专利名称：Wwox基因、包含该基因的载体和在癌症治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明总地说来涉及用于控制异常细胞生长(包括但不限于在癌 症特别是肺癌中发现的异常细胞生长)的组合物和方法。
背景技术：
在美国，肺癌是癌症死亡率的主要原因(i),在美国每年有大约 170， 000例新病例的发病率(i)，并且死亡率非常高。非小细胞肺癌 (NSCLC)占肺癌的大约80%。手术仍然是NSCLC的主要疗法，但大部 患者不能经受治疗性切除术。尽管存在新的药物和治疗方案，但肺癌 患者的预后在过去IO年仍未有明显改变。已在肺癌患者中对重组病毒 基因疗法进行了研究；在肺癌临床试验中向瘤内注射了编码野生型 p53的腺病毒(Ad)和逆转录病毒(2-互)。肺癌I期研究中重组Ad的 注射(2)证明是安全的和可行的，I/II期临床试验目前正招募患者以 评估使用重组Ad的基因疗法的毒性和功效。
肺癌与脆性位点FRA3B (2)的FHIT (脆性组氨酸三联体)基因 (y表达的早期丢失关联。脆性区域在暴露于环境致癌剂时特别容易遭 受损伤，这是肺癌的病因。最近，Yendamuri等人(M))已证明W0X(包 含WW结构域的氧化还原酶)基因在部分非小细胞肺癌中也发生改变。 WWOX位于脆性位点FRA16D (U)且编码具有2个WW结构域和短链脱氢 酶结构域的414个氨基酸的蛋白质。■结构域是蛋白质-蛋白质相互 作用的结构域，已鉴定了在正常上皮细胞中具有重要的信号转导作用的Wwox相互作用子(interactor) 。 Wwox与p73相互作用且可触发 细胞核p73至细胞质的重新分布，从而抑制其转录活性(il)。 Wwox也
与在细胞增殖中具有作用的Ap2-y转录因子相互作用(U)。最近，已 报导Wwox与Yap蛋白竟争对细胞内ErbB4结构域(转录激活因子)的
结合(ii)。因此，Wwox途径包括许多可用作癌症治疗性乾的下游信号
转导蛋白。
WW0X基因在许多类型的癌症包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、 膀胱癌、食道癌和胰腺癌中发生改变(ll-ii)。在非小细胞肺癌中，在 26 %的胂瘤中和8个细胞系中的5个(11)中检测到缺少WW0X外显子的 转录物。在37%的肺瘤中发生WWOX等位基因丟失，在62. 5%的鳞状 上皮细胞肺癌中启动子被超甲基化(ll， ii)。为调查肺癌中的肿瘤抑 制，我们通过使用携带^T(^r基因的Ad的感染来研究Wwox蛋白的表达 在Wwox阴性(A549、 H460和H1299)和阳性肺癌细胞(U2020)中的体外 和体内效应；也用诱导型Wwox表达载体稳定地转染H1299细胞，所 述载体允许诱导接近生理水平的蛋白。Wwox的恢复有效地在体外诱导 细胞凋亡和在棵小鼠中抑制肺癌致肿瘤性，然而对组成型表达Wwox 蛋白的肺癌细胞没有作用。
' 发明概述
本发明提供了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括对受试者 施用编码功能性WWOX基因产物的多核苷酸。在一些实施方案中，癌症 选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌和胰腺癌。 在一些实施方案中，治疗方案包括基因疗法，在一些实施方案中，重 组病毒基因疗法，例如重组腺病毒基因疗法。
本发明还提供治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括在受试者 的至少一个癌细胞中诱导Wwox表达。本发明还提供了在癌细胞系中诱 导细胞生长抑制的方法，其包括在细胞系中诱导Wwox的表达。在一 些实施方案中，癌细胞或癌细胞系是肺癌。
本发明还提供了多核苷酸，其包含编码功能性WWOX基因产物的多核苷酸；和与编码功能性WWOX基因产物的多核苷酸有效连接的异 源启动子。在一些实施方案中，连接多核苷酸的两个末端，从而产生 环状多核苷酸。
本发明还提供了包含WWOX基因产物表达盒的载体，所述表达盒 包含编码功能性WW0X基因产物的多核苷酸；和与编码功能性WW0X 基因产物的多核苷酸有效连接的异源启动子。在一些实施方案中，载 体是病毒栽体，在一些实施方案中，病毒栽体是重组腺病毒载体。本 发明还提供了包含本发明的病毒载体的细胞。所述细胞可以是肺细胞， 特别是肺癌细胞。
本发明还提供了治疗受试者中的癌症的药物组合物，其包含病 毒载体，所述病毒载体包含WWOX基因产物表达盒，所述表达盒包含编 码功能性WWOX基因产物的多核苷酸和与编码所述功能性W0X基因产 物的多核苷酸有效连接的异源启动子；和药学上可接受的赋形剂。病 毒载体可以是例如重组腺病毒栽体。在一些实施方案中，配制用于吸 入的组合物。
本发明还提供了质粒，该质粒包含编码功能性WW0X基因产物 的多核苷酸；和与编码所述功能性WWOX基因产物的多核苷酸有效连接 的异源启动子。本发明还提供了包含本发明的质粒的细胞。
本发明还包括治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括对受试者 施用能够再激活WWOX基因的治疗性化合物。在一些实施方案中，受试 者是人。在一些实施方案中，WWOX基因的再激活导致细胞凋亡的诱导。
本发明的另外的特征和有利方面部分示于下面的描述中，部分根 据说明书可容易看出的，或可通过实施本发明得到了解。通过所附权 利要求中明确指出的元素和组合的技术手段实现和获得本发明的目的 和有利方面。
要理解，如所声称的，前述的概述和下列详细的描述只是示例性 和说明性的并且不限制本发明。
当按照附图阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明 的不同目的和有利方面对于本领域技术人员将变得明显。附图概述
图1. Wwox蛋白的表达。(力在U2020和MCF7细胞而非H1299、 H460或A549细胞中检测到内源性Wwox的表达(50 p g蛋白上样)。泳 道l， H1299;泳道2， H460;泳道3， A549;泳道4， U2020;泳道5， MCF-7。(历在用Ad-WWOX感染后Wwox的表达(25jag的上样)。泳道1， H1299， Ad-WWOX感染的；泳道2， H1299， Ad-GFP感染的；泳道3， H1299; 泳道4， H460， Ad-WWOX感染的；泳道5, H460， Ad-GFP感染的；泳道 6， H460;泳道7， A549， Ad-WOX感染的；泳道8， A549， Ad-GFP感 染的；泳道9， A549。
图2.未处理的、Ad-GFP感染的和Ad-WWOX感染的细胞的流式细 胞术分析。在通过Ad-WWOX感染恢复Wwox的表达后5天Wwox阴性的 A549、 H460和H1299细胞经历细胞凋亡，但U2020细万包不受影响。 Ad-GFP感染不诱导细胞凋亡。
图3. Wwox的表达在体外对细胞生长的影响。(J)未感染的、Wwox 阴性的A549、 H460和H1299细胞以及用Ad-GFP和Ad-WWOX感染后的 细胞的生长。(历PARP和胱天蛋白酶3的免疫印迹检测。泳道1， A549; 泳道2， A549/Ad-GFP;泳道3， A549/Ad-WWOX;泳道4， H460;泳道 5， H460/Ad-GFP;泳道6， H460/Ad-Wwox;泳道7， H1299;泳道8， H1299/Ad-GFP;泳道9， H1299/Ad-W丽;泳道10, U2020;泳道ll， U2020/Ad-GFP;泳道12， U2 020/Ad-WWOX。当通过Ad-Wwox感染恢复 Wwox时，PARP在Wwox阴性细胞系中被切割(泳道3、6和9)。在Ad-WWOX 感染后，胱天蛋白酶3在A549和H460中被切割(泳道3和6)但在 H1299细胞中不^皮切割。在U2020细胞中，在Ad-WWOX感染后，PARP 和胱天蛋白酶3都不被切割(泳道12)。
图4. Wwox在H1299/I细胞中的诱导型表达。(力在10"MponA 存在(+)或不存在(-)的情况下培养细胞48小时，然后就Wwox的表达 对其进行分析。将只在用ponA诱导后表达转基因的克隆7和2用于随
7后的实验中。GAPDH的表达用作上样对照。(历在浓度不断增加的ponA 不存在或存在的情况下溫育H1299/I克隆7细胞，进行48小时。Vfwox 水平以剂量依赖性的方式增加，通过光密度法定量Wwox的水平，然后 将其标准化成GAPDH的表达水平。(O在用10nMponA处理后H1299/I 克隆7细胞中Wwox诱导的时程。通过光密度法定量Wwox的水平。(幼10 jaMponA对H1299/I克隆7细胞的生长的影响。在第1天，加入ponA， 在第4天发现最大的Wwox的表达。从第5天开始，诱导的细胞(H1299/I+) 生长显著比未诱导的细胞(H1299/r)慢(P < 0.001)。以一式三分重复 进行该实验。
图5. Wwox的表达对肺癌细胞的致肿瘤性的影响。(力未处理的、 Ad-GFP感染的和Ad-WWOX-感染的A549、 H460和U2020肺癌细胞的肿 瘤体积。与用Ad-GFP感染的细胞相比，A549和H460细胞中Wwox的 表达的恢复显著抑制肿瘤生长(P < 0. 001)。(历未处理的、Ad-GFP感 染的和Ad-WWOX感染的H1299细胞和H1299/r以及H1299/T细胞的肿 瘤体积。在Ad-WWOX感染的H1299细胞中和Hl"9/I+细胞中肿瘤被抑 制。(0由未感染的、Ad-GFP感染的和Ad-WW0X感染的AW9、 Hl"9/r 和H1299/r细胞产生的肿瘤形成的实例。
图6. H1299/r和H1299/I+细胞的离体分析。C4)通过免疫印迹分 析就Wwox的表达检测来自H1299 (泳道l)、未诱导的H1299/I—(泳道 2、 3和4)以及诱导的H1299/ 1+(泳道5)肿瘤的蛋白裂解物。Wwox在 H1299/r或H1299/I+肿瘤中不表达。(历涂板和培养部分H1299I,肿 瘤，用ponA处理细胞。在用10jaM ponA进行48小时处理后Wwox重 新表达，表明诱导型WWOX质粒的存在。
图7.表l-棵小鼠中肿瘤重量(以克表示)± SD。
优选实施方案的详细描迷 细胞培养。将获自美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的Wwox阴性A549、 H460和H1299以及Wwox 阳性U2020肺癌细胞系保持在具有10%FBS的RPMI培养基16"中。在具有10%FBS的DMEM中培养来自Qbiogene (Carlsbad, CA)的 HEK-293 CymR细胞。H1299细胞不表达p53，而A549和H460表达野 生型p5 3 (^)。
重组Ad和体夕卜转导。使用Superscript First-Strand Synthesis (Invitrogen)从正常人肝RNA(Ambion， Austin, TX)反转录r柳J cDNA。使用下列条件通过PCR扩增来制备双链cDNA: 95。C下进行3分 钟，30个循环94匸进行30秒、65匸下进行60秒、72tl下进行30 秒，和 72 °C下进行7分钟；使用 r柳J的正向引物 5'-GCCAGGTGCCTCCACAGTCAGCC-3' 和 ^好UT 的反向引物 5'-TGTGTGTGCCCATCCGCTCTGAGCTCCAC-3'。 将 cDNA 克隆入 Adenovator-CMV5(CuO)-IRES-C户转移载体(Qbiogene) (U)。该载体 使得可以通过cumate-诱导型CMV5 (CuO)启动子来驱动转基因表达。内 部核糖体进入位点序列确保GFP的共表达。将重组质粒Ad-r柳Z转染 入组成型表达CyraR蛋白的改变的人胚胎肾HEK-293 CymR细胞 (modified human fetal kidney HEK-293 CymR cells) (Qbiogene), 所述CymR蛋白在靜WJ Ad的包装和扩增(expansion)期间抑制 CMV5(CuO)启动子和Wwox的表达。14至21天后，在细胞中发生同源 重组，从而导致蚀斑形成。分离蚀斑，在HEK-293 CymR细胞中扩增病 毒，然后通过CsCl梯度离心法纯化病毒。通过吸光率测量(病毒颗粒 的数目/ml)和噬菌斑测定(噬斑形成单位/ml)确定滴度，使用Wwox单
克隆抗体通过免疫印迹法估量转基因的表达(li)。以不断增加的多重 性感染(moi)(病毒颗粒的数目/细胞)用重组Ad转导细胞，通过目测 表达6T^的细胞来确定转导效率。
诱导型罪UT转染子。将人cDNA克隆入pIND载体的BamHI 和EcoRI位点。用10jjgpVgRXR载体转染H1299细胞，所述载体包含 蜕皮素细胞核受体亚基，通过用报告基因质粒进行瞬时转染来就松甾 酮A(ponA)-诱导型表达选择和检测克隆。用10jag pIND-IT柳J载体转 染显示最高表达的克隆并将其培养在zeocin(lSO^g/ml)和G"8 (1， 200jug/ml)中。在ponA (5-10 p M)处理后就诱导型罪UT表达选择和检测H1299/I克隆。
Western印迹分析。如参考文献1^_中所述进行蛋白质提取和免 疫印迹分析。使用下列第一抗血清(primary antisera):小鼠单克 隆抗Wwox, 1:500 ;兔多克隆抗胱天蛋白酶3， 1: 1， 000 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA);兔多克隆抗胱天蛋白酶9， 1:200 (Santa Cruz Biotechnology);小鼠单克隆抗胱天蛋白酶8 (Cell Signaling Technology), 1: 1， 000;兔多克隆抗PARP [聚(ADP-核糖)聚合酶]，1:1,000 (Cell Signaling Technology);和兔多克 隆抗P-肌动蛋白，1:1， 000 (Cell Signaling Technology)。
细胞生长和细胞周期动力学。以10、 25、 50、 75和100的moi 感染细胞(2 x 105个)，然后以24小时的间隔收获细胞，用台盼蓝染 色，然后计数(ViCell计数器，Beckman Coulter),为了进行流式细 胞计量术，在感染后5天收获细胞，然后将其在冷甲醇中进行固定， 用RNA酶处理，之后用碘化丙锭(50pg/ml)染色。通过使用双线辨别 选通(doublet discrimination gating )经EPICS-XL扫描(Beckman Coulter)就DNA含量分析细胞。以一式二份重复进行所有分析。
体内研究。按照制定的指导方针进行动物研究。用Ad- Td(inoi - IOO)或Ad-(7尸户体外感染H460、 A549和U2020细月包，或对所述细胞 进行模拟感染。在感染后24小时，将5 x 106个活细胞皮下注射入6 周龄雌性棵小鼠(Charles River Breeding Laboratories)的左胁， 每个感染的细胞系或对照细胞系使用5只小鼠。以100的moi用 或Ad-^TOT体内感染H1299细胞。用IOjuM ponA (H1299/I+细胞)处 理H1299/I细月包以i秀导Wwox表达。致瘤对照(Tumorigenic control ) 是未诱导的细胞(H1299/r)。将诱导的(H1299/I, ponA处理后24小 时)和未诱导的(107个)细胞注射入5只棵小鼠；也用Ad-;^柳J感染的、 Ad-67^感染的和模拟感染的H1299细胞注射5只小鼠。每隔5天测量 肿瘤直径，在尸体剖检后称取肿瘤重量。使用公式「(以mi^表示)= ax6y2计算肿瘤体积，其中a是最大直径，6是垂直直径。
离体研究。使用免疫印迹分析就Wwox的表达评估来自H1299、H1299/r和H1299/I+注射的小鼠的肿瘤的蛋白质裂解物。用IOjliM ponA培养和处理来自H1299/I+肿瘤的碎片，进行2天，以通过免疫印 迹检测+秀导型Wwox的表达。
统计分析。体外和体内实验的结果表示为平均值士SD。使用"学 生，，双侧t检验(Student's two-sided t test)比较受试样品和对 照样品的值。P < 0. 05表示显著的差异。
亲本和Ad-靜WJ感染的肺癌细胞中的Wwox的表达。肺癌细胞系 的蛋白的免疫印迹分析显示A549、 H460和H1299细胞不表达内源性 Wwox，然而在U2020细胞中检测到Wwox。乳腺癌MCF-7细胞表达丰富 的内源性Wwox (ii)，从而用作正对照(图l力。
以100的moi用Ad-ZWd或Ad-6T 感染肺癌细胞；如通过GFP 荧光共聚焦显微镜所估量的(数据未显示)，腺病毒转基因在各细胞 系的几乎100%的细胞中表达。感染后72小时的免疫印迹分析显示 ;r柳x的过度表达存在于所有Ad-罪UT转导的细胞中(图l历。
感染的细胞的细胞周期动力学。在使用Ad-肿Ur或Ad-6^户以数 个moi感染后估量由Wwox的过度表达诱导的细胞周期改变。在 Ad-^Ur感染后在不表达内源性Wwox的A549、 H460和H1299细胞中 而非内源性Wwox阳性的U2020细胞中观察到sub-G!群体。Ad-CF尸感 染不改变细胞周期特征。在Ad-r柳J感染(moi = IOO)后96小时，58 。/o的A549、 94%的H460和17%的H1299细胞处于sub-Gi部分；7% 的U2020细胞处于sub-G部分(图2)。细胞死亡的Wwox诱导是moi 和时间依赖性的(数据未显示)。
Wwox-再表达细胞中的细胞凋亡途径。以不断增加的moi感染 A549、 H460和H1299以及U2020肺癌细胞系，用共聚焦显微镜监测转 导细胞的部分，分析细胞周期动力学。在缺乏内源性Wwox的肺癌细胞 系(A549、 H460和H1299)中在多种moi范围下对于Ad-^柳Z和Ad-",户 的感染在细胞生长中观察到显著的差异(iiA)。 U2020细胞不受外源 性Wwox的表达的影响。
为研究Wwox诱导的凋亡途径，在体外估量下游凋亡效应物的表达。在感染后96小时，与Ad-67V对照细胞相比，在Ad-罪 Z感染的 A549和H460细胞中胱天蛋白酶原3和全长PARP-1的水平降低。在 H1299细胞中，观察到全长PARP-1的减少。在感染的U2020细胞中未 观察到前体的切割(图3历。
H1299细胞中条件化的Wwox的表达的效应。H1299/I克隆7仅在 用ponA的诱导下表达r柳J转基因(图4力，从而用于随后的实验中。 在ponA处理后(图4历24至72小时(图4C) Wwox的表达以剂量依赖 性方式增力口。
将克隆7 H1299/I(未诱导的)细胞涂板，24小时后(第l天)， 用IOjjM ponAi秀导Wwox表达。在第4天观察到最高的表达，最高的 表达在第5天显著影响细胞增殖(图4")，导致细胞的数目减少，从 而暗示Wwox抑制H1299细J包的生长。
Ad-WWOX感染的肺癌细胞系的致肿瘤性。用5 x 106个用Ad-67 或 Ad-『/ra/以100的moi体外感染的A549、 H460和U2020细胞接种棵小 鼠，然后培养24小时。未感染细胞用作致瘤对照。在注射后28天，
在用Ad-;war感染的H460细胞接种的小鼠中肿瘤生长被完全抑制(垔
1^)。第28天的对照(Ad-C户和未处理的H460细胞)的平均肿瘤重量 分别是0. 61 ± 0. 15g和0. 64 土 0. llg。在第28天，用Ad-^柳J感染的 A549细胞接种的5只小鼠中的2只显示没有肿瘤，平均肿瘤重量为 0. 08 ± 0. 03g，显著低于(P < 0. 001) Ad-C尸尸感染的A549 (0. 81 ± 0. 16g) 和模拟感染的A549 (0. 86 土0.15g)细胞的的肿瘤(表l)。在用感染的 U2020细胞注射的小鼠中，未观察到肿瘤生长的抑制(图5力。
诱导的Wwox的表达对致肿瘤性的影响。我们接着比较用 Ad-r約 J感染的或通过ponA处理诱导表达Wwox的H1299的致肿瘤性。 在用Ad-ZT柳J或Ad-67 感染后24小时用1 x 107个细胞接种棵小鼠。 也用ponA处理后24小时的1 x 107个未诱导的H1299/I(H1299/r)和 107个H1299/r细胞注射5只小鼠。在注射后第28天，用Ad-驛^T感 染的H1299细胞接种的5只小鼠中有3只和用H1299/r细胞接种的5 只小鼠中有4只没有显示肿瘤(图5历。来自Ad-罪UT感染的细胞(O. 10士0.26g)和H1299/I+ (0.21土0.31g)细胞的肺瘤的平均重量与来自 Ad-牌(1.66±0. 28g)、 H1299/r(1.98土0.41g)和亲本H1299 (1.87
土1.33g)细胞的肿瘤相比显著减少(图7-表1)。因此，在棵小鼠中通 过病毒感染(Ad-腳Wi)递送的或通过诱导失活的"内源性"歸Y J基因
(H1299/I+)表达产生的Wwox的表达在抑制肺癌细胞生长中是有效的。 H1299/I+外植体胂瘤中Wwox的表达。为估量Wwox的离体表达， 我们对从来源于亲本H1299、 H1299/r和H1299/I+肿瘤的碎片提取的 蛋白质进行免疫印迹分析；在任何肿瘤中未发现Wwox表达(图6A)。 通过用ponA处理和通过免疫印迹分析检测Wwox表达来就诱导型驛WJ 质粒的保留检查来自H1299/I+肿瘤的外植的、培养的碎片。H1299/I+ 外植体中Wwox的诱导的检测显示WWOX质粒存在且为可i秀导的(图6历， 这表明小肿瘤来源于接种的细胞，所述细胞由于在体内不存在诱导剂 而丧失Wwox的表达。
讨论
迫切需要用于肺癌治疗的创新治疗策略。因为普通型脆性部位上 的基因通常在瘤形成过程的早期(特别是当暴露于环境致癌剂后)失 活，我们已对癌症发展过程中脆性基因表达丧失的效果和其恢复的治
疗效果产生兴趣(11)。许多研究表明脆性/war基因在大部分肺癌中失 活(i^， ii)，特别是因启动子超甲基化而失活(iA)。超曱基化是可逆的，
是具有癌症治疗前景的策略。因此，我们已经确定在缺少内源性Wwox 的表达的肺癌细胞中恢复Wwox表达是否可以逆转恶性肿瘤，尽管存在
大量已在肺癌细胞系中积累的癌症相关基因的改变。我们已通过使用
Ad-Z^WJ的感染在4个肺癌细胞系中恢复Wwox的表达并且观察到缺少 内源性Wwox的肺癌细胞的致肿瘤性显著消失。
在三个wwox阴性细胞系中导入；war基因导致体外细胞凋亡的诱
导，如通过具有sub-G! DNA含量的细胞部分和通过培养中细胞生长的 抑制所显示的。具有sub-G:DNA含量的Ad-野UT感染的H1299细胞的 部分比其他两种^rd阴性细胞系低，这可能是因为在H1299细胞中，细胞凋亡可能在Wwox表达恢复后更晚发生；另 一种可能性是A549和 H460细胞中p53的表达因Wwox蛋白的表达而具有累加效应，尽管肿 瘤抑制效应在3个肺癌细胞系中相似。表达内源性Wwox的U2020肺癌 细胞不受Wwox的过度表达影响，这表明正常的表达Wwox的肺癌细胞 在腾UT基因治疗后不受Wwox的过度表达影响。如在数天的fT即jf的过 度表达后细胞数目的减少所显示的，在体外，在病毒感染或ponA诱导 后，~01的过度表达不利影响所有3个肺癌细胞系的生长。
我们观察到通过在3个腳Ur阴性肺癌细胞系中进行的Ad-卵WJ 转导和通过稳定转染的H1299肺癌细胞中的Wwox的表达的诱导产生的 肺癌细胞系的体内致肿瘤性的有效抑制。侵袭性H460细胞系的致肿瘤 性在注射后第28天完全被Ad-;r柳J处理抑制。在注射肿瘤罪WZ转导 的A549和H1299细胞的动物中观察到肿瘤的发生和大小显著减少。结 果表明Wwox丟失可在肺癌的发病机理中起着重要作用。有趣的是，在 H1299细胞中恢复Wwox的两种方法似乎都在体内导致比体外更显的效 应，这可能是因为体内微环境不知何故激活了 Wwox细胞凋亡途径。
本研究证明WW0X在肺癌细胞中诱导细胞生长的抑制和细胞凋 亡。在A549和H460细胞系中，我们，见察到通过内途径进4亍的细胞凋 亡的胱天蛋白酶依赖性诱导。在H1299细胞中，我们观察到全长PARP-1 的切割，但胱天蛋白酶原3、 9和8不被切割，这可能是因为细胞凋亡 在这些细胞中更晚发生。Wwox和Fhit蛋白的表达通常在与启动子超 曱基化关联的肺癌、乳腺癌和膀胱癌中减少(ii)。可通过特异性试剂 或抑制剂逆转表观遗传改变，这表明此类抑制剂可用作治疗剂 。 Wwox的ponA诱导型表达可被当作用于研究通过表观遗传学 机制沉默后驛^T再激活的效应的模型。恢复诱导型Wwox的表达后致 肺瘤性丢失的程度在体内和体外都可与Ad-歸WJ表达后观察到的肿瘤 抑制相当，这表明Wwox的大量过度表达不是影响肿瘤抑制所必需的。 该发现表明能够再激活表观遗传学上沉默的詩Z Z基因的药物在肺癌 的治疗中可以是有效的。
肺癌细胞中Wwox蛋白的表达恢复之后发生体外细胞凋亡的诱导和体内致肺瘤性的抑制，从而表明Wwox信号途径的再激活是肺癌预防
和治疗的潜在的靼。
根据专利法的条款，已通过其优选实施方案解释和说明了本发明 的操作原理和方式。然而，必须理解，可以不按特定解释和说明的方 法实施本发明而不背离其精神或范围。
参考文献
上面讨论的参考文献和下列参考文献，在它们对此处所示的参考 文献提供示例性程序或其他细节补充所至的程度上，明确地通过引用 合并入本文。
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权利要求
1.用于治疗受试者中的癌症的方法，其包括对受试者施用编码功能性wwox基因产物的多核苷酸。
2. 权利要求1的方法，其中癌症是肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌和胰月良癌。
3. 权利要求2的方法，其中癌症是肺癌。
4. 权利要求1的方法，其中受试者是人。
5. 权利要求1的方法，其中施用的方案包括基因疗法。
6. 权利要求5的方法，其中基因疗法包括重组病毒基因疗法。
7. 权利要求6的方法，其中重组病毒基因疗法包括重组腺病毒基团疗法。
8. 治疗受试者中的癌症的方法，其包括在受试者的至少一种癌细胞中诱导w讓表达。
9. 在癌细胞系中诱导细胞生长抑制的方法，其包括在细胞系中诱 导Wwox的表达。
10. 权利要求9的方法，其中癌细胞系是肺癌。
11. 一种多核苷酸，其包含编码功能性WWOX基因产物的多核苷 酸；和与编码功能性WWOX基因产物的多核苷酸有效连接的异源启动子。
12. 权利要求ll的多核苷酸，其中连接多核苷酸的两个末端，从 而形成环状多核苷酸。
13. 包含WWOX基因产物表达盒的载体，所述表达盒包含编码功 能性WWOX基因产物的多核苷酸；和与编码功能性WWOX基因产物的多核 苷酸有效连接的异源启动子。
14. 权利要求13的载体，其中载体是病毒载体。
15. 权利要求14的载体，其中病毒载体是重组腺病毒栽体。
16. 包含权利要求14的病毒载体的细胞。
17. 权利要求16的细胞，其中细胞是肺细胞。
18. 权利要求17的细胞，其中肺细胞是肺癌细胞。
19. 用于治疗受试者中的癌症的药物组合物，其包含病毒载体， 所述病毒载体包含W0X基因产物表达盒，所述表达盒包含编码功能性 WWOX基因产物的多核普酸和与编码所迷功能性WOX基因产物的多核苷 酸有效连接的异源启动子；和药学上可接受的赋形剂。
20. 权利要求19的药物组合物，其中病毒载体是重组腺病毒栽体。
21. 权利要求19的药物组合物，其中组合物经配制用于吸入。
22. —种质粒，其包含编码功能性WWOX基因产物的多核苷酸； 和与编码所述功能性WWOX基因产物的多核苷酸有效连接的异源启动子。
23. 包含权利要求22的质粒的细胞。
24. 用于治疗受试者中的癌症的方法，其包括对受试者施用能够 再激活WWOX基因的治疗性化合物。
25. 权利要求24的方法，其中受试者是人。
26. 权利要求24的方法，其中WW0X基因的再激活导致细胞凋亡 的诱导。
27. —种癌症治疗的方法，其包括在缺乏内源性Wwox表达的肺癌 细胞中恢复Wwox的表达，从而逆转恶性肺瘤。
28. 用于在肺癌细胞中谏导r柳j细胞生长抑制和细胞凋亡的方
全文摘要
本发明提供了通过对受试者施用编码功能性WWOX基因产物的多核苷酸来诊断、预后和治疗受试者中的癌症的新方法和组合物。
文档编号A61K38/43GK101312740SQ200680043612
公开日2008年11月26日 申请日期2006年10月4日 优先权日2005年10月5日
发明者C·M·克罗斯, F·特拉帕索, M·法布里 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会