专利名称：：化学免疫治疗方法
技术领域：
：本发明涉及将用化疗剂治疗患者与用抗原引起抗原特异性免疫反应治疗所述患者二者联合起来使用的联合疗法。
背景技术：
：晚期癌症患者通常用化学疗法治疗。然而，癌症很少治愈，特别是实体瘤，所以需要其它治疗途径。人类免疫生物技术的最新进展已经将免疫疗法领域开拓为癌症治疗的新途径。虽然用多种不同的抗癌疫苗在一些患者已经实现抗靶抗原的特异性免疫，但需要改良的长期反应。因此，仍然需要改良治疗方案。因为化学疗法对免疫系统具有许多明显的有害作用，所以化学疗法与免疫疗法被视为不相关，或者更通常是对抗性的治疗形式。这是因为，大部分化学疗法通过凋亡杀死靶细胞，这种细胞死亡模式已4皮-現为免疫性，因为非刺激性或者通过固定免疫反应能够产生免疫耐受(其中T细胞对提呈的抗原不再反应的状态)。此外，化学疗法的常见副作用是诱导淋巴细胞血症(lymphopaenia)，即淋巴细胞减少，这,皮推定为不利于任何潜在的免疫反应。发明概述本发明涉及一种联合治疗，包括给予抗原以引起对所述抗原的免疫反应，以及一种或多种化疗剂。具体来讲，本发明基于出人意料的发现用一种或多种化疗剂治疗可增强给予抗原刺激抗所述抗原的免疫反应的治疗。因此，本发明第一方面提供一种包含抗原和一种或多种化疗剂以及药学上可4妄受的载体、稀释剂或赋形剂的药用组合物。适当地，将此类组合物作为单独、同时或按顺序给予的两种组分提供在如药剂盒的形式中。适当地，所述抗原是希望可引起免疫反应的抗原。此类抗原包括例如病原体的灭活、减毒或非致病株，可用作抗原诱导对抗由病原体所致疾病的免疫性，所述疾病如伤寒、脊髓灰质炎、麻渗、腮腺炎、风渗和结核，分离和用于免疫患者的来自花粉及其它变应性物质的变应性蛋白质，病原生物如B型流感嗜血杆菌、乙型肝炎病毒等的抗原组分。在另一个实施方案中，抗原可以是可用于避孕方法的抗原，所述方法如诱导由精子或卵子特异性蛋白产生的免疫反应的方法。例如，抗原可以是透明带蛋白质。在一个实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。合适的肺瘤相关抗原(TAA)包括5T4。其它合适的抗原包括下列种类的TAA:癌睾丸抗原(如HOM-MEL-40)、分化抗原(如HOM-MEL-55)、过度表达的基因产物(HOM-MD-21)、突变的基因产物(NY-COL-2)、剪接变异体(HOM-MD-397)、基因扩增产物(HOM-NSCLC-ll)和癌相关自身抗原(HOM-MEL-2.4),长口CancerVaccinesandImmunotherapy(2000)Stern,Beverley和Carroll编辑，CambridgeUniversityPress,Cambridge综述。其它实例包括MART-l(T细胞-1识别的黑素瘤抗原)、MAGE-A(MAGE画Al,MAGE-A2,MAGE-A3,MAGE-A4,MAGE-A6,MAGE-A8,MAGE-A10，MAGE-A12)、MAGEB(MAGE-B1-MAGE-B24)、MAGE-C(MAGE-C1/CT7,CTIO)、GAGE(GAGE-l，GAGE-8,PAGE陽l，PAGE-4,XAGE-l，XAGE-3)、LAGE(LAGE-la(lS),-lb(lL),NY-ESO-l)、SSX(SSXl-SSX-5)、BAGE、SCP-1、PRAME(MAPE)、SART-1、SART-3、CTpll、TSP50、CT9/BRDT、gplOO、MART-l、TRP-l、TRP-2、MELAN-A/MART-1、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、MUCIN(MUC-l)和酪氨酸酶。TAA综述于CancerImmunology(2001)KluwerAcademicPublishers,TheNetherlands。其它肺瘤相关抗原包括Her2、存活素和TERT。本文所述"抗原，，包括提供有待导入个体内的抗原蛋白或肽的工具。如本文所述，可通过递送肽或蛋白质或通过递送编码肽或蛋白质的核酸提供抗原。在本发明上下文中，"抗原，，还指包括抗原衍生的抗原肽。具体来讲，"肺瘤相关抗原"意思是指包括肺瘤相关抗原衍生的肽。可提供抗原如肺瘤相关抗原，以多种不同方式作为药物使用。它可作为病毒载体的一部分给予。本领域技术人员熟知多种合适的病毒载体，包括本文描述的多种载体。TroVax⑧疫苗(在美国注册为TroVax，欧共体商标为OxfordBiomedicaplc)包含用已经过改良可表达肿瘤相关抗原5T4的MVA的病毒载体。在一个实施方案中，用于本发明组合的肺瘤抗原是5T4,由TroVax⑧疫苗提供。合适的化疗剂包括任何常规药物。在一个实施方案中，所述化疗剂选自伊立替康、氟尿嘧啶、亚叶酸钩和奥沙利铂。在另一个实施方案中，"化疗剂"可包括化疗剂的治疗组合如FOLFOX或IFL。另一方面，提供本发明组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。适当地，当抗原是肺瘤相关抗原时，所述疾病是癌症。又一方面，提供包含同时、按顺序或单独用于治疗的抗原和一种或多种化疗剂的药品。抗原适合是肺瘤相关抗原。术语"同时"指同时给予两种药物。术语"按顺序"指给予一种药物之后在一定时间范围内给予另一种，以便两种药物在相同时间范围内都可发挥治疗作用。两种药物给药之间的最佳时间间隔将根据递送肿瘤抗原方法的精确性能而变化。术语"单独"用于指第一种药物与第二种药物给药之间的间隔是相当大的(substantial)。在一个实施方案中，在给予抗原之前给予化疗。适当地，在给予抗原之前10周给予化疗，优选少于10周，更优选在给予抗原之前约2周。在优选实施方案中，在给予抗原之前2周给予化疗。在一个实施方案中，在化疗开始之前给予接着在化疗之后再次给予抗原。在另一个实施方案中，在化疗期间以及化疗之前和/或之后给予抗原。在一个实施方案中，在化疗后至少24小时、优选48小时给予抗原。优选在化疗后至多8周、优选至多6周、甚至更优选4-6周之间给予抗原。在一个实施方案中，当待治疗受试者的CD4+CD25+Treg细胞计数减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予抗原。术语"€04+0025+Treg细胞计数减少"指低于给予CD4+CD25+Treg细胞计lt减少剂如一种或多种化疗剂或者Ontak之前测定的CD4+CD25+Treg细胞计数的CD4+CD25+Treg细胞计数。优选CD4+CD25+Treg细胞水平比给予CD4+CD25+Treg细胞计数减少剂(如一种或多种化疗剂或者Ontak)之前测定的CD4+CD25+Treg细胞水平低至少15°/。、30%、50%、70%、90%。最优选在化疗已导致〔04+€025+Treg细胞最大耗尽的同时接种疫苗。通过术语"〔04+0025+Treg细胞功能降低，，来指CD4+CD25+Treg细胞功能低于给予CD4+CD25+Treg细胞功能降低剂如化疗剂或Ontak之前测定的CD4+CD25+Treg细胞功能。优选CD4+CD25+Treg细胞功能比给予CD4+CD25+Treg细胞功能降4氐剂(如一种或多种化疗剂或者Ontak)之前测定的CD4+CD25+Treg细胞功能低至少15%、30%、50%、70%、90%。最优选在化疗已导致CD4+CD25+Treg细胞功能最大降低的同时接种疫苗。在一个实施方案中，提供采用包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药用组合物形式的本发明的药品。另一方面，提供治疗或预防疾病的方法，所述方法包括将抗原和化疗剂同时、按顺序或单独给予受试者。适当地，治疗个体的方法包括步骤a)给予化疗b)给予抗原。在一个实施方案中，所述方法还包括在给予化疗之前给予抗原。在另一个实施方案中，所述方法还包括在给予化疗的相同时间范围内给予抗原。另一方面，提供治疗癌症的方法，所述方法包括将肿瘤相关抗原和化疗剂同时、按顺序或单独给予受试者。适当地，治疗个体的方法包括步骤a)给予肿瘤抗原以引起抗肺瘤反应，b)给予化疗c)给予肺瘤抗原。在一个实施方案中，所述方法还包括测定004+0025+Treg细胞计数或CD4+CD25+Treg细胞功能。在另一个实施方案中，所述方法包括在化疗之前和/或同时和/或之后测定004忙025+Treg细胞计数或降低的CD4+CD25+Treg细胞功能。又一方面，提供抗原在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述治疗包括将一种或多种化疗剂和抗原同时、按顺序或单独给予受试者。另一方面，提供抗原和一种或多种化疗剂在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途。另一方面，提供抗原在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述治疗用于与化疗剂的组合疗法。另一方面，提供一种或多种化疗剂在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述治疗用于与抗原的组合疗法。又一方面，提供抗原和一种或多种化疗剂在制备用于同时、单独或按顺序用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中给药方式包括在给予化疗之前给予抗原和在化疗之后给予抗原。另一方面，提供抗原在制备用于给予哺乳动物以诱导对所述抗原的免疫反应的药物中的用途，其中给予抗原包括在治疗或预防疾病时，在给予化疗剂之前和/或同时和/或之后给予抗原。适当地，在上述任何方面的一个实施方案中，抗原是肺瘤相关抗原，疾病是癌症。在本发明的又一方面，提供在抗原致敏之前和/或同时和/或之后通过用化学疗法治疗以增强对抗原的免疫反应的方法。另一方面，提供包含用于给予抗原的工具的药剂盒，所述抗原与将给予的一种或多种化疗剂组合。本发明的其它方面在附属权利要求和下列描述和讨论中列出。这些方面在单独的部分标题下列出。然而，应理解在各部分标题下的内容不一定限制所述具体部分标题。发明详述抗原肿瘤相关抗原(TAA)虽然TAA已被鉴定为膜蛋白或者糖蛋白和糖脂的改变的碳水化合物分子，但是它们的功能很多仍未清楚。一种TAA家族，跨膜4超家族(TM4SF)通常具有四种非常保守的跨膜区、某些半胱氨酸残基和短序列基序。有证据表明TM4SF抗原与其它重要膜受体紧密締合，包括T细胞的CD4和CD8(Imai&Yoshie(1993)JImmunol.151,6470-6481)。还提出TM4SF抗原可能在信号转导中发挥作用，转而影响细胞发育、激活和活力。TM4SF抗原实例包括人黑素瘤相关抗原ME491、人和小鼠白细胞表面抗原CD37和人淋巴细胞性白血病相关TALLA-1(Hotta,H.等(1988)CancerRes.48,2955-2962;Classon,B.J.等(1989)J.Exp.Med,169:1497-1502;Tomlinson,M.G.等(1996)Mol.Immun.33:867-872;Takagi,S.等(1995)Int.J,Cancer61:706-715)。TAA的其它实例还包括但不限于下列种类TAA:癌睾丸抗原(HOM-MEL-40)、分化抗原(HOM-MEL-55)、过度表达基因产物(HOM-MD_2l)、突变基因产物(NY-COL-2)、剪接变异体li(HOM-MD-397)、基因扩增产物(HOM-NSCLC-ll)和癌相关自身抗原(HOM-MEL-2.4)，如CancerVaccinesandImmunotherapy(2000)Stern,Beverley和Carroll编辑,CambridgeUniversityPress,Cambridge综述。其它实例包括MART-1(T细胞-1识别的黑素瘤抗原)、MAGE-A(MAGE-A1,MAGE-A2,MAGE画A3，MAGE-A4，MAGE-A6,MAGE-A8,MAGE-A10,MAGE-A12)、MAGEB(MAGE-B1-MAGE-B24)、MAGE-C(MAGE-C1/CT7,CTIO)、GAGE(GAGE-1，GAGE-8，PAGE-1,PAGE-4,XAGE-1,XAGE-3)、LAGE(LAGE-la(lS),-lb(lL),NY-ESO-l)、SSX(SSX1-SSX匿5)、BAGE、SCP-1、PRAME(MAPE)、SART-1、SART-3、CTpll、TSP50、CT9/BRDT、gplOO、MART-1、TRP-1、TRP-2、MELAN-A/MART-1、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、MUCIN(MUC-l)和酪氨酸酶。TAA综述于CancerImmunology(2001)KluwerAcademicPublishers,TheNetherlands。在一个实施方案中，所述肿瘤相关抗原是5T4。5T45T4先前已被鉴定于例如WO89/07947中。人5T4序列在GenBank中出现的登记号为Z29083。5T4抗原可来自不同物种，如鼠5T4(WO00/29428)、犬5T4(WO01/36486)或猫5T4。抗原还可来自特殊物种、优选哺乳动物中发现天然存在的5T4变异体。此类变异体可由相同基因家族的相关基因、特殊基因的等位变异体编码，或者代表5T4基因的选择性剪接变异体。5T4及其用途也已描述于EP1036091。不同物种或剪接变异体的5T4衍生的肽表位可具有与类似物人野生型5T4肽表位不同的氨基酸序列。然而，只要该肽保留与人肽相同性质的结合特异性(即在相同单倍体的MHC分子的肽结合沟结合)，则仍然是符合本发明的表位。抗原衍生的免疫原性肽"抗原，，包括来自包括肿瘤相关抗原在内的具体抗原蛋白的肽表位。合适的表位包括T细胞表位。所述肽适合是"免疫原性肽"，即它们能够刺激抗肿瘤相关抗原免疫反应。此类免疫反应包括对肽的细胞毒性T细胞反应以及对普通蛋白质抗原的细胞毒性T细胞反应和/或抗体反应。在这方面，术语"肽，，具有正常含义，指通常通过相邻氨基酸的a-氨基与羧基之间的肽键相互连接的连续残基(通常是L-氨基酸)。术语包括修饰肽和合成肽类似物。T细胞表位是可用蛋白质抗原得到的短肽。抗原提呈细胞可内化抗原，将其加工为能够与MCH分子结合的短片段。与MHC结合的肽特异性取决于肽与特定MHC分子的肽-结合沟之间具体的相互作用。与I类MHC分子结合(由CD8+T细胞识另'J)的肽通常为6-12、更通常为8-12个氨基或者8-10个氨基酸长度。通常，所述肽为9个氨基酸长。肽氨基末端的胺基与肽沟(groove)—端的不变位点接触，羧基末端的羧酸基与沟另一端的不变位点结合。因此，此类肽通常具有疏水或碱性的羧基末端，在最终的氨基端不存在脯氨酸。肽沿着沟呈延伸构象，顺着该沟排列的主链原子与保守的氨基酸侧链之间还存在更多接触。通过肽主链的扭结(通常在脯氨酸或甘氨酸残基)调节肽长度的变化。与II类MHC分子结合的肽通常至少10个氨基酸，例如约13-18个氨基酸长，可以更长。这些肽沿着两端都开放的MHCII肽-结合沟呈延伸构象。主要通过与沿着肽-结合沟排列的保守残基接触的主链原子固定肽的位置。Textbook.MikosBodansky，Springer-Verlag,Berlin.)。例如，可将肽用固相技术合成(RobergeJY等(1995)Science269:202-204)，从树脂上切下，用制备高效液相层析纯化(如Creighton(1983)ProteinsStructuresAndMolecularPrinciples,WHFreemanandCo,NewYorkNY)。可实现自动合成，例如用ABI431APeptideSynthesizer(PerkinElmer)才艮据制造商提供的说明书合成。或者可将所述肽用重组方法或从更长的多肽中裂解制备。例如，可通过裂解全长蛋白质如全长5T4得到所述肽。可通过氨基酸分析或测序(如Edman降解操作)确认肽的组成。术语"肽表位"包括修饰肽。例如，只要保留野生型肺瘤相关抗原肽的MHC结合特异性，可通过氨基酸插入、缺失或置换使肿瘤相关抗原肽突变。在优选实施方案中，修饰的表位对肽结合沟具有更大亲和力。优选所述肽包含5个或以下、更优选3个或以下、最优选l或0个野生型序列的突变。或者(或另外)可以不改变肽的氨基S吏序列进行修饰。例如，可包含D-氨基酸或其它非天然氨基酸，可用酯或烷基主链4建、N-或C-烷基取代基代替正常的酰胺键，侧链修饰，可包含空间束缚(constmint)如二石克桥和侧链酰胺或酯链。此类改变可导致肽的体内稳定性更大，生物学半衰期更长。其它修饰形式包括翻译后修饰如肽的磷酸化和糖基化。翻译后修饰的肽诱导与本发明其它肽基本相同的免疫反应。某些修饰可能导致诱导的免疫反应增加，而其它将降低反应。其它修饰包括添加或脱除糖基化或磷酸化位点，以改变或调节由这些肽刺激的免疫反应。表位的修饰可根据用K.Parker(NIH)提出的"肽结合预测"程序衍生的更有效的T细胞诱导进行，所述程序可参阅htttr.〃www-bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/kenparkercomboform(还参阅Parker,K.C等，1994.J.Immunol.152:163)。"修饰的"抗原肽表位包括已与转运肽或佐剂键合或其它方式的结合以增加其引起免疫反应的能力的肽。例如，肽可与TAP非依赖性转运肽融合以有效转运至HLA,与HLA分子相互作用以增强CTL表位(综述参阅Yewdell等，1998JImmunother21:127-31;Fu等，(1998)JVirol72:1469-81)。在又一个实施方案中，抗原或此类抗原衍生的肽可与乙型肝炎核心抗原融合以增强T辅助细胞和抗体反应(Schodel等，1996Intervirology39:104-10)。作为表位，肽应当能够与I或II类MHC分子的肽-结合沟结合并-故T细月包识别。由指定抗原衍生的肽的细胞表面提呈不是随机性的，容易被少数频繁出现的表位支配。具体肽的优势将取决于许多因素，例如与MHC分子结合的相对亲和力、在APC内产生的时空点和抗降解度。抗原的表位等级结构被认为随免疫反应的进展改变。在对免疫优势肽的初级免疫反应之后，表位"扩展，，可出现亚优势决定子(Lehmann等(1992)Nature358:155-157)。对于任何指定抗原，还可存在隐蔽表位。隐蔽表位是作为肽给予时可刺激T细胞反应但作为完整抗原给予时不能产生此类反应的表位。可能是在APC内抗原被加工成肽的过程中隐蔽表位受到破坏。用于本发明的肽可以是免疫优势表位、亚优势表位或隐蔽表位。通过测定APC提呈抗原时使跨抗原部分的肽重叠的T细胞反应，可鉴定抗原的表位。此类研究通常导致肽的"嵌套"，通过测量对截短肽的反应，可评估对特殊T细胞系/克隆的最小表位。抗原的最小表位可能不是实用目的的最佳表位。很可能在最小表位侧面的氨基酸将是与MHC最佳结合所必需。在包含抗原提呈细胞和T细胞的抗原提呈系统中测试肽。例如，抗原提呈系统可能是鼠类脾细胞制剂、来自扁桃体或PBMC的人细胞制剂。或者，抗原提呈系统可包含特殊T细胞系/克隆和/或特殊抗原提呈细胞类型。通过T细胞增殖(如用3H-胸苷掺入)或细胞因子产生可测量T细胞活化。通过IFNy产生(可用标准技术如ELISPOT测定检观'j)可以检测TH1-型CD4+T细胞的活化。,^在声一/rtgJ已经发现诱导对抗原的免疫反应特别有效的方法是用多表位串，所述多表位串包含连接一起的一种或多种抗原的大量抗原表位。例如，对于疟疾，已经描述主要是疟疾(恶性疟原虫尸./a/";parwm)CD8T细胞肽表位的多表位串，所述多表位串还表达破伤风毒素和结核分枝杆菌(M^Z^cM/o^)和牛分枝杆菌(M6ov&)各种菌抹的38Kd分枝杆菌抗原的CD4T细胞表位。因此，用于本发明的胂瘤相关抗原可以是包含至少一种来自胂瘤相关抗原的肽的多表位串。多表位串适合由至少1、2、3、4或多个肽表位组成。所述串还可包含由抗原如5T4抗原衍生的另一种表位或者来自另一种抗原(如另一种TAA)的表位或其组合。多表位串在不同肺瘤抗原表位之间可任选包含其它插入氨基酸。所述表位适合与全长蛋白质缺乏的其它序列连接。本发明还提供与细胞渗透剂締合的抗原或其肽表位或者多表位串的用途。肿瘤免疫(Celluzzi等(1996)J.Exp.Med.183283-287;Young等(1996)J.Exp.Med.1837-11)。已显示通过与细胞渗透肽(CPP)连接，可能延长树突状细胞对肽的提呈(从而增强抗肿瘤免疫)(Wang和Wang(2002)NatureBiotechnology20149-154)。细胞渗透剂可以是增强肽/多表位串细胞内递送至抗原提呈细胞的实体。例如，细胞渗透剂可以是与肽締合时增强其跨膜能力的脂质。或者，细胞渗透剂可以是肽。已经鉴定来自蛋白质的几种细胞渗透肽(CPP),包括HIV的Tat蛋白(Frankel和Pabo(1988)Cell551189-1193)、HSV的VP22蛋白(Elliott和O'Hare(1997)Cell88223-233)和成纤维细胞生长因子(Lin等(1995)J.Biol.Chem.27014255-14258)。术语"締合"意思是指包括直接连接，如通过共价键连接。连接氨基酸的共价键实例包括二硫桥和肽键。在优选实施方案中，肽/多表位串与CPP通过肽键连接以产生融合蛋白。该术语还包括非共价连接，如通过静电结合、氢键和范德华力締合。细胞渗透剂和肽/多表位串可以不需要共价或非共价键而締合。例如，细胞渗透剂可以是将肽/多表位串包嚢化的脂质(如脂质体)。發f顏拟絲絲話载体系统送或给予哺乳动物如人类患者。用于本文时，"载体"可以是能够递送或维持宿主细胞内核酸的任何载体，包括病毒载体、质粒、棵核酸、与多肽或其它分子络合的核酸以及固定在固相颗粒上的核酸。此类载体在下文详细描述。应理解本发明最广泛的形式不限于用于递送肿瘤相关抗原-编码核酸的任何具体载体。可通过病毒或非病毒技术递送或给予编码本发明的抗原、表位和多表位串的核酸。非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。这里，转染包括用非病毒载体将编码抗原的基因递送至靶哺乳动物细胞的过程。典型转染方法包括电穿孔、核酸生物导弹术、脂质介导的转染、紧密型核酸介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质转染、阳离子试剂介导的、阳离子面式两亲物(CFA)(NatureBiotechnology199614;556)、多价阳离子如精胺、阳离子脂质或聚赖氨酸、1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)-胆固醇复合物(Wolff和Trubetskoy1998NatureBiotechnology16:421)及其组合。非病毒递送系统还可包括但不限于细菌递送系统。细菌作为抗癌剂和作为抗癌药物递送剂的用途已经描述于ExpertOpinBiolTher2001Mar;l(2):291-300。合适的细菌包括但不限于细菌病原体和非病原体共生细菌。例如，合适的种属可选自b少门氏菌属05*"/^0"￡//<3)、分枝杆菌属(Myco6acten^m)、耶尔森氏菌属(7erw'm'a)、志贺氏菌属(572/(^//力、李斯特菌属(1^^^)和布鲁氏菌属(万^"/&)。这些细菌的发病学和分子生物学最新进展已经允许合理地发展新的和改良的细菌载体以及更有效的基因表达系统。这些进展已经改善这些递送系统的性能和多样性。所述细菌可以是能够将真核生物表达质粒转移入体外和体内哺乳动物宿主细胞的侵入性细胞内细菌。质粒转移可发生在重组细菌在宿主细胞内死亡时，归因于代谢衰减或诱导自溶。或者，可使用抗生素，还观察到自发转移，提示这种现象也可在生理学条件下发生。虽然已经报道弗氏志贺菌0$7^6//"y/e;men')、鼠伤寒沙门氏菌(&/附0^^/^fe'mwWwm)、斑渗伤害沙门氏菌(S.(yp/z/)、单核细胞增多性李斯特菌(ZiWen.awo"oqytoge"ey)和重组大肠杆菌(五sc/zen'c/n'aco/Z)的质粒转移，但也可使用其它侵入性细菌。可用细菌递送DNA疫苗。此类细菌可在吞噬作用后进入宿主细胞胞质，例如志贺氏菌属(572/<^/^)和李斯特菌属(￡/^^^)，或者它们停留在吞噬体隔室内-如沙门氏菌属。两种细胞内定位都可适合成功地递送DNA疫苗载体。细菌递送系统可利用非病原体分枝杆菌菌林形式的分枝杆菌、克隆和表达载体形式的遗传转移系统以及相关技术得到产物，所述产物包含例如非毒性免疫调节分枝杆菌佐剂、对各种疾病具有特异性的非毒性免疫刺激外源性抗原以及促进TH-1途径的非毒性量细胞因子(TunisMed2001Feb;79(2):65-81)。沙门氏菌(&/附0^//")林(如减毒抹，包含确定的基因缺失)可用作合适的递送系统，如递送抗原。已经尝试这些菌抹的多种递送策略，从以质粒为基础至染色体整合系统。例如，Rosenkranz等Vaccine2003，21(7-8),798-801描述编码细胞因子的真核生物表达质粒，评估它们在不同实验模型中调控免疫反应的能力。在巨细胞病毒启动子下构建编码小鼠IL-4和IL-18的质粒，转化入活的减毒肠沙门氏菌(^/附0"6/&ewten'ca)血清型Typhi林CVD908-htrA和肠沙门氏菌(&/附0"6/&e"ten'a7)血清型Typhimurium林SL3261中。减毒鼠伤寒沙门氏菌(Sa/mowe//a2y;/7/^mn'wm)作为潜在的基因递送载体的用途已经综述于AnticancerRes2002,22(6A):3261-6中。流产布氏杆菌C5n<ce//aWoWw力也可用作合适的递送系统，如由Vemulapalli等描述于InfectImmim(2000)68(6):3290-6。流产布氏杆菌08race//aWom/"抹RB51是广泛用作牛布氏杆菌病活疫苗的稳定、未加工的减毒突变体。该菌株可作为递送载体，例如用于递送其它细胞内病原体的保护性抗原，其中需要有效地保护对强烈的TH1型免疫反应的诱导。Boyd等EurJCellBiol(2000)79(10)659-71描述用小肠结肠炎耶尔森氏菌(7erw'm'aenteraco/z'"ca)将蛋白质递送入多种细胞类型内。小肠结肠炎耶尔森氏菌(7e"feraco/Wca)将毒性蛋白质(称为Yop效应子)转移入真核细胞胞质内。未报道其中小肠结肠炎耶尔森氏菌(7^2teraco/"/ca)可使Yop易位的真核细胞范围。Yop效应子YopE、YopH和YopT对测试的粘附细胞类型具有各自的细胞毒性，显示不仅小肠结肠炎耶尔森氏菌(Fe"feraco版ca)非选择性使特殊Yop效应子易位入各种细胞类型内，而且这些Yop效应子的作用也是非细胞类型特异性的。为了广泛应用耶尔森氏菌(7era/m'a)易位系统，构建用于将异种蛋白递送入真核细胞内的小肠结肠炎耶尔森氏菌(JeMteraco//"c")易位抹和载体。这种菌抹和载体组合缺乏易位的Yop效应子，允许与YopE的最小N-端分泌/易位信号融合的异种蛋白递送入真核细胞内。US5965381描述用于将蛋白质递送入真核细胞内的重组耶尔森氏菌(7e^z'm'a)。此类耶尔森氏菌(7era/m'a)虽然不足以产生功能性效应蛋白，但可促进功能性分泌和易位系统。细胞粘附分子是涉及各种细胞-细胞和细胞-细胞外基质(ECM)相互作用的一大类分子，被多种病原微生物利用为进入细胞的受体。这些分子可用于瞄准和摄取基因和药物递送系统。细胞粘附分子及其在基因转移中的用途已经综述于AdvDrugDelivRev2000Nov15;44(2-3):135陽52。基因枪递送系统还可用于递送DNA，与肌内接种相比是非常可靠的方法(JpnJPharmacol2000Jul;83(3):167-74)。病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺病毒相关性病毒(AAV)载体、疱渗病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或杆状病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、痘病毒类如金丝雀痘病毒(Taylor等1995Vaccine13:539-549)、昆虫痘病毒(LiY等1998XIIthInternationalPoxvirusSymposium144页.摘要)、penguinepox(Standard等JGenVirol.199879:1637-46)曱病毒和以曱病毒属为基础的DNA载体。逆转录病毒实例包括但不限于鼠白血病病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV)、Moloney鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽骨髓细胞瘤病毒-29(MC29)和禽成红细胞增多症病毒(AEV)。逆转录病毒的详细目录可参阅Coffin等("Retroviruses"1997ColdSpringHarbourLaboratoryPressEds:JMCoffm，SMHughes,HEVa腿s,758-763页)。慢病毒属可分为灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒实例包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)，人类自身免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体，和猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒包括原型"慢病毒，，绵羊脱髓鞘性脑白质炎/肺腺瘤病病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。慢病毒家族与其它逆转录病毒类型的区别在于慢病毒属既能够感染分裂细胞也能够感染非分裂细胞(Lewis等1992EMBO.J11:3053-3058;Lewis和Emerman1994J.Virol.68:510-516)。相反，其它逆转录病毒-如MLV-不能感染非分裂细胞，如组成例如肌肉、脑、肺和肝组织的细月包。可将用于本发明的载体配置为断裂-内含子载体。断裂内含子载体描述于PCT专利申请WO99/15683和WO99/15684中。如果将腺病毒特征与逆转录病毒/慢病毒的遗传稳定性合并，则基本上可用腺病毒转导靶细胞，成为可以稳定地感染邻近细胞的过渡性逆转录病毒产生细胞。可将设计用于表达5T4抗原的此类逆转录病毒产生细胞植入生物体如动物或人中，用于治疗血管发生和/或癌症。可将用于本发明的载体装配为假型载体。在设计逆转录病毒载体时，优选可设计对天然病毒具有不同靶细胞特异性的颗粒，以便能够将遗传物质递送至扩展或改变范围的细胞类型中。实现这个目的的一种方法是设计病毒包膜蛋白以改变其特异性。另一种方法是将异种包膜蛋白引入载体颗粒内，以代替或加入病毒的天然包膜蛋白。术语假型化指用异种包膜基因(如另一种病毒的包膜基因)掺入病毒基因组的至少一部分或者取代一部分或者更换全部包膜基因。假型化不是新现象，实例可参阅WO99/61639、WO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/09400、WO-A-91/00047和Mebatsion等1997Cell90，841-847。假型化可改善逆转录病毒载体稳定性和转导效率。已经描述用淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)包装的鼠白血病病毒的假型(Miletic等(1999)J.Virol.73:6114-6116),显示在超速离心过程中稳定，能够感染来自不同物种的几种细胞系。抗原如TAA的免疫原性很弱，一皮免疫系统识别为"自身"，所以4艮大程度地耐受。有时用痘病毒载体能够导致抗原提呈，以致这种耐受至少部分被克服(特别是在免疫逃逸基因缺失时-见下文)，从而使宿主能够产生免疫反应。痘病毒载体优选用于本发明。将痘病毒设计用于重组基因表达和用作重组活疫苗。这使重组技术能够用于将编码外来抗原的核酸引入痘病毒基因组内。如果在病毒生命周期非必需的病毒DNA位点整合核酸，则新产生的重组痘病毒可能具有传染性，也就是说传染外来细胞，从而表达整合的DNA序列。以这种方法制备的重组痘病毒可用作预防和/或治疗致病性和传染性疾病的活疫苗。抗原肽在重组痘病毒如牛痘病毒中的表达，需要将疫苗启动子与编码5T4肽的核酸连接。已构建质粒载体(也称为插入载体)，通过供体质粒核酸侧面的病毒序列与亲代病毒中存在的同源序列的同源重组，将核酸插入牛痘病毒内(Mackett等1982PNAS79:7415-7419)。一种插入载体类型由下列组成(a)包括转录起始位点在内的牛痘病毒启动子；(b)位于核酸插入的转录起始位点下游的几种独特的限制性核酸内切酶克隆位点；(c)位于启动子和克隆位点侧面的非必需牛痘病毒序列(如胸普激酶(TK)基因)，将核酸顺向插入病毒基因组的同源非必需区内；和(d)在大肠杆菌(ECo/Z)中用于复制和选择的复制和抗生素耐药标记的细菌源。此类载体实例描述于Mackett(Mackett等1984,J.Virol.49:857-864)。与亲代病毒如痘病毒一起，将含有待插入核酸的分离质粒转染入细胞培养基如鸡胚成纤维细胞中。质粒与病毒基因组中同源牛痘DNA之间的重组分别产生重组痘病毒，对其基因组中启动子-基因结构的存在进行修饰，在该位点不影响病毒活力。如上所述，将核酸插入不影响所得重组病毒的病毒活力的病毒区内(插入区)。很容易鉴定病毒中的此类区域，例如通过随机测试病毒DNA链段中不严重影响重组病毒活力允许形成重组体的区域。很容易使用并且存在于许多病毒中的一种区域是胸苷激酶(TK)基因。例如，TK基因已被发现存在于所有受检的痘病毒基因组中[兔痘病毒Upton等，J.Virology60:920(1986)(shope纤维瘤病毒)；羊痘病毒Gershon等，J.Gen.Virol.70:525(1989)(Kenya绵羊-l);正痘病毒Weir等，J.Virol46:530(1983)(牛痘)；Esposito等，Virology135:561(1984)(猴痘和类天花病毒)；Hruby等，PNAS，80:3411(1983)(牛痘)；Kilpatrick等,Virology143:399(1985)(Yaba猴肿瘤病毒)；禽痘病毒Binns等，J.Gen.Virol69:1275(1988)(禽痘)；Boyle等，Virology156:355(1987)(禽痘)；Schnitzlein等,J.VirologicalMethod,20:341(1988)(禽痘，鹌鸫痘)；昆虫痘病毒(Lytvyn等，J.Gen.Virol73:3235-3240(1992)]。在牛痘中，除了TK区之外，其它插入区包括例如HindIIIM。在禽痘中，除了TK区之外，其它插入区包括例如BamHIJ[Jenkins等，AIDSResearchandHumanRetroviruses7:991-998(1991)]、五coRI-HindIII片段、B^wffl片段、EcoRV-Hindlll片段、BamHI片段和HindIII片段，参阅EPO申请号0308220Al。[Calvert等，J.ofVirol67:3069-3076(1993);Taylor等,Vaccine6:497-503(1988);Spehner等，(1990)和Boursnell等，J.ofGen.Virol71:621-628(1990)]。在猪痘中，优选插入位点包括胸苷激酶基因区。根据宿主和靶细胞类型很容易选择启动子。例如在痘病毒中，应当用痘病毒启动子，如牛痘7.5K或40K或者禽痘Cl。也可使用包含适当痘病毒序列的人工构建。还可联合使用增强子元件以提高表达水平。而且，在一些实施方案中，优选用本领域也熟知的可诱导性启动子。外来基因表达可通过酶或免疫测定(例如免疫沉淀、放射免疫测定或免疫印迹)检测。由重组牛痘感染细胞产生的天然存在的膜糖蛋白被糖基化，可转运至细胞表面。用强启动子可得到高表达水平。性。MVA是具有良好安全记录的复制缺陷牛痘。在大多数细胞类型和正常人组织中，MVA不复制。在一些转化细胞类型如BHK21细胞中可观察到MVA复制。Carroll等(1997)已经显示重组MVA在产生保护性CD8+T细胞反应方面与常规重组牛痘载体一样好，有效代替更23常用的复制活性牛痘病毒。由MVA衍生的牛痘病毒或者使MVA特别适合用于疫苗的具有MVA特征的独立开发林也适合用于本发明。优选所述载体是牛痘病毒载体如MVA或NYVAC。最优选牛痘抹修饰的病毒ankara(MVA)或其衍生抹。备选牛痘载体包括禽痘载体如禽疽或金丝雀痘(称为ALVAC)及其衍生株，它们可在人体细胞中感染和表达蛋白质，但不能复制。在本发明一方面，痘病毒载体缺失至少一个免疫逃逸基因。病毒，特别是具有广泛编码容量从而可编码多种基因的大病毒如痘病毒，已经发展了逃避其宿主免疫系统的多种技巧。例如它们能够逃避非特异性防御如补体、干扰素和炎症反应，以及干扰或阻断细胞因子功能。除了左侧末端区干扰素耐药蛋白之外，MVA已缺失大量这些免疫逃逸多肽。痘病毒通常是产生急性(而不是潜伏性)感染的大DNA病毒。它们编码如此多抗原蛋白，以致很难抗原变异，>^人而依赖活性免疫逃逸保护其自身免受哺乳动物免疫系统的作用。它们具有编码多肽的大量基因，所述多肽负责干扰免疫系统的多个方面它们中断干扰素作用，千扰补体、细胞因子活性、炎症反应和CTL识另'J(参阅Smith等(1997)ImmunolRev159:137-154)。除去这些蛋白质有利于促进在痘病毒载体上编码的弱免疫原引起受试者免疫反应的能力。免疫逃逸基因或多肽是辅助病毒逃避哺乳动物免疫系统的基因或其产物。优选所述基因或基因产物至少在一个水平干扰免疫系统运行。这可通过多种方法实现，例如通过干扰信号途径、提供信号分子竟争剂、提供可溶性拟细胞因子受体等。免疫逃逸基因包括但不限于下列基因"f扰,遞逸差^。牛痘具有至少3个干扰IFN作用的基因。E3L基因表达与Pl蛋白激酶竟争性与dsRNA结合的25Kd多肽，该事件导致P1活化、elF2a磷酸化和翻译起始复合物不能组装。该途径通常由IFN活化引起，但受E3L表达阻碍，从而允许翻译起始不受妨碍地进行。K3L基因表达也干扰P1活性的10.5Kd多肽，因为它是有效的拟elF2a,充当P1蛋白激酶竟争剂。所以其作用方式与E3L相似。预测A18R基因可编码解旋酶，其干扰2',5'-寡腺苷酸途径，转而呈IFN反应性。2',5'-A激活RNAseL,防止病毒翻译。A18R的表达降4氐受感染细胞内的2',5'-A水平。##。已知牛痘的B5R基因产物与因子H高度相关，因子H是旁路补体途径的调节剂。与经典途径不同，该途径可能由抗原单独激活。由此B5R基因产物可干扰旁路补体途径。C21L基因又与人体的C4b-结合蛋白相关，与表面携带C4b的细胞相互作用，防止与CR1补体受体结合。了溶遂勿/《^"^€#。牛痘WRB15R基因(Copenhagen抹牛痘中的B16R)与IL1-R有关。Copenhagen林牛痘中的WR基因ORFSalF19R、A53R编码TNF受体。然而，人们认为在野生型病毒中，这两种基因都无活性，因为ORF断裂。B8R基因^皮认为编码可溶性IFN-y受体，前提是所述病毒还有另一种IFN逃逸;^L制。义'症。人们认为多种基因涉及预防对病毒感染的炎症反应。这些基因包括A44L、K2L、B13R和B22R。在本发明一方面，重组痘病毒载体缺失大部分免疫逃逸基因。优选缺失全部免疫逃逸基因。因此，在本发明一方面，所述重组痘病毒载体是重组MVA载体，其中K3L干扰素抗性蛋白基因已经断裂或缺失。优选对预期受试者无害的痘病毒。因此，例如用于人体时，优选宿主范围受限的疸病毒(如禽痘病毒)或另外减毒的痘病毒(如减毒牛痘林(包括NYVAC和MVA))。尽管最优选减毒牛痘病毒株，但非牛痘抹通常用于原有天花免疫的受试者。将构建体(包含至少一种编码肿瘤相关抗原表位的核酸，位于与MVA基因组内天然存在的缺失如II缺失相邻的MVADNA序列侧面)引入被MVA感染的细胞内，让其同源重组。一旦已将构建体引入真核细胞内并且肿瘤相关抗原表位DNA已与病毒DNA重组，即可分离所需重组牛痘病毒，优选在标记物的辅助下分离(Nakano等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79,1593-1596[1982],Franke等，Mol.Cell.Biol.1918-1924[1985],Chakrabarti等，Mol.Cell.Biol.3403-3409[1985]，Fathi等，Virology97-105[1986])。待插入的构建体可以是线性或环状。优选环状DNA,特别是质粒。所述构建体包含位于MVA基因组内天然存在的缺失如II缺失的左侧和右侧侧面的序列(Altenburger,W.,Suter,C.P.和AltenburgerJ.(1989)Arch.Virol.105，15-27)。将外来DNA序列插入天然存在的缺失侧面的序列之间。为了表达至少一种核酸，调控序列是必需的，这是核酸转录的需要，位于核酸上游。本领域技术人员已知此类调控序列，包括例如描述于EP-A-198,328的牛痘11kDa基因和7.5kDa基因的调控序列(EP-A-110,385)。可通过转染将构建体引入MVA感染细胞内，例如通过磷酸钧沉淀(Graham等，Virol.52,456-467[1973];Wigler等，Cell777-785[1979])、电穿孔(Neumann等，EMBOJ.1,841-845[1982])、微注射(Graessmann等，Meth.Enzymology101,482-492(1983))、月旨质体(Straubinger等，MethodsinEnzymology101,512-527(1983))、原生质球(Schaffner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77,2163-2167(1980))或本领域技术人员已知的其它方法。优选通过脂质体的方式转染。用于本发明的重組载体可对哺乳动物的特殊细胞类型具有取向性。例如，可将本发明的重组载体设计为感染专职APC如树突状细胞和巨噬细胞。已知树突状细胞可协调产生成功的免疫反应，特别是细胞介导的反应。已经显示用抗原或含有此类靶抗原的病毒载体离体处理树突状细胞，当注入同种动物或人体内时，将诱导有效的免疫反应(参阅NestleFO.等,Vaccinationofmelanomapatientswithpeptide-ortumorlysate-pulseddendriticcells,NatMed.1998Mar;4(3):328-32禾口KimCJ,等DendriticCellsinfectedwithpoxvirusesencodingMART-l/MelanAsensitizeTlymphocytesinvitro.JImmunother.1997Jul;20(4):276-86。重组载体还可感染肿瘤细胞。或者，所述重组载体能够感染哺乳动物内的任何细胞。其它载体实例包括离体递送系统，包括但不限于DNA转染法如电穿孔、DNA生物导弹术、脂质介导性转染和紧密型DNA介导性转染。载体可以是质粒DNA载体。用于本文时，"质粒"指用于将异源DNA引入细胞内用于其表达或复制的分立的元件。本领域技术人员熟知此类载体的选择和使用。适合给予肺瘤相关抗原的载体系统是TroVax⑧疫苗，一种用减毒牛痘病毒载体(MVA)递送5T4的临床开发的癌症疫苗。目前在晚期结肠直肠癌、肾癌和前列腺癌患者中正在进行1^0￥&乂@的II期临床试验评估。使用TroVax的试验描述于例如PCT/GB2005/000026。还涉及以给予肺瘤相关抗原的TroVax为基础的更多变更或》f饰。本发明还提供用由肿瘤相关抗原或肽脉沖的细胞给予抗原。优选待脉冲的细胞能够表达MHCI类或II类分子。MHCI类分子可在几乎所有细胞类型上表达，但MHCII类分子的表达限于所谓"专职"抗原提呈细胞(APC)、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞。然而，通过用IFNy处理可将MHCII类的表达诱导在其它细胞类型上。MHCI类或MHCII类分子的表达还可通过基因工程实现(即将编码相关MHC分子的基因提供给待脉冲的细胞)。这种方法具有的优点是可选择与肽特异性结合的适当MHC单倍体。优选待脉沖的细胞是抗原提呈细胞，即在正常免疫反应中能够加工抗原并将其提呈在与MHC分子连接的细胞表面的细胞。抗原提呈细胞包括B细胞、巨噬细胞和树突状细胞。在特别优选的实施方案中，细胞是树突状细胞。优选细胞能够表达MHC分子，该MHC分子在其肽结合沟与本发明第一方面的肽结合。例如，所述细胞可表达一种下列HLA限制元件B8、Cw7或A2(对于MHCI类)。肽脉冲方案已为本领域所知(参阅例如Redchenko和Rickinson(1999)J.Virol.334-342;Nestle等(1998)Nat.Med.4328-332;Tjandrawan等(1998)J.Immunotherapy21149-157)。例如，在用肽填充树突状细胞的标准方案中，使细胞和肽以50吗/ml与3pg/ml卩-2微球蛋白在无血清培养基中培养2小时。然后洗去未结合的肽。可将本发明的脉冲细胞用作疫苗，例如用于刺激抗特异性肺瘤相关抗原的预防或治疗性免疫反应。因此本发明还^是供用于治疗和/或预防疾病的方法，包括将肽脉冲细胞联合化疗剂给予有需要的受试者。核酸可通过编码所述肿瘤相关抗原的核酸分子提供用于本发明的组合物或药物或者给予本发明组合的抗原。参考本文，"核酸，，可以是天然存在或合成的DNA或RNA或其任何组合。本发明的核酸只限于它们发挥编码肿瘤相关抗原肽的功能，以便其可被宿主生物体的细胞结构翻译。因此，可以修饰天然核酸，例如用于增加其稳定性。可以修饰DNA和/或RNA,但特别是RNA,以便改善DNA或RNA的核酸酶抗性。例如，已知的核糖核苷酸修饰包括2'-0-曱基、2'-氟代、2'-顺2和2'-0-烯丙基。本发明的修饰核酸可包含化学修饰，进行所述修饰是为了增加核酸的体内稳定性、增强或介导其递送或者降低机体的清除率。此类修饰的实例包括在指定RNA序列的核糖和/或磷酸盐和/或碱基位置的化学取代。参阅，例如WO92/03568;U.S.5,118,672;Hobbs等，(1973)Biochemistry12:5138;Guschlbauer等，(1977)NucleicacidRes.4:1933;Schibaharu等，(1987)NucleicacidRes.15:4403;Pieken等，(1991)Science253:314，其各自通过引用具体结合到本文中。编码合适的抗原或其衍生肽的核酸将为本领域技术人员熟悉，或者可用本领域技术人员的标准方法衍生。例如，用于本发明的DNA如下获得用较长的多核苷酸如整个肺瘤相关抗原编码序列或其片段用聚合酶链式反应(PCR)或直接裂解进行化学合成。编码合适的抗原和肽或其衍生的多表位串的核酸可以是优化密码子。密码子优化已经描述于WO99/41397和WO01/79518。不同细胞的区别在于其使用特殊密码子。密码子偏倚与细胞类型中特殊tRNA相对丰度的偏倚相对应。通过改变序列的密码子，将其特制为与相应tRNA的相对丰度匹配，能够增加蛋白质表达。同样，通过巧妙地选择在特殊细胞类型中已知相应tRNA很少的密码子可以减少表达。因此，翻译控制的添加度是有效的。本领域已知哺乳动物细胞以及各种其它生物体的密码子选择表。变异体/片段/同源物/衍生物本发明包括编码抗原及其变异体、同源物、衍生物和片段的核香酸和氨基酸序列的用途。术语"变异体"用于指不同于野生型序列的天然存在的多肽或核苦酉t字列。术语"片段"表示含有受试序列的一部分的多肽或核香S吏序列。优选所述序列包含至少50%、更优选至少65%、更优选至少80%、更优选至少90%、最优选至少90%受试序列。如果所述片段是氨基酸片段,则优选所述片段长6-12个氨基酸。更优选，所述片段长8、9或10个氨基酸。术语"同源物"指与受试氨基酸序列和受试核苷酸序列具有某些同源性的实体。这里，术语"同源性"可等同于"一致性"。在本文，同源序列意思是指包括与受试序列可以有至少75、85或90%相同(优选至少95或98%相同)的氨基酸序列。通常，同源物将含有与受试氨基S^列相同的活性。虽然也可以将同源性视为相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但在本发明上下文中，优选用序列同一性表达同源性。在本文中，同源序列意思是指包括与受试序列可以有至少75、85或90%相同(优选至少95或98。/。相同)的核苷酸序列。通常，同源物将含有与受试序列相同的活性。虽然也可以将同源性视为相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但在本发明上下文中，优选用序列同一性表达同源性。本领域技术人员熟悉确定序列同一性的方法。一种合适的5T4同源物描述于GB0615655.8,其通过引用结合到本文中。《斜微合#本发明提供与一种或多种化疗剂联合使用的疫苗/药用组合物，包含上文描述的抗原、衍生自肿瘤相关抗原的肽表位、多表位串、核酸序列、载体系统和/或细胞。为了给予上文描述的抗原或衍生物，可将疫苗制备为液体溶液或混悬液注射剂；还可制备适合在注射前配制在液体中成为溶液或混悬液的固体形式。还可将制剂乳化，或者将蛋白质封装在脂质体中。通常使活性免疫原成分与药学上可接受并且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，疫苗可包含少量辅助物质如湿润剂或乳化剂、pH緩冲剂和/或提高疫苗功效的佐剂。可能有效的佐剂实例包括但不限于氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-原-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(CGP11637,称为原-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A,称为MTP-PE)和RIBI,将提取自细菌的三种成分单磷酰脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)包含在2%角鲨烯/Tween80乳液中。佐剂及其它试剂的其它实例包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、硅土、高岭土、碳、油包水乳液、水包油乳液、胞壁酰二肽、细菌内毒素、月旨质X、短小棒状杆菌(Co^ywek)fcten'wmparvwm)(痤百曰咳杆菌(Borafefe//"pem^!'s)、多核糖核苷酸、藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂素、脂质体、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物及其它合成佐剂。此类佐剂可购自多种来源，如MerckAdjuvant65(MerckandCompany,Inc.,Rahway,NJ.)或弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories,Detroit,Michigan)。通常，使用佐剂如Amphigen(水包油)、Alhydrogel(氢氧化铝)或Amphigen和Alhydrogel的混合物。只有氢氧化铝被批准用于人。免疫原与佐剂的比率可在很大范围内变化，只要两者都以有效量存在。例如，氬氧化铝在疫苗混合物中的量可占约0.5%(以八1203为基础)。方便地，将疫苗配制为包含终浓度为0.2-200(ig/ml范围、优选5-50pg/ml、最优选15pg/ml的免疫原。配制后，可将疫苗装入无菌容器内，然后将该容器密封，低温(如fC)贮存，或者可将其冷冻干燥。冷冻干燥允许以稳定的形式长期贮存。可通过方便的方法给予疫苗，例如通过口服、静脉内(水溶性)、肌内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(如用緩慢释放的分子)。常规通过胃肠外如皮下或肌内注射给予疫苗。适合其它给药方式的其它制剂包括栓剂，在一些情况下包括口服制剂。对于栓剂，常规粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；此类栓剂可用包含0.5%-10%、优选1%-2%范围活性成分的混合物形成。口服制剂包括通常使用的此类赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳SH镁等。这些组合物采用溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶嚢剂、持续释放制剂或散剂的形式，包含10%-95%、优选25%-70%活性成分。当疫苗组合物为冻干剂时，可在给药前将冻干材料重新配制(如成为混悬液)。优选在緩冲液中完成重新配制。口服给予患者的胶嚢剂、片剂和丸剂可配备肠溶衣，所述肠溶衣包含例如Eudragit"S"、Eudragit"L"、乙酸纤维素、邻苯二曱酸乙酸纤维素或羟丙基曱基纤维素。可将肽和多肽配制成中性或盐形式的疫苗。药学上可接受的盐包括酸加成盐(用肽的游离氨基形成)，用无机酸(如盐酸或磷酸)或者有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸和马来酸)形成。用游离羧基形成的盐还可以用无机碱(如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物)和有机碱(如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组胺和普鲁卡因)形成。5T4肽可与共刺激分子一起给药，所述共刺激分子如涉及表达于抗原提呈细胞和T细胞表面的受体-配体对之间相互作用的分子。通过给予蛋白质分子或编码蛋白质分子的相应核酸可给予此类共刺激分子。合适的共刺激分子包括CD40、B7-1、B7-2、CD54、ICAM家族成员(如ICAM-1、-2或-3)、CD58、SLAM配体、结合热稳定抗原的多肽、结合TNF受体家族成员(如4-lBBL、TRAF-l、TRAF-2、TRAF-3、OX40L、TRAF-5、CD70)的多肽和CD154。所述肽还可与刺激性趋化因子或细胞因子(包括例如IL-2、IL-3、IL4、SCF、IL-6、IL7、IL-12、IL15、IL16、IL18、G-CSF、GM画CSF、IL誦a、IL-ll、MIP-ll、LIF、c-kit配体、血小板生成素和flt3配体、TNF-a和干扰素如IFN-a或IFN-力联合给药。还可将趋化因子与抗原或肽如CCL3或CCL5联合使用，或者可与本发明的肽(如CXCL10和CCL7)稠合。当抗原或肽通过给予编码该肽的核酸给药时，共刺激分子也可以通过给予编码该共刺激分子的相应核酸给药。例如，用抗-CTLA-4、抗-CD25、抗-CD4处理时，已经显示融合蛋白IL13Ra2-Fc及其组合(如抗-CTLA-4和抗-CD25)可上调抗肺瘤免32疫反应，适合与本发明的肽联合使用。调节性T细胞(Treg)抑制剂ONTAK(IL-2白喉毒素缀合物DAB389lL2)已经显示可增强疫苗介导的抗肺瘤作用，因此Treg的抑制剂也适合与本发明的疫苗使用。#源遂接#才黄可用常规功效测试确定本发明的疫苗/药用组合物的给药方案。然而，特别优选包括连续致敏和增效步骤的方案。发现此类方案可以很好地避免免疫耐受和诱导T细胞反应(参阅Schneider等，1998NatMed4:397-402)以及诱导B细胞和抗体反应。致敏-增效方案可为同源性(其中以后续剂量给予同一组合物)或异源性(其中致敏和增效的组合物不同)。例如，致敏组合物可以是编码肿瘤相关抗原的非病毒载体(如质粒)，增效组合物可以是编码肿瘤相关抗原的病毒载体(如痘病毒载体)，其中一种或两种所述"肿瘤相关抗原"是本发明的表位或多表位串。资餘治#才法本发明还提供本发明的组合在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。还提供治疗和/或预防受试者疾病的方法，包括给予有效量的本发明组合。用于本文时，术语"治疗(treatment)"、"治疗(treating)"和"疗法(therapy)"包括治愈作用、改善症状作用、緩解作用、预防进展、预防作用和改善患者存活率的任何作用。当疫苗是或包含I类肽表位时，引发的免疫反应可涉及5T4特异性细胞毒性T淋巴细胞的活化。当疫苗是或包含II类表位时，引发的免疫反应可涉及THl和/或TH2细胞的活化。有利的是，所述反应是抗肿瘤免疫治疗反应，有效抑制、阻止或逆转受试者肿瘤的发展。化疗剂用于本发明组合的"化疗剂"是适合抗癌或抗肺瘤疗法的药物。合适的化疗剂包括用于化疗的标准化合物、嵌入剂，例如含铂化合物。合适的药物包括但不限于全反式维曱酸、辅酶Bu、阿扎胞香、硫唑噤呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、伊立替康、来那度胺(Lenalidomide)、亚叶酸、双氯乙基甲胺、美法兰、巯嘌呤、曱氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、来那度胺(Revlimid)、替莫唑胺、硫鸟噪呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。在一个实施方案中，用于本发明药物组合的化疗剂本身可以是不同化疗剂的组合。合适的组合包括FOLFOX和IFL。FOLFOX是包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸和奥沙利铂的组合。IFL治疗包括伊立替康、5-FU和亚叶酸。在一个实施方案中，化疗剂是环磷酰胺。在该实施方案中，优选给予低剂量形式的环磷酰胺。已经显示低剂量环磷酰胺可增强继承性细胞转移免疫疗法的抗肿瘤反应(参阅Dudley等，J.Clin.Oncol.(2005)23,2346-2357)。在另一个实施方案中，组合物还可包含激酶抑制剂，用于单独、同时单独或者联合治疗肿瘤。合适的激酶抑制剂包括已经显示具有抗肿瘤活性的激酶抑制剂(如吉非替尼(Iressa)和埃罗替尼(Tarceva)),可与肽联合使用。已经显示有效治疗肾细胞癌的受体酪氨酸激酶抑制剂如苹果酸舒尼替尼和索拉非尼也适合用于本组合物。射遂甜法本发明还涉及肺瘤抗原靶分子如抗肺瘤抗原抗体如抗5T4scFvs的用途。肺瘤抗原靶分子还包括T细胞受体(TCR)，包括描述于WO2004/033695和WO99/60119的合成TCR。这些抗体可用于(i)对准原位天然或外源性5T4和/或(ii)将免疫增强剂分子如B7.1递送至原位天然或外源性5T4(Carroll等(1998)JNatlCancerInst90(24):1881-7)。这赋予受试者5T4的免疫原性。本发明还可用于继承性转移分离自患者的肿瘤浸润淋巴细胞(Dudley等J.Clin.Oncol.(2005)23:2346-2357)。可用本发明治疗和/或预防的疾病包括其中抗原特异性免疫反应可促成预防和/或治疗的疾病。在优选实施方案中，所述疾病(可用本发明组合预防/治疗)是癌症。具体来讲，所述疾病可以是例如乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、结肠直肠癌、肾癌或前列腺癌以及黑素瘤。优选可显示对组合中存在的肿瘤相关抗原呈阳性反应的疾病。例如，WO89/07947描述用抗-5T4单克隆抗体对新生物组织的免疫组化筛查。因此，当肺瘤相关抗原是5T4时，所述疾病优选用诊断性测试(如用抗-5T4抗体)显示5T4阳性的癌症，例如法特壶腹、乳腺、结肠、子宫内膜、胰腺或胃的浸润性癌；膀胱、宫颈、肺或食道的鳞癌；结肠的管形绒毛状腺癌；子宫内膜的恶性混合Mullerian肿瘤；肾的透明细胞癌；肺癌(大细胞未分化的、巨细胞癌、支气管肺泡癌、转移性平滑肌肉瘤)；卵巢癌(Brenner瘤、嚢腺癌、实体畸胎瘤)；睾丸癌(精原细胞瘤、成熟的嚢性畸胎瘤)；软组织纤维肉瘤；畸胎瘤(间变性生殖细胞瘤)；或者滋养层癌(绒毛膜癌(如子宫、肺或脑)、胎盘部位肿瘤、葡萄胎)。剂量和给药在本发明的一些实施方案中，在CD4+CD25+Treg细胞计凄史减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予本发明的抗原和疫苗。优选在CD4+CD25+Treg细胞计数减少剂或CD4+CD25+Treg细胞功能降低剂如一种或多种化疗剂或者Ontak已经导致Treg最大耗竭/功能降低的同时接种是最佳时机。在给予化疗后24小时，可通过分析从患者血液分离的外周血单核细胞(PBMC)确定耗竭的程度，直至下一次给予化疗或者最后一次给予化疗后至多6周。Treg细胞是CD4+T细胞的特殊亚群，表达CD25的水平高于CD4阴性细胞；由此通过测定CD4+CD25+占所有CD4+T细胞的百分数分析Treg水平。所以CD4+CD25+hi的水平。因此将在给予Treg减少剂之前和之后测定CD4+CD25+hi(Treg)T细胞相对于总CD4+T细胞水平的水平。在环磷酰胺的情况下，给予CY后4天出现CD4+CD25+Treg的最大耗竭(Lutsiak等，2005Blood105:2862-2868)。可通过分泌细胞因子、对一些细胞表面标记物染色和抑制免疫反应的能力，确定其它T调节细胞类型如产生TGF-p的TH3细胞、产生IL-10的Trl细胞和CD8+CD28-T细胞的水平(Marshall等，2004.Blood.103:1755-1762;Wei等，2005.CancerRes65:5020-6;Leong等，2006Immunol.Lett.15:229-236;综述参阅Levings和Roncarlo，2005.CTMI292:303-326;Huehn,Siegmund和Hamann,2005.CITR293:89-114;Faria和Weiner,2005Immunol.Rev.206:232-259;Weiner,2001Immunol.Rev.182:207-214;Weiner等，2001.Microbesinfect.3:947-954;Roncarlo等，2001Immunol.Rev.182:68-79)。7>egi眾/逸^錄的确;t通过测量CD4+CD25+Treg细胞在多种体外测定(包括增殖和ELISPOT测定)中抑制活性的丧失确定这些细胞功能的降低。测定可用CD4+CD25+Treg细胞未耗竭或耗竭的PBMC进行。CD4+CD25+Treg细胞可用PBMC纯化，例如用；兹珠或流式细胞仪通过CD4+和CD25+分离技术纯化。在功能性CD4+CD25+Treg细胞的存在下，可能由于Treg导致的抑制而检测不到免疫反应。在功能性CD4+CD25+Treg细胞缺乏的情况下，可4企测免疫反应。将纯化的CD4+CD25+Treg细胞加回耗竭的PBMC中，将导致这些免疫反应的抑制。在细胞功能降低的情况下，甚至当测试中存在所述细胞时，也可检测到免疫反应。通过在给予CD4+CD25+Treg细胞功能降低剂之前和之后在PBMC上进行此类测定，确定Treg功能的丧失。财厕技术人员清楚本发明的组合物、方法和用途不需过多试验即可适合用于本发明的具体化疗剂和抗原。具体来讲，用于本发明的一种或多种化疗剂可能需要具体的给药和剂量时间表。对于不同的化疗剂这些给药和剂量时间表可能不同。通常，可将一种或多种化疗剂以短频率的间隔(例如每1或2小时)给药，接着较长时间(例如间隔2周)不给药。这种给药和不给药的顺序构成化疗周期。化疗治疗可根据所用药物由多个周期组成。各化疗周期之间的时间构成休息期。不同化疗剂和治疗之间的休息期不同。此类化疗剂和推荐休息期的实例在下表给出。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>应理解治疗由多个周期组成，限定的刹K息期也可因不同的患者而改变。而且，对于化疗剂的不同组合和混合物，此类治疗可不同。技术人员将选择适合每个患者和化疗剂或化疗剂组合的周期和^f木息期数。本发明抗原和一种或多种化疗剂的给药方案适合于所用具体药物和药物组合。应理解运用本发明组合物、方法和用途的完整治疗可涵盖多种单独的化疗周期。还应理解治疗方式可根据需要重复任何次数。具体来讲，本发明的组合物、方法和用途包括在给予化疗剂、与所选化疗剂/疫苗組合一致的化疗周期或者几个周期的完整化疗之前和/或在此期间和/或之后给予疫苗。还应理解本发明组合物、方法和用途在治疗方案内使用，所述治疗方案还包括其它治疗如手术和/或放疗。优选在化疗周期内或之后的休息期给予抗原。通过测定每次化疗期间Treg水平或Treg功能的降低优化给药时间。本领域技术人员不需过多试验就很容易确定给予受试者的一种本发明组合物的合适剂量。通常，医生将决定最适合具体患者的实际剂量，该剂量将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性、作用时长、年龄、体重、一般状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物组合、具体疾病的严重度和个体正在接受的治疗。本文公开的剂量是一般情况下的举例。当然有需要更高或更低剂量范围的个别情况，这也在本发明范围之内。例如，给予化疗方案FOLFOX和IFL的合适剂量在本文实施例部分列出。此外，与肺瘤抗原给药联合给予的这些方案的合适方案在本文列出。下列实施例进一步描述本发明(只用于举例说明)，其中参考下列各图。图1显示实施例部分描述的疫苗和监测方案的概略图。图2:TV2-FOLFOX:整个临床试验时程的肿瘤大小。该图显示在3个CT扫描时间点对可评价患者而言把肿瘤损害的总数(在TroVax接种(筛选)之前和第14和X+8周)。图3TV2-IFL:整个临床试验时程的肿瘤大小。该图显示在3个时间点TroVax接种(筛选)和第X和X+14周靶肿瘤损害的总数。图4a显示TV2-IFL中的5T4反应，图4b显示TV2-FOLFOX中的5T4反应，图4c显示TV2-IFL中的MVA反应，图4d显示TV2-FOLFOX中的MVA反应，图4e显示TV2-IFL中的TT反应，图4f显示TV2-FOLFOX中的TT反应。图5在TV2试验期间不同时间点患者TV2-016的CD4+CD25+Treg(右手象限)的百分数。将结果显示为CD4+T细胞的百分数。图6通过细胞内FoxP3表达的染色确认CD4+CD25+Treg表型。对CD4+T细胞门控(A),确定其CD25表达(B)。通过设定绝对象限(B;右上象限)选择CD25+hi表达体。对该右手象限内的细胞门控，大部分表达FoxP3(C;右上象限)。图7.TV2-IFL(黑色『7)和-FOLFOX(灰色『6)患者CD4+T细胞群中CD4+CD25+Treg的平均百分数。实施例概迷这些实施例概述在TV2IFL和FOLFOX试验中检测的免疫反应的动力学，研究临床与免疫反应之间的关系。i瘦X^和动力夢在TV2IFL(11=12)和FOLFOX(n=ll)临床试验中所有可评估的患者都发生5T4特异性细胞和/或体液免疫反应，如下详述试验(可评估的患者数)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在两个试验中，6次接种每次接种后平均抗体滴度都增力口(与前一采样时间点相比)。在FOLFOX试验中，化疗期间(第4-19周)的平均抗体滴度可与化疗后(第X+2-X+10周)相比。然而，在IFL试验中，化疗期间的平均抗体滴度明显低于化疗后，提示IFL化疗方案可影响抗体反应。在两个试验中，最大的平均抗体滴度发生在第X+8周即第6次免疫接种之后。平均5T4增殖反应显示6次免疫接种中任何一次接种后都增加很少或不增加，但个别患者显示增加。在两个试验中，与化疗期间相比，在化疗完成后增殖反应最大。在两个试验中，5T4特异性增殖反应在第19与X+2周之间明显增加；MVA或TT反应则没有这种情况，提示两种化疗方案影响对自身抗原增殖反应的检测，但对离体外来抗原不影响。通常，进入TV2试验的患者发生的5T4特异性细胞和体液免疫反应在强度和持续时间上都大于早期试验(TV1)，其中募集到TroVax单一疗法组的患者，在给予TroVax之前某一时间已经用化疗治疗。根据每个患者报告的肺瘤反应，通过对其免疫反应的强度分级，调查5T4特异性免疫反应与临床反应相关性的可能趋向。TV2-FOLFOX:所得数据表明与稳定或进展性疾病相比，高5T4特异性抗体滴度和ELISPOT(但非增殖)反应与完全和部分反应的相关更常见。当在整个监测时程、化疗期间和之后分析反应时，这种观察结果是一致的。如果将ELISA和ELISPOT的数据整合，结合临床反应将组合反应的强度列表，评分越高的部分越频繁出现阳性肿瘤反应(CR+PR)。在第14周或X+8周分类为SD或PD的患者具有最低的组合评分。将ELISA和ELISPOT数据合并得到的趋势比个别分析每次测定更强。TV2-IFL:在IFL试验中强烈的免疫反应主要出现在化疗完成后。通过监测存活率并在免疫反应之间进行比较评估临床效益，一旦数据有效即可研究总存活率。数据分析免疫反应动力学的分析a.在每个试验内，只分析可评价的(每次实验设计)患者的数据。b.将所有数据都以类似方式表示。将每个可评价患者在每个分析时间点的抗原特异性反应列表。此外，以总体为基础将每个试验在下列时间点的平均抗原特异性免疫反应列表1.每个时间点2.接种前(第-2和0周)3.化疗期间(第4-19周)4.化疗后(第X+2-X+14(IFL)或X+10(F0LF0X)周)应指出在化疗期间注射2次TroVax,化疗完成后注射2次。而且，15周化疗期包括6个采血时间点。化疗完成后，对IFL患者监测14周，也包括6个采血时间点。对F0LF0X患者在化疗完成后监测10周，这包含5个采血时间点。c.将每次接种后免疫反应的增加倍数(FOLDincrease)列表。此外，还注明第19周与X+2周(即化疗结束时和化疗完成后)之间的增加倍数。数据分析免疫反应与肿瘤反应之间的相关性分析已经确定所有可评价患者在3种核心免疫监测分析(EUSA、增殖和ELISPOT)中每一种分析的平均5T4特异性免疫反应。按照各自的肿瘤反应(一些CT扫描是明显的)，将反应按照上升的顺序分级和比较。在3个时间段确定平均5T4特异性免疫反应(i)在所有TroVax后时间点，即对FOLFOX患者而言为第2周-X+10周，对IFL患者而言为第2-X+14周，(ii)化疗期间(第4-19周)出现的所有TroVax后时间点和(iii)化疗完成后(对于FOLFOX而言为第X+2-X+10周或者对于IFL而言为第X+14周)出现的所有TroVax后时间点。而且，按照报告的临床反应，将5T4特异性ELISPOT、增殖和抗体反应整合和比專交。为了实现这一点，将每个可评价患者检测到的最大免疫反应强度进行简单评分。例如，将跨越所选监测期(即所有TroVax后时间点、化疗期间、化疗后)的平均5T4抗体滴度最高的患者评分为100%,将所有其他患者评分为最大反应的百分数。为了整合测定，将每个患者每次测定的分数进行筒单合计。此类分析视为患者免疫反应的强度，但对所有测定的"权重"相等。方法和试验计划Trovax+FOLFOX进行与5-氟尿嘧啶/亚叶酸/奥沙利铂(FOLFOX)联用的TroVax的开放标签研究的II期临床试验，确定在化疗之前、期间和之后的安全性和免疫原性。a)研究设计这是在晚期结肠直肠癌患者中进行的开放标签给药研究，与5-FU/奥沙利柏/亚叶酸标准方案联用注射至多6次TroVax。总计有15名患者加入，以获得10名可评价患者。剂量方案为化疗前注射2次、化疗期间(假定持续至多6个月)注射2次和化疗已经停止后注射2次。可对患者研究最多40周，以评估治疗方案的耐受性、5T4细胞表面抗原诱导的体液和细胞免疫以及载体诱导的免疫反应。b)治疗丁rovax在第0、2、11、17周以及末次化疗后2和6周单次肌内注射Trovax10x，使患者免疫。奥沙利铂/5-FU/亚叶酸患者在第4周开始化疗。以2周为间隔给予化疗12周(6个周期，第4、6、8、10、12、14周)。在第6个周期完成后一周评估反应(第14周；CT/MRI扫描)。如果研究者对患者感兴趣可给予更多化疗周期(至多6个周期，第16、18、20、22、24、26周)。c)并行治疗与奥沙利铂一起通过改良deGramont方案(MdG)给予5-FU/亚叶酸化疗，(OxMdG)。在LeedsTeachingHospitalsNHSTrust进行的标准方案如下1将250ml5。/o葡萄糖中的左亚叶酸(leukovorin)175mg(或350mg外消旋亚叶酸)输注2小时。2将250ml5%葡萄糖中的奥沙利铂85mg/m2输注2小时.。3将5-氟尿嘧口定400mg/m2推注5分钟。4用BaxterLV5泵将5-氟尿嘧咬2400mg/m2输注46小时。每个化疗周期前给予止吐药，包括静脉内注射5HT-3拮抗剂和地塞米松。如果需要，对患者进行口服止吐疗法，包括3天疗程减量的地塞米^^和多潘立酮。将所有需要的止吐疗法记录在CRF中。TroVax+IFLa)治疗计划和方法邀请符合入选标准的患者进入本研究。获得完全知情同意之后，对患者进行体格检查以证明全身情况适合开始试验。如果可能，则取组织测定5T4状态。在此时，用相关CT扫描证明转移和/或局部复发，监测血中CEA(5ml)表面抗原水平。采血进行血液学和临床化学(IOml)检测、垂体激素筛选(ACTH,TSH,LH，FSH;10ml)、自身抗体(10ml)和免疫测试(对5T4和载体的抗体，对5T4及其它抗原的细胞反应；100ml)。这种筛选在免疫接种时间表开始前2周内进行。在第0周和第2周，单次肌内注射TroVax使患者免疫。两次注射之前，都釆血测定CEA和免疫测试(IOOml)。患者在第4周开始化疗。虽然如果患者有反应，则化疗以2周的间隔进行至多12个月，但通常治疗持续时间为6个月。在第4和6周化疗之前采血测量CEA和免疫测试(IOOml)。每次化疗之前采血进行血液学(5ml)4企测。在第11和17周(即化疗间隔期)再注射TroVax。每次这些注射之前和2周后(第13和19周)采血测量CEA和免疫测试(100ml)。然后继续化疗，只要患者的医生认为合适。在化疗结束时，对疾病进行CT扫描再分期。化疗结束后2周(X+2周)，再单次肌内注射TroVax。在注射之前及其2周后(X+4周)，采血测量CEA和免疫测试(100ml)。最后一次注射在前一次注射后4周(X+6周)。在这次注射之前及其后2周(X+8周)和4周(X+10周)，采血测量CEA和免疫测试(100ml)。最后一次随访在4周后(X+14周)进行。b)并行治疗DeGramont方案用2小时为患者静脉输注亚叶酸(200mg/m2/天)，接着以400mg/mV天快速静脉内注射5-FU,然后以600mg/m2/天连续输注22小时，重复连续2天。在第1天给予伊立替康(180mg/m2;30分钟静脉输注)，同时给予亚叶酸。这种周期每2周重复1次。改良DeGramont:在第1天给予患者亚叶酸和大剂量5FU,接着用46小时输注5FU。在试验持续期间，包括在本试验中的患者不能接受任何其它抗癌治疗。如果需要此类治疗，则必须将该患者排除出本试验。用于緩解症状的药物由研究者经过慎重考虑开出处方，记录在病历(CRP)中。患者还应记录所用任何对抗药物，应将这些药物在CRF中注明。免疫监测用于免疫监测的测定可分为下文列出的测量细胞或体液反应的测定细胞反应的测量1.增殖测定本测定用新鲜血加工和在采血当天制备的PBMC进行。本增殖测定以免疫细胞(主要是CD4+T细胞)对特殊蛋白反应的能力为基础。其中T细胞与其靶蛋白相互作用后反应的一种方式是通过快速细胞分裂。通过对加入刺激剂之前和之后培养液中出现的细胞数进行计数，可测量对此类刺激物的反应。然而，这可能既费劲又困难，因为应答细胞可能只构成总细胞群的小部分。所以事实上，通过将3&胸香加入细胞DNA内(与下面细胞数的改变密切相关的过程)测量任何增强的细胞分裂。可将由测试蛋白诱导的增殖反应与培养液单独(无刺激对照)诱导的相比。将数据转换，得到刺激指数(S丄)，将其定义为"与测试抗原培养的PBMC的平均CPM除以与单独培养液培养的PBMC的平均CPM"。这种细胞活性的相对测量值被广泛用于纵向研究(如参加临床试验的患者)时各样品之间的比较，处理单独培养液时背景增殖的差异。用细胞收集器和TopCount,根据标准方法制备来自全血的血浆和PBMC以及测量临床样品的抗原特异性增殖反应。方法描述于如BraybrookeJP,SladeA,DeplanqueG，等PhaseIstudyofMetXia-P450genetherapyandoralcyclophosphamideforpatientswithadvancedbreastcancerormelanoma.ClinCancerRes11:1512-1520,2005和HarropR,45RyanMG，GoldingH,等Monitoringofhumanimmunologicalresponsestovacciniavirus.MethodsMolBiol269:243-266，2004。2.ELISPOT13年前，将酶联免疫斑点(ELISPOT)测定用于在单细胞水平检测特殊免疫细胞。ELISPOT测定用于多种用途，包括监测接受免疫治疗的癌症患者的细胞反应。IFNyELISPOT测定具有高水平敏感性，允许每百万PBMC检测<10个应答细胞。通过这种测定，可以检测通过分泌细胞因子IFNy对抗原刺激物产生功能性应答的记忆T细胞。而且，IFNyELISPOT测定不需要使用新鲜细胞或放射性物质，是比其它测定更简单和更可转移的技术，所述其它测定如已被常规用于测量T细胞反应的疫苗试验的铬释放测定。IFNyELISPOT的重要优点在于它可直接测量Thl细胞介导的免疫反应。这样，可用于监测疫苗诱导细胞介导的免疫性的功效。此外，可将新鲜收集或冰冻的PBMC用于IFNyELISPOT的评估。这对于在临床试验程序中多个时间点采集患者样品分析是显著的优点。使用冰冻PBMC使批量处理样品成为可能，从而减少测定的变异性。此外，冰冻测试样品的有效性意味着可重复测定。将PBMC放在包被孔内，与合适的抗原在37。C、5。/。C02培养过夜。共培养约6小时后，抗原特异性记忆细胞开始分泌IFNY，也就是说，转而被膜结合抗体捕获。因此，IFNY结合发生在紧邻细胞因子分泌细胞周围的环境中。约20小时后，将细胞洗掉。接着，本测定利用两种直接对抗同一细胞因子分子的不同表位的高亲和力细胞因子特异性抗体。由比色反应产生斑点，其中可溶性底物分开，在反应位置剩下不溶性沉淀物。所得斑点代表原始细胞因子产生细胞的足迹。斑点数直接量度细胞因子产生T细胞的频率，斑点数随着免疫反应的强度成比例增加。活化CD8+T纟田月包、CD4+辅助性T细胞和NK细胞分泌这种细胞因子。比较免疫周期之前、期间和之后抗原特异性T细胞的频率应当反映待评估疫苗的相对免疫原性。用自动化ELISPOT读板器通过ELISPOT用全血制备血浆和PBMC并测量临床试验样品对载体的细胞免疫反应，所用标准方案如描述于BraybrookeJP,SladeA，DeplanqueG等PhaseIstudyofMetXia-P450genetherapyandoralcyclophosphamideforpatientswithadvancedbreastcancerormelanoma.ClinCancerRes11:1512-1520,2005.HarropR,RyanMG,GoldingH,etal:Monitoringofhumanimmunologicalresponsestovacciniavirus.MethodsMolBiol269:243-266,2004。体液反应的测量(ELISA)酶联免疫吸附测定(ELISA)以抗体与其靶蛋白以高度特异的方式结合为&出。用ELISA分析抗原特异性抗体反应是广泛使用和成熟的技术。该测定可用于提供血清(或其它体液)中抗原特异性抗体的相对测量值。该技术多种适应症的其中之一是在接种后监测抗体水平，确定治疗是否增加感兴趣抗体的浓度。为了测量抗原特异性抗体反应，使靶蛋白结合至96孔ELISA板表面。封闭(使抗体直接与塑料的非特异性结合最小)后，将血浆加入板内，在室温下培养。然后洗涤各孔，再次使抗体的非特异性结合最小化。将对待测血清种类具有特异性(如抗人)的二抗加入各孔内。使二抗与酶(如过氧化物酶)缀合，与发色底物(如OPD)脬育，催化其转化为有色的可溶性产物，可用分光光度计将该产物定量。通常，颜色改变越大，待测血清中存在的抗体浓度越高。根据制造说明书，用连同Dynex洗板器一起的用于免疫测定的DynexMRX读板器，按照标准技术用全血制备血浆和PBMC和用ELISA测量抗原特异性抗体滴度。合适的方法描述于如BraybrookeJP,SladeA,DeplanqueG等PhaseIstudyofMetXia-P450genetherapyandoralcyclophosphamideforpatientswithadvancedbreastcancerormelanoma.ClinCancerRes11:1512-1520,2005.HarropR,RyanMG,GoldingH等Monitoringofhumanimmunologicalresponsestovacciniavims.MethodsMolBiol269:243-266,2004。测定对照为了用ELISA测量抗体反应，将取自5名健康志愿者的混合人血浆用作阴性对照。作为阳性对照，用取自加入前一临床试验的患者(分别为TV1或BC2临床试验的患者TV1-102(第10周)或患者BC2-102)的血浆。所有测定板都包括阴性和阳性对照血浆，每个板都应用"合格/不合格"接受标准。将使用的接受标准/统计方法测定接受标准和数据处理如下。将每种测定中由接种引起的阳性免疫反应分别详细定义如下ELISA将抗体滴度定义为血浆的最大稀释度，其中待测血浆的平均吸光度(O.D.)比相同稀释度的阴性对照(正常人血清;NHS)的平均O.D22倍。如果出现下列情况，则报告接种诱导阳性5T4特异性抗体反应a.抗体滴度与NHS相比^10且b.注射后抗体滴度与注射前两个时间点相比^2倍。增殖测定将增殖测定的结果报告为刺激指数(S.I.),将其定义为S.I.=与待测抗原培养的PBMC掺入的3&胸苷仅与培养液培养的PBMC掺入的31^-胸苷如果出现下列情况，则报告接种诱导阳性5T4增殖反应a.5T4抗原(蛋白质或肽)的刺激指数(S丄)22且b.含5T4抗原的复制的CV.<100%且c.免疫接种后5T4抗原诱导的S丄比任一注射前时间点抗原诱导的最高S丄^2倍。EUSPOT如果出现下列情况，则报告接种诱导阳性5T4ELISPOT反应a.对5T4抗原(蛋白质或肽)反应的平均斑点形成单位(SFU)/孔比只含培养液的孔的平均SFU/孔23倍且b.对5T4抗原反应的平均SFU/孔^10且c.免疫接种后5T4抗原特异性前体频率(抗原特异性细胞翁:/106个总PBMC)比任一注射前时间点的前体频率^2倍。结果1.TV2-FOLFOX1.1源临床和患者数据17名患者进入TV2-FOLFOX试验，其中11名具有用于评估免疫反应(表l)的价值。表l:临床数据。表中包括全部H名ITT(待治疗)患者。可评价患者(11=11)用阴影标明(迄今为止的存活数据)。注解WD-患者退出所以无有效结果；NAA^已测量但现无效。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>图2显示TV2-FOLFOX:整个临床试验时程的肿瘤大小。该图显示在3个CT扫描时间点(在TroVax接种(筛选)之前和第14和X+8周)对可评价患者而言靶胂瘤损害的总数。在第14周，11名可评价患者全部显示肿瘤负荷的减少。在第X+8周只有4名患者进行CT扫描，与第14周相比全都显示肿瘤负荷进一步下降。1.2免疫反应1.2.1抗体反应表2显示在整个监测时程中每个可评价患者的5T4特异性抗体滴度。表2:5T4特异性抗体反应。将结果以每个采样时间点的5T4特异性抗体滴度(待测样品的平均O.D.(490nm)^2倍阴性对照样品(正常人血清；NHS)的最大血清稀释度)表示。表中H0的粗体结果代表阳性抗体反应。报告所有患者在每个时间点以及接种前、化疗期间和化疗后多个时间点的平均滴度。此外，显示每次接种后平均滴度比前一时间点增加的倍数。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>在整个TroVax后免疫监测时程中，平均5T4特异性抗体滴度是100。大部分患者在第4周(即2次TroVax接种后)血清转化。在FOLFOX试验中，平均抗体滴度在化疗期间高(平均滴度为103)，化疗完成后(第19-X+2周之间)下降，化疗完成后适当增加(平均滴度为115)。可见每个患者在6次接种后平均抗体滴度都增加。1.2.2增殖反应表3a-b是在整个监测时程中每个可评价患者的详细抗原特异性增殖反应。已经分析对5T4(3a)和MVA(3b)的反应。5T4代表关4建抗原，预期可诱导有效和长期的免疫反应。作为用于递送5T4的载体，MVA代表非常有用的"内部对照"，可将其作为反应的"基准"。预期患51者可产生抗MVA(复合和外来病原体)的强烈免疫反应，可将此类反应的强度和动力学与抗5T4诱导的比较。表3a-b:概括用5T4(a)和MVA(b)体外再刺激后患者PBMC的增殖反应。将结果以刺激指数(单独由培养液诱导的增殖+由待测抗原诱导的增殖)表示。刺激指数22(粗体表示)视为该时间点具有阳性反应。将阳性(S丄22)且比注射前(第-2或0周)反应至少大2倍的增殖反应用粗体表示。表3a:TV2-FOLFOX:对5T4的增殖反应<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>对5T4和MVA的平均增殖反应显示反应强度和持续时间的差异。将依次说明每种抗原A.5T4对于全部可评价FOLFOX患者，TroVax接种后的平均5T4特异性增殖反应比注射前提高(6.8:3.6)。此类反应在化疗完成后比化疗期间更强(分别为10.5:4.3)。这种差异在第9周与X+2周之间、即大部分患者仍然接受化疗的最后时间点与化疗完成后的第一个时间点之间最明显。这种观察结果非常出乎意料，因为患者在此期间没有接受接种(最后一次接种在第17周)。FOLFOX患者显示第9周至X+2周之间平均增殖反应增加2.5倍，这是在相邻时间点观察到的最大增加倍数，比6次接种的任何一次接种后都大。在FOLFOX试验中，第1、5和6次接种后而不是在化疗期间进行的接种检测到的平均5T4增殖反应增加非常小。B.MVA意料之中，对MVA的平均增殖反应的强度大于相应的5T4反应。TroVax接种后的平均MVA特异性增殖反应是35，与注射前相比SI为2.9。MVA特异性增殖反应在化疗完成后比化疗期间大(分别为57.8:18.2)，其增加与5T4的相似。然而，与5T4不同，第9与X+2周检测的增殖反应差异很小。1.3免疫和临床反应的比较1.3.1包括全部测定的免疫反应概述表4:在全部可评价患者中检测的免疫反应概述<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>1.3.2抗体反应与临床反应比较的分析按照报告的临床反应，比较所有可评价患者的平均5T4抗体滴度。测定3个时间段的平均5T4抗体滴度(i)所有TroVax后时间点即第2周-X+10周(或最后一个有效数据点)、(ii)化疗期间出现的所有TroVax后时间点(第4-19周)和(iii)化疗完成后出现的所有TroVax后时间点(第X+2-X+10周)。表5a-5c:各表显示在整个监测期间(第2-X+10周；表Sa)、化疗期间(第4-19周；表5b)和化疗完成后(第X-X+10周；表5c)的平均5T4抗体滴度。按照患者在第14和X+8周的临床反应将平均滴度从最低至最高分级。表5a:整个时程<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>表5b:化疗期间<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>化疗后平均TroVax后5T4滴度v肿瘤反应<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>可看到CR(许多为PR)的患者落在表的下半部分，即具有高于SD或PD患者的更高平均5T4抗体滴度。在表14c中，按照第X+8周的肿瘤反应报告化疗后的5T4滴度。许多X+8周CT扫描都很明显，但可看到CR和PR患者集中在表的底部(即具有高的化疗后抗体滴度)。不符合这种方式的重要患者是患者101,其不产生对5T4的抗体反应或增殖反应，但在化疗后显示对5T4蛋白强烈的ELISPOT反应和对I类肽的中度反应。1.3.3增殖反应与临床反应的比较分析按照报告的临床反应(一些CT扫描很明显)，比较所有可评价患者的平均5T4增殖反应(SI)。测定3个时间段(整个监测时程、化疗期间和化疗完成后)的平均增殖反应，列在表6a-c中。表6a-6c:各表说明3个不同时间段的平均5T4增殖反应表6a为整个监测期(第2-X+10周)、表6b为化疗期间(第4-19周)和表6c为化疗完成后(第X-X+10周)。按照患者在第14和X+8周的临床反应将平均增殖反应从最低至最高分级。表6a:整个时程表6b:化疗期间<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表6c:化疗后化疗后TroVax后的平均5T4SIv肿痼反应<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>这组患者在化疗期间的增殖反应低于化疗后(平均SI为4.3:10.4)。而且，最大平均增殖反应发生在第X+10周。虽然这时的有效增殖反应不影响第X+8周检测的肺瘤反应，但对患者存活率可具有积极作用。当数据有效时将进行此类计算。1.3.4ELISPOT与临床反应的比较分析按照报告的临床反应，比较所有可评价患者的平均5T4ELISPOT反应(抗原特异性细胞/106PBMC)。在整个监测时程中在选择的时间点测定平均ELISPOT反应，列在表7a-c中。表7a-7c:各表说明在整个时程(7a)、化疗期间(7b)或化疗完成后(7c)的平均5T4特异性ELISPOT反应(所有5T4蛋白和肽抗原)。按照患者在第14和X+8周的临床反应将平均ELISPOT反应从最低至最高分级。表7a:所有5T4抗原，整个时程表7b:所有ST々抗原,化疗期间<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>观察一组具有高平均ELISPOT反应的阳性临床反应。具体来讲，在所有时间点和化疗后期间对所有5T4抗原反应的强度与报告的肿瘤反应密切相关。1.3.5免疫与临床反应比较的整合分析将5T4特异性ELISPOT、增殖和抗体反应整合，按照冲艮告的临床反应比较。为了实现这一点，按照检测的最大免疫反应强度对每个可评fh患者简单评分。例如，将所选监测期(即所有TroVax后时间点、化疗期间、化疗后)平均5T4抗体滴度最高的患者评分为100%,将所有其他患者评分为最大反应的百分数。为了整合测定，将每个患者每种测定的分数简单相加。此类分析考虑患者"免疫反应"的强度，对所有测定给予相等"权重，，。表8a和b详述与报告的临床反应比较的整合免疫反应(表8a为抗体+ELISPOT和表8b为抗体+ELISPOT+增殖)等级。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表8a:在整个免疫监测时程中ELISPOT和抗体测定的整合分析v临床反应表8b:在整个免疫监测时程中ELISPOT、抗体和增殖测定的整合分析v临床反应1.3.6免疫和临床反应的比较预结论预分析提示一些高强度5T4特异性免疫反应组具有阳性临床反应。下文分别讨论此类趋势A.ELISA高5T4特异性抗体滴度与完全和部分反应的相关性比与稳定或进展性疾病更密切。当在整个监测时程、化疗期间和化疗后分析反应时这种观察结果是一致的。当分析化疗后抗体反应时，第X+8周CT扫描时间点CR和PR的滴度高。这些趋势例外的情况是患者101,不出现血清转化，而且出现强烈的ELISPOT反应。B.增殖5T4特异性增殖反应的强度似乎与阳性肿瘤反应(CR和PR)不相組合si+滴度关。然而，增殖反应在化疗完成后更大，最大的整体反应发生在第X+10周，即太迟而对肿瘤反应无影响。这些反应确实可反映存活率。C.ELISPOT5T4特异性ELISPOT反应的强度似乎与阳性胂瘤反应相关。当整个时程、化疗期间和化疗完成后分析ELISPOT数据时，这种趋势很明显。D.整合分析ELISA+ELISPOT如果整合ELISA和ELISPOT的数据，按照临床反应将组合反应强度列表，分数越高则与阳性肿瘤反应的相关性更密切。在第14周或X+8周分类为SD或PD的患者具有最低的组合分数。E.整合分析ELISA+ELISPOT+增殖如果整合ELISA、ELISPOT和增殖的数据，按照临床反应将组合反应强度列表，同样分数越高则与阳性肿瘤反应的相关性更密切。2.TV2IFL2.1源临床和患者数据19名患者参加TV2-FOLFOX试验，其中12名成为评估免疫反应的可评价患者(表9)。表9:临床数据。表中包括全部19名ITT患者。可评价的患者用阴影表示(迄今为止的存活数据)。注解，=患者退出因此无有效数据；N/A=无数据患者ID活/死肿瘤反应靶损害总数存活(从第0周开始的周数)x周X+14周筛选x周X+14周001死N/AWD45WDWD42002活CRCR5900101003死PRPD11992N/A66004死WDWD135WDWD9005死PRPD172177477<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>图3显示TV2-IFL:整个临床试验时程的肺瘤大小。该图显示在3个时间点即TroVax接种(筛选)之前和第X和X+14周靶肿瘤损害的总数。在12名可评价患者的11个有效CT扫描数据中，在第X周时间点靶损害总数全部降低。至第X+14周，5名患者(7个有效扫描数据)具有靶肿瘤负荷，保持低于筛选时的水平。2.2免疫反应2.2.1抗体反应表10详细描述在TV2-IFL试验整个监测时程中每个可评价患者的5T4特异性抗体滴度。表10:5T4特异性抗体反应。将结果以每个采样时间点的5T4特异性抗体滴度(待测样品的平均O.D.(490nm)^2倍阴性对照样品(正常人血清；[NHS])的最大血清稀释度)表示。表中210的粗体结果代表阳性抗体反应。报告所有患者在每个时间点以及接种前、化疗期间和化疗后多个时间点的平均滴度。此外，显示每次接种后平均抗体滴度比前一时间点增加的倍数。在初次接种后的时间点(周)的5T4特异性抗体滴度—4:.:—:"-;.-<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>在TroVax后整个免疫监测时程中，观察平均5T4特异性抗体滴度。大部分患者在第4周(即2次TroVax接种后)血清转化。在IFL试验中，平均抗体滴度在化疗期间很低(平均滴度为7.4)，化疗完成后(第19-X+2周)下降，化疗完成后急剧增力o(平均滴度为i58.3)。可见6次接种后每次平均抗体滴度都增加。2.2.2增殖反应表lla-b详细描述整个监测时程中每个可评价患者的抗原特异性增殖反应。已经分析对5T4(1la)和MVA(1lb)的反应。表lla和b:概括用5T4(a)和MVA(b)体外再刺激后患者PBMC的增殖反应。将结果以刺激指数(单独由培养液诱导的增殖+由待测抗原诱导的增殖)表示。刺激指数22(粗体表示)视为该时间点具有阳性反应。将阳性(S丄S2)且比注射前(第-2或0周)反应至少大2倍的增殖反应用红体表示。表lla:TV2-BFL:对5T4的增殖反应<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>对5T4和MVA的平均增殖反应显示反应强度和持续时间的差异。将依次说明每种抗原A.5T4总体而言，与注射前相比，TroVax接种后对5T4的平均增殖反应无增加(平均SI均为4.9)。因此，在群体水平和所有时间点上，TroVax接种后IFL患者对5T4的平均增殖反应不增加。但是，个别患者在特殊时间点提高。化疗完成后反应提高(S.L为化疗后5.8:化疗期间3.8),这种差异在第9-X+2周、即大部分患者仍然接受化疗的最后时间点与化疗完成后的第一个时间点之间最明显。这种观察结果出乎意料，因为患者在此期间没有接受接种，其最后一次接种在第17周。IFL患者显示在第9-X+2周平均增殖反应增加6倍(SI分别为1.6:9.2),这是观察到的最大增加倍数，比6次接种的任何一次接种后都大。B.MVA对MVA的平均增殖反应在TroVax接种后比注射前大6倍(平均S.L分别为13.2:2.2)。MVA特异性增殖反应在化疗完成后比化疗期间大，其增加与5T4的相似。然而，与5T4不同，第9-X+2周检测的增殖反应无差异(平均S.I.分别为10.5:10.1)。2.3免疫和临床反应的比较2.3.1包括全部测定的免疫反应概述表12:在全部可评价患者中检测的免疫反应概迷<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>2.3.2抗体反应与临床反应比较的分析按照报告的临床反应(一些CT扫描很明显)，比较所有可评价患者的平均5T4抗体滴度。测定3个时间段的平均5T4抗体滴度①所有TroVax后即第2周-X+10周(或最后一个有效数据点)时间点、(ii)化疗期间(第4-19周)出现的所有TroVax后时间点和(iii)化疗完成后(第X+2-X+14周)出现的所有TroVax后时间点。表13a-13c按照患者报告的各种临床反应将平均抗体滴度分级。表13a-13c:各表显示在整个监测期间(第2-X+14周；表13a)、化疗期间(第4-19周；表13b)和化疗完成后(第X-X+14周；表13c)的平均5T4抗体滴度。按照患者在第X和X+14周的临床反应将平均滴度从最低至最高分级。表13a:整个时程<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表13c:化疗后<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>与化疗后相比，这组患者在化疗期间的抗体反应非常低(平均滴度为158:7)。而且，最大平均抗体滴度发生在第X+8周。虽然在这个时间点的有效抗体反应可能不影响第X+14周检测的肿瘤反应，但可能对患者存活率具有积极作用。2.3.3增殖反应与临床反应的比较分析按照报告的临床反应(一些CT扫描很明显)，比较所有可评价患者的平均5T4增殖反应(SI)。测定3个时间段(整个监测时程、化疗期间和化疗完成后)的平均增殖反应，列在表14a-c中。表14a-14c:各表说明3个不同时间段的平均5T4增殖反应表14a为整个监测期(第2-X+14周)、表14b为化疗期间(第4-19周)和表14c为化疗完成后(第X-X+14周)。按照患者在第X和X+14周的临床反应将平均增殖反应从最低至最高分级。<image>imageseeoriginaldocumentpage73</image>2.3.4ELISPOT反应与临床反应的比较分析按照报告的临床反应(一些CT扫描很明显)比较所有可评价患者的平均5T4ELISPOT反应(抗原特异性细胞/106PBMC)。在整个监测时程中在选择的时间点测定平均ELISPOT反应，列在表15a-c中。表15a-15c:各表说明在整个时程(15a)、化疗期间(15b)或化疗完成后(15c)的平均5T4ELISPOT反应。按照患者在第X和X+14周的临床反应将平均ELISPOT反应从最低至最高分级。表15a:所有5T4抗原，整个时程平均TroVax后5T4^总ELISPOTv肿瘤反应？.ELJSPPT,X周..XH4周g表15b:所有5T4抗原，化疗期间—'化疗期间平均TroVax后"""5T4ELISPOTv肺瘤反应患者ELISPOTX周..X+14周;47.5CRS.7PR91.6PR33.5SD371.8SO99.2PR0sp7.2PR33.5PR5.7PR165.6SD4.1PDPDP。PDPDPDPDPDPDPDPD^，.3,麵18'9""3.25264,4DDDDppppDDDDDRDpppppcppsppspppspcs64377:3*4"忠AA11279表15c:所有5T4抗原，化疗后<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>分析5T4ELISPOT反应显示高5T4反应与有益临床反应的相关性比用增殖作为变量计算的相关性更好。2.3.5免疫与临床反应比较的整合分析将5T4特异性EUSPOT、增殖和抗体反应整合，按照报告的临床反应比较。为了实现这一点，按照检测的最大免疫反应强度对每个可评^T患者简单评分。例如，将所选监测期(即所有TroVax后时间点、化疗期间、化疗后)平均5T4抗体滴度最高的患者评分为100%，将所有其他患者评分为最大反应的百分数。为了整合测定，将每个患者每种测定的分数简单相加。此类分析考虑患者免疫反应的强度，对所有测定给予相等"权重"。表16a和b详述整合免疫反应(表16a为抗体+ELISPOT和表16b为抗体+ELISPOT+增殖)等级vs报告的临床反应。表16a:在整个免疫监测时程中ELISPOT和抗体测定的整合分析v临床反应<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表16b:在整个免疫监测时程中ELISPOT、抗体和增殖测定的整合分片斤v临床反应IFL试验中的强免疫反应主要发生在化疗完成后。因此免疫反应不可能在X周CT扫描且甚至可能在X+14周对肿瘤产生有益影响。3.发生在FOLFOX和IFL试验的免疫反应的比较3.1抗体反应在整个免疫监测时程中，两种试验的平均5T4特异性抗体滴度(迄今为止)相似，TV2-IFL为76,TV2画FOLFOX为IOO(表17)。然而，每种试验的抗体反应动力学不同。在IFL试验中，抗体反应在化疗期间非常低(第4-19周平均滴度为7),但化疗完成后(第X+2-X+14周平均滴度为158)急剧增加(〉20倍)。相反，在FOLFOX试验中，平均抗化蟲ri产组合si+滴^'g:...肿瘤反应+ELISPOT，患者X周X+14周评分S3344566773W52RDDDDcpppQ>DDDDDDpppppp.CPPP5SPppsps.脊，多f.-，sw讀fv.，1^參,fi:,"參转76体滴度在化疗期间高(平均滴度为103),化疗完成后中度增力O(平均滴度为115)。在两种试验中，第19-X+2周平均抗体滴度都降低。在两种试-险中所有6次接种后都可看到抗体滴度增加。表17:TV2IFL与FOLFOX试验之间5T4特异性抗体反应的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>3.1.1TV2IFL和FOLFOX试验检测的5T4特异性抗体反应的统计分析用Wilcoxon以"每种试验"为基础进行数据的统计分析。结果如下(a)化疗期间反应(第2-19周)IFL:平均分数(滴度)=0.44(<10)FOLFOX:平均分数(滴度)=1.73(17)组间差异P=0.011(P<2%)结论在患者接受化疗期间，IFL和FOLFOX组检测的抗体滴度存在显著差异。(b)化疗后反应(第X+2-X+10周)IFL:平均分数(滴度)=1.85(18)FOLFOX:平均分数(滴度)=2.29(24)组间差异P-0.53(NS)结论化疗完成后，IFL和FOLFOX组检测的抗体滴度无显著差异。(c)从化疗期间至化疗后的变化(第2-19vX+:2-X+10周)IFL:平均分数(滴度)化疗期间=0.44(<10)化疗后=1.85(18)变化=1.41(x2.7)P-0.020(P<2%)FOLFOX:平均分数(滴度)化疗期间=1.73(17)化疗后=2,29(24)变化=0.56(x1.5)P=0.16(NS)结论在IFL组化疗期间与化疗后的抗体滴度存在显著差异。相反，FOLFOX组无显著差异。(d)从笫19周至第x+:2周的变化IFL:平均分数(滴度)第19周=0.67(<10)平均分数(滴度)第X+2周=0.00(<10)改变=-0.67(x0.62)P=0.13(NS)FOLFOX:平均分数(滴度)第19周=2"(24)平均分数(滴度)第X+2周=0.36(<10)改变=-1.91(x0.27)P=0.016(P<2%)组间差异P^0.10(NS)结论在第19-X+2周之间，IFL组检测的抗体滴度无显著差异，但FOLFOX组的滴度明显下降。3.2增殖反应5T4特异性增殖反应在FOLFOX的强度比IFL试验大(表18)。在两种试验中，化疗完成后的增殖反应都更大。第19-X+2周差异最明显，如图4a-b显示。然而，当分析对MVA或TT的反应时这种差异不明显(图4c-4f)。表18:TV2IFL与FOLFOX试验之间5T4特异性增殖反应的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>图4a显示TV2-IFL的5T4反应，图4b显示TV2-FOLFOX的5T4反应，图4c显示TV2-IFL的MVA反应，图4d显示TV2-FOLFOX的MVA反应，图4e显示TV2-IFL的TT反应，图4f显示TV2-FOLFOX的TT反应。3.2.1TV2IFL和FOLFOX试验检测的5T4特异性增殖反应的统计分析进行统计分析(Wilcoxon)以评估TV2FOLFOX和IFL试验检测的抗原特异性免疫反应的显著性。(a)从基线至接种后增殖反应的变化(从第-2和0周v第2周-X+14周(IFL)或第X+10周(FOLFOX))別IFL:平均对数(S.I.)基线二1.05(2.9)接种后=1.02(2.8)变化=-0.03(x0.97)P=0.96(NS)FOLFOX:平均对数(S丄)基线^0.69(2.0)接种后=1.25(3.5)变化=0.56P=0.10(NS)IFL:平均对数(S丄)基线-0.17(1.2)接种后=1.62(5.1)变化=1.45(x4.3)P=0.002(P<0.5%)FOLFOX:平均对数(S.I.)基线0.18(1.2)接种后=2.37(10)变化=2.19(x8.9)P=0.002(P<0.5%)7TIFL:平均对数(S.I.)基线二0.90(2.5)接种后=1.06(2.9)变化=0.17(xl.2)P=0.52(NS)FOLFOX:平均对数(S丄)基线1.42(4.1)接种后=1.50(4.5)变化=0.08CxU)P=1.00(NS)结论从基线至TroVax接种后对5T4和TT的增殖反应无显著变化。然而，对MVA的反应显著增加。(b)从基线至化疗期间增殖反应的变化(第-2和0周v第4周-19周)，IFL:平均对数(S丄)基线^1.05(2.9)化疗期间=0.76(2.2)变化=-0.29(x0.75)P=0.11(NS)FOLFOX:平均对数(S丄)基线0.69(2.0)化疗期间=0.94(2.6)变化=0.25(xl.3)P=0.64(NS)IFL:平均对数(S丄)基线0.17(1.2)化疗期间=1.17(3.2)变化=1.00(x2.7)P=0.03(P<5%)FOLFOX:平均对数(S丄)基线0.18(L2)化疗期间=1.99(7.3)变化=1.81(x6.1)P-0扁(P<0.5o/o)rrIFL:平均对数(S丄)基线^0.90(2.5)化疗期间=0.98(2.7)变化=0.09(xl,l)P=0.79(NS)FOLFOX:平均对数(S丄)基线1.42(4.1)化疗期间=1.47(4.3)变化=0.04(x1.04)P=0.89(NS)结论从基线至化疗期间出现的TroVax接种后时间点，对5T4和TT的增殖反应无显著改变。然而，对MVA的反应明显增加。(c)从基线至化疗后增殖反应的变化(第-2和0周v第2周-X+14周(IFL)或第X+10周(FOLFOX))IFL:平均对数(S.I.)基线-1.05(2.9)化疗后=1.18(3.3)变化=0.13(xl.l)P=0.79(NS)FOLFOX:平均对数(S丄)基线0.69(2.0)化疗后=1.82(6.2)变化=1.13(x3.1)P=0.04(P<5%)IFL:平均对数(S丄)基线-0.17(1.2)化疗后=2.05(7.8)变化=1.88(x6.6)P=0.001(P<0.2%)FOLFOX:平均对数(S丄)基线-0.18(1.2)化疗后=2.84(17)改变=2.66(xl4)P-0扁(P<0.5%)7TIFL:平均对数(S丄)基线O.卯(2.5)化疗后=1.16(3.2)变化=0.27(xl.3)P=0.27(NS)FOLFOX:平均对数(S丄)基线-1.42(4.1)化疗后=1.58(4.9)变化=0.16(xl.2)P=0.90(NS)结论从基线至化疗完成后发生的TroVax接种后时间点，对5T4(仅IFL)和TT的增殖反应无明显变化。然而，对MVA和5T4的反应(仅FOLFOX)明显增加。(d)第19与X+2周之间增殖反应的变化IFL:平均对数(S丄)第19周=0.33(1.4)第X+2周=1.49(4.4)变化=1.16(x3.2)P-0.04(P<5%)FOLFOX:平均对数(S丄)第19周=0.75(2.1)第X+2周=1.64(5.2)变化=0.89(x2.4)P-0.04(P<5%)IFL:平均对数(S.I.)第19周=1.24(3.5)第X+2周^1.37(3.9)变化=0.13(xl.l)P=0.68(NS)FOLFOX:平均对数(S丄)第19周=2.02(7.5)第X+2周=2.33(10)变化=0.31(xl.4)P=0.64(NS)rrIFL:平均对数(S丄)第19周=1.42(4.1)第X+2周=1.13(3.1)变化=-0.29(x0.75)P-0.34(NS)FOLFOX:平均对数(S.I.)第19周=1.48(4.4)第X+2周=1.47(4.3)变化=-0.02(x0.98)P-0.90(NS)结论从第19至X+2周对MVA和TT的增殖反应无明显变化。然而，对5T4的反应明显增加。概述与FOLFOX組相比，IFL组的抗体反应纟皮化疗方案抑制。然而，在两组中，第5次和第6次接种后许多患者都可看到促进作用-这在前一TV1试验很少看到。事实上，IFL和FOLFOX试验中6次接种每81次都提高平均5T4抗体滴度。在细胞水平，与基线水平相比，TroVax接种后对5T4和TT的平均增殖反应都没有显著增加。然而，在FOLFOX试验中，化疗完成后检测的平均增殖反应比基线明显提高。第19周与X+2周之间对5T4增殖反应的增加是吸引人的。对5T4而并非MVA或TT的反应在这2个时间点明显增强，尽管事实是在此期间(约8周)没有接种。分析外周调节性T细胞水平可进一步了解这种观察结果。4.T调节性细胞在1970年因为一种T细胞亚群具有诱导耐受性的能力而开始将其称为抑制性T细胞，现在描述为T调节性细胞(Gershon和Kondo,1970.Immunology18:723-737;Gershon1975.TransplantRev.26:170-185;Taams和Akbar,2005.Curr.Top.Microbiol.Immunol.293:115-131)。T调节性(Tr)细胞在诱导和维持对外来和自身抗原的耐受性方面发挥重要作用。已经描述不同类型调节/抑制细胞，包括CD4+CD25+T细胞、产生TGF-卩的TH3细胞、产生IL-10的Trl细胞和CD8+CD28-T细胞(综述参阅Levings和Roncarlo，2005.CTMI.292:303-326;Huehn,Siegmund和Hamann,2005.CITR293:89-114;Faria和Weiner,2005Immunol.Rev.206:232-259;Weiner,2001Immunol.Rev.182:207-214;Weiner等，2001.MicrobesInfect.3:947-954;Roncarolo等，2001Immunol.Rev.182:68-794.1.CD4+CD25+Treg:诱导这些调节性T细胞可在人外周血中检测到，能够以抗原非特异性和接触依赖性方式抑制旁观T细胞。这些Treg的特征在于IL-2受体a-链(CD25)高组成水平的表达，常称为CD4+CD25hi+Treg。它们还表达高水平的细胞内转录因子FoxP3及其它细胞受体，包括CTLA-4、GITR(糖皮质激素诱导性TGFR超家族成员18)、CD45RO、CD45RB、ICOS和神经菌毛素1。与鼠CD4+CD25+Treg相反，人对应物不表达高水平整合素CD103。因为所有可用于鉴定CD4+CD25+细胞的标记物可由其它T细胞亚群表达，虽然处于不同水平和组合，但没有限定CD4+CD25+Treg细胞的单种标记物。虽然CD4+CD25+Treg发挥其抑制功能的精确分子机制尚未明确，但已知需要细胞接触，不依赖自身分泌细胞因子的Treg(Takahashi等，1998Int.Immunol.10:1969-1980;Thorton和Shevach1998.J.Exp.Med.188:287-296)。CD4+CD25+Treg可对T细胞、B细胞、初于突状细胞、NK细胞(Shimuzu等，1999.J.Immunol.163:5211-5218)、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞(Maloy等，2003.J.Exp.Med.197:111-119;Taams等，2005.Hum.Immunol.66:222-230)发挥其抑制作用。CD4+CD25+Treg可抑制CD4+和CD8+的诱导和效应活性(综述参阅VanBoehmer2005.Nat.Immunol.6:338-344)。这些Treg的作用方式似乎不同，可包括控制效应T细胞分泌细胞因子(如IL-2和IFN-力、抑制CD8+T细胞的细胞杀伤性(Chen等，PNAS102:419-424)、干扰受体信号、通过穿孔素依赖性机制杀死效应T细胞(Piccirillo和Shevach，2004.Semin.Immunol.16:81-88)和诱导分泌IL-10和TGF-卩的T细胞(Jonuleit等，2002J.Exp.Med.196:255-260)。一些更后的细胞表现为TrlTreg(Levings等，2002Int.Arch.AllergyImmunol.129:262-276),提示CD4+CD25+Treg促进其它Treg分化。CD4+CD25+Treg还可调节B细胞活性。已经发现这些Treg可抑制自身抗体反应成熟(Fields等，2005J.Immunol.175:4255-4264)、B细胞活化和抗体分泌(Sakaguchi等，1995.J.Immunol.155:1151-1164;Bystry等，2001.Nat.Immunol.2:1126-1132)。也已报道通过Fas/FasL相互作用由Treg杀伤涉及提呈抗原的B细胞(Janssens等，2003J.Immunol.171:4604-4612)。CD4+CD25+Treg可通过调节抗原提呈细胞的作用对旁细胞发挥其抑制作用。CD4+CD25+Treg可通过下调共刺激分子如CD80和CD86的细胞表面表达和/或预防成熟限制APC的刺激能力(Cederborn等,2000.Eur.LImmunol.30:1538-1543;G醒dstorm等，2003.J.Immunol.170:5008-5017;Taams等，2005.Hum.Immunol.66:222-230;Misra等,172:4676-4680)。在另一项研究中，Treg通过阻断共刺激分子上调和抑制细胞因子分泌抑制骨髓DC成熟，导致抗原提呈能力差(Hout等，2006.J.Immunol.176:5293-5298)。然而，有利于TH2发展的类浆细胞DC对Treg的作用不敏感。也已描述在Treg的存在下单核细胞(Taams等，2005.Hum.Immunol.66:222-230)和单核细胞衍生的DC驱动的抗原提呈少(Misra等，2004.J.Immunol.172:4676-4680)。Treg还可对成熟DC诱导的Thl型反应发挥负反馈才几制，从而緩解TH1反应的发生(01denhove等，2003.J.Exp.Med.198:259-266)。此外，Treg可调节DC分泌吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的能力，该酶使必需氨基酸色氨酸代谢耗尽，增加抑制T细胞增殖和促进活化T细胞优先凋亡的犬尿氨酸的产生(Terness等，2002.J.Exp.Med.196:447-457)。高水平IDO导致T细胞丢失色氨酸然后凋亡(Fallarino等，2003.NatImmunol.4:1206-1212)。还显示Treg限制DC与CD4+辅助纟田胞之间的接触(Tand和Krummel,2006.C跳Opin.Immun.18:496-502)。证据提示CD4+CD25+Treg来自胸腺，可由外周CP4+CD25-T细胞分化(综述参阅Huehn，Siegmim和Hamann,2005.CTMI293:89-114;Taams和Akbar,2005CTMI293:115-131;Akbar等，2003Immunology109:319-325;Bluestone和Abbas,2003)。FoxP3表达是CD4+CD25+Treg发育和功能的关键(综述参阅Nomura和Sakaguchi，2005.CTMI293:287-302)。此外，大量研究证明Treg发育和功能需要CD4+CD25+Treg与APC之间的多种相互作用(Rutella和Lemoli，2004.Immunol.Lett.94:11-26;Zheng等，2004J丄173:2428;Herman等，2004.J.Exp.Med.199:1479;Min等，2003.J.Immunol.170:1304-1312;Kumanogoh等，2001.J.I.166:353;Salomom等，2000)。例如，Treg不能在缺乏CD28/B7相互作用的小鼠中发育。然而，CD4+CD25+Treg也可影响DC分化(Min等，2003.J.Immunol.170:1304-1312)。人们认为CD4+CD25+Treg的抗原组成成分与幼稚T细胞一样广泛，使能够识别自身和非自身抗原的广泛排列，从而允许控制多种免疫反应。为了发挥其抑制功能，需要激活其TCR。然而，一旦活化，它们就可非特异性地抑制抗原(Jonuleit等，1999.J.Immunol.193:1285;Thornton和Shevach,2000.J.Immunol.164:183-190;Levings，Sangregorio和Roncarolo,2001J.Exp.Med.193:1295;Yamagiwa等,2001J.Immunol.166:7282)。在TCR介导的刺激之后，相同Treg抑制由同种异体抗原和分裂素激活的幼稚CD4+CD25-T细胞活化(Levings,2001)。证据还提示一些Treg的发育、维持或扩大需要外周抗原(Mastellar,Tang和Bluestone2006.Semin.Immunol.18:103-110)。4.2.TV2患者PBMC的CD4+CD25+Treg分析通过将PBMC用抗-CD4和-CD25抗体染色、对CD4+细胞门控并设定绝对象限(为了只包括CD4+CD25hJ+细胞作为阳性读数)评估CD4+CD25+Treg的水平。用相同象限评估所有患者。图5显示一种染色实例。还进行细胞内染色以确认表达转录因子FoxP3的这些细胞(图6)。在文献中，通常接受将CD4+CD25+Treg水平以总CD4+T细胞群的百分数表示。但存在一些争议，CD4+CD25+Treg细胞代表健康个体外周血中存在的CD4+T细胞最大量的至多2-10%(Maloy和Powrie2001.Nat.Immunol.2:816-822;Sakaguchi等，2001.I腿unl.Rev.182:18-32;Gavin和Rudensky,2003.Curr.Opin.Immunol.15:690-696;Piccirillo和Shevach,2004.Seim.Immunol.16:81-88Masteller,Tang和Bluestone2006.Semin.Immunol.18:103-110)。TV2-IFL和-FOLFOX患者的数据在表1列出。在化疗之前，患者外周血CD4+T细胞内似乎包含正常水平CD4+CD25+Treg(至多2-10%)。表19.CP4+CD25+Treg在总CD4+T细胞群中的百分数。将试验期的平均数计算为每个个别时间点的平均数。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>FL和FOLFOX治疗都导致Treg耗尽。对于IFL患者(n:7)，与化疗前时间点相比，化疗期间Treg下降15-83%范围。对于FOLFOX患者(n-5),观察到的范围是31-52%(注意排除患者TV2-108，因为没有检测化疗前时间点)。化疗后，Treg水平比化疗期增加，提示IFL和FOLFOX的作用都是暂时的。在一些患者中，Treg水平恢复至试验前水平。图7显示在不同试验阶段CD4+CP25+Treg在CD4+群中的平均百分数。总体而言，TV2-FOLFOX患者组显示的CD4+CD25+Treg水平高于研究的TV2-IFL患者组。虽然TV2-FOLFOX患者的Treg水平高于(但在健康个体的预期范围内)TV2-IFL患者，但两种试验观察到的这种细胞群在试验全程的平均变化是相似的。与试验前相比，化疗期间Treg下降约30%。化疗后，这些细胞的水平增加，〗旦维持在CD4+CD25+Treg的预期正常范围内。对数据的统计分析揭示在两种试验中CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞群中的百分数在化疗期间比化疗前都明显下降。IFL治疗时，Treg的几何均数从化疗前1.36下降至化疗期间0.68(p=0.001)。FOLFOX治疗时，Treg的几何均数从化疗前2.31下降至化疗期间1.75(p=0.0093)。然而，化疗后Treg水平与化疗前无显著差异。对于IFL和FOLFOX试验，化疗后Treg几何均数分别是1.06(pK).2629)和2.17(p=0.4923)。该数据提示IFL和FOLFOX治疗时在耗尽CD4+CD25+Treg后，Treg的水平可增加。如本研究的测量，IFL和FOLFOX患者的Treg水平分别在化疗后14和10周内恢复。4.3.结论IFL和FOLFOX治疗都导致Treg减少。虽然FOLFOX组患者的水平略高于IFL组，但两种TV2试-险化疗期间CD4+CD25+Treg在总CD4+T细胞群中的百分数都下降30%。4.4.i寸论已经显示多种不同类型癌症患者的外周血、淋巴结、肺瘤腹水和肺瘤组织中CD4CD25+Treg增加(综述参阅Nomura&Sakaguci,2005Curr.Top.Microbiol.Immunol.293:287)。也已显示肿瘤负荷增加与Treg比例增加相关(Liyanage等，2002.J.Immunol.169:2756-2761;Woo等，2001.CancerRes.61:4766-4772)。在这项TV2患者的研究中，CD4+CD25+Treg似乎以预期的正常范围(至多2-10%总外周血)存在于大部分患者的外周血中。然而，该研究没有考虑在这些患者的肿瘤附近Treg增加的可能性，局部抑制其它免疫细胞启动或维持不适当地抑制自身或肿瘤相关抗原的反应的能力。在化疗后1周测量时，IFL和FOLFOX化疗都导致CD4+CD25+Treg在外周血总CD4+T细胞群中的百分数下降(30%)。已经描述许多其中人外周血CD4+CP25+Treg水平降低的其它化疗治疗，包括环磷酰胺(Ghirighelli等，2004;Eur.J.Immunol.34:336-344;Lutsiak等，2005.Blood105:2862-2868)、GOLF(吉西他滨[GEM]、奥沙利铂、LF和FU;Correale等，2005.J.Clin.Oncol.23:147-162)和替莫唑胺(Su等，2004.J.Clin.Oncol.4:610-616)。也已显示ONTAK(重组IL-2融合毒素缀合物DAB389IL-2)可耗尽人PBMC的CD4+CD25+Treg,允许用RNA转染DC以启动/促进免疫反应(Dannull等，2005J.Clin.Invest.115:3623-3633)。在这项TV2患者的研究中，观察到外周血CD4+CP25+Treg降低可反映凋亡/细胞死亡导致的丢失，或者定位改变从而使外周血Treg补充入组织或淋巴结内。因为这些细胞通过细胞接触发4军其抑制作用，所以它们必须迁移至合适的部位。在次级淋巴组织内，必须存在Treg以抑制免疫反应和记忆反应的启动。在炎症部位中，CD4+CD25+Treg必须迁移以有效地阻止多种可能的免疫反应。更重要的是，CD4+CD25+Treg功能的丧失而不是Treg绝对数的丧失可能是关键因素，以具备启动或维持抗自身和肿瘤相关抗原的免疫反应的能力(Coulie和Connerotte,2005.Curr.Opin.Immunol.17:320-325)。最近已经阐明环磷酰胺(CY)能够通过影响Treg增强免疫反应的机制(Lutsiak等，2005.Blood105:2862-2868)。CY不仅降低Treg数目，还通过增加凋亡、降低稳态增殖抑制其抑制功能。CY还改变基因表达和下调GITR和FoxP3。CY对Treg的作用是暂时的，所以CY暴露后10天Treg的绝对数恢复至治疗前水平。Treg的短暂降低可能是成功免疫治疗所必需，同时维持抗自身免疫的一些防御。确定IFL和FOLFOX是否以相似或不同的方式影响Treg功能也是重要的。可利用涉及Treg细胞分化、成熟和维持的分子如FoxP3的抑制剂增强对肿瘤抗原的免疫反应。FoxP3的抑制剂包括其mRNA的反义治疗(Veldman等，2006.J.Immunol.176:3215-3222)和通过转录因子NFAT中断其转录的因子如环孢菌素A(Mantel等，2006J.Immunol.3593-360)。FoxP3蛋白与靶基因的相互作用也涉及NFAT(Wu等，2006.Cell126:375-387)。也显示多巴胺可抑制Treg抑制活性(Kipnis等，2004J.Ne卿sci.24:6133-6143)。虽然Treg细胞耗尽可增强肿瘤免疫反应，但Treg细胞完全缺乏不足以治疗建立的表达肿瘤的自身抗原(Antony和Restifo，2002.J.Immunother.25:202;Antony等，2005.J.Immunol174:2591-2601)。这提示胂瘤退化理论上涉及Treg和效应T细胞的产生联合下降。因此，用导致Treg和/或Treg功能丧失的因子联合接种的对策可能有利于肺88瘤免疫治疗。用TV2患者的水冻PBMC研究只测量一种调节性T细胞类型，CD4+CD25+Treg。两种试验化疗期间都观察到30%的降低。CD4+CP25hi+Treg可来源于胸腺(天然Treg)或来自外周(适应性Treg;Bluestone和Abbas,2003)。没有证据提示抑制抗自身抗原免疫反应的Treg只来自胸腺，或者只来自外周。在它们可从合适的骨髓前体再生之前，切除产生Treg的胸腺可导致Treg降低几周。附录l:患者人口统计TV2FOLFOX受试者号年龄(进入试验时的岁数)性别人种10168男白种人10265男白种人10365男白种人10459女白种人10556男白种人10654女白种人10767男白种人10859男白种人10966男黑种人11055男白种人11165女白种人11272女白种人11347男亚洲人11456女白种人11562男白种人11649女白种人11751男白种人TV2IFL受试者号年龄(进入试验时的岁数)性别人种00160女白种人00265男白种人<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>以上说明书提及的所有出版物都通过引用结合到本文中。本领域技术人员清楚可不脱离本发明的范围和主题对所述本发明方法和系统进行各种修饰和变更。虽然已经结合具体优选实施方案描述本发明，但应理解要求保护的本发明不应过度受限于此类具体实施方案。事实上，分子生物学或相关领域技术人员明白所述实施本发明的方法的各种修饰预期在以下权利要求保护的范围内。权利要求1.一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括同时、按顺序或单独给予受试者抗原和一种或多种化疗剂，包括下列步骤a.给予一种或多种化疗剂，和b.在给予化疗剂后至多6周给予抗原。2.—种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括同时、按顺序或单独给予受试者抗原和一种或多种化疗剂，包括下列步骤a.给予一种或多种化疗剂，和b.在CD4+CD25+Treg细胞计数减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予抗原。3.权利要求1或2要求保护的方法，还包括测定CD4+CD25+Treg细胞计数的步骤。4.权利要求3要求保护的方法，其中在化疗之前和/或化疗期间和/或化疗后测定CD4+CD25+Treg细胞计数或CD4+CD25+Treg细胞功能。5.上述权利要求中任一项要求保护的方法，还包括在化疗前给予抗原的步骤。6.上述权利要求中任一项要求保护的方法，还包括在与给予化疗相同的时间范围期间给予抗原的步骤。7.—种治疗癌症的方法，所述方法包括同时、按顺序或单独给予受试者肿瘤相关抗原和一种或多种化疗剂，其中所述方法包括步骤a.给予肺瘤抗原以？1起抗肿瘤反应，b.给予一种或多种化疗剂，和c.在给予化疗剂后至多6周给予肿瘤抗原。8.一种治疗癌症的方法，所述方法包括按顺序或单独给予受试者肺瘤相关抗原和一种或多种化疗剂，其中所述方法包括步骤9.一种治疗癌症的方法，所述方法包括按顺序或单独给予受试者肺瘤相关抗原和一种或多种化疗剂，其中所述方法包括步骤a.给予肿瘤抗原以引起抗肺瘤反应，b.给予一种或多种化疗剂，和c.当受试者的CD4+CD25+Treg细胞计数减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予肿瘤抗原。10.权利要求8或9要求保护的方法，还包括测定CD4+CD25+Treg细胞计数或CD4+CD25+Treg细胞功能。11.抗原在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述治疗包括同时、按顺序或单独给予受试者一种或多种化疗剂和抗原，其中在化疗后至多6周给予抗原。12.抗原和一种或多种化疗剂在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中药物的给药方式包括在化疗后至多6周给予抗原。13.抗原在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述治疗用于与一种或多种化疗剂的联合治疗，其中在化疗后至多6周给予抗原。14.一种或多种化疗剂在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述治疗用于与抗原的联合治疗，其中在化疗后至多6周给予抗原。15.抗原和一种或多种化疗剂在制备用于同时、单独或按顺序用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中在给予一种或多种化疗剂之前或者在给予化疗剂后至多6周给予抗原。16.抗原在制备用于给予哺乳动物以诱导对所述抗原的免疫反应从而治疗或预防疾病的药物中的用途，其中在给予一种或多种化疗剂之前和/或同时和/或之后至多6周给予抗原。17.抗原在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述治疗或预防包括同时、按顺序或单独给予受试者一种或多种化疗剂和抗原，其中在受试者的CD4+CD25+Treg细胞计数减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予抗原。18.抗原和一种或多种化疗剂在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中在CD4+CD25+Treg细胞计数减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予抗原。19.抗原在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述治疗用于与一种或多种化疗剂的联合疗法，其中在CD4+CD25+Treg细胞计数减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予抗原。20.—种或多种化疗剂在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中所述治疗用于与抗原的联合疗法，其中在CD4+CD25+Treg细胞计数减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予抗原。21.抗原和一种或多种化疗剂在制备同时、单独或按顺序用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中在化疗之前、在CD4+CD25+Treg细胞计数减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予抗原。22.抗原在制备用于给予哺乳动物以诱导对所述抗原的免疫反应的药物中的用途，其中抗原的给药包括在给予化疗剂之前和/或同时和/或之后给予抗原，其中当哺乳动物的CD4+CD25+Treg细胞计数减少或CD4+CD25+Treg细胞功能降低时给予抗原。23.权利要求11-22中任一项要求保护的用途，其中抗原是肿瘤相关抗原，疾病是癌症。24.权利要求23要求保护的用途，其中肿瘤相关抗原是5T4。25.—种通过在抗原致敏前和/或同时和/或之后至多6周用化学疗法治疗增强对所述抗原的免疫反应的方法。26.—种药剂盒，所述药剂盒包含给予抗原以及与之组合的一种或多种化疗剂的给药工具。27.—种药用组合物，所述药用组合物包含抗原和一种或多种化疗剂以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。28.权利要求27要求保护的组合物，其中将所述组合物以两部分形式提供，用于单独、同时或先后给药。29.权利要求27或28要求保护的组合物，其中抗原是肿瘤相关抗原(TAA),选自5T4、癌睾丸抗原(HOM-MEL-40)、分化抗原(HOM-MEL-55)、过度表达基因产物(HOM-MD-21)、突变基因产物(NY-COL-2)、剪接变异体(HOM-MD-397)、基因扩增产物(HOM-NSCLC-ll)、癌相关自身抗原(HOM-MEL-2.4)、MART-1(T细胞-1识别的黑素瘤抗原)、MAGE-A(MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A10、MAGE-A12)、MAGEB(MAGE-B1-MAGE-B24)、MAGE-C(MAGE隱C1/CT7、CT10)、GAGE(GAGE-1、GAGE-8、PAGE-1、PAGE匿4、XAGE-1、XAGE-3)、LAGE(LAGE-la(lS)、-lb(lL)、NY画ESO-l)、SSX(SSX1-SSX陽5)、BAGE、SCP画1、PRAME(MAPE)、SART-1、SART隱3、CTpll、TSP50、CT9/BRDT、gp100、MART-1、TRP-1、TRP-2、MELAN-A/MART-1、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、MUCIN(MUC-1)、酪氨酸酶、Her2、存活素和TERT。30.权利要求27-29中任一项要求保护的组合物，其中抗原由表达载体提呈。31.权利要求30要求保护的组合物，其中表达载体是病毒载体。32.权利要求5要求保护的组合物，其中病毒载体衍生自MVA。33.权利要求30-32中任一项要求保护的组合物，其中抗原是5T4。34.上述权利要求中任一项要求保护的组合物，其中一种或多种化疗剂选自伊立替康、氟尿嘧啶、亚叶酸和奥沙利铂。35.权利要求27-33中任一项的组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。36.权利要求9要求保护的用途，其中疾病是癌症。37.—种药品，所述药品包含在治疗中同时、按顺序或单独使用的抗原和一种或多种化疗剂。全文摘要一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括同时、按顺序或单独给予受试者抗原和一种或多种化疗剂，包括步骤给予一种或多种化疗剂，给予化疗剂后至多6周给予抗原。文档编号A61K45/06GK101312741SQ200680043514公开日2008年11月26日申请日期2006年9月21日优先权日2005年9月21日发明者M·凯莱赫,M·卡罗尔,R·哈罗普,S·金斯曼,W·欣格勒申请人:牛津生物医学(英国)有限公司