以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法

专利名称：以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法
技术领域：
本发明涉及的一种生物工程技术领域的细胞增殖方法，特别的是一种以 GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法。
背景技术：
造血干细胞移植已经成为逐渐增多的白血病、恶性肿瘤和某些遗传性疾病 患者的临床治疗选择。造血干细胞来源于骨髓、脐带血及动员后的外周血，但由 于其来源及可获得的细胞数量有限，限制了临床应用，所以造血干祖细胞的体外 扩增是一个研究热点。
Notch (Notch为一条被广泛应用的，进化高度保守的细胞分化调节信号通 路)通路在许多发育系统中对细胞的命运决定起着重要的调节作用，对造血系统 的发生和发育也具有重要的调控作用，被认为是解决干细胞扩增的最有前途的研 究方向之一。Notch通路(Notch通路由Notch受体、Notch配体和细胞内效应 分子组成，hDelta-like-1简写为hDll-l，是人Notch配体之一)与其他因子协 同作用可促进造血干/祖细胞体外扩增。hDSL是由hDll-l配体蛋白中的99个 氨基酸组成的多肽，是目前国际上Notch配体中结构最简单、分子量最小、又具 有生物活性的Notch配体。
经对现有技术的文献检索发现，Han W等在《Blood》(《血液》，2000年95 巻1616-1625页)发表了题为"A soluble form of human Delta-like-1 inhibits differentiation of hematopoietic progenitor cells ，，("可溶性人 Delta-like-l蛋白对人造血祖细胞分化的抑制")的论文，提出纯化的GST-hDSL 融合蛋白(GST为谷胱甘肽-S-转移酶)与细胞因子粒-巨噬细胞集落刺激因子、 IL-1 (白介素l)、 IL-3 (白介素3)的联合作用可以促进小鼠造血干、祖细胞的 扩增，但并没有用于人造血干、祖细胞的扩增。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种以GST-hDSL重组蛋白 增殖人造血干细胞及祖细胞的方法，使其实现对人造血干、祖细胞的有效扩增。 本发明是通过如下技术方案实现的，具体步骤包括
(1)从髓、外周血或脐带血中取样，用密度梯度离心分离出单核细胞，然 后用CD34分离试剂盒对CD34细胞进行标记，采用免疫磁珠技术(属现有技术) 对CD34细胞进行纯化，得到CD34+细胞；
(2)采用含10%-20%胎牛或人血清的细胞培养基对上述CD34+细胞进行培 养，加入细胞因子(包括粒-巨噬细胞集落剌激因子和干细胞生长因子)和浓度 为5ug/ml-50ug/ml的GST-hDSL重组蛋白，培养1周，换入含10%-20%胎牛或人 血清的新鲜细胞培养基，并重新加入细胞因子(包括粒-巨噬细胞集落刺激因子 和干细胞生长因子)和5ug/ral-50ug/ml的GST-hDSL重组蛋白再继续培养培养扩 增1周，得到增殖了的造血干细胞、祖细胞。
所述的细胞因子，包括5ng/ml-15ng/ml的粒-巨噬细胞集落剌激因子和 10ng/ml-30ng/ml干细胞生长因子。
本发明所采用GST-hDSL重组蛋白是Notch通路的配体之一，通过GST-hDSL 重组蛋白与位于CD34+造血干、祖细胞上的Notch受体结合而激活Notch通路， 激活的Notch通路有维持造血干、祖自我更新促进其生长的作用，从而达到增殖 造血干、祖细胞的目的。通过从CD34+细胞或是从总集落数(CFC)及高增殖潜能 集落数(HPP-CFC)的检测对照，本发明可有效促进人造血干、祖细胞的增殖， 其增殖效果为现有技术的1. 2至5. 3倍。本发明将在生物医药领域得到广泛的应 用。


图1为实施例1中CD34+造血干/祖细胞扩增情况对比示意图。 图2为实施例1中GST-hDSL重组蛋白对集落形成(CFC)的影响对比示意图。 图3为实施例1中GST-hDSL重组蛋白对高增殖潜能集落(HPP-CFC)形成的 影响对比示意图。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案
为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于 下述的实施例。 实施例1
本实施例1是在以下实施条件和技术要求条件下实施的
(1) 脐血单核细胞的制备和CD34+造血干、祖细胞的分离纯化 常规无菌条件下取正常足月顺产胎儿脐带血约100ml，与磷酸缓冲液以1:
2的体积比混匀稀释，取10支50ml的无菌离心管，每支加入15ml的淋巴细胞 分离液(密度为1.077±0.002g/ml)，再沿管壁缓缓加入已稀释的脐血，形成清 晰层面，将离心管于2300rpm离心30min，离心后小心用吸管吸取离心管中间白 色雾状细胞层到另一50mL无菌离心管中，加入20ml磷酸缓冲液混匀后2000 rpm 离心10 min，弃去上清液，再用磷酸缓冲液将沉淀的细胞悬浮后合并为一管， 制得脐血单个核细胞悬液；将上述脐血单个核细胞悬液于1800rpm离心10min， 弃去上清液，按300ul/l(f细胞的量向离心管中加入含10%胎牛血清及2X10—3 mol/L EDTA的磷酸缓冲液悬浮细胞，并按100111/108细胞的量分别加入FcR阻断 剂及CD34抗体磁珠，4'C孵育30min后按照德国美天旎公司提供的MS Columns 分离系统说明书纯化CD34+细胞，悬浮于含10%胎牛血清的函EM/F-12培养基(一 种细胞培养基，SIGMA公司产品或DMEM IMDM)中，制成7X 10"个细胞/ml的CD34+ 细胞悬液，用流式细胞仪检测CD34+细胞比例为96%。
(2) 、造血干、祖细胞的培养扩增
用吸管吸取上述制备的CD34+细胞悬液，分别加入到24孔细胞培养板的6 个复孔中，每孔加lml，在这6个孔中分别加入10ng/ml的干细胞生长因子和 5ng/ml的粒-巨噬细胞集落刺激因子，再在其中三个孔中加入5ug/ml的GST-hDSL 重组蛋白以证明其作用，在第7天时将细胞吸出，离心(1800rpm， 10min)后去 除上清按分组补入相应的细胞因子、蛋白及新鲜培养基，再继续培养扩增7天， 经流式检测和集落培养检测GST-hDSL重组蛋白组的CD34+细胞扩增倍数，总集落 数以及代表更原始的造血祖细胞的高增殖潜能集落数分别是对照组的1.9、 1.2、 5.3倍，如图l，图2，图3所示。CD34+造血干、祖细胞在对照组添加干细胞 生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子和GST-hDSL重组蛋白组添加干细胞生长
因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、GST-hDSL重组蛋白的条件下培养扩增14天， 流式检测并计算得到CD34+细胞扩增倍数并将培养后的细胞转入集落培养系统检 测总集落数和高增殖潜能集落数数量。人脐血CD34+细胞在上述的不同条件下培 养扩增14天，培养后的细胞通过流式分析检测CD34+细胞的比例，乘以液体培养 细胞总数后再除以CD34+细胞初始细胞数即得CD34+细胞扩增倍数。
如图2和图3所示，GST-hDSL重组蛋白对集落形成的影响对比干细胞生 长因子和粒-巨噬细胞集落刺激因子，GST-hDSL重组蛋白组干细胞生长因子、 粒-巨噬细胞集落刺激因子和GST-hDSL重组蛋白；人脐血CD34+细胞在上述的不 同条件下培养扩增14天，培养后的细胞再转入集落培养系统检测CFC (图2)和 HPP-CFC (图3)数量。CFC:细胞数大于40的集落；HPP-CFC:直径大于lmm的 集落。
实施例2
本实施例2是在以下实施条件和技术要求条件下实施的
(1) 骨髓单核细胞的制备和CD34+造血干、祖细胞的分离纯化 常规无菌条件下取骨髓液约100ml，与磷酸缓冲液以1: 2的体积比混匀稀
释，取10支50ml的无菌离心管，每支加入15ml的淋巴细胞分离液(密度为 1.077±0.002g/ml)，再沿管壁缓缓加入己稀释的脐血，形成清晰层面，将离心 管于2300rpm离心30mim离心后小心用吸管吸取离心管中间白色雾状细胞层到 另一 50mL无菌离心管中，加入20 ml磷酸缓冲液混匀后2000 rpm离心10 min, 弃去上清液，再用磷酸缓冲液将沉淀的细胞悬浮后合并为一管，制得脐血单个核 细胞悬液；将上述脐血单个核细胞悬液于1800rpm离心10min，弃去上清液，按 300u 1/108细胞的量向离心管中加入含15%人血清及2X10—3mol/L EDTA的磷酸 缓冲液悬浮细胞，并按100111/108细胞的量分别加入FcR阻断剂及CD34抗体磁 珠，4t:孵育30min后按照德国美天旎公司提供的MS Columns分离系统说明书纯 化CD34+细胞，悬浮于含15%人血清的DMEM/F-12培养基(一种细胞培养基，SIGMA 公司产品或面EM IMDM)中，制成7X 104个细胞/1111的CD34+细胞悬液，用流式细 胞仪检测CD34+细胞比例为96%。
(2) 、造血干、祖细胞的培养扩增
用吸管吸取上述制备的CD34+细胞悬液，分别加入到24孔细胞培养板的6 个复孔中，每孔加lml，在这6个孔中分别加入20ng/ral的干细胞生长因子和 10ng/ml的粒-巨噬细胞集落刺激因子，再在其中三个孔中加入20ug/ml的 GST-hDSL重组蛋白以证明其作用，在第7天时将细胞吸出，离心(1800rpm， 10min) 后去除上清按分组补入相应的细胞因子、蛋白及新鲜培养基，再继续培养扩增7 天，经流式检测和集落培养检测GST-hDSL重组蛋白组的CD34+细胞扩增倍数，总
集落数以及代表更原始的造血祖细胞的高增殖潜能集落数分别是对照组的1. 9、 1.2、 5. 3倍。 实施例3
本实施例3是在以下实施条件和技术要求条件下实施的
(1) 外周血单核细胞的制备和CD34+造血干、祖细胞的分离纯化 常规无菌条件下取骨髓液约100ml，与磷酸缓冲液以l: 2的体积比混匀稀
释，取10支50ml的无菌离心管，每支加入15ml的淋巴细胞分离液(密度为 1.077±0.002g/ml)，再沿管壁缓缓加入已稀释的脐血，形成清晰层面，将离心 管于2300rpm离心30min，离心后小心用吸管吸取离心管中间白色雾状细胞层到 另一 50mL无菌离心管中，加入20 ml磷酸缓冲液混匀后2000 rpm离心10 min， 弃去上清液，再用磷酸缓冲液将沉淀的细胞悬浮后合并为一管，制得脐血单个核 细胞悬液；将上述脐血单个核细胞悬液于1800rpm离心10min，弃去上清液，按 300u 1/108细胞的量向离心管中加入含20%人血清及2X10_3mol/L EDTA的磷酸 缓冲液悬浮细胞，并按100111/108细胞的量分别加入FcR阻断剂及CD34抗体磁 珠，4。C孵育30min后按照德国美天旎公司提供的MS Columns分离系统说明书纯 化CD34+细胞，悬浮于含20%人血清的DMEM/F-12培养基(一种细胞培养基，SIGMA 公司产品或DMEM IMDM)中，制成7X 1(^个细胞/ml的CD34+细胞悬液，用流式细 胞仪检测CD34+细胞比例为96%。
(2) 、造血干、祖细胞的培养扩增
用吸管吸取上述制备的CD34+细胞悬液，分别加入到24孔细胞培养板的6 个复孔中，每孔加lml，在这6个孔中分别加入30ng/ml的干细胞生长因子和 15ng/ml的粒-巨噬细胞集落刺激因子，再在其中三个孔中加入50ug/ml的
GST-hDSL重组蛋白以证明其作用，在第7天时将细胞吸出，离心(1800rpm， lOmin) 后去除上清按分组补入相应的细胞因子、蛋白及新鲜培养基，再继续培养扩增7 天，经流式检测和集落培养检测GST-hDSL重组蛋白组的CD34+细胞扩增倍数，总 集落数以及代表更原始的造血祖细胞的高增殖潜能集落数分别是对照组的1. 9、 1.2、 5. 3倍。
权利要求
1、一种以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法，其特征在于，具体步骤包括(1)从髓、外周血或脐带血中取样，用密度梯度离心分离出单核细胞，然后用CD34分离试剂盒对CD34细胞进行标记，采用免疫磁珠技术对CD34细胞进行纯化，得到CD34+细胞；(2)采用含10％-20％胎牛或人血清的细胞培养基对上述CD34+细胞进行培养，加入细胞因子，加入蛋白，培养1周，换入细胞培养基，并重新加入蛋白再继续培养扩增1周，得到增殖了的造血干细胞、祖细胞。
2、 如权利要求1所述的以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞 的方法，其特征是，所述的加入细胞因子，是指加入粒-巨噬细胞集落刺激因 子和干细胞生长因子两种细胞因子。
3、 如权利要求1所述的以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞 的方法，其特征是，所述的加入蛋白，是指加入浓度为5ug/ml-50ug/ml的 GST-hDSL重组蛋白。
4、 如权利要求1所述的以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞 的方法，其特征是，所述的换入细胞培养基，是指换入含10%-20%胎牛或人血 清的新鲜细胞培养基。
5、 如权利要求1所述的以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞 的方法，其特征是，所述的重新加入重组蛋白，是指重新加入粒-巨噬细胞集 落刺激因子和干细胞生长因子两种细胞因子和5ug/ml-50ug/ml的GST-hDSL重组 蛋白。
6、 如权利要求2或者5所述的以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及 祖细胞的方法，其特征是，所述的细胞因子，包括5ng/ml-15ng/ml的粒-巨噬细 胞集落剌激因子和10ng/ml-30ng/ml干细胞生长因子。
全文摘要
本发明是一种生物工程技术领域的以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法。步骤包括(1)从骨髓、外周血或脐带血中，用密度梯度离心法分离制备单个核细胞，然后对CD34细胞进行标记，而后对其进行纯化，得到CD34⁺细胞；(2)将CD34⁺细胞加入细胞培养基中进行培养，同时加入细胞因子和GST-hDSL重组蛋白，培养后，换入新鲜的细胞培养基并重新加入细胞因子和GST-hDSL重组蛋白再继续培养，得到增殖了的造血干、祖细胞。从CD34⁺细胞和从总集落数及高增殖潜能集落数来检测，本发明可有效促进人造血干、祖细胞的增殖，并将在生物医药领域得到广泛的应用。
文档编号A61K38/16GK101096654SQ20071004112
公开日2008年1月2日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者吴明媛, 姜俊芬, 林小娟, 伟 韩 申请人:上海交通大学