专利名称：：用于个人化抗癌化疗(pac)的综合诊断检测方法
技术领域：
：本发明涉及癌症治疗领域。本发明特别涉及对个体患者的癌症进行最有效治疗的鉴别。发明的背景癌症是高度个体化的疾病，目前采用单一药物进行治疗的良好响应率(responserate)较低(~20%)。为了提高响应率，针对每名患者选择正确的药物尤为重要。不同的患者对相同药物的响应途径各不相同，这很可能归因于由遗传导致的个体差异，这一点得到了公认。针对药效的遗传性差异的临床观察已经开辟了药物基因组学的领域。在已报导的许多病例中，药物响应的个体间差异归因于编码药物代谢酶、药物转运蛋白或药物靶点的基因中的序列突变体(例如，参见Evans,W.E.Johnson,J.A.Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2001;2:9-39和McLeod,H丄.Evans,W.E.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2001;41:101-121)。除了宿主对药物代谢的异质性之外，肿瘤的变化也影响肿瘤对特定药物的响应，例如1)如果结肠癌患者的胸苷酸合成酶、胸苷磷酸化酶和二氩。密啶脱氢酶表达水平低，绝大多数结肠癌患者都会对5-FU化疗有响应。如果一种或多种酶的表达处于高水平，则患者的响应就很低；2)卩微管蛋白突变的患者对以紫杉醇(paclitaxel)为基础的化疗响应不佳，而约40%的具有野生型卩微管蛋白的患者则具有完全或者至少部分的响应。此外，携带野生型卩微管蛋白基因的患者的中位生存(mediansurvival)也被改善了；3)可以使用受体蛋白的HER-2/neu基因扩增或强过表达(免疫组织化学+3)来鉴定更有可能对细胞毒性化疗和曲妥珠单抗(trastuzumab)的组合产生响应的患者的子集。作为针对患有转移性乳腺癌妇女的一线治疗，单一药物曲妥珠单抗是有活性的并且被很好地耐受，而这种乳腺癌表现出HER-2/neu过表达或基因扩增；以及4)高核苷酸切除修复活性与非小细胞肺癌细胞对顺铂的抗性密切相关，已经有关于人卵巢癌细胞中ERCC-1表达水平和顺4自诱导的DNA损伤的修复之间的关系的报导。上述例子表明肿瘤细胞上的一种或多种特定生物标记物的表达水平与肿瘤对特定药物的响应有关。由于更多新近的抗癌药物被设计成在生命过程(例如，修复，有丝分裂)中对抗特定的.细胞成分(例如，受体，酶)，因此可能可以发现这样的生物标记物，即当用机理上相关的抗癌药物治疗时，该标记物能够显示肺瘤细胞的响应(参见例如，Park等，ClinicalCancerResearch2004;10:3885-3896和VandeWoude，G.F.等，ClinicalCancerResearch2004;10:3897-3907)。本领域/>认需要将个体的特定肺瘤与最有效的治疗方式相匹配，即需要个人化的抗癌化疗(PAC)。本发明满足这个以及其它要求。发明概述本发明通过体外成像技术建立了用于个人化抗癌化疗(PAC)的分子诊断检测方法。PAC包括了以药物响应指示剂/生物标记物(DRI)表征获自个体患者的肿瘤细胞。靶向化疗药物的出现以及对肺瘤细胞生物标记物表达的阐明使得该方法受到了欢迎，该方法可以与肿瘤对机理上相关的药物的抗性相关联。已经釆用计算机化的焚光显微系统对新鲜细胞或保存在石蜡块中的存档细胞(archivalcell)进行肺瘤体外成像。利用焚光微球作为参考对测量值进行标准化。在某些具体实施方案中，本发明包括从患者获取一种或多种肿瘤细胞并对肺瘤细胞进行表征。表征可以包括通过抗体，特别是单克隆抗体对肿瘤进行表征。典型的这样的抗体会以肿瘤细胞成分作为靶点，而这些细胞成分是与化疗药物的作用机理有关的。这些成分的存在、缺失或数量都反映了肿瘤细胞对治疗中使用的相关药物的敏感性或抗性。本发明提及的细胞成分是与特定的化疗药物的作用机理有关的，其可以被认为是针对该化疗药物的药物响应指示剂(DRI)。在某些具体实施方案中，抗体可以被标记，例如可以用不同的荧光染料标记每种抗体，这些染料在同时进行的个体检测中具有不同的激发和非重叠的发射光谱。可以测定这些不同的经荧光标记的抗体的结合，例如可以进行定量测量。在某些具体实施方案中，可以使用计算机化的荧光显微系统和记录系统进行测量，所述荧光显微系统相对于用于光学标准化的基准对荧光强度进行定量。明确地对应于不同化疗药物的不同响应指示剂的定量是根据以细胞中药物响应指示剂为靶点的经染料标记的抗体的荧光来测量的，可以对比来自不同的相关癌症细胞系的上述定量，而这些细胞系都表现出不同程度的对特定抗癌化疗药物的细胞毒性响应。通过外推来自不同相关癌症细胞系的药物响应指示剂的数据来解释来自患者肿瘤的药物响应指示剂的数据，在培养物中所述癌症细胞系针对相关的药物治疗有着不同的细胞毒性lf丈感性。通过记录对药物响应指示剂的阳性和/或阴性影响来评价化疗药物的预期效果，而所述药物响应指示剂与特定药物有关，即肿瘤细胞中某些药物响应指示剂的缺失或存在，以及数量高或低会导致肿瘤对特定药物治疗不响应(或不敏感)。这种预期可以描述哪一种经政府(FDA)批准的化疗药物最有可能在个体患者的抗肿瘤治疗中无效。因此，在某些具体实施方案中，根据来自个体癌症患者肺瘤细胞的药物响应指示剂的显示结果，通过将所有采用无效药物的治疗排除在外从而选出用于个体患者的有效化疗药物。本发明通过对采用药物治疗的细胞培养物数据的统计学分析，证实了药物响应指示剂的数量与药物活性直接相关。在某些具体实施方案中，肿瘤细胞样品可以由血液中的循环癌细胞获得，该循环癌细胞代表了体内转移癌。在某些具体实施案中，肿瘤细胞样品可以由邻近原发性肺瘤的淋巴结获得，淋巴系统中的循环癌细胞可以通过如支气管窥镜活检的活组织检查方法获得。在某些具体实施方案中，肿瘤细胞样品可以由原发性胂瘤获得，而肺瘤组织是通过活组织检查或手术切除的标本获得的。在某些具体的实施方案中，当样品是获自原发性肿瘤时，可以将肿瘤组织固定在福尔马林中，并且包埋在石蜡快中，可以将其6切成薄切片，置于显微镜载玻片上用于检查。在某些具体实施方案，由肿瘤组织的石蜡块制备带切片的载玻片可以采用二曱苯和乙醇清洗进行脱蜡，并且可以经过抗原修复过程的处理，例如加热/水解(hydroloysis)/复性，然后可以用适宜的焚光标记的单克隆抗体染色，所述单克隆抗体是对抗鉴别过程以及药物响应指示剂的定量测量中所使用的不同细胞成分的。在某些具体实施方案中，可以釆用计算机化的荧光显微系统对经处理的载玻片上的组织进行检查、成像、分析和记录。在某些具体实施方案中，可以同时在相同视野下对带切片的载玻片上的5种或更多种焚光抗体进行测定、成像、分析和记录。本发明可以-陂用于分析任何来源的癌症和任何治疗方法。例如，源于胸部、肺、结肠的癌症细胞系以及其它上皮细胞来源的癌症，它们都对政府(FDA)批准的不同细胞毒性药物表现出不同程度的抗性(或敏感性)。细胞毒性药物可以包括但不限于卡铂、顺铂、奥沙利铂、多西紫杉醇、紫杉醇(paclitaxel)、紫杉醇(taxol)、长春瑞宾(长春花生物碱)、5-氟尿嘧啶相关的药物(如希罗达，xeloda)、吉西他滨和蒽环类。在某些具体实施方案中，抗癌药物可以包括人用单克隆抗体，如曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀，herceptin)、西妥昔单抗(cetuximab)(爱必妥，erbitux)以及贝4戈单4元(beracizumab)(阿瓦-Jt汀，avastin)。在某些具体的实施方案中，药物响应指示剂包括以下细胞成分(抗原)，并且可以被用于评价经FDA批准的相应抗癌药物的有效性药物响应指示剂ERCC1鲁激素受体卩-微管蛋白III亚型药物卡铂顺柏奥沙利铂他莫昔芬芳香酶抑制剂多西紫杉醇紫杉醇(paclitaxel)紫杉烷(taxane)长春瑞宾胸苷酸合成酶5-FU相关的药物希罗达核糖核苷酸还原酶吉西他滨拓朴异构酶n蒽环类HER-2/neu受体，PTEN曲妥珠单抗(赫赛汀)在某些具体实施方案中，药物响应指示剂可以包括以经适当标记的单克隆抗体治疗性药物为靶点的抗原，如适当荧光标记的曲妥珠单抗(trastuz腦ab)(赫赛汀,herceptin)、西妥昔单抗(cetuximab)(爱必妥，erbitux)以及贝4戈单^t(beracizumab).(阿瓦其斤汀，avastin)。在一个具体实施方案中，本发明提供一种选择用于治疗个体癌症患者的癌症的治疗药物的方法，其中包括从患者中获取肺瘤细胞样品，采用抗体确定样品中的多种药物响应指示剂；并且选择化疗药物。在某些具体实施方案中，抗体可以是经荧光标记的，例如单克隆抗体。当抗体经荧光标记时，特异性针对每种待测药物响应指示剂的抗体可以经不同的荧光染料标记，所述荧光染料具有不同激发和非重叠发射光谱，可以同时对多种药物响应指示剂进行定量。典型地，药物响应指示剂是与化疗药物的作用机理有关的细胞成分，并且是基于样品的细胞中存在的药物响应指示剂的存在/缺失或数量来选择的。当检测到一种或多种药物指示剂的存在，并且希望对存在的药物响应指示剂定量时，这种定量可以包括将样品中药物响应指示剂的荧光强度与一种或多种参考基准进行比较。典型地，本发明的方法可以包括测定至少5种药物响应指示剂。在某些具体实施方案中，测定步骤包括将样品中的多种，例如5种或更多种药物响应指示剂的数量与细胞中相同的药物响应指示剂的数量进行对比，而所述细胞对通过药物响应指示剂发挥作用的化疗药物的响应是已知的。任何相同类型的样品均可以用于本发明的实践中，例如样品可以取自患者血液中的循环癌症细胞，取自邻近患者原发性肺瘤的淋巴结或者取自患者的原发性胂瘤。本发明的方法可以被用于对任何适合的所属
技术领域：
已知化疗药物进行选择，例如卡铂、顺铂、奥沙利铂、多西紫杉醇、紫杉醇(paclitaxel)、紫杉醇(taxol)、长春瑞宾、长春花生物碱类、5-氟尿嘧啶相关的药物、希罗达、吉西他滨、蒽环类、人用单克隆抗体，曲妥珠单抗(赫赛汀)、西妥昔单抗(爱必妥)以及贝伐单抗(阿瓦斯汀)。在某些具体实施方案中，至少一种药物响应指示剂是ERCC1，并且化疗药物选自卡铂、顺铂和奥沙利铂。在某些具体实施方案中，至少一种药物响应指示剂为P-微管蛋白III亚型，并且化疗药物选自多西紫杉醇、紫杉醇(paclitaxel)、紫杉烷和长春瑞宾。在某些具体实施方案中，至少一种药物响应指示剂为胸苦酸合成酶，并且化疗药物选自5-FU相关的药物，曱酰四氢叶酸、Pemetrexd和希罗达。在某些具体实施方案中，至少一种药物响应指示剂为拓朴异构酶n,并且化疗药物选自蒽环类、阿霉素和表柔比星。在某些具体实施方案中，至少一种药物响应指示剂为拓朴异构酶I,并且化疗药物为伊立替康。在某些具体实施方案中，至少一种药物响应指示剂为核糖核酸酶还原酶，并且化疗药物为吉西他t<'已经建立起三种i貪断^r测方法以实施该方法。这些i貪断4企测方法为(1)药物响应指示剂检测(DRIT);(2)用于HER-2/neu过表达为阳性的乳腺癌患者的赫赛汀-紫杉烷响应检测(HER-Tax检测)；(3)循环癌症细胞检测(CCCT)。DRIT和HER-Tax是用于DRI的定量测量的才全测方法，而CCCT测量循环癌细胞(CCC)的数量以及CCC中DRI生物标记物的表达。这三种检测提供了有关个体患者肿瘤的药物响应的综合信息，通过它们能够选择出最有效的化疗治疗方法。例如，可以利用单克隆抗体(MAB)测定乳腺癌和肺癌，或者肿瘤组织切片载玻片中DRI的表达水平，而该单克隆抗体是经用于标本染色的荧光染料标记的。要建立起一种指标系统(indexingsystem)将DRI的表达和具有不同药物抗性的不同癌症细胞系的细胞毒性响应(IC50)关联起来。这种细胞毒性的关联性涉及测量包埋在石蜡块中的癌症细胞的DRI,从而建立起一种能够用作基准的标准细胞系，该基准是关于石蜡块上切下的人类肿瘤组织切片的DRI表达的。每种经测量的肿瘤切片中的DRI的参考范围可以由对应于药物的抗性/响应概率算出，而药物的抗性/响应概率是才艮据培养物中癌细胞的IC5Q得出的。利用临床结果记录进行回顾性临床研究以验证该DRI指数的参考范围。这种应用上的革新是基于(l)体外成像系统的发展；(2)与DRI水平相关联的细胞毒性响应的指标系统；(3)由肿瘤抗性的概率来显示，对应于肿瘤响应的DRI指数的参考范围。在考虑患者的DRI指数以及临床响应的参考范围后，主治医师能够有依据地决定该患者的药物处方。附图的简要说明图1是采用InSpeck显微镜图像强度校准试剂盒(6微米荧光微球)生成的标准曲线，该试剂盒是用于对比来自不同肿瘤细胞制品的HER-2/neu定量数据。图2是显示乳腺癌患者组织切片的HER-2/neu荧光信号的数字图像。该切片是由包埋在石蜡块中的肺瘤组织上切下的，其经过曲妥珠单抗-Alexa532染色处理，通过焚光显微镜分析并经CCD照相机成像。图3显示了被选用于HER-2/neu定量的经曲妥珠单抗-Alexa532染色的细胞膜区域中的目标区域(AOI)。发明详述术语"生物学标记物(生物标记物)"；故定义为"作为正常生物学过程、发病过程，或者对治疗性干预的药理学响应的指示剂而被客观测量和评价的特征"。对于本申请的目的而言，细胞中药物响应指示剂是一种提供细胞如何对药物进行响应的4言息的生物标记物。本发明对PAC的发展是基于(1)根据荧光强度对每种细胞的目标区域中的药物响应指示剂(DRI)进行定量测量和同时测量，以参考基准进行标准化。荧光显示了经标记的抗DRI的MAB的染色数量。(2)采用一组(battery)对不同抗癌药物具有不同抗性的细胞系，以及在统计学上将每种药物对细胞体外生长的抑制与有关该药物的DRI测量关联起来。(3)来自个体癌症患者的肿瘤细胞和肿瘤组织用作DRI测量的原料。化疗药物的低效能和实际的副作用，以及开发新型抗癌药物所需的高成本和时间推动了PAC的发展。将现有的抗癌药物更有效地用于个体患者是一种很大的需求。PAC的临床应用可以提供一种或多种以下优点1)指标系统为患者提供了关于对处方药产生抗药性的概率的参考，而这种概率是由患者的DRI表达所表示的，这样指标系统将指导医生开具一种药物或系列药物的处方。2)同时对几种经FDA批准的药物(3-6种)以及几种用于这些药物的定量生物标记物进行^r测。通过这种方式，可以迅速将无效的药物从备选的治疗方法中删除，并且用可选择的更有效的药物来代替。3)检测可以实时进行(2-3天)，却是廉价的(少于1000美元)，大容量(专业实验室每天进行多达100次检测)的，并且可以在普通医院中进行。4)图像技术为肿瘤DRI值的定量测定奠定了基础，其包括对肿瘤异质性(heterogeneity)的评价。这种对异质性的测定可以显示出该患者对该药物的响应持续时间。根据对文献的认真查阅，经FDA批准的广泛用于乳腺癌、肺癌和结肠癌以及分别用于乳^^癌、肺癌或结肠癌，并在才几理上与DRI相关的药物的目录如下表所述。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>下表提供了6种癌症的靶向抗癌化疗药物的药物响应指示剂(DRI)，该表还提供了另外的药物响应指示剂。所列化疗药物来自于国家综合癌症网络(NationalComprehensiveCancerNetwork,NCCN)2006年肺瘤学临床实践指南(ClinicalPracticeGuidelinesinOncology)。有关化疗药物的DRI来自文献。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注1)对经多聚曱醛固定后的活组织检查中的新鲜癌症细胞，以及固定在福尔马林中并且包埋在石蜡块中的肿瘤组织切片进行DRI测定。2)针对DRI检测的相关性临床研究将在IV期病人或转移性患者上进行。根据这群患者的胂瘤尺寸或数量来确定更多已知的临床响应。但是该结果适用于化疗的所有阶段，包括辅助期(adjuvantstage)。3)就肺癌而言，这些药物用于小细胞肺癌(以星号表示)以及非小细胞肺癌，除了多柔比星仅用于小细胞肺癌。4)贝伐单抗(阿瓦斯汀)用于乳腺癌、结肠癌、肺癌的组合。一项单独的DRI检测可以获得有关阿瓦斯汀与肺瘤细胞的结合的评价。如上所述，建立指标体系需要一组对不同抗癌药物具有不同抗性的癌细胞系。源于永生细胞系的肺瘤通常表现出强力的增殖，其满足功能性癌症细胞模型系统的要求。癌细胞系已经被用于预测对抗癌药物的响应，并取得了一定程度的成功。在一项研究中，针对39种人癌细胞系对55种细胞毒性癌症药物的壽丈感性，对这39种人癌细胞系进行了分析。结论为完整的基因表达和化学敏感性情况的数据库可以用于开发用于预测药物效力的系统。在另一项研究中，31种细胞毒性药物的II期试验结果是与国家癌症研究所人肿瘤细胞系组的筛选相关的。其结论为体外细胞系模型可以以不同的方式对非小细胞肺癌、乳腺癌和卵巢癌进行预测。虽然没有研究是针对于临床应用系统的，但是它们表明人癌细胞系的细胞毒性敏感性能够用于对临床试验结果的关联和预测。靶向抗癌治疗的有效应用与分子诊断技术一起形成了个人化抗癌化疗(PAC)。目前，PAC是癌症治疗发展中最具前景的。HER-2/neu表达以及用于治疗转移性乳腺癌(MBC)患者的曲妥珠单抗是第一个经FDA批准的Rx-Dx联合(coupling),并用作PAC的模型系统。本发明包括体外成像技术和分子诊断的应用，其特征在于获自个体患者的肿瘤细胞用于药物响应指示剂/生物标记物的定量，并应用该信息来选择适宜用于患者的治疗方案。分子诊断方法由以下三个步骤组成(1)从个体癌症患者获取癌细胞样品；这些癌细胞可以获自冷冻肿瘤切片、活组织检查原料、血液中的循环癌细胞或取自连续切片的存档细胞，所述切片是从包埋在石蜡块中的经福尔马林固定的肿瘤组织上切下的。14(2)定量评估肿瘤细胞中表达的生物标记物(药物响应指示剂，DRI),因为这些生物标记物的表达水平是与肿瘤细胞对特定靶向治疗的抗性有关的。评估可以包括采用经适当荧光标记的，以细胞生物标记物为耙点的单克隆抗体(Mab),该细胞生物标记物是肿瘤细胞对靶向治疗产生抗性的原因。可以釆用计算机化的荧光显微镜系统、适当的软件以及参考基准来完成定量。(3)根据肺瘤细胞中药物响应指示剂的表达与肿瘤细胞对机理上相关的药物的细胞毒性响应之间的相关性，选择适宜的治疗方案。可以使用一组对不同抗癌药物具有不同抗性的相关癌细胞系。这些药物对培养物中的癌细胞系增殖的作用以及在这些细胞系中相应的DRI的表达水平一同被确定。由于这些数据是与肿瘤对靶向治疗药物的抗性有关的，因此这些数据能够说明肿瘤细胞的DRI表达水平(通过荧光)。将针对特定药物的DRI表达与特定患者对该药物治疗的临床响应之间的相关性进行推广(extending)，其实验基础就是体外药物细胞毒性-DRI的关系。这种相关性推广到包埋在石蜡块中的癌细胞的DRI测量中，其,可以作为从石蜡块上切下的人肺瘤组织切片的DRI表达的参考。可以确定肿瘤切片中每种DRI测量值的参考范围，其显示了基于培养物中癌细胞的IC5。的相应的对药物的抗性/响应概率。根据肿瘤细胞中DRI的积极和/或消极影响，对施用于患者肺瘤的靶向治疗的有效性进行预测，即肿瘤细胞中DRI的缺失/存在或数量低/高会导致肿瘤对特定药物治疗不发生响应。因此，根据对癌症患者的肿瘤细胞的DRI测量结果，将所有采用无效药物的治疗排除掉，从而完成了对有效用于患者的靶向治疗的选择。个体患者的肺瘤对特定药物的响应持续时间还可以通过具有抗药性的肿瘤细胞的百分比与没有抗药性的肺瘤细胞(肺瘤的异质性)的百分比之比来进行评价。当肺瘤的无抗性部分被药物攻击并且被消灭时，那么剩余的抗性细胞成为占优势的部分，并且整个肺瘤产生抗药性。这种推理表明对肿瘤异质性的测定将是抗性的标志，并且进一步表明必须使用另一种有效药物作为组合和/或后续治疗来延长患者的生存时间。在临床应用中，患者的响应率(RR)和/或病情发展时间(TTP)与他们的肺瘤的DRI测量值在统计学上是相关联的。具有不同DRI指数的每位个体患者的抗性(非响应性)概率的参考范围将被构建起来。在参考个体患者的DRI指数以及临床响应的参考范围后，主治医师能够就该病人的药物处方做出有依据的决定。为了实施PAC方法，已经建立了三种诊断检测方法以服务于癌症患者。这些诊断性测试方法为(1)药物响应指示剂检测(DRIT);(2)赫赛汀-紫杉烷响应检测(HER-TAX测试)；以及(3)循环癌细胞检测(CCCT)。这些检测将在下文进一步描述。癌性细胞具有两种明显的特征1)在宿主中不受控制地复制，形成肺瘤，以及2)肺瘤增大、扩散并妨碍身体的生命机能，导致死亡。当癌症或肿瘤不能被物理力(外科手术或放射)移除或破坏时，那么就需要全身性的抗癌化疗。抗癌化疗成功的关4建在于破坏肿瘤细胞而不损害正常细胞的能力，正常细胞是宿主内占绝对多数的细胞。由于不可控制的复制以及妨害正常功能是癌症细胞的特征，因此大多数抗癌的细胞毒性药物都被设计成对细胞实体(entities)以及复制过程所涉及的过程进行攻击。现代抗癌细胞毒性药物都属于耙向治疗，其目标是生命过程所涉及的细胞成分，例如DNA复制酶、核苦酸(核酸的结构单元)酶、DNA^'务复酶、传送复制信号的受体等。根据这些关键的蛋白部分(moieties)，可以容易地制备出具有范围在10""Mol"的高亲和常数的抗体，特别是单克隆抗体(Mab)。此外，当Mab与荧光染料经化学4建连4妄时，可以对荧光Mab-靶点复合物的数量和位置进行检测、成像和记录。当不同的Mab都用具有不同的且非重叠的激发/发射光谱位置的不同荧光染料标记时，这些不同的Mab-耙点可以同时在目标区域(ROI)成像，但要分别检测。一种有效用于检测焚光复合物的仪器是计算机化的焚光显微镜系统(FMS)。可以对包含这些复合物的细胞内区域进行限定，焚光的检测值可以以有限空间区域的总荧光，或者每像素的平均荧光，或者甚至是该区域中每像素的最大强度来表示。实施例1中显示了这种能力。除了进行定量测量之外，可以通过使用荧光孩i球来对FMS测量进行标准化。利用荧光微球在不同波长下对FMS进行4交准后，可以,人时间的角度对比FMS测量，而且可以对不同FMS上进行的FMS测量进行对比。这种操作见于实施例2。个体患者的肿瘤组织通常取自三种来源(1)/人肺瘤或邻近肿瘤的淋巴结中取样得到的活组织检查原料，(2)从切除肿瘤的手术中获取的外科手术原料，(3)代表转移性肺瘤的血液中循环癌细胞。我们已经检查了所有这些来源的肺瘤细胞，并且每种来源都有其独特的要求。为了表征由活组织检查获得的肿瘤细胞，最重要的要求从正常细胞中区分出肺瘤细胞。当肿瘤细胞是来源于上皮，但周围的细胞并不是来源于上皮(血细胞或淋巴细胞)，那么根据上皮细胞的特征性细胞角蛋白骨架，区分就是相对直接的。可以采用特异性抗细胞骨架蛋白的Mab。为了将循环胂瘤细胞从血液中区分出来而使用一种富集方法，通过该方法把大多数正常血细胞排除，癌性上皮细胞被留下用于表征。最普遍地，从手术标本中收集肿瘤组织；这些组织在福尔马林中固定，并被包埋在石蜡块中储存。然后在经过脱蜡、清洗和抗原修复的过程后，由这些块制得带切片的载玻片以便观察。实施例3显示了这样的制备过程。每种抗原或甚至蛋白靶点都可能需要单独的活化M务复过程。在实施例4中，我们将描述定量检测和通过FMS记录带切片的载玻片的观察区域(ROI)中带萸光的Mab-抗原复合物的实-验过程。该过程需要通过计算机系统减去自发荧光背景。采用未被带荧光的Mab染色的石蜡块连续切片，通过FMS观察相似区域可以获得该背景。另外，光学测量过程要保持一致，并将有关背景的信息存储在计算机中以便随后作为背景被减掉。实施例5描述了包埋在石蜡块中经福尔马林固定的肿瘤组织切片中药物响应指示剂的染色和定量测量。实施例6描述了对肿瘤切片的不同区域内的异质性的评价。个体患者的肿瘤对特定药物的响应持续时间还可以通过有抗药性的肺瘤细胞的百分比与没有抗药性的肿瘤细胞的百分比之比(肺瘤的异质性)来评价。对肿瘤异质性的测定将作为抗性的标记，并且进一步表明必须将另一种有效药物用作后续治疗以延长患者的生存时间。实施例7中描述了DRI指数的构建，该DRI指数将化疗药物的细胞毒性作用与机理上相关的DRI表达关联起来。该方法确立了培养的人肿瘤细胞对化疗药物的应答性和DRI表达之间在统计学上的显著相关性，其中DRI表达与药物作用模式的机理有关。如实施例9所述，进行统计学分析使这两个数值相关联，并确立一个可以被用作显示临床响应指数的DRI表达水平。实施例8中描述了将上述体外指数系统推广到DRI指数系统的构建之中，其基础是经石蜡包埋的培养的标准细胞。这种技术确立了一种反映组织固定和处理的影响的对照标准。实施例10中详细描述了三种可以提供有关个体癌症患者的疾病管理信息的诊断性检测方法。为了实施PAC方案，已经建立起这些诊断检测方法以服务于癌症患者。诊断性检测为(1)药物响应指示剂检测(DRIT);(2)赫赛汀-紫杉烷响应检测(HER-TAX检测)；以及(3)循环癌细胞检测(CCCT)。每种都在实施例中进行了详细描述。实施例11中详细说明了建立乳腺癌患者的PAC所必需的步骤，并提供了相关数据来支持该方案。实施例12中描述了印证PAC系统所必需的临床相关性研究的设计方案。首先进行回顾性研究从而将已知的临床结果与那些相同患者的肿瘤细胞的DRI测量值关联起来。随后，有关DRI数据的前瞻性研究会将患者的治疗结果关联起来。该试验数据将用作IDE,并导致FDA成为PMA。使用人用单克隆抗体治疗剂，如用于乳腺癌的曲妥珠单抗(赫赛汀)和用于结肠癌的西妥昔单抗,(爱必妥)时，上述方案能特别有效地发挥作用。在该方法中，我们已经在把焚光染料连接到治疗性Mab之后，使用单克隆抗体本身作为靶点-受体的探针。显而易见，如果治疗性Mab不能连接到肿瘤细胞上，肺瘤细胞不会对治疗性Mab产生响应。应该注意的是其逆命题可能不正确，也就是说，Mab连接到肺瘤细胞上可能不产生细胞毒性响应。因此，由这种药物响应指示剂的定量测量方法获得的重要信息是由于不存在药物响应指示剂，由此确定了哪种细胞不会对药物表现出细胞毒性响应。然而，有利的药物响应指示剂测量可能不会提供确实的信息，即这些肿瘤细胞会表现出细胞毒性响应。换句话说，药物响应指示剂为阴性预示着肺瘤细胞不会表现出细胞毒性响应，但是药物响应指示剂为阳性并不能确定肺瘤细胞会表现出细胞毒性响应，因为还有其它重要因素的影响。因此，我们拥有"无效药物指示剂"从而将对个体患者的肿瘤无效的药物(但是仍然表现出副作用)排除掉。对无效药物指示剂的认识是非常有用和可靠的，这是因为在一系列限定条件下，在细胞培养物中，该结论得到了统计学意义上的支持。说明书上文大体上概述了个人化抗癌治疗(PAC)中包括的组成部分。首先，耙向治疗药物是由FDA开发和批准的。其次，基本的细胞靶点已经在实验室和临床研究中经过鉴定。第三，特异性抗该蛋白靶点的抗体(特定的单克隆抗体)已经被生产出来并经适宜的荧光染料标记。第四，组装计算机化的荧光显微镜系统对肿瘤细胞中的这些荧光Mab-耙点复合物的数量和位置进行测量、成像和记录。第五，有代表性的肺瘤细胞原料可以通过活组织检查方法、外科手术样本或血液循环肿瘤细胞来获得。第六，在明确定义的体外环境中，已完成的相关性研究证明药物响应标记物的数量与肺瘤细胞的细胞毒性响应在统计学上是相关联的，由此选择适宜的化疗剂。这六个组成部分相互联系形成了"个人化抗癌治疗"的基础，这种个人化抗癌治疗根据建议信息，将那些对特定癌症患者无效的药物排除掉。这种方案已经在临床的相关性研究中被证实，该研究涉及有关"无效药物指示剂"的信息的医疗贡献。该论证的初始阶段已经在FDA批准使用曲妥珠单抗的程序中给出，并且会在单独的部分进行描述。将PAC系统组织起来，我们提供了在对获自个体患者肺瘤细胞的生物标记物的定量测量中应用FMS的方法。针对获自不同来源的肿瘤细胞的特定方法将在实施例中描述。，实施例1对显微镜载玻片上固定细胞中的荧光复合物的测定。我们的系统是配备CCD照相机、八滤镜旋转盘(eight-filtercubeturret)以及用于图像捕捉和图象处理的Image-ProPlus软件的计算机辅助的LeicaDMRXA荧光显微镜。目前，我们能够对相同细胞的五种光谌范围的荧光进行测量；两种用于细胞鉴定，三种用于测量生物标记物。为了用多种小鼠单克隆抗体对细胞染色，必须直接地标记每种抗体。这是采用来自MolecularProbes的异硫氰酸焚光素和Alexa染料琥珀酰亚胺酯衍生物来完成的。该实施例演示了对乳腺癌细胞系的HER-2/neu的定量。用Alexa532标记单克隆抗体曲妥珠单抗，并且用FITC标记抗广谱细胞角蛋白(anti-pancytokeratin)。将乳腺癌细胞系(SKBR-3)与上述抗体一起孵育，然后清洗并置于抗衰减介质中用DAPI复染。采用滤镜(filtercubes)经适当的曝光时间获取数字图像，该滤镜能够区分相同细胞中的DAPI、FITC和Alex532信号。利用细胞角蛋白荧光勾画出每种细胞的空间区域。将这些轮廓保存、调用以及覆盖在Alexa532图像上，即HER-2/neu信号。下表显示了四种细胞中HER-2/neu表达的定量数据。第1列给出了对象编号，第2列以像素数表示细胞区域，第3列给出了每种细胞中每像素的平均荧光强度，第4列给出了每种细胞的累积荧光强度。数据显示细胞中的HER-2/neu表达可以是变化的。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例2显微镜系统的校准。为了进行定量的免疫荧光研究，必须能够获得数字图像并将不同时间段内和不同显微镜上获取的荧光测量值进行对比。.这是通过采用来自MolecularProbes的筒4更有效的荧光标准品对Leica显微镜系统进行校准来实现的。该标准品是由直径为6微米的荧光微球构成的(Inspeck显微镜图4象强度才交准"i式剂盒，InspeckMicroscopyImageIntensityCalibrationKit)。将微球的悬浮液置于显微镜载玻片上，空气干燥并置于抗衰减基质中，盖上盖玻片。经不同的曝光时间获取图像，所述曝光时间一定不要超时，以免达到饱和程度，即对于12比特的图像而言，每像素达4096荧光单位。采用Image-ProPlus软件处理图像，获得每个曝光时间下约4个或5个微球的每像素荧光强度。绘制采用每种滤镜获得的标准曲线，其中每像素平均荧光强度对应于每毫秒曝光时间。这种线性标准曲线的例子见于图1。根据参考基准，将斜率和截距用于计算产生2000单位平均荧光所需的曝光时间。就图l所示曲线图而言，获得了176毫秒时的数值。因此，通过使用相同的荧光标准品，选择适宜的曝光时间，每个显微镜/滤镜都可以被校准从而产生相同的荧光强度。实施例3用于鉴别和表征的肺瘤细胞配制品的制备和染色。通过支气管窥镜活检可以获得肺癌细胞。从患者中取出活组织检查原料后，可以将其放入中性生理盐水中。可以在PBS中清洗细胞并将细胞培养至特定体积用于计数。可以将适宜数量的细胞沉积在显微镜载玻片上由PapPen勾画的区域内。干燥后，可以将细胞固定在2%多聚曱醛中，与抗广谱细胞角蛋白-FITC—起孵育，用DAPI复染以识别上皮细胞。获取图像并对具有完整细胞核的上皮细胞计数。确定载玻片上的细胞中上皮细胞/wbc核DNA的比例，以此作为异倍性(aneuploidy)的测量值，通过用特异性单克隆抗体染色对上皮细胞中曱胎蛋白受体的表达进行定量，这样将胂瘤细胞与正常的上皮细胞区分开来。如实施例l所述，可以使用荧光标记的抗体进行定量。可以将外科手术或活组织检查中获得的组织切片固定在福尔马林中，并包埋在石蜡块中。可以从这些石蜡块上切下4微米的连续切片，并置于显微镜载玻片上。可以按以下步骤对切片脱蜡二曱苯中2次，每次5分钟；95%乙醇中2次，每次3分钟；70%乙醇中2次，每次3分钟；然后在自来水中至少10分钟。为了抗原修复，可以在10mMEDTA、pH8或10mM柠檬酸盐、pH6中95度下加热载玻片30分钟，随后在室温下置于相同的溶液中20分钟。可以在PBS中清洗载玻片并用抗广谱细胞角蛋白-fitc以及其它选择的荧光标记的抗体染色。可以按照以下方法分离并鉴定血液中的循环癌症细胞(ccc):采用双梯度离心富集15-20ml血液中的癌细胞，随后用免疫磁性珠移去大多数血细胞(阴性选才奪，negativeselection)。将细胞沉积在显^f效镜载玻片上PapPen勾画的区域内，并且与混合抗体(antibodycocktail)(具有对抗9种细胞角蛋白的反应性的FITC标记的抗体，以及人癌上表达的与肿瘤有关的糖蛋白)一起孵育。置于包含dapi的抗衰减基质中复染。用荧光显微镜扫描载玻片并对具有完整细胞核的fitc阳性细胞计数。在标准的ccc检测中，与ccc一起回收了超过100,000个白细胞(wbc)。wbc有时会妨碍用染料-mab复合物对癌细胞的染色(但不用HER-2/neu或细胞角蛋白)。因此，开发出了超富集方法(SuperEnrichment),该方法使少于3000个wbc与癌细胞一起#:回收。在这些制备过程中，细胞染色不会受少量WBC影响。该方法详见下文ccc超富集方法用PBS将15-20ml经抗凝血处理的外周血(6小时，最多(spiked)包含100个MCF-7乳腺癌细胞)稀释至总计30ml;在50ml圆锥管中小心地将稀释的细胞悬浮液分层，其梯度为1.083且超过15mL，并且在20。C下在吊桶式转头(swinging-bucketrotor)中以2000rpm离心30分钟(不制动)。移出全部上清液并收集6-8ml的1.083G界面(interface)的上面部分；用Hanks'溶液经1200rpm离心10min清洗两次；小心除去全部上清液；加入1倍稀释緩沖液至最终体积为40ml,并且搅拌均匀；加入5mlMACS细胞固定溶液(CellFixSolution)，混合均勻并孵育30分钟后，加入5mlMACSCellPerm溶液，混合均勻并在室温(RT)下孵育恰好5分钟；在1200rpm下离心细胞悬浮液10分钟；在终体积为600|il的1倍MACS细胞染色溶液(CellStainSolution)中将细胞团再悬浮；加入200|ilFcR封闭试剂并混匀；加入200|ilMACSCK微珠并在20-25°C下孵育45分钟；加入100^抗细胞角蛋白-FITC并再孵育10分钟；加入4ml1倍MACS细胞染色溶液(CellStainSolution)并在1200rpm下离心悬浮液；在MACS分离器的磁场中放置阳性选择柱；将再悬浮的细胞加到柱中，使白细胞(WBC)通过柱子，并用3x500jJ脱气的1倍稀释缓冲液清洗；将柱子从分离器上移开，置于15ml试管中；吸取lml柱子顶部的经脱气的l倍稀释缓沖液，并采用与柱子一起使用的柱塞(plunger)洗脱j皮保留的循环癌细胞；将细胞团离心并直接沉积在载玻片上，所述载玻片在室温(RT)下干燥8-24小时；以及加入含有DAPI的封固剂，并对样品进行计算机辅助显微镜分析。实施例4对石蜡块上切下的肿瘤组织切片的生物标记物表达定量。跨(across)组织切片的荧光强度测量值反映了与抗原结合的经荧光标记的一抗的量，其进而代表了细胞中靶蛋白(生物标记物)的量。然而，需要考虑经福尔马林固定的组织所固有的自身荧光，以获得可重复的定量数据。根据上述方法，但不使用荧光标记的一抗，对作为对照载玻片的相同肺瘤的连续切片进行处理，测得自身焚光。获取每种肺瘤的3至4个不同区域的数字图像。采用Cl(DAPI)、C2(FITC)、C3(Alexa532)、C4(Alexa594)和C5(Alexa647)滤镜，根据我们的参考基准，所采用的曝光时间将产生2000个荧光单位。对照载玻片和实验载玻片经过完全相同的处理。此外，每次都对载玻片上的背景区域过滤从而获取图像，所述载玻片上不包含组织。采用Image-ProPlus软件处理图像。由直方图获得针对每种图像背景的每像素焚光平均值，并从适当的实验图像中减去该数值。在每个图像上选择3至4个目标区域(A01)，每个区域包含约10个细胞，用于对生物标记物进行定量。图2显示了有代表性的HER-2/neu染色的乳腺肺瘤切片的图像。能够观察到完全的强烈的染色。对膜区域的荧光强度进行定量，下表显示了5名不同的乳腺癌患者的数据。其中4名的HER-2/neu表达高于自身荧光的约2至4倍。1名患者的自身荧光与HER-2/neu信号相似。橫跨不同的肺瘤区域的HER-2/neu表达存在异质性。我们已经观察到高表达区域和较低表达区域之间有3.3倍的差异。由UMM和WR-877微秒曝光获取的乳腺癌组织的赫赛汀-Al532染色<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>*对每个图像的3至4个区域进行分析，显示的是平均值。ABY表示用于染色的标记的单克隆抗体。我们还对乳腺肺瘤组织中雌激素受体表达和结肠肺瘤组织中P-微管蛋白III亚型和ERCC-1(DNA修复酶)进行了定量。下表列出了数据。针对ERCC-1、(3-微管蛋白III亚型和雌激素受体，染色组织平均荧光与自身荧光(无抗体)的比值分别为5.7、3.6和15.S。由石蜡块上切下的组织切片中药物响应指示剂的定量测量<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实施例5以乳腺癌为例，对包埋在石蜡块中的经福尔马林固定的肿瘤组织切片中的药物响应指示剂进行的染色和数字化测量。我们已经建立起一种可重复的荧光显微方法，用于对由石蜡块上切下的乳腺肿瘤组织切片中的HER-2/neu受体表达的定量。按照如下步骤对置于显微镜载玻片上的组织切片进行脱蜡将载玻片置于二曱苯中5分钟，重复一次；将载玻片置于95%乙醇中3分钟，重复一次；将载玻片置于70%乙醇中3分钟，重复一次；在蒸馏水中清洗载玻片。然后通过在10mM，pH6.0的柠檬酸盐中95度下加热30分钟，随后在室温下冷却20分钟从而对载玻片进行抗原修复处理。同时将载玻片与曲妥珠单抗-Alexa532偶联物以及抗广谱细胞角蛋白-FITC—起孵育。根据参考基准，采用能产生2000荧光单位的曝光时间获取每种肺瘤切片的3至4个数字图像。过表达HER-2/neu的细胞的完整细胞膜上显现出非常强烈的荧光染色。；f企查每个数字图像上3至4个目标区域(A01)。可以制成显示AOI的定量荧光数据的直方图(每像素平均荧光，标准偏差，最小和最大值以及完整的焚光强度)。该荧光数据用于选择被染色的膜的区域从而对HER-2/neu的表达定量。图3显示了上述AOI中之一的区域，该区域被选择并且被勾画出而用于定量。下表显示了定量的测量数据(以像素数量表示的区域以及每像素平均荧光，密度亮度)。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例6对在肿瘤切片的不同区域中HER-2/neu表达的异质性的评估。患者胂瘤细胞中HER-2/neu表达的异质性可以决定对曲妥珠单抗治疗响应的全部和持续时间。我们已经能够利用上述定量方法来评估患者肺瘤组织切片的这种异质性。来自两名乳腺癌患者肿瘤组织的数字图像的四个AOI的数据如下表所示。我们观察到HER-2/neu-染色的膜的最大和最小荧光强度之间存在2.1倍(患者为1)至3.3倍(患者为2)的差别。对患者肿瘤的不同区域内Her-2/Neu表达的异质性评估<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>**测量膜的数值实施例7一种将化疗药物的细胞毒性作用与机理上相关的药物响应指示剂的表达关联起来的体外系统。该实施例描述了将培养的人癌症细胞系对抗癌药物的细胞毒性响应与细胞中机理上相关的药物响应指示剂(DR1)的表达水平关联起来的体外系统。对该数据进行统计学分析以确定可以被用于分类别地显示细胞毒性响应的DRI水平。永生细胞系派生出的肺瘤通常表现出强烈的增殖并且满足功能性癌细胞模型系统的要求。癌细胞系已经在一定程度上被成功地用于对抗癌药物的响应的预测上，这表明化学敏感性情况可以用于开发预测药物效力的系统。在目前的实施例中，釆用与荧光染料相连的单克隆抗体作为探针对多种乳腺癌派生的细胞系中的DRI进行定量。DRI表达的水平以数值来表示，该数值经容易获得的荧光标准品标准化，从而能够用于各天之间和各实验室之间的数据对比。所有的药物均具有在机理上与作用模式相关的潜在细胞耙点。乳腺癌细胞系在显微镜载玻片上被固定和染色，这是通过与结合了Alexa532的赫赛汀(曲妥珠单抗，抗-HER-2/neu受体)或者结合了Alexa594的抗-ER或结合了Alexa647的抗-TUBIII或结合了FITC的抗-细胞角蛋白同时孵育实现的。在适宜的曝光时间(根据荧光基准产生为2000的数值)下获取FITC信号(470nm/497nm/522nm)、Alexa647信号(630nm/649nm/667nm)、Alexa594信号(581nm/593nm/617nm)以及Alexa532信号(546nm/557nm/567腿)的数字图像，并且对其分析以确定在每ROI(癌细胞)中每像素的平均荧光。根据很强的细胞角蛋白焚光确定每个ROI的空间区域。轮廓被保存、调用和覆盖在相同的细胞视野下的Alexa532图像、Alexa594图像或Alexa647图像上。软件形成了显示每个ROI的区域和每像素平均荧光的表。就实验条件而言，将包含104个活细胞的细胞悬液置于包含100)al培养基的96孔板中，在含5。/。C02空气中，37。C下使细胞贴壁24小对。在该孵育过程之后，根据公开的药物代谢动力学分析的规定，将细胞暴露于指定剂量的药物下，所述剂量是基于血浆峰浓度(PPC)的。在他莫昔芬的例子中，细胞生长72小时直至汇合。然后将包含0.5。/。FCS的培养基加到每个孔中以使ER表达最大化。对照孔包含100jil适宜的培养基，并且与测试孔进行相同的处理。处理后的第72小时，对孔板进行WST-8分析。WST-8是一种四唑盐，其经细胞脱氬酶生物还原形成带颜色的曱腊产物。曱腊产物的量与活细胞数量直接成比例。基于曱腊的分析已经被成功地用于化学敏感性的检测中。使用Biotek微孔板读数器在460nm下测定每个孔的吸收值。针对每种药物浓度计算平均吸收值士SE。结果以生长抑制百分比来表示，与药物浓度比较。使用(logfa/logfu)比logC的半数效应图来确定IC5。值，其中fu为未受影响的组份，fa为受影响的组份，C为药物浓度。不同的乳腺癌细胞系对化疗药物的生物响应与相关的DRI表达完全符合。采用两种被详细表征的DRI、HER-2/neu和雌激素受体(ER)进行最初的研究来验证模型系统。HER-2/"w致癌基因编码与表皮生长因子受体具有广泛同源性的3争膜酪氨酸激酶受体。HER-2/weM过表达导致对赫赛汀(曲妥珠单抗)治疗的敏感性提高。另一种对乳腺癌有效的靶向治疗为他莫昔芬，其与癌细胞表面上的雌激素受体结合并且阻碍雌激素对细胞生长的影响。ER是已知的在确定对他莫昔芬治疗的敏感性的过程中有意义的预测值。结合在细胞系表面上的经荧光标记的赫赛汀表现出最高水平时，表明该细胞系对赫赛汀治疗的最大响应。这些特定的细胞系，HCC2218和SKBR-3,表现出与剂量相关的增殖抑制，分别在低至0.032和0.125mg/ml浓度时有响应。相关地，如下表所示，在赫赛汀结合水平低的乳腺癌细胞系中，或者增殖未受千扰，或者只有在高药物剂量时产生响应。培养的乳腺癌细胞中生物响应与DRI表达水平的比较。-Her-2/neu/赫赛汀<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>注*NR-对高达2mg/ml的赫赛汀治疗无响应**相对于参考基准的平均荧光/像素，该参考基准在经历一定时间的曝光后产生2000单位荧光。按照相似的方式，ER高表达的细胞系(MCF-7)对他莫昔芬治疗表现出高敏感性。相反地，ER结合度较低的细胞系(SKBR-3、MDA-MB231)对他莫昔芬治疗表现出相当低的敏感性响应，如下表所示。培养的乳腺癌细胞中生物响应与DRI表达水平的比较。-雌激素受体/他莫昔芬<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>注*服-对高达50[ig/ml的他莫昔芬治疗无响应**相对于参考基准的平均荧光/像素，该参考基准在经历一定时间的曝光后产生2000单位焚光。将这些实验推广至有关卩微管蛋白III(TUBIII)表达与对抗癌药物紫杉醇(PTX)和多西紫杉醇(DTX)的生物响应之间相关性的考虑上。这些药物与TUBIII结合并通过稳定微管来发挥它们的生长抑制作用。据推测，可以通过几种包括乳^M中瘤的人癌症中TUBIII的表达水平来改变这些药物的抗肺瘤作用。'培养的乳腺癌细胞中生物响应与DRI表达水平的比较。-紫杉醇(Paclitaxel)/(3微管蛋白III<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>注*NR-对高达50吗/ml的紫杉醇(Paclitaxel)治疗无响应**相对于参考基准的平均荧光/像素，该参考基准在经历一定时间曝光后产生2000单位荧光。培养的乳腺癌细胞中生物响应与DRI表达水平的比较。-多西紫杉醇/p微管蛋白III<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>注**相对于参考基准的平均荧光/像素，该参考基准在经历一定曝光时间后产生2000单位荧光。正如赫赛汀和他莫昔芬的例子，不同的乳腺癌细胞系对PTX和DTX的生物响应与TUBIII的表达完全符合。TUBIII结合水平低的细胞系(T47D、MCF-7、SKBR-3)对PTX和DTX的治疗敏感。相反地，TUBIII水平较高的细胞系(HCC2218，HCC38)仅对较高剂量的DTX表现出响应。这些细胞系还对PTX表现出响应，但不表现出IC50值。证实一种细胞系(HCC202)对PTX和DTX的治疗都有抗性。在另一个实施例中，胸苷酸合成酶(TS)的表达与乳腺癌细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的响应相关联。TS是DNA生物合成中的关键酶，其已经被假定为在预测对基于5-FU的化疗的响应中起到重要作用。进行实验来^^查这种关系。实验条件和分析方法与使用赫赛汀时的相似。剂量范围为5-300(ig/ml。培养的乳腺癌细胞中生物响应与DRI表达水平的比较。-5-氟尿嘧。定/胸苷酸合成酶<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>注**相对于参考基准的平均荧光/像素，该参考基准在经历一定曝光时间后产生2000单位萸光。ND为未确定的。不同的乳腺癌细胞系对5-FU的生物响应与TS的表达完全符合。对较低剂量的5-FU响应的细胞系(T47D、MCF-7和SKBR-3)的TS表达要比那些仅对较高剂量的5-FU响应的细胞系(HCC38、HCC202、HCC2218)高。对5-FU响应的等级与TS表达之间相关性在统计学上是显著的，正如由以下可见的Pearson's相关系数所确定的。根据Pearson's相关系数，DRI可能与机理上相关的药物体外对细胞生长的抑制在统计学上相关。该方法测量两种变量之间的线性关系强度。Pearson's相关系数通常由r(rho)表示，可以在-1.0至1.0的范围内取值，其中-1.0为完全负向(相反的)相关，0.0为不相关，l.O为完全正向相关。可以使用下式计算Pearson's相关系数<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>Pearson's相关系数分析显示1(:5()值与DRI表达之间存在强而且显著的统计学相关性，如下表所示。生物响应与DRI表达的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>为了进一步通过简单的聚类分析和转变点分析来确定DRI表达的分界点，从而确定是否存在可以被用于分类別地显示生物响应的DRI表达水平，将对这些相关性数据进行分析。实施例8基于石蜡包埋的经培养的标准细胞的DRI指标系统。为了对保藏在石蜡块中的人肺瘤组织的DRI表达进行指标化，必须建立一种反映组织固定化和处理的影响的对照标准品。针对该目的，许多实验室已经使用了靶抗原表现出可变表达的细胞系。按照与临床样品相同的方式对这些细胞系进行固定、处理和分析。该技术已经被成功地应用于HER-2/neu敏感性试验、雌激素受体的免疫细胞化学分析、DNA倍体(ploidy)分析以及增殖标记物MIB-1的质量控制的标准化。收集用于经培养的人肿瘤细胞系统的相同批次经培养的人乳腺癌细胞。然后将这些细胞包埋在琼脂栓塞(plug)中并用石蜡处理。采用4(im切片制成载玻片，固定并用HER-2-Alexa532(546nm/557nm/567nm)染色。然后，如上所述，对样品进行荧光显微镜分析。结果(下表)与在培养的肺瘤标准细胞系统中观察到的结果很相似。HCC2218和SKBR-3表现出的赫赛汀结合值高，而MCF-7和HCC38表现出较低的数值。对这些细胞暴露于赫赛汀中产生的IC5o进行的比较，以及赫赛汀结合导致的Pearson's相关系数为-0.9,都再次与培养的肿瘤标准细胞系统中观察到的很相似。该模型显示石蜡包埋的经培养的标准细胞可以用作活内标，用于指示石蜡包埋的人癌组织的生物响应。培养的人乳腺癌细胞的生物响应与DRI表达水平的比较。曲妥珠单抗/曲妥珠单抗-结合细胞IC50jig/mlMAB结合平均^直"新鲜石蜡#被分析的细胞新鲜石蜡HCC22180.0653.831.34859SKBR30.3021.525.1526233<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>ND为未确定的NR为无响应实施例9为确定DRI指数的参考范围而进行的对DRI表达与对抗癌药物的响应的相关性的统计学分析。确定肿瘤响应的DRI参考范围的基本原理和方法是基于(1)体外指标系统；(2)体外指标系统中的石蜡块。这两种体外系统的成功构建提供了这样的信心，即肿瘤细胞的细胞毒性响应可以与石蜡包埋后的DRI测量值在统计学上相关联。该指标的目的是计算在个体患者肺瘤的不同DRI表达水平下，其对药物产生抗性的概率。然后，主治医师可以查阅该参考范围，从而对具有一定水平DRI表达的特定癌症患者开具抗癌药物处方。我们将依据有关每种药物的DRI表达水平，使用统计学回归方法来模拟每种药物对体外细胞生长的抑制。该方法将应用于培养的标准肿瘤细胞和石蜡包埋的培养的标准细胞。结果变量为由细胞系剂量响应曲线确定的IC50的对数，独立变量为DRI水平。采用1oglC5o的原因在于我们初步数据以及文献中的数据。在该被提出的研究中，采用了13种细胞系，我们有充足的理由(80%的可能性)说明在5%的显著水平下，真实的相关性至少为60%。我们设定了备择假设，即相关性的计算值为0.90,由于在上述实验实施例中观察到的Pearson's相关系数高于0.90,该假设似乎是真实的。我们将进一步通过简单的聚类分析和转变点分析来分析该相关性数据。达水平。实施例10为个体癌症患者的疾病管理提供信息的三种分子诊断检测。药物响应指示剂4金测(DRIT)说明1)将6-8种细胞生物标记物用荧光标记的单克隆抗体(fMAb)染色，这些生物标记物都是在原发性肺瘤细胞中表达的，并与肿瘤抗性和靶向化疗有关。釆用计算机辅助的焚光显微镜系统对这些标记物的表达水平定量，并将其用于靶向化疗。2)以商购的荧光标准品对这些生物标记物的荧光测量数值进行标准化，这样能够进行各天之间、各实验室之间的数据对比。3)建立由一种类型(如乳腺癌或肺癌等)癌细胞系的培养的癌细胞组成的体外校准系统，该癌细胞具有不同程度对靶向治疗的抗性。抗性程度(由IC50测定)和生物标记物表达(每像素荧光)之间的显著相关性已经由Pearson's系凄t确定了。〗衣据与药物有关的DRI表达水平，将统计回归方法用于模拟每种药物对体外细胞生长的抑制。结果变量为由细胞系剂量响应曲线确定的ICso的对数，独立变量为DRI水平。采用简单的聚类分析或转变点分4)按照与原发性胂瘤相同的方式，将这些细胞系固定并且包埋在石蜡块中。如上所述，对载玻片上的这些细胞切片进行染色和测量.。再次确立这些细胞的IC5。和相应的生物标记物表达之间的相关性。5)上述ICso和相应的生物标记物表达之间的相关性研究被用于确立用于生物标记物的DRI指数。这种指数可以被用于将肺瘤的生物标记物的表达与该肿瘤对机理上相关的药物治疗的抗性程度关联起来。DRI指数可以用于描述抗性的概率(治疗失败)。6)通过回顾性临床相关性研究和前瞻性临床相关性研究来验证和改进这些实验室^f究，以使DRI指数及其概率的参考范围建立在临床数据的基础上。7)针对原发性肺瘤的4微米厚的石蜡块切片进行检测(需要6个载玻片进行多次测量)，耗时2天。固定的肺瘤细胞，没有被包埋，也可以容易地进行纟全测。应用1)一份保密性检测报告将提供DRI指数以及由统计学方法计算出的个体患者的肿瘤对5-6种经FDA批准的、广泛使用的化疗药物产生抗性的概率，这些药物均包括在由国家癌症协会(NationalCancerSociety)获得的国家综合癌症网络(NationalComprehensiveCancerNetwork,NCCN)指南中。医生可以根据对最适合该病人的治疗方案的4全测结果做出有依据的决定。HER-tax检测说明1)HER-tax检测应用于HER-2/neu受体呈阳性(IHC3+或FISH+显示过表达)的乳腺癌患者。2)按照与DRIT相似的方式，对包埋在石蜡块中原发性胂瘤进行^r观'J,除了对HER-2/neu受体(用荧光标记的赫赛汀)、PTEN以及对p4效管蛋白III(针对紫杉烷的DRI)染色。3)目的是筛选出HER-2/neu过表达处于低范围(但仍是IHC3+)的患者，以及PTEN表达值低、p-微管蛋白III表达值高的患者的胂瘤。该患者群的肺瘤可能对赫赛汀和紫杉烷都有抗性。提供抗性的概率。4)测量与HER-2/neu和p-微管蛋白III有关的肺瘤中癌细胞的异质性。异质性的程度与对赫赛汀-紫杉烷治疗方案产生有利响应的持续时间是有关的。应用1)由于仅有40-50%的HER-2/neu阳性患者会在有限持续时间(最可能是不超过1年)内对赫赛汀-紫杉烷产生有利的响应，因此这种HER-tax检测将选择有抗性的患者，并预测治疗中患者可能产生有利响应的持续时间。赫赛汀是相当昂贵的药物并且具有心脏毒性。乳腺癌患者的循环癌细胞检测(CCCT)说明1)采集20ml患者的静脉血，通过密度梯度离心和磁性细胞分选将正常血细胞除掉从而富集循环癌细胞(CCC)。通过阴性选择法收集这些癌细胞，置于显微镜载玻片上，然后用荧光单克隆抗体染色并采用计算机化的荧光显微镜系统进行计数。2)收集血液样品后24小时内进行检测。样品可以通过由CCCDiagnostics验证的置于特殊装运容器中的快件发送。3)可以对CCC中表达的药物响应生物标记物进行表征。4)转移癌(IV期)中发现的CCC数量高于I、II和III期癌症。大量的CCC与预后不良和对药物治疗响应差在统计学上相关联。5)在提出的药物治疗研究中，在治疗前的检测以及治疗期间和治疗后(2-3月时间间隔)的2-3次检测中对CCC计数，这可以反映治疗作用。如果治疗后CCC的数量保持较高，药物可能是无效的，如果治疗后CCC的数量变得相当低，则药物可能是有效的。这种初步发现将经过临床检验。已经针对7种癌症(前列腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌)开发了在血液中发现CCC的技术。应用1)对于III期或IV期乳腺癌患者，可以在治疗前进行CCCT来评价预后，治疗后进行2-3次CCCT以说明响应情况。可以在患者进行图像检查(X射线或CT)之前获得结果。2)当肿瘤可能产生药物抗性时，为了再选择另一种治疗药物，可以进行CCCT来测定CCC中生物标记物的变化情况。这些结果可以与体外校准系统相关联，该系统由来自一种类型癌(如乳腺癌或肺癌等)的细胞系的培养的癌细胞组成，而这些细胞对耙向疗法的治疗具有不同程度的抗性。这种相关性是基于特定DRF表达和培养的细胞对药物治疗的响应的。3)有关CCC数量的数据可能不能代替图像检查，但CCCT更快并能了解转移肺瘤的药物抗性特征的变化情况。可以通过成像方法对与生物标记物有关的肿瘤抗性进行表征。实施例11PAC需要三大步骤。步骤l:同时对肺瘤中几个靶点进行定量测定。这些靶点^L称之为药物响应指示剂(DRI),通过采用标记的单克隆抗体的免疫焚光和计算机化的萸光显微镜对这些靶点进行评价。为了比较，可以用荧光参考基准对获得的数值进行标准化。步骤II:确立DRI表达与胂瘤细胞对相关药物的细胞毒性响应在统计学上的显著相关性。建立体外指标系统将每种药物细胞毒性作用与相应的DRI测量关联起来。采用了对不同抗癌药物具有不同敏感性的7种乳腺癌(BC)细胞系。他莫昔芬、紫杉醇(paclitaxel)、曲妥珠单抗和阿霉素的作用与这些细胞系中针对每种药物的DRI表达相关联。DRI分别为雌激素受体、卩-微管蛋白III、HER-2/neu和拓朴异构酶n。Pearson分级(rank)相关系数的范围为0.77至1,p值范围为0.005至0.02。步骤ni:从个体癌症患者获取癌细胞的技术。对于转移性肺瘤，使用阴性选择法(Cancer2000:Vol.88，no.12，p.2787)从外周血中获取循环癌细胞(CCC),计数并用标记的曲妥珠单抗进行染色，从而对HER-2/neu表达定量。对101个BC患者进行了研究，并抽取402份血样；每名患者抽取样品的中间数为4(1-7)。CCC与远距离转移有关；88。/。的IV期患者在取样期间的某些时间点上带有CCC。每个样品中CCC数量范围在1-1283。20名患者进行了4次或更多次的HER-2/neu表达检测，并且还获得了肿瘤组织的数据。在18名患者中，CCC和原发性肺瘤同时发生(90%)，其中6名HER-2/neu呈阳性，12名HER-2/neu呈阴性。1名患者的肺瘤组织中HER-2/neu呈阴性，而CCC中HER-2/neu呈阳性。1名患者被鉴定为肺瘤组织中HER-2/neu呈阳性，CCC中HER-2/neu呈阴性。治疗(曲妥珠单抗)-诊断(HER-2/neu表达)的结合是第一个经FDA批准的用于BC的PAC模型。然而，虽然HER-2呈阴性的患者对作为单一治疗药物的曲妥珠单抗的响应明显较小，但是低于30%的HER-2呈阳性的转移性BC患者对作为单一治疗药物的曲妥珠单抗有响应。BC肿瘤组织的DRI测量和CCC的改进可以产生能被更好地预测的治疗效果。还报导了对带切片的载玻片的DRI测量，该切片是从BC患者的原发性肿瘤组织上切下的。，.实施例12对福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织的DRI定量，该组织来自乳腺癌、结肠癌和肺癌患者。实施例1和4中描述了采用焚光标记的单克隆抗体制备置于显微镜载玻片上的FFPE组织切片及其孵育过程。如实施例2所述，采用由标准曲线确定的曝光时间，利用滤镜获取相同细胞视野下的数字图像，这些滤镜可以区分DAPI、FITC、Alexa532、Alexa594和Alexa647荧光。获取每种肿瘤组织的5个不同区域的图像并保存。利用不包含任何组织的载玻片，在适宜的曝光时间下利用每种滤镜获取图像背景。为了评价组织的自发荧光，还要获取每种肿瘤的连续切片的图像，这时仅与抗广谱细胞角蛋白-FITC—起孵育，利用上述每种滤镜，并且完全按照测试样品的步骤处理。为了对DRI焚光强度定量，通过从DRI图像中减去适当的图像背景对图像进行首次平场(flat-fielded)。这就消除了光照场(illuminationfield)内的任何变异(variations)。然后从经平场的图像中减去图像背景(获自图像直方图)的每像素平均荧光(F/P)。对经处理的DRI图像进行交互式检查，并勾画出荧光最强的区域(通常是50至100个细胞)。复制该目标区域(AOI)并保存为剪切图像。调用该保存的剪切图像并定位于采用FITC滤镜获得的相同细胞视野下的图像中，以确保AOI中的所有细胞均为细胞角蛋白阳性的上皮细胞。每幅剪切DRI图像中的荧光信号经Image-Pro软件分析，从而选择从背景中分离出荧光目标(细胞或细胞团)的强度。随后，Image-Pro会勾画、计算和显示出有关剪切图像中的目标的定量数据。将数据输入Excel程序中，并针对每种肺瘤的5个图像中的每一个中的目标计算F/P平均值，并以参考基准进行标准化。采用与用于检测载玻片完全相同的方法，计算相同肿瘤的连续载玻片在每种滤镜下的自发荧光。以参考基准的百分比的形式描述了减去组织自发荧光的每个DRI图像的每像素平均荧光(每种肿瘤为5,共计250至500个细胞)。有关6位乳腺癌患者的FFPE组织的DR1结果见于以下的第一个表。对雌激素受体(ER)、(3-微管蛋白III(TUB)、胸苷酸合成酶(TS)、拓朴异构酶II(TOP)、核苷酸还原酶(RR)、HER-2/neu(HER)和4普配切除修复酶-1(ERCC-1)进行定量。对6名不同患者的每种DRI进行测定，每种经测定的DRI的5个剪切图像中被选择的目标的平均F/P(经参考基准标准化)与5个数值的平均值(粗体显示)以及5个数值(括号中显示)的变异系数(CV)—起显示。6名患者的5个DRI图像的CV值范围在8.9(39名患者的TS)至37.4(39名患者的ER)。在18个测量值中有5个由于DRI值太低而未应用CV。当对复制的相同患者的系列切片进行分析时，如下表所示，DRI数值处于相同的相关范围内。乳腺癌研究<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>小鼠IgG-Alexa532,括号中的数值为针对肺瘤组织的5个不同区域测定的DRI值的变异系数。载有乳腺癌、肺癌和结肠癌患者的FFPE组织的载玻片获自NCI人体组织合作网络(CooperativeHumanTissueNetwork,CHTN)中大西洋部(Mid-AtlanticDivision)。下表显示3种不同类型的癌症患者的DRI测量值，并还将由两名不同操作者使用两台不同显微镜从相同患者中获取的连续切片的ERCC-1表达值进行对比。来自胂瘤组织不同区域的5个剪切图像的DRI测量值与变异系数一起被显示。结果表明可以对三种类型癌症的FFPE组织的上皮细胞(细胞角蛋白染色呈阳性)的这四种DRI进行测定，两名技术人员使用两台不同显微镜进行DRI测量取得了相似的数据。应该注意的是每种DRI测量值将与患者对相关抗癌药物的响应相关联，以便评价医生使用这种试验为个体患者选择适合的药物的潜力。这样的信息将通过最初的回顾性研究以及随后的前瞻性临床试验来获得。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>CV是肺瘤组织中5个不同区域中测量的DRI值的变异系数。DR1值以参考基准的百分比来表示，平均值以粗体字显示。，为了能清楚地理解，现在已经通过图解和实施例的方式一定程度上详细且充分地描述了本发明，对于所属
技术领域：
的普通技术人员显而易见的是，在宽泛的和相当的条件、配方以及其它参数的范围内对发明进行修改或变化同样可以实施本发明，且不影响本发明的范围及其任何特定的具体实施方案，这种修改或变化将被包括在所附的权利要求书的范围内。该说明书中提及的所有的出版物、专利和专利申请都代表了本发明所涉及的
技术领域：
的技术人员的技术水平，本发明引入它们作为参考，其程度相当于特意地和单独地指出每篇出版物、专利或专利申请都被引入作为参考。权利要求1.一种为个体癌症患者选择治疗癌症的化疗药物的方法，其中包括选择一组经政府批准的用于治疗该患者所患类型癌症的化疗药物；从患者获取肿瘤细胞样品；在肿瘤细胞样品的至少一个细胞中，使用抗体确定对应于化疗药物组的一组药物响应指示剂的表达；以及根据药物响应指示剂的表达选择化疗药物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体经过焚光标记。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述药物响应指示剂是与化疗药物的作用机理有关的细胞成分。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体用具有不同激发和非重叠发射光谱的不同荧光染料进行荧光标记。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述确定步骤包括对药物响应指示剂进行定量。*6.根据权利要求5所述的方法，其中所述定量步骤包括将焚光强度与参考基准进行对比。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述确定步骤包括在1次检测中对至少5种药物响应指示剂进行定量。8.根据权利要求5所述的方法，其中所述确定步骤包括将样品中多种药物响应指示剂的表达量与细胞中相同的药物响应指示剂的量关联起来，所述细胞对通过药物响应指示剂发挥作用的化疗药物产生已知的响应。9.根据权利要求8所述的方法，其中对检测中的至少5种药物响应指示剂的表达量进行对比。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述肺瘤细胞样品选自循环癌细胞、取自邻近原发性肺瘤的淋巴结的样品、来自原发性肿瘤的样品以及来自固定的并包埋在石蜡块中的原发性肿瘤的样品。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述化疗药物选自卡粕、顺柏、奥沙利铂、多西紫杉醇、紫杉醇(paclitaxel)、紫杉醇(taxol)、长春瑞滨、长春花生物碱类、5-氟尿嘧啶相关的药物、希罗达、吉西他滨、蒽环类、伊立替康。12.才艮据权利要求1所述的方法，其中所述化疗药物选自人用单克隆抗体、曲妥珠单抗(赫赛汀)、西妥昔单抗(爱必妥)以及贝伐单抗(阿瓦斯汀)。13.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种所述药物响应指示剂为ERCC1,并且所述化疗药物选自卡铂、顺钩和奥沙利钩。14.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种所述药物响应指示剂为P-微管蛋白III亚型，并且所述化疗药物选自多西紫杉醇、紫杉醇(paclitaxel)、紫杉烷和长春瑞滨。15.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种所述药物响应指示剂为胸苷酸合成酶，并且所述化疗药物选自5-氟尿嘧咬相关的药物、曱酰四氬叶酸、Pemetrexel禾口希罗达。16.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种所述药物响应指示剂为拓朴异构酶II,并且所述化疗药物选自蒽环类、阿霉素和表柔比星。17.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种所述药物响应指示剂为拓朴异构酶I,并且所述化疗药物为伊立替康。18.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种所述药物响应指示剂为核糖核酸酶还原酶，并且所述化疗药物为吉西他滨。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述确定步骤包括针对一种或多种选自乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌和食道癌的癌症进行药物响应指示剂检测，其中所述药物响应指示剂检测提供了国家综合癌症网络患者治疗(NationalComprehensiveCancerNetworkTreatmentforPatients)指南中列出的、用于经诊断的癌症类型的所有化疗药物的肿瘤抗性/敏感性数据。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述胂瘤抗性/敏感性数据可以根据对相关性临床研究的统计学分析，由受试个体患者的药物响应失败的百分比概率来说明。全文摘要本发明提供了评价和选择癌症治疗方式的方法。文档编号A61K39/395GK101313221SQ200680043595公开日2008年11月26日申请日期2006年9月21日优先权日2005年9月21日发明者P·O·P·卓,S·莱斯克申请人:Ccc诊断有限责任公司