专利名称：用于与蛋白质和肽缀合的四个支链的树枝状大分子peg的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有四个支链的聚乙二醇(PEG)的树枝状大分子样聚合结构，用于获得药学目的的缀合物。
背景技术：
治疗性蛋白质与聚乙二醇的缀合对于一些药理学性质的益处是众所周知的。例如，由于不同的原因，在血中的半衰期延长，其中聚合残基可以防止蛋白酶的攻击和通过免疫系统进行的药物的识别，至于天然蛋白质，缀合物的流体力学体积显著地减少了肾滤过。尽管在很多情况中，PEG化会影响蛋白质的体外生物活性，但是在血中寿命的显著延长使得其治疗作用更为有效(Harris J.M.y Chess R.B.(2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2214-21)。
PEG化也从立体上阻止了疏水性相互作用诱导的降解途径，产生了立体非特异性障碍，从而减小了与蛋白质热不稳定性有关的分子间作用力。所有这些使得PEG化的蛋白质比未修饰的分子具有了更高的物理稳定性，这是一种对于最终药物制剂的制备非常有用的性质(HarrisJ.M.y Chess R.B.(2003)Effect of pegylation onpharmaceuticals.Nat.Rev.Drug Discov.2214-21)。
常用于蛋白质缀合的试剂是在其一个末端甲基化的聚乙二醇，称作单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。甲基保护PEG链的一个末端的事实使得其仅能通过另一个末端激活，成为单官能化试剂。这对于治疗性蛋白质的缀合是非常重要的，因为一般与双官能化或多官能化试剂的缀合会导致交联，从而影响蛋白质的生物活性。mPEG分子总是具有一小部分的非甲基化聚合物，即二醇部分。由于更难以控制非常长的链的聚合过程，因此在较高分子量的mPEG中二醇部分的比例更高(Roberts M.J.，Bentley M.D.，Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide和蛋白质PEGylation.Adv.Drug Deliv.Reviews 54459-76)。
由PEG衍生的第一类分子中的一种是通过与氯化氰反应而合成的。但是该试剂的缀合试验引起了广泛的PEG化。这是治疗性蛋白质所不期望的，因为PEG化的程度较高会导致生物活性突然降低，原因在于直接阻断活性位点，或是掩盖了易接触的蛋白质表面的这些位点的拓扑变化。通常，期望的缀合物是在每个蛋白质分子上仅有一个PEG残基；该分子已知是单-PEG化的。
从80年代开始，开始使用“更软”的活性基团。尽管也可以使用其他基团，但这些基团主要是N-羟基琥珀酰亚胺酯。三种最常见的基团是琥珀酰亚胺琥珀酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)和琥珀酰亚胺碳酸酯。这时的活化PEG被称作第一代活化PEG(Roberts M.J.，Bentley M.D.，Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide andprotein PEGylation.Adv.Drug Deliv.Reviews 54459-76)。
90年代后半期出现了第二代的活化PEG。它有两个重要的进步能够更为选择性地PEG化的基团(例如优选通过蛋白质的N末端缀合的醛基)和支链结构(Roberts M.J.，Bentley M.D.，Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide and protein PEGylation.Adv.DrugDeliv.Reviews 54459-76)。支链PEG的例子是用两个支链单官能化的(US5,932,462)，用四个支链四官能化的和用八个支链八官能化的。缀合治疗性蛋白质的更有用的活化PEG是单官能化的，因为它们避免了蛋白质和聚合物之间的交联。支链PEG也具有伞样的结构，从而更好地保护蛋白质的表面。
两个支链的单官能化的PEG能够得到具有干扰素α-2a的缀合物，该缀合物比天然蛋白质在临床中显示出更好的效果(Rajender ReddyK.，Modi M.W.，Pedder S.(2002)Use of peginterferon alfa-2a(40KD)(Pegasys)for the treatment of hepatitis C.Adv.DrugDeliv.Reviews 54571-86)。
至于mPEG合成的现有技术，仅仅能获得30kDa的链，原因在于具有两个支链的试剂能够获得最大为60kDa的分子量。人们期望具有更高分子量的单官能化的PEG的结构，其可以用于探索更宽范围的缀合物，以在某些蛋白质中得到最佳的值。但是，在上述的报告中都没有使用、表征或提及单官能化和具有两个以上的PEG链的PEG化试剂。在获得具有两个以上的PEG链的试剂的情况中，可以获得更高分子量的缀合物，除了上述的优点以外，它允许使用更短的mPEG线性支链使类似分子量的PEG化试剂成为两个支链的结构。这些较小的支链含有的二醇部分量更小，这使得合成过程更容易。
发明内容
本发明解决了上述问题，提供了具有四个mPEG支链的单官能化树枝状大分子样结构。该结构能够获得具有高达120kDa的聚合残基的缀合物。这个事实可以用于探索具有广泛不同的分子量的缀合物，包括具有高分子量的缀合物。此外，使用这个方法，可以获得分子量与其他支链化的单官能化试剂类似的PEG分子，但是它具有较低分子量的线性链。
在本发明一个优选的实施方案中，获得了一种聚合结构，其中PEG链的分子量为5,000到30,000Da，总分子量为20,000到120,000Da。
使用小的线性链几乎消除了在较大的线性PEG分子中的二醇污染。出人意料地，与类似分子量但是用仅有两个支链的结构制备的缀合物相比，具有本发明所述结构的缀合物具有高得多的物理-化学稳定性(耐高温和蛋白酶降解)。同时出人意料的是，它们在血中具有更高的平均寿命。另一个出人意料的结果是具有本发明树枝状大分子样结构的缀合物更为同质，与具有类似分子量但仅有两个支链的缀合物所获得的结果相比，具有更少的位置异构体。
树枝状大分子样四个支链的单官能化的PEG是在两个主要步骤中获得的。第一个步骤是通过两个线性PEG分子与核结合来合成两支链-衍生物，其中该核可以是例如赖氨酸。其他作者已经使用类似方法获得了良好的结果(US 5,932,462)。第二个步骤是与前一步骤类似，将两分子的两支链-衍生物与核结合，获得四支链-衍生物。为了在第一步骤中将两个线性PEG支链与核结合，它们需要具有活性基团。该基团可以选自现有技术水平已知的基团。例如，其中包括琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、对硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、琥珀酰亚胺丁酸酯。在本发明中优选的线性活化PEG是琥珀酰亚胺碳酸酯。这主要是由于下列主要的不同原因该试剂和具有游离氨基的核之间具有良好的反应性，制备官能化PEG的方法简便。合成方法(Miron T.，Wilchek M.(1993)A Simplified Method for thePreparation of琥珀酰亚胺碳酸酯Polyethylene Glycol forCoupling to Proteins.Bioconjugate Chem.4568-69)是本领域技术人员公知的
当准备好线性的活化PEG时，通过与选作核的分子进行反应可以容易地完成第一个步骤。在本发明一个优选的实施方案中，由于其生物适合性，核是L-赖氨酸，它具有两个游离的氨基和一个羧基，它们可以在随后用于被激活。
通过色谱法可以从反应混合物中容易地纯化两支链-衍生物。用核分子激活该两支链-衍生物以用于后续的反应并合成四支链-衍生物。可以以不同方法激活该产品，但是根据效力和简便性优选的一种方法是形成N-羟基琥珀酰亚胺酯。
该方法已经成功地用于激活具有包含PEG链的结构的羧基，使其成为N-羟基琥珀酰亚胺酯(US 4,732,863，US 5,932,462)。
制备四支链-衍生物的第二个阶段包括两支链-衍生物与核分子的反应，其与本发明的第一个阶段类似；本发明的一个优选实施方案是使用L-赖氨酸作为核。
通过色谱法可以容易地从反应混合物中纯化感兴趣的衍生物。
使用不同的反应性基团与蛋白质缀合可以激活树枝状大分子样PEG分子。用于激活其他PEG结构的任意官能团同样可用于本专利所述的树枝状大分子样PEG。这些基团的一些例子是N-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、不同类型的醛、马来酰亚胺等等。可以使其结构与蛋白质结合的其它类型的基团是螯合基次氮基三乙酸酯(NTA)，其可以通过过渡金属与肽骨架中存在的组氨酸残基缀合。反应性基团的选择将取决于欲与PEG分子结合的蛋白质残基。
例如，如果优选与游离的氨基结合，那么树枝状大分子样聚合物可以激活成N-羟基琥珀酰亚胺酯。这样，根据与阶段1中激活两支链-结构所述相同的方法，本发明的一个实施方案是获得N-羟基琥珀酰亚胺酯。
蛋白质与激活的PEG的缀合发生在适当的缓冲溶液中。除了其他因素，缓冲溶液的性质取决于聚合物的官能团和缀合的目的。例如，如果需要通过游离氨基与官能化的PEG缀合而成N-羟基琥珀酰亚胺酯，那么用预定的pH将可以在一定程度上预测缀合位点。pH值约为9对于通过赖氨酸的ε-氨基进行缀合是有利的。
另一个例子是，当与醛基官能团缀合时，稍酸性的pH将允许PEG化优选发生在蛋白质的N-末端上。然后可以通过不同的色谱技术进行感兴趣的缀合物的纯化。
在本发明的一个实施方案中，所述的缀合物是，其中的亲核基团包含在选自蛋白质、肽和多肽的生物分子中。
必须分析缀合物的某些化学、物理和生物学性质，尽可能地完成对纯化的缀合物的特征描述。例如，通常可以通过紫外线光谱法(在280nm处的吸光度)来确定缀合物的浓度，这是因为PEG残基几乎不会影响蛋白质的消光系数。必须通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)确定纯化产品的纯度，这是因为色谱法例如凝胶过滤很难分辨感兴趣的缀合物和污染物所对应的信号。通过常用方法可以研究其他的物理-化学性质。
该操作的结果是，本发明的一个优选的成果是描述了缀合物的制备，其中蛋白质选自干扰素α-2b、链激酶、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素或表皮生长因子。
附图1.保护免受蛋白酶的降解。X-轴表示时间，单位为小时；Y-轴是未降解的蛋白质的量，单位是对时间为0时的量的百分比。
附图2.耐热性。X-轴表示时间，单位为天；Y-轴是未降解的蛋白质的量，单位是对时间为0时的量的百分比。
具体实施方式
/实施例 实施例1.激活为N-羟基琥珀酰亚胺酯的PEG的合成 结构的获得和激活 获得单甲氧基聚乙二醇的琥珀酰亚胺碳酸酯(SC-PEG) 将分子量为12,000Da(mPEG12K)的15g单甲氧基聚乙二醇溶解于500mL甲苯中，并共沸干燥3小时。然后将体积减小至250mL，反应混合物冷却至室温。向该溶液中加入下列试剂60mL的干燥二氯甲烷，溶解于15mL干燥丙酮中的2g二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)，和溶解于甲苯DCM为3:1混合物10mL中的1g二甲氨基吡啶。反应在搅拌下过夜(16小时)。用1L的冷乙醚沉淀反应混合物，过滤收集沉淀。将产物溶解于丙酮中，并用乙醚沉淀，如此重结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贮存于-20℃的氮气下。该方法的最终收率在90％以上。通过与甘氨酰(glycil)-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过与TNBS反应来定量游离的氨基。
获得二PEG化的赖氨酸(Lys-2PEG) 将12g的SC-PEG12K与溶解于100mM硼酸盐缓冲液的pH8.5的浓度为0.2mg/mL的46mg L-(+)-赖氨酸反应。反应在室温下搅拌过夜(16小时)。然后用重蒸馏水将反应混合物稀释5倍，并用盐酸调节pH。用1体积的DCM将PEG萃取3次。用无水硫酸钠干燥合并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩PEG的DCM溶液直至20mL。用120mL的冷乙醚沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。用DEAE琼脂糖通过离子交换色谱从反应混合物的剩余组分中分离Lys-2PEG。
用3体积的100mM硼酸盐缓冲液，pH7.5使包含1L色谱基质的柱达到平衡，然后用5体积的重蒸馏水洗涤。将10g的反应混合物以5mg/mL溶解于重蒸馏水中。用2体积的重蒸馏水洗涤该柱，清除未反应的PEG，用1mM的氯化钠溶液洗脱Lys-2PEG。用盐酸将该部分的pH调节至3并用1体积的DCM萃取3次。用无水硫酸钠干燥合并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩PEG的DCM溶液直至10mL。用60mL的冷乙醚沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。通过SDS-PAGE确定纯度，用5％的氯化钡溶液和100mM碘给凝胶染色。通过MALDI-TOF确定的分子量是23.0-24.5kDa。该方法的总收率在40％以上。
激活二PEG化的赖氨酸成为N-羟基琥珀酰亚胺酯(PEG2，12K-NHS) 将6g的Lys-2PEG溶解于20mL的干燥DCM中，并加入60mg的N-羟基琥珀酰亚胺和250mg的N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)。将反应在室温和搅拌下保持24小时。过滤混合物，并通过旋转蒸发浓缩至5mL。用20mL的冷乙醚沉淀产物，将其溶解于丙酮并用乙醚沉淀，如此重结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贮存于-20℃的氮气下。该方法的总收率在95％以上。通过与甘氨酰-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过与TNBS反应来定量游离氨基的个数。
获得树枝状大分子样四支链-PEG 将5g的PEG2，12K-NHS与溶解于100mM硼酸盐缓冲液的pH8.5的浓度0.1mg/mL的7mg L-(+)-赖氨酸反应。反应在室温下搅拌16小时进行。然后用重蒸馏水将反应混合物5倍稀释，并用盐酸调节pH至3。用1体积的DCM将PEG萃取3次。用无水硫酸钠干燥合并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩PEG的DCM溶液直至5mL。用30mL的冷乙醚沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。在G3000PW柱中通过大小排阻层析法纯化树枝状大分子样四支链-PEG。用盐酸将包含所需结构的部分的pH调节至3，用1体积的DCM萃取3次。用无水硫酸钠干燥合并的3次萃取部分并过滤。在旋转式蒸发器中浓缩PEG的DCM溶液直至5mL。用30mL的冷乙醚沉淀该浓缩物，过滤收集并高真空下干燥。通过SDS-PAGE确定纯度，用5％的氯化钡溶液和100mM碘给凝胶染色，纯度在98％以上。通过MALDI-TOF确定的分子量是45.5-50kDa。该方法的总收率在30％以上。
树枝状大分子样四支链-PEG官能化为N-羟基琥珀酰亚胺酯(PEG4，12K-NHS) 将1.5g的树枝状大分子样四支链-PEG溶解于5mL的干燥DCM中，并加入9mg的N-羟基琥珀酰亚胺和37mg的N，N’-二环己基碳二亚胺。将反应在室温和搅拌下保持24小时。过滤产物，并用20mL的冷乙醚沉淀。将其溶解于丙酮并用乙醚沉淀，如此将沉淀重结晶3次。高真空下干燥最终产物，并贮存于-20℃的氮气下。该方法的总收率在95％以上。通过与甘氨酰-甘氨酸反应来确定激活的PEG的份数，通过与TNBS反应来定量游离的氨基个数。
实施例2.用PEG4，12K-NHS获得IFN-α2b缀合物 缀合反应 将活化成N-羟基琥珀酰亚胺酯(PEG4，12K-NHS)的4g树枝状大分子样四支链-PEG加入到溶液中，该溶液是包含浓度为6mg/mL的1gIFN-α2b的120mM硼酸盐缓冲液，且pH 8.5的溶液。温和搅拌下将反应在4℃下保持1小时，然后用pH 4的10mM乙酸钠缓冲溶液稀释50倍来停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收率，用考马斯亮蓝R-250染色。含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化IFN-α2b的份数在40％以上。
纯化含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化IFN-α2b 用3体积的pH 4的10mM乙酸盐缓冲液，以40mL/分钟的流速使包含500mL的触须型树脂填料Fractogel EMD 650(M)COO-的XK50/60柱(Pharmacia公司)达到平衡。以相同流速将包含反应混合物的溶液应用于该柱。用pH4的40mM乙酸盐缓冲液、和25mM的氯化钠进行2小时的洗涤，以清除未反应的PEG和具有一个以上的PEG残基的缀合物。用pH4的50mM乙酸钠缓冲液、和150mM的氯化钠洗脱单PEG化的缀合物。纯度在96％以上，主要的污染物是未变性的干扰素和二PEG化的缀合物。浓缩感兴趣的部分直至200mL，并应用于XK 50/60柱(Pharmacia)上，该柱包含用pH7的50mM磷酸盐缓冲溶液，及用100mM氯化钠平衡的1L的Sephadex G-25。通过0.2μm孔径的乙酸纤维素膜过滤含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化的干扰素，并在4℃下贮存。
实施例3.PEG4，12K-IFN-α2b的物理-化学性质 确定缀合物的浓度 通过在280nm的UV-吸光度确定作为蛋白质残基的函数的缀合物浓度。认为一个吸光度单位等于1mg/mL的浓度。
确定缀合物的分子量 通过MALDI-TOF确定缀合物的分子量。期望的树枝状大分子样四支链-PEG的平均分子量是48,000 Da，IFN-α2b的平均分子量是19,200Da，因此该缀合物的理论分子量是67,200Da。PEG4，12K-IFN-α2b的计算分子量是64,000-70,000Da。
实施例4.PEG4，12K-IFN-α2b缀合物的生物学性质 在ELI SA-型分析中缀合物的免疫鉴定 将不同浓度的缀合物样品和阴性对照物应用于ELISA微量滴定板上，该滴定板上补充有对抗IFN-α2b的单克隆抗体。接着，加入另一种单克隆抗体，其中该抗体识别IFN-α2b的另一个表位，与辣根过氧化物酶结合。我们认为，当缀合物样品的吸光度高于阴性样品的吸光度的平均值加上这些值的标准差的3倍时，该样品就是免疫识别的。在所有情况中，这些样品都被识别。
体外抗病毒活性 通过抑制脑心肌炎病毒对Hep-2细胞(ATCC No.CCL23)产生的细胞病变效应来确定体外抗病毒活性。在96-孔微量滴定板的细胞单层中混合缀合物的最小必需培养基的系列稀释液(1:2)，其中该培养基含有2％胎牛血清和40μg/mL的庆大霉素。将该板在3％二氧化碳大气、95％相对湿度和37℃下培养24小时。加入病毒(107TCID)，培养该板，直至细胞病变效应变得明显(90％细胞溶解)。通过用结晶紫将细胞染色来测定细胞破坏的程度。用国际单位(IU)表示每种样品的活性，用世界卫生组织的IFN-α2b国际标准69/19计算，表1是所得到的结果。
表1.天然IFN-α2b和与树枝状大分子样四支链-PEG缀合的IFN-α2b的体外抗病毒活性
体外抗增殖活性 通过缀合的IFN-α2b抑制Daudi细胞(Burkitt Lymphoma)生长的能力来测定体外抗增殖活性。结果表明，PEG4，12K-IFN-α2b的体外活性等于未变性的IFN-α2b的5％。
实施例5.PEG4，12K-IFN-α2b的物理-化学稳定性 对于蛋白酶降解的抵抗性 将包含400μg/mL天然IFN-α2b与类似分子量的两或四支链-PEG的缀合物的40微升4％碳酸氢钠溶液，pH 8与10μL的160μg/mL胰岛素溶液混合。将样品在37℃下培养一段时间。用10μL的三氟乙酸使反应停止。通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价蛋白质(缀合或未缀合)的残留量，用考马斯亮蓝染色。结果(附图1)表明，四个支链的PEG结构(▲)对IFN-α2b缀合物降解的保护优于类似分子量的两个支链-结构(●)产生的保护。
热稳定性 为了确定具有树枝状大分子样四支链-PEG的IFN-α2b缀合物的稳定性，将天然和缀合后的蛋白质样品在60℃的磷酸盐缓冲溶液中进行培养。使用类似分子量的两支链-PEG的IFN-α2b缀合物样品作为对照。在某些时间分离样品，通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价蛋白质(缀合或未缀合)的残留量，用考马斯亮蓝染色。结果(附图2)表明，具有四个支链的结构的缀合物(▲)的热稳定性高于其他两种情况[天然IFN(■)，与两个支链结构的IFN缀合物(●)]。
实施例6.PEG4，12K-IFN-α2b的药代动力学 在平均重量为2kg的新西兰兔中进行未变性干扰素和与树枝状大分子样四支链-PEG的蛋白质缀合物之间的比较药代动力学研究。使用两支链-PEG的IFN-α2b缀合物作为对照。通过每kg体重150μg蛋白质的皮下途径来注射生物分子。在144小时的间隔里，在预定时间取血样。离心样品，分离血清，并在-20℃下贮存至分析。用对该细胞因子具有特异性的单克隆抗体通过ELISA-型分析来确定IFN-α2b浓度(缀合或未缀合)。判读是基于经典的房室乳突模型。结果如表2所示。
表2.天然IFN-α2b、与两支链-PEG缀合的IFN-α2b和PEG4，12K-IFN-α2b的比较药代动力学 实施例7.其他治疗性蛋白质与树枝状大分子样四支链-PEG的缀合 其他治疗性蛋白质例如重组链激酶(r-SK)、红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和表皮生长因子(EGF)可以与树枝状大分子样四支链-PEG缀合。评价缀合对蛋白酶降解率的效应。
激活为N-羟基琥珀酰亚胺酯的树枝状大分子样四支链-PEG的缀合 将100mg的激活为N-羟基琥珀酰亚胺酯的树枝状大分子样四支链-PEG(PEG4，12K-NHS)加入到溶液中，该溶液是包含6mg/mL的25mg治疗性蛋白质的120mM硼酸盐缓冲溶液、pH 8.5的溶液。温和搅拌下将反应在4℃下保持1小时，然后用10mM乙酸钠缓冲溶液，pH4稀释50倍来停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收率，用考马斯亮蓝R-250将样品染色。在所有情况中，含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化的蛋白质的比例都在30％以上。
用激活为醛的树枝状大分子样PEG进行缀合 将100mg的激活为醛的树枝状大分子样四支链-PEG(PEG4，12K-ALD)加入到溶液中，该溶液是包含4mg/mL的15mg治疗性蛋白质的100mM乙酸盐缓冲溶液、pH 5并包含20mM氰基硼氢化钠的溶液。温和搅拌下将反应在4℃下持续24小时，然后用1mM HCl稀释20倍来停止反应。通过SDS-PAGE的光密度测定来确定反应的收率，用考马斯亮蓝R-250将样品染色。在所有情况中，含有树枝状大分子样四支链-PEG的单PEG化的蛋白质的比例都在30％以上。
树枝状大分子样四支链-PEG的缀合对于蛋白酶降解蛋白质的效应 将包含400μg/mL天然蛋白质、或与四支链-PEG的缀合物的40微升4％碳酸氢钠溶液，pH 8与10μL的160μg/mL胰岛素溶液混合。将样品在37℃和温和搅拌下培养4小时。然后用10μL的三氟乙酸使反应停止。通过SDS-PAGE分析中谱带的消失来评价蛋白质(缀合或未缀合)的残留量，用考马斯亮蓝染色。结果(表3)表明，与树枝状大分子样四支链-PEG的缀合保护了缀合的蛋白质免受胰岛素的降解。在所有情况中，不依赖于所使用的化学缀合方法，在与胰岛素反应4小时后，超过35％的蛋白质都没有消化。但是，天然蛋白质在该反应时间后，没有检测到任何信号。
表3相对于反应前的蛋白质量，未消化的蛋白质的份数(％)
权利要求
1.聚合树枝状大分子样结构，包括四个支链的单甲氧基-聚乙二醇，其可以表示为
用于获得药学目的的缀合物。
2.权利要求1的聚合结构，其中每个PEG链的分子量是5,000-30,000Da，总分子量是20,000-120,000Da。
3.权利要求2的聚合结构，活化用于与亲核基团缀合，通过羧基官能化获得。
4.一种缀合物，包含权利要求1的聚合结构和亲核基团。
5.权利要求4的缀合物，其中亲核基团包含在选自蛋白质、肽和多肽的生物分子中。
6.权利要求5的缀合物，其中蛋白质选自干扰素α 2-b、链激酶、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素或表皮生长因子。
全文摘要
本发明涉及具有四个支链的单甲氧基-聚乙二醇的聚合树枝状大分子样结构，其可以表示为右式，可以将前述结构的羧基官能化，以产生药学目的的缀合物，该树枝状大分子样聚乙二醇与治疗性蛋白质的结合改善了它们的体外和体内稳定性。
文档编号A61K47/48GK101389354SQ200680049165
公开日2009年3月18日 申请日期2006年11月20日 优先权日2005年11月30日
发明者J·A·拉蒙赫尔南德兹, F·R·卡斯特罗奥迪澳, V·M·赛兹玛提内兹, R·派斯梅雷莱斯, E·菲尔南德兹萨恩彻兹 申请人:遗传工程与生物技术中心