免疫原)特异性应答。优选的有用佐剂包括单磷酰脂质A(MPL)、3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL),这是RibiImmunochem，Hamilton,Montana制造的7>知佐剂。该佐剂含有三种从细菌提取的成分单磷酰脂质(MPL)A、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)(MPL+TDM+CWS),它们包含在2。/。角豊烯/Tween8(f乳液中。这个佐剂可通过GB2122204B中教导的方法制备。3-de-0-酰基化单磷酰脂质A的优选形式是直径小于0.2)im的小粒径乳液形式(EP0689454Bl)。最优选的是MPL的合成单糖类似物，其称为氨基烷基葡糖酰胺4-磷酸，AGP,例如以标号RC-529出售{2-[(11)-3-十四烷酰氧基-氨基]-乙基-2-脱氧-4-0-膦酰基-3-0-[(11)-3-十四烷酰基-氧基十四烷酰基]-2-[(11)-3-十四烷酰氧基-十四烷酰氧基氨基]-p-D-吡喃葡萄糖苷三乙铵盐}。RC-529可获自CorixaCorp.，在角鲨烯乳液中以标号RC-529SE出售，在含水制剂(aqueousformulation)中以标号RC-529AF出售(参见美国专利4,987,237和6,113,918)。这些佐剂可单独使用或者一种或多种其它佐剂如Alhydrogel丁M组合使用。更多的精心设计佐剂包括含有一重或多重CpG核苷酸基序(motif)的合成寡核苷酸佐剂，其可获自ColeyPharmaceuticalGroup。可获自AquilaBiopharmaceuticals,Inc.的标号QS21的佐剂，是书亍自南美洲才对种智利皂荚树(QuillajaSaponariaMolina)树皮的一种具有佐剂活性的免疫活性皂苷流分(等QuiFMA)，其生产方法在美国专利5,057,540中公开；智利皂荚树皂苷的半合成和合成衍生物也有用，例如美国专利5,977,081和6,080,725描述的那些皂苷。可获自ChironCorp.的标号为MF59的佐剂,在美国专利5,709,879和6，086,901中有描述。还精心设计了胞壁酰二肽佐剂，其包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰-去曱-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺[CGP11637，称为去曱-MDP]和N-乙酰胞壁-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)乙胺[(CGP)1983A，称为MTP-PE]。所谓的胞壁酰二肽类似物在美国专利4，767，842中描述。优选的佐剂组合物包括3D-MPL和QS21的组合(EP0671948Bl)、包含3D-MPL和QS21的水包油型乳液(WO95/17210、PCT/EP98/05714)、与其它载体配制在一起的3D-MPL(EP0689454Bl)、配制在含胆固醇的脂质体中的QSU(WO96/33739)或免疫刺激性寡核苷酸(WO96/02555)。可获自SKB(现Glaxo-SmithKline)的SBAS2(现AS02)在水包油型乳液中含QS21和MPL。另外的佐剂包括WO99/52549中描述的那些佐剂和聚氧乙烯醚的非颗粒性悬浮剂(英国专利申请9807805.8)。佐剂以佐剂量(adjuvantamountM吏用，该量可随佐剂、哺乳动物和重组HBc嵌合免疫原而异。典型的量可从约1(ig至约1mg/次免疫的范围变动。本领域技术人员知道，可容易地确定出适当的浓度或量。接种物和疫苗在常规上是通过注射(例如皮下注射或肌肉内注射)进行胃肠外给药。适合于其它给药方式的另外制剂包括栓剂，在有些情况下是口服制剂。还精心设计到使用Neirynck等，(1999)iV^w^5(10):1157-1163中述及的接种用鼻腔喷雾剂。对于栓剂，传统的粘结剂和载体可包括例如聚烷撑乙二醇或甘油三酯；这种栓剂可从含有0.5%-10%、优选1-2%的活性成分的混合物形成。口服制剂包含诸如以下的常用赋形剂药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。接种物或疫苗组合物呈溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶嚢剂、緩释制剂或散剂的形式，含有免疫有效量的HBc嵌合体或HBc嵌合体缀合物(优选为颗粒形式)作为活性成分。在典型的组合物中，免疫有效量的优选HBc嵌合体或HBc嵌合体缀合物颗粒如前所述为约1吗至约1mg活性成分/剂量，更优选约5吗至约50昭活性成分/剂量。疫苗通常配制成供胃肠外给药。示例性的免疫是以皮下(SC)、肌肉内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)方式进行。但是，还精心设计到口服和鼻内途径的疫苗接种。HBc嵌合体颗粒和HBc嵌合体颗粒缀合物可以以中性形式或盐形式配制到疫苗中。药物可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质或半抗原的游离氨基形成)，是用无机酸如盐酸或磷酸或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等来形成。与游离羧基所成的盐也可衍自无机碱如氬氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁和有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。65在又一个实施方案中，精心设计到这样的疫苗或接种物，其中将编码所精心设计的HBc嵌合体的基因转染到适当减毒的肠道细菌如伤寒沙门菌(S.2yp/n')、鼠伤寒沙门氏菌OS./)^H'mw^m)、鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合菌或大肠杆菌(五.co/z')中。示例性的减毒或无毒伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合菌，在前文提供的引文中有论述。这些疫苗和接种物特别精心设计用于抗击以下疾病通过鼻腔、肠道和生殖道黏膜感染或传播的疾病如流感，酵母(如黑曲霉和-暇丝酵母)疾病，病毒(如脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒、曱型肝炎病毒)疾病，细菌(如霍乱菌、沙门氏菌和大肠杆菌)疾病，对于这些疾病除了要产生全身IgG应答外还需要黏膜IgA应答，或者不需要前一应答而需要后一应答。肠道细菌可进行冻干，与干燥的药物可接受稀释剂混合，制备成片剂或胶嚢剂，以供宿主动物摄取、用药或服用，这些是常用的固体药物。另外，这些细菌性疫苗的含水制剂适用于通过口服、皮内、直肠内或阴道内给药进行熟膜免疫。用含有所精心设计嵌合分子颗粒的植物物质进行的口服免疫，可通过简易地摄取转基因植物组织如根(例如胡萝卜)或种子(如大米或玉米)来实现。在这种情况下，口腔和胃肠道中的水分提供通常所用的免疫用含水介质，而周围的植物组织则提供药物可接受的稀释剂。接种物或疫苗以与剂型相适应的方式给药，给药量为治疗有效和能产生免疫原性的量。要给予的数量取决于待治疗受试者、受试者免疫系统合成抗体的能力和所需的保护作用程度。所需给予的活性成分的精确量根据主治医师的判断来决定，每个受试者个体各不相同。但是，合适的剂量范围大约是每个个体几十微克活性成分。合适的初次给药和强化(boostershot)注射方案也是可变的，但通常是初次给药后间隔一定时间(数周或数月)再进行注射或其它给药。哺乳动物一旦免疫后使其维持一^殳时间，该时间足以让重组HBc嵌合免疫原诱导产生足够滴度的能结合目的抗原(如对于疟疾疫苗，为子孢子)的抗体。为产生示例性的抗子孢子抗体的维持时间，通常持续约3至约12个月的时间，且可包括强化注射或者疫苗的再次免疫给药。如果需要，还精心设计到在第一次免疫后24周至5年的时间进行第三次免疫。特别精心设计到，一旦达到了保护水平滴度的抗体，寻皮接种哺乳动物优选通过以约1至约5年的间隔时间进行定期强化免疫，来保持在该抗体滴度水平上或附近。抗子孢子抗体(在疟疾疫苗的情况中)或其它抗体的产生，可^_利的这样进行确证从被免疫哺乳动物获得到血浆或血清样品，通过下文描述的ELISA测定或通过本领域公知的其它免疫测定如蛋白质印迹，测定其中的抗体结合适当的抗原如合成的环子孢子免疫显性抗原[等本文所用的恶性疟原虫(户./"/c^"n^)CS蛋白肽(NANP)s]的能力。要指出的是，诱导出的抗体如抗CS抗体或抗流感抗体可用公知的技术从-故接种宿主哺乳动物的血液分离出来，然后重构(reconstitiited)成第二疫苗供进行被动免疫，这是本领域公知的。有类似的技术用于对人类进行Y-球蛋白免疫。例如，可将来自一个或多个被免疫宿主的抗血清在硫酸铵水溶液(通常40-50%饱和)沉淀，然后将沉淀的抗体用亲和层析法进行层析纯化，其中(NANP)5或流感M2多肽用作抗原固定化在层析柱上。因此，例如可将接种物用于马或山羊体内诱导产生抗疟疾抗体，该抗体再用于另一种动物如人类体内进行净皮动免疫。本发明的另一个实施方案是在动物宿主体内诱导产生抗体、活化的T细胞或这两者的方法，所述方法包括用接种物接种所述动物宿主的步骤。用于这个方法的接种物包含免疫原性产生量的上述HBc嵌合颗粒或HBc嵌合颗粒缀合物，该颗粒或颗粒缀合物溶于或分散于药物可接受的稀释剂。使动物宿主保持足以让抗体或活化的T细胞得到诱导(可通过公知的方法测定)的一段时间，该时间通常需要数周至数月(同样是公知的)。精心设计了在这个维持时间中进行多次这种免疫。实施例以下实施例只以示例方式给出，不应被认为是对本发明的限制。可以不偏离本发明的精神和范围，对这个技术作出许多变化。免疫学和重组DNA方法在本公开内容中可能没有明确进行描述，但这些方法完全在本领域技术人员的技能范围内。本文和其它文献引述的参考文献明确地整体包括在本文中。实施例1:用M2胞外域构建稳定化HBc多肽VLP为说明流感病毒M2蛋白的N末端区域以非共价方式使乙型肝炎病毒核心样颗粒稳定的能力，将M2e的胞外域融合到C末端截短的HBc多肽的C末端。为确保不是固有的半胱氨酸残基促成稳定化，使用了其中半胱氨酸突变成丝氨酸的M2(位置2-24)版本(CV-1895,V7.M2e(2C>2S)。为构建表达载体V7.M2e(2C>2S)，将一对寡核苷酸退火并插入到表达载体V7(见下)中，载体V7在HB衣壳多肽基因的氨基酸V149之后接受插入。这在图2中示意显示。因此，构建了新的载体，以使自结合肽能够融合到HBc嵌合体的C末端。在HBC缬氨酸149和HindIII位点之间插入独特的EcoRI和Sacl限制位点，以促进合成的dsDNA定向插入到EcoRI-HindIII(或EcoRI-SacI)限制位点中。使用以下所示一对PCR引物来扩增HBcl49基因，该基因在氨基末端有Ncol限制位点，在羧基末端有EcoRI、Sacl和HindIII位点。将PCR反应的产物(479bp)用Ncol和HindIII消化并克隆到pKK223-3N中，以形成载体V7。为插入自结合肽，将质粒(V7)用EcoRI和HindIII(或EcoRI和Sacl)消化，将具有EcoRI/Hindlll(或EcoRI/SacI)突出端的合成dsDNA片段连接到V7中。对于所有的V7构建物，天然HBc(缬氨酸149)的最后一个氨基酸和插入的自结合肽的第一个氨基酸，被形成EcoRI限制位点的核苷酸所编码的甘氨酸-异亮氨酸二肽序列隔开。对于在EcoRI/SacI插入的表位，在终止密码子之前、自结合肽之后，有由Sacl位点提供的另外的谷氨酸-亮氨酸残基。以下同样用下划线表示限制位点。HBcl49/Nco工-F5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTASEQIDNO:278HBcl49/Sac工-EcoRI-H3-R5'-cgcaagcttagagctcttgaattccaacaaca3tactctcq3SEQIDNO:279以下以单字母代码显示M2肽C末端插入物的序列，该序列编码颗粒CV-1895[M2(2-24/C17S,C19S)]的DNA序列。islli;ev'etpirnewaatotctctgttaaccgaagtggagacgccgattcotaacgaatgggagagacaattggcttcacctctgcggctaagcattgcttacccgsrsndssdelseq'idno:29gtagccgctctaatgatagctctgacgagctseqidno:280catcggcgagattactatcgagactgcseq工dno:281实施例2:稳定化HB衣壳多肽VLP的分析进行了颗粒的表达和纯化后，用分析型尺寸排阻层析法分析其保持颗粒状形态的能力。当用这种方式分析时，无c末端稳定化颗粒(例如CV-1048)以颗粒状和非颗粒状物质的混合物的形式存在。CV-1895颗粒的类似分析揭示它们是作为均一颗粒结构洗脱出来(图4)。这些数据表明，M2e(2-24,C17S,C19S)序列当存在时与HBc的C末端融合，形成能使颗粒结构稳定化的分子间相互作用。这些数据进一步表明，分子间稳定化是在M2位置17和19的半胱氨酸残基不存在的情况下出现的。实施例3:用GCN4-pl亮氨酸拉链构建稳定化HBc多肽VLP为研究酵母GCN4转录调节子的亮氨酸拉链结构域以非共价方式使乙型肝炎衣壳多肽颗粒稳定化能力，将衍自GCN4蛋白的、在溶液中能同时形成二聚体和三聚体的修饰亮氨酸拉链GNC4-VL用基因工程法融合到C末端截短的HBc颗粒的C末端。按照实施例1的构建表达载体的方法，将编码GCN4-VL的合成寡核苷酸退火并插入到表达栽体V7中，载体V7在HB衣壳多肽基因的氨基酸V149之后接受插入。以这种方式连接到HB衣壳的肽具有以下序列RVKQLEDKVEELLSKVYHLBNEVARLKKLVGERSEQIDNO:282所获得的颗粒经分析型大小排阻层析法分析比原始CV-1048VLP更加稳定，基本上不发生核酸结合。实施例4:具有N末端含赖氨酸接头突出端的稳定化HBcVLP按照Clarke等，EP0385610的教导，将表位连接到适当修饰的HBc多肽VLP的N末端赖氨酸残基，例如，将CV-1895工程改造成在HBc衣壳多肽N末端具有另外的氨基酸残基。N末端突出端中可存在一个以上赖氨酸残基。这种工程改造的衣壳多肽在C末端具有稳定性肽，例如在实施例1中的流感A的M2蛋白的胞外自组装肽。这里使用了FMDV01和A12亚型的表位。这些是VP1衣壳蛋白的大约氨基酸残基142至大约160。这些序列可重复两次。例如，有用的表位是FMDVCQ〈FMDV01VP1AA137-162)-〈FMDV01VP1AA137-162)-Cys'-70以单字母代码表示，这个序列是MRNAVPNLRGDIiQVLAQpb/ART:LPTS鹏AVPNLRGDIiQVLAQKVARTIjPTSCSEG工DNO:283fmdva12,(FMDVA12VP1AA137-162)-(FMDVA12VP1AA137-162)-Cys:以单字母代码表示，这个序列是YSASGSGVRGDK3SLAPRVARQLPASYSASGSGVRGDLiGSLAPRVARQ:LPASCSEQIDNO:284FMDV表位的更短免疫原性序列可以被呈递，也可以被重复。有用的更小的肽是(FMDV01VP1AA145-150)-(FMDV01VP1AA145-160)-Cysrrgd;lqvrgd:lqvlaqkvartijPCseqidno;2s5和(FMDV01VPlAA145、:i50〉-(FMDV01VP1AA145-150)-(FMDV01VP工AA145-160)-Cys:rgdlqvrgdlqvrgd;lqviaqkvartlpcSEQIDNO:286.N末端接头突出端可具有任何适当的长度，条件是具有该突出端的HBc能自组装成核心样颗粒，另一条件是该接头突出端中的赖氨酸残基暴露出来可供进行偶联。如果需要，接头突出端可最长达IOO个氨基酸残基或更长。短接头突出端可最长达60个氨基酸残基，例如最长达40、20、10或5个氨基酸残基。一个合适的突出端包含I型脊髓灰质炎病毒(PV1)林如Sabin或Mahoney林的VP1衣壳蛋白的残基95-102，例如95-104:SabinPV1VP195-102:SASTKNKDSEQIDNO:287;SabinPV1VP135-104;SASTKNKDKLSEQIDNO:288MahcmeyPV1VP195-102,'PASTTUKDSEQIDNO:285MahcmeyPV1VP195-104:PASTTNKDKLSEGID亂'290如ClarkeEP0385610所教导，在HB衣壳多聚蛋白的任何N末端突出端中，通常前十四个N末端残基当中应有至少一个赖氨酸残基。为选择多肽用于进行偶联，选择具有这样的N末端突出端的HBc多肽是适当的，该N末端突出端在靠近其N末端处包含赖氨酸残基。而且，N末端突出端可以是亲水性的。可通过标准的遗传工程技术，获得其N末端接头突出端包含这些序列中的一个或任何其它掺入赖氨酸残基的序列的修饰HB衣壳多肽。实施例5:将异源表位化学连接到带有N末端含赖氨酸接头突出端的稳定化HBcVLP缀合物通过将表位偶联到修饰HBcVLP来制备，所述偶联是通过在修饰HB衣壳VLP的N末端接头突出端氨基酸残基当中存在的赖氨酸残基的侧链氨基来进行。这个偶联通常是这样实现的使4务饰HBcVLP与能够连接到氨基和连接到巯基的双功能试剂反应。然后使这样衍生化的修饰HBcVLP与表位反应，该表位如果本来不具有游离巯基，则事先对其进行了修饰使其具有疏基。合适的双功能试剂包括SMCC、MBS和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡咬基二硫)丙酸酯(SPDP)。双功能试剂往往包含能形成肽键的基团和能形成二硫键或硫醚键的基团。巯基可通过合成出含有半胱氨酸残基的肽来加到肽表位，该合成是通过使氨基官能团与2-亚氨基硫杂环戊烷或者3-(3-二硫吡咬基)丙酸或S-乙酰硫代乙醇酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来进行。在与S-乙酰硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酉旨(SATA)反应后，用例如羟胺使SATA脱乙酰化产生游离-SH基团。小分子表位，包括药物，按化学领i或7厶知的方法4汙生化。巯基修饰的HBcVLP在使用前先进行羧酰胺甲基化(carboxamidomethylated)，以阻断衍生化后在VLP上的任何未反应巯基，从而防止VLP互相交联。羧酰胺曱基化通过使衣壳多肽颗粒与碘代乙酰胺反应来实现；过量的试剂通过凝胶过滤或透析除去。或者且优选地，巯基在其加到的肽上作为半胱氨酸硫醇存在，该半胱氨酸辟K醇首先与双功能交联试剂反应。这样官能化的肽经纯化后与HBcVLP的N末端赖氨酸反应。类似的化学反应在美国专利6，231，864中有教导，该反应是赖氨酸残基首先加到HBc的免疫原性环中。在实践中，通常是将稳定化带接头HBcVLP在緩冲液如pH值约7的磷酸盐缓沖液中提供。加入摩尔过量的溶于惰性溶剂的双功能试剂，该溶剂例如非质子有机溶剂如二甲基曱酰胺。于是发生HB衣壳VLP的衍生化。将过量的双功能试剂例如通过过滤除去。然后加入过量的待偶联到HB衣壳VLP的表位。于是发生偶联，将所得的由表位连接到修饰HB衣壳VLP组成的缀合物例如通过过滤进行回收。优选的是首先将肽表位衍生化，然后使过量的该衍生化的肽表位与稳定化VLP反应。实施例6:将自结,合肽化学连接到HB衣壳多肽的N末端或C末端按照Clarke,EP0385610的方法和前面实施例所详述的方法，将在N末端或C末端带有1-6个另外的赖氨酸的、没有稳定性肽的HB衣壳多肽，例如CV-1048和其它多肽的衍生物，化学偶联到自结合肽。如在实施例l中，用分析型大小排阻层析法发现，所得的带N偶联或C偶联自结合肽的VLP比由未修饰CV-1048或其它HB衣壳多肽组成的VLP更加稳定。实施例7:将FMDVVP1残基141-160加上C末端Cys残基组成的肽偶联到稳定化带N末端接头突出端的HB衣壳VLP将例如以上实施例4所述的稳定化带合适N末端接头突出端的HB衣壳VLP,在两个连续蔗糖梯度上进行纯化，以5mg/ml的浓度在10mM磷酸盐緩沖液(pH7.2)中通过SephadexG100柱。这些在10mM磷酸盐緩冲液中浓度为2mg/ml的修饰HB衣壳多肽是这样进行衍生化的加入1/20体积的溶于干的二甲基曱酰胺的SMCC(PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL)，使得SMCC在VLP样品中的最终浓度相对于衣壳多肽为50倍摩尔过量。在室温下30分钟后，将SMCC在10mM磷酸盐緩冲液(pH7.2)中过滤通过SephadexG100进行除去。将刚溶解的、具有序列PNLRGDLQVLAQKVARTLPC(SEQIDNO:291)的体外合成FMDV141-160Cys以1/10体积加入，以提供相对于衍生化的HBc多肽10倍摩尔过量的肽。在室温下搅拌2小时后，通过SephadexG200过滤将未偶联的肽与这样衍生化的VLP分离。回收连接有肽的稳定化HB衣壳VLP。经分析型凝胶过滤层析法测定，这些VLP比基于CV-1048的同样加工的缺乏自结合肽的VLP更加稳定。实施例8:将HRV2肽偶联到稳定化HB衣壳VLP按照实施例7所述的程序，将包含NIm-n表位和具有序列VKAETRLNPDIjQPTCSEQIDNO:292的HRV2肽偶if关到带有N末端接头突出端的稳定化HB衣壳多肽VLP。回收连接有肽的VLP。如前所讨论，用分析型大小排阻层析法测定发现，这些VLP比缺乏自结合肽的在其它方面相同的VLP更加稳定。实施例9:HbsAgB细胞表位与带有N末端接头突出端的稳定化HB衣壳VLP的偶联按实施例7所述，将实施例4的带有N末端接头突出端的稳定化HB衣壳VLP用等摩尔的SMCC在DMF中进行衍生化。通过实施例7的方法，将刚合成的、包含来自preS蛋白的HBsAgB细胞表位残基132-145加额外的C末端Cys的、具有序列QDP職GLYFPAGGC卿工D助293的肽，与刚进行SMCC衍生化的带N末端接头突出端的稳定化HB衣壳VLP进行反应。用分析型大小排阻层析法测定发现，包含自结合肽如亮氨酸拉链肽的VLP,比缺乏自结合肽的在其它方面相同的VLP更加稳定。实施例10:衍自噬菌体MS2的衣壳多肽的稳定化VLP噬菌体MS2是光滑病毒科(丄eWWn'^e)中的能感染细菌的成员。如Mastico(1993)7!Wra/"74:541-548和Brown(2002)/"/wvz>o/ow,45:371-380所教导，对RNA噬菌体MS2的衣壳蛋白的质粒表达载体进行修饰，以在衣壳蛋白基因当中在对应于残基15和16之间的位点引入独特的Kpnl限制位点。在这个位点插入编码肽的DNA寡核苷酸，可以生产出被表达为位于外部的发夹(exterior-locatedhairpin)的中央部分的、具有外来肽序列的嵌合MS2衣壳蛋白。还在3'末端用基因工程法引入编码衣壳多肽的C末端的独特限制位点。在这个位点插入编码肽的DNA寡核苷酸，可以生产出独立于任何插入的异源表位的带有C末端自结合肽的嵌合MS2衣壳蛋白。在本实施例中，将编码人乳头状瘤病毒16的Ll蛋白(对应于具有序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>的蛋白质)的表位的寡核苷酸插入到MS2衣壳多肽编码序列中的Kpnl位点中。缺乏自结合肽的含表位衣壳多肽在大肠杆菌中自组装成基本上无RNA的VLP,其在提取后可容易地解开和重新组装。将编码GCN4蛋白(GCN4-pl)的野生型亮氨酸拉链肽(具有序列RMKQLEDKVEELLSKNYHLBNEVARiiKKIjVGERSEQIDNO:295)的寡核苷酸，插入到用基因工程法引入在衣壳多肽编码序列的3'末端的位点中。这样，当在大肠杆菌中表达时，含表位的衣壳多肽的C末端融合到GCN4-pl肽。所得的VLP具有高度免疫原性，且用分析型大小排阻层析法测定发现比由缺乏自结合肽的相同融合多肽组成的VLP更加稳定。实施例11:衍自在酉良酒酵母(5^cc/^rawjcascwevz&a)中表达的人多瘤病毒JCVP1的稳定化VLP缺乏前12个M酸的人多瘤病毒JCV衣壳多肽(VP1)不会将宿主DNA包壳，尽管衣壳样结构的完整性得到保持。[Ou等，(2001)JFz>o/.64:366-73]。VP1的12个氨基末端氨基酸和16个羧基末端氨基酸对于病毒样颗粒的形成是非必需的，但VP1任一端的进一步截短会导致这一特性的丧失。[Ou等，(2001)/7Vewravz>o/.7:298-301]。将N末端12个氨基酸用GCN4-VL肽取代，该肽在溶液中作为N-乙酰化肽形成三聚体和二聚体；GCN4-VL亮氨酸拉链肽的序列是SEQIDNO:296所述取代是这样进行的将编码该肽的杂交化互补寡核苷酸插入到衣壳多肽编码质粒中，而不是4又仅在除去编码N末端12个氨基酸的DNA区段后使该质粒重新环化。当在酵母中从强诱导型pGALl启动子表达时，经分析型大小排阻层析法测定发现，从嵌合衣壳多肽形成的空VLP比缺乏自结合肽的在其它方面相同的VLP更加稳定。实施例12:带有异源表位的稳定化禽兽棚病毒(FlockHouseVirus)VLP按照Hall的美国专利6,171,591的方法，将表位插入到罗达病毒(nodavirus)禽兽棚病毒衣壳蛋白残基205-209之间的外环中。在其它罗达病毒科(M^vz'nWae)成员的每一个(如黑曱虫罗达(BlackBeetle)病毒和日本库蚊罗达(Nodamura)病毒)的表面上，也发现相应的环。由于这类病毒在结构上的相似性，可以容易地进行类似的插入。将N末端20个残基删除，以使其失去核酸结合能力；将编码GCN4-VL肽的合成寡核苷酸退火并插入到表达载体中，以取代衣壳多肽N末端。将表达的VLP从杆状病毒表达系统纯化出来，经分析型大小排阻层析法分析发现比不含自结合肽序列的在其它方面相似的VLP更加稳定。实施例13:基于松皇蛾Q(A^/awe//acamera"omega)病毒衣壳多肽类似物的稳定化VLP对应于禽兽棚病毒的表位插入位点的环也可见于相关的四病毒科(7^rav/n'^e)的表面上，因此将松皇蛾Q病毒这种四病毒按类似于实施例13的方式进行修饰。将表位插入在外环中的氨基酸残基380和381之间，该外环从衣壳多肽的Ig样结构域中的残基374延伸到残基382。[M簡hi等,(1996)/嵐編.261:1-10]。来自四臂粘联蛋白(tetrabrachion)的能形成四聚体的肽[Stetefeld(2000)A^.5Vrwc.说o/.7:772-776]取代了Xtal结构所没有的N末端44个残基，以使VLP稳定化和减少核酸结合。用分析型大小排阻层析法测定所表达的VLP发现，从杆状病毒表达系统获得的颗粒比缺乏四臂粘联蛋白(tetrabrachion)的能形成四聚体的肽的空衣壳更加稳定。实施例14:衍自雀麦花叶病毒衣壳多肽的稳定化VLP雀麦花叶病毒(BMV)是一种感染植物的病毒，是雀麦花叶病毒科(SramowW&e)的典型成员。如Price等的美国专利5，869，287所教导，当N末端25个残基被取代的BMV衣壳多肽在酵母中表达时，该取代(缺失)会消除核酸结合能力，但也会导致VLP稳定性降低。用具有序列IFSLEQEKTRUiQQNTQLKRPlQEIi(SEQIDNO:297).的人AP-4蛋白亮氨酸拉链肽取代被缺失的残基，稳定性可以得到恢复，但核酸结合能力没有恢复。实施例15:衍自芜菁皱病毒衣壳多肽的稳定化VLP芜菁皱病毒(TCV)是il豆花叶病毒属(comovirus)的成员。该衣壳多肽的40个N末端残基具有核酸结合能力，将其删去或者用GCN-4pl自结合亮氨酸拉链肽取代。当在酿酒酵母中在强诱导型GAL1启动子的控制下表达时，可通过用玻璃珠在VSB緩冲液中进行旋涡搅拌来提取VLP。通过在pH7.2的50mM磷酸盐緩冲液中进行温育，将缺乏核酸结合域的TCV衍生VLP的稳定性与带有自结合肽的VLP的稳定性进行比较。按照实施例2进行分析型大小层析，证明自结合肽取代了N末端结构域的VLP比只进行缺失的VLP更加稳定。实施例16:衍自人乳头瘤病毒16Ll衣壳的稳定化VLP人乳头瘤病毒16是乳头瘤病毒科(尸^///0附。^>/^6)的成员。将自结合亮氨酸拉链肽GOT4-VIj證QIjEDKVEEI)1jSKVYHIjENBVARIjKKLVGER(SEQIDNO:298)遗传融合到HPV16Ll的N末端。将表位例如HPV16L2序列LVEETSFIDAGAP(SEQIDNO:299)在残基351-355处插入到免疫显性外环。已证实这种情况能增强外来肽在其存在于组装的VLP中时的免疫原性[Slupetzky等，(2001」(饥Wra/.82:2799-804]。使用杆状病毒表达系统是因为Kimbauer,(1992)TVoc.iVa/.5W.89:12180-4发现这个系统最佳。带有N末端亮氨酸拉链肽的VLP比缺乏自结合肽的相同VLP显著稳定得多，因此更具免疫原性。实施例17:衍自诺瓦克病毒衣壳多肽的稳定化VLP诺瓦克病毒是嵌杯样病毒科(0/Wv/n'^^)家族的成员。衍自诺瓦克病毒衣壳多肽的VLP用杆状病毒表达系统来产生。当这样产生出时，这些VLP组装成缺乏RNA的颗粒。因为残基228-530(整个外部P结构域)对于克隆形成来说是非必需的，故将它们从序列中缺失，同时用能形成二聚体的亮氨酸拉链取代N末端20个残基，以使B和C亚单位之间的相互作用稳定化。所得的缺乏P结构域的颗粒比缺乏自结合肽的在其它方面相同的VLP更加稳定。实施例18:衍自VP2人B19细小病毒主要衣壳的稳定化VLP人B19细小病毒是细小病毒科CParvoWW&e)的成员。衍自B19VP2主要衣壳多肽的空VLP通过在昆虫细胞中在多角体启动子的控制下从杆状病毒表达载体表达VP2来产生。[Kajigaya等，(1991)v4cad88:4646-4650]。将前25个氨基酸残基从N末端缺失，但不会破坏VLP自组装。[Kawase等，(1995)/Voc.扁.^cad69:6567-6571]。制备出这样的N末端缺失VP2的衍生物，其中VP2的N末端25个残基用c-Myc亮氨酸拉链自结合肽YIjSVQAEEQKLISEEDIiIjRKRREQLKHKLEQJj(SEQIDNO:300),取代。简单缺失VP2多肽和取代衍生物从杆状病毒载体表达后，将它们从昆虫细胞中提取出来。包含具有亮氨酸拉链的嵌合VP2多肽的VLP比包含简单缺失VP2多肽的VLP更加稳定。实施例19:衍自辛德毕斯病毒衣壳的稳定化VLP辛德毕斯病毒是披膜病毒科(7bgavzW&e)的成员。其衣壳多肽的N末端109个氨基酸残基牵涉到病毒粒子组装及核酸结合所需的衣壳多肽间相互作用。[Lin等，(2000)乂Wra/.74:493-504]。为消除核酸结合和使从嵌合多肽组装的VLP稳定化，将衣壳多肽的N末端109个氨基酸用串连亮氨酸拉链自结合肽取代。在这个构建物中，插入了两个自结合肽N末端是GCN4-pl亮氨酸拉链肽，接着是五个甘氨酸的柔性接头区段，再接着是c-Myc亮氨酸拉链自结合肽。当按照Frolov[(1997)Wra/.71:2819-2829]的方法在BHK细胞中表达时，带有取代衣壳多肽VLP的N末端109个氨基酸的双亮氨酸拉链的辛德毕斯衣壳多肽能够进行组装，而相应的N末端缺失衣壳多肽不能够进行组装。实施例20:衍自Physalismottle病毒衣壳的稳定化VLPPhysalismottle病毒是芜菁黄花叶病毒属的成员。当按照Sastri[(1997)/Mo/.所o/.272:541-52]的方法在大肠杆菌在中表达缺失了N末端30个氨基酸残基的衣壳多肽时，VLP可容易地进行回收。也可以容易地从表达这样的衣壳多肽衍生物的大肠杆菌获得VLP，该衍生物中的N末端30个氨基酸残基被GCN4-VL亮氨酸拉链取代。这些VLP当从大肠杆菌提取出来时，在中性pH下比缺乏自结合肽的VLP更加稳定。实施例21:衍自轮状病毒衣壳多肽的稳定化VLP轮状病毒是呼肠孤病毒科(/eov/nVfae)的成员。带有VP2的N末端92个氨基酸残基的大量取代的VLP可用痘苗载体在哺乳动物细胞中进行表达。这种VLP显示出核酸结合能力降低。[Charpilliene(2001)/历o/.276:29361-29367]。为使轮状病毒VLP稳定化，将COMP五聚化结构域遗传融合到VP2的N末端至最大N末端融合体可接受的程度。当提取出来时，包含其残基1-92被COM自结合肽取代的VP2的VLP比包含缺失了残基1-92的VLP更加稳定。实施例22:衍自烟草花叶病毒(TMV)衣壳的稳定化VLP烟草花叶病毒(TMV)是烟草花叶病毒属的典型成员。在带有TMV基因组包装信号的RNA不存在下，TMV衣壳多肽单体在溶液中会自組装成双层中空圓盘(disk)，每个圆盘具有大约17个拷贝的衣壳多肽。氨基酸残基89-114形成暴露在这些圆盘和病毒颗粒的空芯(hollowcore)中的内环。这些残基的序列是DTRNRlIEVENgQSPTTAET1jD(SEQ工dno:301)。为使无RNA的圆盘稳定化，放入稳定性元件，使得这些元件在TMVCP圓盘的空芯当中发生相互作用。因此，将TMVL毒抹的衣壳多肽(CP)工程改造成位置54和69处的赖氨酸变成甘氨酸,位置100处的谷氨酰胺(以上下划线处)变成赖氨酸充当接头位点。这样，在内环中，CP中只有一个赖氨酸。将羧基形式的金属离子辅助自结合肽，如SEQIDNO:1和2的那些肽，偶联到工程改造的TMVCP的内环赖氨酸接头，使得所产生的连接的工程改造TMVCP带有金属辅助自结合肽。衍生化的TMVCP在适当的金属离子存在下会自组装成双层圆盘。经分析型HPLC和离心测定发现，稳定化的双圆盘对温度和离子强度的变化的稳定性比从野生型TMVCP形成的圆盘更高。如果需要，可将异源表位遗传改造成作为工程改造的CP的C末端突出端而存在。由于该C末端在晶体结构上是无序的，且在组装的CP的外表面上存在，该表位的结构可独立于TMVCP载体。完全TMVLCP序列imsysitspsqfvflssvwadpiellnvctn31slgnqfqtqqa:rt匕vcjqgfsewkpfpgst61vrfpgdvykvyxynavldplitallgafdt91rairiievengqspttaetldatrrvddatv121airsainnlvnelvrgtglynqntfe抓sg151lvwtsapasSEQIDNO:302实施例23:衍自豇豆花叶病毒衣壳的稳定化VLP豇豆花叶病毒是豇豆花叶病毒科(Ow2oWn'^e)的典型成员。已证实豇豆花叶病毒的S衣壳多肽能容忍在位置22和23之间插入异源肽。[Porta等，(1994)r/TO/ogy202:949-955]。对于本实施例，将来自脊髓灰质炎病毒的Sabin毒林的、对应于序列为SASTKWKDKL(SEQIDNO:303)的VP1残基95-104的表位插入在该位点，该插入是用编码该表位和在其它情况下会丢失的S多肽残基18-22和23-26的退火互补寡核苦酸取代pMT7-FMDV-II的NheI/AatII片4殳来进行。当CPMVS和L在昆虫细胞中表达时，获得了基本上无RNA的VLP。[Shanks(2000)/Ge".Wra/.81:3093-3097]。将具有序列IjKFRFRDirERSKRSVMVGHTATAA(SEQIDWO:304)的COMP肽融合到S多肽的N末端，所产生的VLP比由缺乏自结合肽的衣壳多肽组成的颗粒更加稳定。实施例24:衍自酵母Tyl转座子衣壳的稳定化VLP酵母Ty1转座子是假病毒科(/^w^vzW&e)的成员。按照Kingsman的美国专利5,463,024的方法，将Tyl的TyA衣壳多肽进行修饰，使得具有序列GELAEQKLEQALQKLA〈SEQ工DNO:305》的金属离子辅助可三聚化自结合肽通过遗传融合连接到衣壳多肽的羧基末端。使用了对应于残基286-381的最小颗粒形成性TyA多肽。VLP在酵母的无Tyl菌林，例如酿酒酵母MD40-4c(urd2,trpl,leu2-3,leu2-112,his3誦11，his3-15)中产生。Ty-VLP如下进行纯化使酵母细胞在30°C下选择性生长至密度约8xl(^个细胞/ml。然后通过低速离心收集细胞，在用水预冷的水中洗涤一次，重新悬浮于TEN緩冲液(IOmMTris,pH7.4;2mMEDTA;140mMNaCl)中,浓度为1ml细胞/1升緩冲液。将细胞用玻璃珠(40目)在4。C下旋涡搅拌进行破碎，直到有超过70。/。的细胞破碎。将玻璃珠通过低速离心进行沉淀，然后收集上清液，通过在微量离心机中离心20分钟除去碎片。然后在4。C下以100，000g离心1小时，使Ty-VLP从上清液沉淀出来，将其在TEN緩冲液中重新悬浮过夜(约18小时)。将重新悬浮的Ty-VLP在微量离心机中4。C下离心15分钟，以除去细胞碎片，然后将上清液加样到15-45%(w/v)蔗糖梯度(在10mMTris，pH7.4;10nMNaCl中)，在15。C下以76,300g离心3小时。通过管的底部收集各流分，将峰流分取等分试样在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后对凝胶进行考马斯蓝染色鉴定峰流分。将峰流分在4。C下以100，000g离心1小时，以浓缩VLP。在与适当的金属离子如Ru(m)温育后发现，带有自结合肽的VLP比缺乏自结合肽的VLP更加稳定。实施例25:衍自丙型肝炎病毒衣壳的稳定化VLP丙型肝炎病毒是黄病毒科(F/av/v/n'^e)的成员。当按照Baumbert等，[(1998)JWra/.72:3827-3836]的方法在昆虫细胞中表达时，其衣壳多肽形成VLP。向该黄病毒衣壳多肽的C末端加入能形成三聚体的自结合亮氨酸拉链肽GCN4-LL,该肽的序列为R]jKQLBDKLEELLSKLYHIjENELAR1jKKLVGERSEQ工DNO;306在表达包含衣壳蛋白加自结合肽的VLP之后发现，嵌合VLP在磷酸緩冲盐水(0.9%NaCl,50mMNaHP04pH7.3)中比包含非修饰衣壳多肽的VLP更加稳定。实施例26:衍自脊髓灰质炎病毒衣壳多肽的稳定化VLP脊髓灰质炎病毒是小RNA病毒科CPicomaWnWae)的成员。空衣壳是大多数小RNA病毒科感染的天然产物。只有衣壳前体P1和病毒蛋白酶在能使衣壳稳定化的化合物吡罗达韦的存在下一起共表达并进行纯化，才在酿酒酵母中形成具有天然抗原性的空衣壳。[Rombaut(1997)/G饥Wra/.78:1829-1832]。向Pl(其随后在体内被3CD蛋白酶切割变成VP1thru4)的C末端加入金属离子辅助自结合肽，该肽前面有五个甘氨酸充当柔性接头；所得的C末端添加具有序列GGGGGGLAQKLLEALQKALA(SEQIDNO:307)。在p比罗达韦的存在下在酵母中表达嵌合多肽并从中进行纯化时，获得了带有金属离子辅助自结合肽的空脊髓灰质炎病毒衣壳。在与适当的金属离子如Ru"—起温育后发现，相对于没有金属离子的相同VLP或者包含没有自结合肽的脊髓灰质炎病毒衣壳多肽的VLP,这些衣壳的稳定性显著增加。实施例27:衍自麻瘆病毒衣壳的稳定化VLP麻渗病毒是副粘病毒^f牛(尸aram，)/xovzWdae)的成员。*接照Warnes[Ge"e(l"5)160:173_178]的方法，在大肠杆菌中表达编码核衣壳(衣壳)多肽的麻渗病毒(MV)基因。在pTrc99c质粒中在tac启动子控制下表达完整N基因产生出正确大小(60kDa)的蛋白质，该蛋白质代表大约4%的总细胞蛋白质，能被已知的麻渗阳性人血清识别。副粘病毒核衣壳所特有的"鲱鱼鱼骨"结构，在进行了电子显微镜;险查的破碎细胞中容易识別到。将编码金属离子辅助自结合肽(该肽序列为GGGGGGIAQKLLEALQKALA(SEQIDNO:308)的基因--该基因前面是编码五个充当柔性接头的甘氨酸的核酸序列——框内连接到N基因的C末端。在大肠杆菌中表达嵌合多肽并从中进行纯化后，获得了带有金属离子辅助自结合肽的麻渗病毒衣壳。在与适当的金属离子如Ru+3一起温育后发现，相对于没有金属离子的相同VLP或者包含没有自结合肽的麻渗病毒衣壳多肽的VLP，这些衣壳的稳定性显著增加。实施例28:衍自A型流感病毒衣壳的稳定化VLP流感病毒是正粘病毒科(OAom，yxov/nWae)的成员。其N末端189个氨基酸残基牵涉到RNA结合。用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中产生缺失了N末端RNA结合域的流感A核衣壳多肽，获得VLP。为使VLP稳定化，用前述的GCN4-pl亮氨酸拉链自结合肽取代N末端RNA结合域。当带有自结合肽的VLP在昆虫细胞中表达时，用于嵌合衣壳蛋白构建物的示例性表位和接头见下用于嵌合衣壳蛋白构建物的示例性表位和接头表位参考文献FMDVO.sub.l林的VP1的残基141-160美国专利5,874,087VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(SEQIDNO:309)自美国专利6171591B细胞表位水疱性口腔炎病毒(VSV)Kreis(1986)￡MSO,5:931-941G糖蛋白Kolodziej(1991」194:508-519毒林ts-045VSV印第安纳血清型YTDIERLGK(SEQIDNO:310)邻接B细胞和T细胞表位牛呼吸道合胞病毒(BRSV)Walravens等，(1990)JGe"P7ra/.71:3009-3014F蛋白Bourgeois等，(画)乂Ge".fW.72:1051-1058毒抹RB94DKBLLPKVNNHDCQISITIATVIEFQQ(SEQIDNO:311)邻接B细胞和T细胞表位人呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白毒抹RSS-2(亚型A)DKQLLPIVNKQSCSISNIETV正FQQ(SEQIDNO:312)邻接B细胞和T细胞表位人呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白毒林18537(亚型B)DKRLLPIVNQQSCRISN正TVIEFQQ(SEQIDNO:313)T细胞表位人呼吸道合胞病毒(RSV),和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)F蛋白毒抹RSS-2(亚型A)(RSV)18537(亚型B)(RSV),和RSS-2(亚型A)(BRSV)FPSDEF[100%序列保守](SEQIDNO:314)B细胞表位乙型肝炎病毒(HBV)N,th等，(1986)r固'"e4:35preS2残基132-145Itoh等，(1986)JVa".爿c^/.Sex.83:9174QDPRVRGLYFPAGG(SEQIDNO:315)*用以下表位制备的双嵌合体重叠Th和CTL表位乙型肝炎病毒(HBV)Franco等，(1997)7wmw"o/.159:2001-2008HbsAg残基178-204Greenstein等，(1992)///wm/"o/.148:3970LQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNF(SEQIDNO:316)自Cooper等的美国专利6,174,528A型链球菌表位链球菌M蛋白p145氨基酸337-356LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQIDNO:317)自美国专利6,060,064HIV-1分离物的V3环BH10SNCTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISG(SBQIDNO:318)HXBIISNCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISG(SEQIDNO:319)画SNCTRPNyNKRKRIHIGPGRAFYTTKMIGTIRQAHCNISG(SEQIDNO:320)MALSNCTRPGNNTRRGIHFGPGQALYTTGIVDIRRAYCTING(SEQIDNO:321)RFSNCTRPNNNTRKSITKGPGRVIYATGQIIGDIRAHCNIiSGS(SEQIDNO:322)ELISTCARPYQNTRQRTPIGLGQSLYTTRSRSIIGQAHCNISG(SEQIDNO:323)MAL(var)SNCTRPG丽TRRGIHFGPGQALYTTGIVDEIRRAYCNISG(SEQIDNO:324)RF(var)SNCTRPNNTRKSITKQRGPGRVLYATGQIIGDIRKAHCNSIG(SEQIDNO:325)ELI(var)STCARPYQNTRQRTPIGLGQSLYTTRGRTKIIGQAHCNISG(SEQIDNO:326)自美国专利6,110,466HIV-1gp41的氨基酸735-752Dagleish,A.G等，(1988)K/roZogy165:209-215;Chahn,T.C.等，(1986)丑M万O,5:3065-3071DRPEGIEEEGGERDRDRSD(SEQIDNO:327)人鼻病毒14的VP1的氨基酸85-99Lomonossoff等的美国专利6,110,466PATGIDNHREAKLD(SEQIDNO:328)T细力包表位恶寸生痴原虫(尸/cw7W(i/w/r2y^/c^anw7)LSA-ITl表4立Heal等，(2000)18:251-258LTMSNVKNVSQTMFKSLLRNLGVS(SEQIDNO:329)在cp的G14和T15之间向M2中的插入Mastico等，1993/"fen;/ra/ogy74:541-548HA9YPYDVPDYA(SEQIDNO:330)Wilson等，(1984)Ce//37:767-778IgEFVPFGSKTK(SEQIDNO:331)Stanworth等，(1990)丄a"c"336:1279-1281Mai(表面抗原)NANPNANPNANP(SEQIDNO:332)Greenwood等，(1991)J!MoZ.廳.220:821-827HPVLIPNDTFIVSTNPNTVTSSTPI(SEQIDNO:333)Dillner等，(1990)/"A/Ca"c"45:529-535HPVL2KGSPCTNVAVNPGDCPPLDL(SEQIDNO:334)Javaherian等，(1989)尸roc.iVa".^cW.&/.86:6768-6772HIVgpl20NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIG(SEQIDNO:335)B细胞和T细胞表位绿脓杆菌(i^eMtomo"oy"erwg/wora)PAK菌毛蛋白氨基酸82-104Smart等，(1988)/"/ec./wmw.56:18-23GTIALKPDPADGTADITLTFTM(SEQIDNO:336)其它插入生物素结合肽(自美国专利6,380,364)GGGCSWAPPFKASC(SEQIDNO:337)GGGRGEFTGTYITAVT(SEQIDNO:338本文引述的每个专利和文章通过引用结合到本文中。名词"一"包括"一个或多个"的含义。前文的描述和实施例是示例说明而非限制本发明。本领域技术人员还可以轻而易举地做出落入本发明精神和范围内的其它变化方案。权利要求1.一种嵌合多肽，该多肽包含a)第一多肽部分，该部分在水溶液中自组装形成具有至少约9个亚单位的有序、重复、超分子结构，和b)第二肽部分，该部分包含长度约15-约80个氨基酸残基的肽，所述肽i)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，ii)当在至少10μmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或iii)为流感AM2多肽的自组装细胞外域，条件是第二部分不是N-末端结合于第一部分即HBc多肽的包含0、1或2个半胱氨酸的细胞外M2区域；所述第一和所述第二部分通过共价键连接，且所述嵌合多肽形成的有序、重复、超分子结构比所述第一部分单独形成的结构更稳定。2.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一和所述第二部分通过肽键连接。3.权利要求l的嵌合多肽，其中所述第一部分包括接头残基。4.权利要求3的嵌合多肽，其中表位连接于所述接头残基。5.权利要求l的嵌合多肽，其中所述第一部分包括异源表位。6.权利要求5的嵌合多肽，该多肽当接种至宿主动物时引发免疫反应。7.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分包含丙酮酸脱氢酶酶复合体E2多肽。8.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分包含2,4-二氧四氢蝶啶合酶多肽。9.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分为病毒衣壳多肽或病毒衣壳多肽类似物。10.权利要求9的嵌合多肽，其中所述第一部分包含感染动物病毒、感染植物病毒、感染细菌病毒或感染真菌病毒的衣壳多肽或病毒衣壳多肽的类似物。11.权利要求1的嵌合多肽，其中所述第一部分包含多肽的N-末端部分，所述第二部分包含所述多肽的C-末端部分。12.权利要求10的嵌合多肽，其中所述第一部分包含乙型肝炎病毒衣壳多肽。13.权利要求l的嵌合多肽，其中有序、重复、超分子结构是病毒样颗粒(VLP)。14.权利要求l的多肽，其中所述笫一部分包含选自以下科或属的病毒的衣壳多肽小核糖核酸病毒科(ft'cw"awW^e)、嵌杯样病毒牙牛(Ca/z'cz'v/W(i(3e)、才皮月莫病毒牙斗(7bgavz>/<i<3e)、黄病毒一牛(F/認'v/nWae)、弹状病毒科(i/zaM。Wr油e)、副粘病毒科(户aram;KXCiWn'(iag)、正粘病毒科(CW/z謹，o"v7W^e)、呼肠孤病毒科(ieov/nWae)、逆转录病毒科(Adrav/n'cfae)、多瘤病毒科(尸0/70wav/nV^ae)、專'L头瘤病毒牙牛(尸a//〃omav/n'(iae)、享'L头多空病毒牙+(户07^ovaWnV/ae)、肝DiV^病毒一+(//e/^c/"avzWdae)、罗达病毒一牛(A^^mWc/ae)、四病毒一牛(7^rav/n'^3e)、蕃茄丛矮病毒一牛(Jb附^w^WnV/"e)、豆工豆花叶病毒:#(Ccwov/nV/"e))、洱关体病毒-牛(Gew/"/v/r/(iae)、雀麦花叶病毒-牛(5rawoWnVfea)、马铃薯Y病毒科(Po/yvzWcfe(3)、丝形病毒科(/"o由'(iae)、光滑病毒科(Z^WvzW(i"e)、微病毒科(Mz'crav/r油e)、假病毒科(尸化W(iovzV油e)、球状真菌病毒科(7b"vzWt/ae)、转座病毒科(MetoWnWae)和蔓菁黄花叶病毒科(7>movzWdae)，以及》因草花叶病毒属(to^wwvz>j)、蔓菁黄花叶病毒属((ymov/n^)、马铃薯X病毒属(/otocvzVus)和南方豆花叶病毒属(TO&e附cw7"w)。15.权利要求l的嵌合多肽，其中所述第一部分包含二十面酶复合体的自组装多肽亚单位。16.—种重组嵌合乙型肝炎病毒核心(HBc)蛋白分子，其长度至多约570个氨基酸残基，该蛋白分子(a)包含HBc分子N-末端150个氨基酸残基中至少约135个残基的序列，其中包括通过肽键连接的异源表位或用于连接存在于HBc免疫显性环中缀合表位的异源接头残基；或N-末端150个HBc氨基酸残基中至少约135个残基的序列，(b)包含长度约15-约35个残基的氨基酸残基的C-末端自结合序列，所述自结合序列当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH7.0、浓度约10mmol的PBS水溶液中形成自组装的平行多聚体，(c)包含从HBc位置135至HBc的C-末端的至少5氨基酸残基的序列，所述嵌合分子(i)包含不超过10%保守取代的HBc序列中的氨基HBc嵌合体形成的颗粒更稳定。17.权利要求16的重组HBc嵌合蛋白分子，其中所述通过肽4建连接的异源表位或用于连接缀合表位的异源接头残基为异源表位。18.权利要求17的重组HBc嵌合蛋白分子，其中所述异源表位为B细胞表位。19.权利要求18的重组HBc嵌合蛋白分子，包含通过肽键连接于HBc的氨基酸残基1-4之一的第二异源表位。20.权利要求18的重组HBc嵌合蛋白分子，其中所述B细胞表位通过肽键连接在氨基酸残基76和85之间的HBc序列中的位置，并且位置76至85之间的HBc序列的至少5个残基被呈递。21.权利要求20的重组HBc嵌合蛋白分子，其中氨基酸残基76和85之间的HBc序列被呈递，但被所述B细胞表位中断。22.权利要求17的重组HBc嵌合蛋白分子，还包含通过肽^t连接的异源T细胞表位。23.—种稳定超分子结构的方法，该方法包括将第二自结合肽部分连接于第一多肽部分，其中所述第一多肽部分自组装形成具有至少约9个亚单位的有序、重复、超分子结构，所述第二肽部分包含长度约15-约80个氨基酸残基的肽，并且所述第二肽a)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平行多聚体，b)当在至少10iumol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或c)为流感AM2多肽的自组装细胞外域。24.—种稳定病毒样颗粒的方法，该方法包括a)通过将第二自结合肽部分共价连接于第一多肽部分来制备嵌合多肽，其中所述第一多肽部分为病毒衣壳多肽或衍生自病毒衣壳多肽，所述第二肽部分包含长度约15-约80个氨基酸残基的肽，所述第二肽i)当以N-乙酰化肽形式存在时，在pH7.0、浓度为约10mmol/L的PBS水溶液中自组装形成平^f亍多聚体，ii)当在至少10inmol/L浓度的溶液中存在时，在五倍摩尔过量的预定多价金属离子存在下，发生自组装，或iii)为流感AM2多肽的自組装细胞外域，条件是第二部分不是N-末端结合于第一部分即HBc多肽的包含0、1或2个半胱氨酸的细胞外M2区域；和b)将多个所述嵌合多肽在含水组合物中维持足够长时间，使病毒ii)回收所述病毒样颗粒，所述稳定化的病毒样颗粒比包含缺少所述连接的自结合肽的病毒衣壳多肽的病毒样颗粒更稳定。25.—种超分子结构，该结构由权利要求1的嵌合多肽形成。26.—种颗粒，该颗粒由权利要求16的重组嵌合乙型肝炎病毒核心蛋白分子形成。全文摘要公开了一种嵌合多肽，该多肽包含i)第一部分，自组装形成包含至少约9个亚单位的有序、重复、超分子结构，其共价连接于ii)第二多肽部分，包含长度约15-约80个氨基酸残基的肽。第二部分肽自组装形成平行多聚体。本发明精心设计的嵌合多肽形成的颗粒比第一多肽形成的颗粒更稳定，该第一多肽除缺少第二多肽部分的共价连接的自结合肽序列外，在序列的其它方面相同。文档编号A61K39/00GK101309699SQ200680040527公开日2008年11月19日申请日期2006年8月25日优先权日2005年8月31日发明者A·J·伯克特申请人:塞尔德克斯医疗有限公司