专利名称：：丹参总酚酸脂质体及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种中药有效部位丹参总酚酸的脂质体及其制备方法。
背景技术：
：丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根茎，是我国传统医学中最常用的药材之一，临床上广泛用于冠心病、心肌梗塞、脑血栓等心脑血管疾病和肝炎肝硬化、肿瘤等多种疾病的治疗。丹参的化学成分主要可分为脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类两大类。现代化学和药理研究表明，水溶性的酚酸类成分是丹参的主要有效部位，其中主要包括丹参酚酸A(salvianolicacidA)、B(salvianolicacidB)、C、D、E、F、G、丹参素(danshensu)、原儿茶醛(protocatechuicaldehyde)、丹参酚(salviol)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、紫草酸(lithospermicacid)等。现代药理研究证明丹参总酚酸具有多方面的药理活性如对心血管系统和脑损伤的保护作用、抗肝纤维化作用、诱导细胞凋亡、防治神经退行性疾病等多种。丹参酚酸类产品虽然在临床治疗心血管疾病和肝纤维化方面表现出了良好的效果，但其口服的胃肠吸收较差，代谢很快，有研究表明，实验大鼠口服丹参水提取物后的丹酚酸B消除半衰期仅为19.16分钟。静脉注射后丹参总酚酸后有效成分也较快被代谢消除掉，如丹酚酸B大鼠尾静脉给药后的体内消除半衰期为53分钟；注射用多酚酸盐在健康受试者的药代动力学研究表明，丹酚酸B在人体内的消除半衰期约为1小时，表观分布容积为0.5L/kg，用药后4h药效渐渐消失，静脉滴注后7h，体内药物存留不到1％。所以，在进行心脑血管疾病治疗时，由于包括丹酚酸B在内的主要有效成份在体内被很快代谢消除，难以在较长时间内维持有效的血药浓度，从而影响药物的治疗效果。而心脑血管疾病一般为慢性疾病，需要长期治疗，因此，有必要进行高效、长效丹参总酚酸新型制剂的研究，以延长有效成分在血液中的滞留时间，提高血液中的药物浓度，提高治疗效果，降低药物用量。脂质体(Liposomes)以其独特的优势，近40年来一直是医药领域的研究热点。作为药物载体，脂质体具有诸多的优点如既可以包封脂溶性药物，也能包封水溶性药物，可使药物对淋巴及网状内皮系统有良好的靶向性、延长药物体内滞留时间和疗效、提高药物稳定性、降低药物毒性、避免耐药性等。是一种具有良好发展前途和应用前景的新型给药系统，。
发明内容本发明的目的是提供一种丹参总酚酸脂质体制剂。本发明的丹参总酚酸脂质体制剂既能显著提高贮存的稳定性，又能使脂质体中的药物持续释放，延长药物在血循环中的滞留时间，提高药物的生物利用度，达到高效、长效的目的。本发明采用中药有效部位丹参总酚酸为原料药，与磷脂、胆固醇及pH调节剂等附加剂制备成脂质体。本发明所述的丹参总酚酸是指以中药丹参为原料，经过提取纯化得到的水溶性提取物，其中采用紫外分光光度法测定的、以丹酚酸B计的丹参总酚酸的含量为50％～100％，采用高效液相色谱法测定的丹酚酸B的含量为不低于40％。本发明所述脂质体的处方中，丹参总酚酸与磷脂的质量比为1∶1～1∶100，磷脂与胆固醇的质量比为1∶1～10∶1。所述的磷脂，选自卵磷脂，包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂；或氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、双肉豆蔻磷脂酰胆碱、双肉豆蔻磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油或二硬脂酰磷脂酰胆碱。优选大豆卵磷脂。所述脂质体的制备方法可以采用溶剂注入法、薄膜分散法、逆相蒸发法、主动包封法(包括pH梯度法、硫酸铵梯度法等)、冷冻干燥法、复乳法、去污剂分散法、机械法(包括使用均质机、乳匀机、高压乳匀机、挤出仪、纳米机、匀浆机、高压微射流等各种机械设备制备脂质体的方法)。其中逆相蒸发法中的成乳步骤可采用探头超声、高压乳匀、搅拌滴加。制得的脂质体粒径为50～1000nm。本发明所述的丹参总酚酸脂质体通过下述方法制备，按重量比称取磷脂、胆固醇溶于氯仿和/或甲醇溶剂中，加入丹参总酚酸的缓冲溶液，采用探头超声、高压乳匀或搅拌方法形成乳剂，除去有机溶剂，即得本发明的丹参总酚酸脂质体。上述脂质体制备过程中采用的缓冲液pH为3.00～5.00。缓冲液可以为甘氨酸-盐酸缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液。为提高本发明脂质体的稳定性及制剂的适应性，可在脂质体中加入支持剂进行冷冻干燥。冻干支持剂可选用蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、果糖或甘露糖，或上述任意两种或两种以上混合使用。冻干支持剂的用量为1％～30％。上述脂质体可以制成注射液。脂质体的冻干品可制成冻干粉针剂、胶囊剂、片剂、喷雾剂等。本发明丹参总酚酸脂质体可减缓药物释放、延长药物在体循环中的滞留时间并显著提高药物的生物利用度。体外释放试验结果表明，游离药物2h的累积释放百分率接近100％；空白脂质体与丹参总酚酸的物理混合物24h的累积释放百分率大于90.0％；丹参总酚酸脂质体中的药物在前2h释放较快，随后开始缓慢释放，24h累计释放百分率为46.8％；加入空白人体血浆后，24h累计释放百分率为64.1％。丹参总酚酸脂质体的释放曲线用Weibull方程进行拟合，拟合方程为ln((47.22-Q)/63.45)＝-0.9757t0.6119，r＝0.9978。加血浆后丹参总酚酸脂质体释药的拟合方程为ln((64.28-Q)/58.90)＝-0.3314t0.8983，r＝0.9990。脂质体可显著减慢药物的体外释放。大鼠药物动力学实验结果采用3p87药动学程序进行药动学参数计算，以二室模型、权重为1/C2进行房室模型拟合。其中，AUC0～T，AUC0～∞计算采用梯形法。药动学参数计算结果显示，脂质体的t1/2α和t1/2β较溶液剂均显著延长(P＜0.01)，脂质体的t1/2β为溶液剂的5.7倍，表明脂质体可以显著延长丹参酚酸B的体内循环时间。脂质体的AUC0～T和AUC0～∞较溶液剂也有显著增大(P＜0.01)，分别为溶液剂的6.7、6.8倍，表明脂质体可以显著提高丹参酚酸在大鼠体内的生物利用度。表1是大鼠药动学试验结果。表1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="610">Parametersunitsolutionliposomet1/2αt1/2βK21K10K12AUC(0～T)AUC(0～∞)hhh-1h-1h-1μg.ml-1.hμg.ml-1.h0.04±0.010.71±0.664.36±3.309.46±2.106.22±3.8810.39±4.1611.21±4.100.47±0.134.10±0.780.28±0.041.01±0.3710.55±0.3569.57±19.1575.80±19.92</table></tables>另取Beagle犬6只，按三周期交叉试验设计，分别给予丹参总酚酸溶液和丹参总酚酸脂质体，分别于给药前及给药后不同时间眼眶取血约0.5ml，经预处理后HPLC法测定丹酚酸B的含量，并进行药动学参数的计算，Beagle犬的药动学试验结果表明，相对溶液剂，脂质体的t1/2α和t1/2β都显著延长(P＜0.01)，脂质体的消除半衰期t1/2β为溶液组的4.9倍，表明脂质体可以显著延长丹酚酸B在体内的循环时间。脂质体的AUC也显著增大(P＜0.01)，脂质体的AUC0～T和AUC0～∞分别为溶液组的5.7和13.6倍，表明脂质体可以显著提高丹参总酚酸的生物利用度。表2是Beagle犬分别给予丹参总酚酸不同制剂后的药动学参数。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="577">Parametersunitsolutionliposomet1/2αt1/2βK21K10K12AUC0～TAUC0～∞hhh-1h-1h-1μg.ml-1.hμg.ml-1.h0.031±0.0040.87±0.332.46±0.978.55±2.8612.73±2.165.91±0.727.28±1.260.09±0.074.25±1.171.77±0.741.09±0.328.59±3.8733.56±9.0150.67±11.53</table></tables>图1是采用本发明制备的丹参总酚酸脂质体的电镜照片。图2采用透析法测定丹参总酚酸脂质体的体外释放曲线，其中，游离总酚酸，丹参总酚酸脂质体，丹参总酚酸脂质体加空白人体血浆，空白脂质体加丹参总酚酸。图3是丹参总酚酸脂质体的大鼠体内药时曲线。其中，丹参总酚酸溶液，丹参总酚酸脂质体。图4是丹参总酚酸脂质体的Beagle犬体内药时曲线，其中，丹参总酚酸溶液，丹参总酚酸脂质体。具体实施例方式通过下列实施例进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围，不局限于此。实施例1探头超声制备丹参总酚酸脂质体丹参总酚酸100mg大豆磷脂(PC含量＞95％)500mg胆固醇250mg生理盐水5mL三氯甲烷15mL1％甘氨酸-HCl缓冲溶液(PH＝3.50)5mL分别称取上述处方量的大豆磷脂和胆固醇加入三氯甲烷，室温溶解。称取处方量的丹参总酚酸加入生理盐水，待溶解后，将以上两种液体混合，探头超声(400W，1.5min)形成初乳，置于茄形瓶中，室温下减压旋转蒸发至形成胶态，另取甘氨酸-HCl缓冲溶液加入茄形瓶，继续减压蒸发1小时，形成均匀乳剂，过0.8μm的微孔滤膜，即得脂质体。丹参总酚酸包封率为75.1％，粒径为240.2±37.5nm。实施例2探头超声制备丹参总酚酸脂质体丹参总酚酸25mg大豆磷脂(PC含量＞95％)250mg胆固醇25mg生理盐水5mL三氯甲烷15mL0.1％甘氨酸-HCl缓冲溶液(PH＝5.00)5mL分别称取上述处方量的大豆磷脂和胆固醇加入三氯甲烷，室温溶解。称取处方量的丹参总酚酸加入生理盐水，待溶解后，将以上两种液体混合，探头超声(400W，1min)形成初乳，置于茄形瓶中，室温下减压旋转蒸发至形成胶态。另取甘氨酸-HCl缓冲溶液加入茄形瓶，继续减压蒸发1小时，形成均匀乳剂，过0.8μm的微孔滤膜，即得脂质体。丹参总酚酸包封率为46.8％，粒径为220.6±37.5nm。实施例3探头超声制备丹参总酚酸脂质体丹参总酚酸25mg大豆磷脂(PC含量＞95％)250mg胆固醇50mg生理盐水5mL三氯甲烷10mL5％甘氨酸-HCl缓冲溶液(PH＝3.50)5mL分别称取上述处方量的大豆磷脂和胆固醇加入三氯甲烷，室温溶解。称取处方量的丹参总酚酸加入生理盐水，待溶解后，将以上两种液体混合，探头超声(400W，1.5min)形成初乳，置于茄形瓶中，室温下减压旋转蒸发至形成胶态，另取甘氨酸-HCl缓冲溶液加入茄形瓶，继续减压蒸发1小时，形成均匀乳剂，过0.8μm的微孔滤膜，即得脂质体。丹参总酚酸包封率为85.9％，粒径为235.6±45.4nm。实施例4探头超声制备丹参总酚酸脂质体丹参总酚酸100mg大豆磷脂(PC含量＞95％)250mg胆固醇62.5mg生理盐水5mL三氯甲烷15mL1％甘氨酸-HCl缓冲溶液(PH＝3.50)5mL分别称取上述处方量的大豆磷脂和胆固醇加入三氯甲烷，室温溶解。称取处方量的丹参总酚酸加入生理盐水，待溶解后，将以上两种液体混合，探头超声(400W，1.5min)形成初乳，置于茄形瓶中，室温下减压旋转蒸发至形成胶态，另取甘氨酸-HCl缓冲溶液加入茄形瓶，继续减压蒸发1小时，形成均匀乳剂，过0.8μm的微孔滤膜，即得脂质体。丹参总酚酸包封率为63.1％，粒径为230.3±47.1nm。实施例5高压乳匀法制备丹参总酚酸脂质体丹参总酚酸250mg大豆磷脂(PC含量＞95％)500mg胆固醇62.5mg生理盐水10mL三氯甲烷20mL1％甘氨酸-HCl缓冲溶液(PH＝3.30)10mL分别称取上述处方量的大豆磷脂和胆固醇加入三氯甲烷，室温溶解。称取处方量的丹参总酚酸加入生理盐水，待溶解后，将以上两种液体混合，高压乳匀形成初乳，置于茄形瓶中，室温下旋转蒸发至形成胶态，另取甘氨酸-HCl缓冲溶液加入茄形瓶，继续减压蒸发1小时，形成均匀乳剂，过0.8μm的微孔滤膜，即得脂质体。丹参总酚酸包封率为80.5％，粒径为127.4±28.9nm。实施例6搅拌滴加成乳法制备丹参总酚酸脂质体丹参总酚酸100mg大豆磷脂(PC含量＞95％)250mg胆固醇62.5mg生理盐水5mL三氯甲烷15mL1％甘氨酸-HCl缓冲溶液(PH＝4.00)5mL分别称取上述处方量的大豆磷脂和胆固醇加入三氯甲烷，室温溶解。称取处方量的丹参总酚酸加入生理盐水，待溶解后，将三氯甲烷溶液于室温下搅拌滴入药物生理盐水中，得到稳定的乳剂，置于茄形瓶中，室温下旋转蒸发至形成胶态，另取甘氨酸-HCl缓冲溶液加入茄形瓶，继续减压蒸发1小时，形成均匀乳剂，过0.8μm的微孔滤膜，即得脂质体。丹参总酚酸包封率为59.3％，粒径为297.2±32.4nm。实施例7乙醚注入法丹参总酚酸100mg大豆磷脂(PC含量＞90％)250mg胆固醇62.5mg生理盐水5mL乙醚5mL分别称取上述处方量的大豆磷脂和胆固醇加入乙醚，室温溶解。称取处方量的丹参总酚酸加入生理盐水，待溶解后，置于60℃水浴中搅拌，将乙醚溶液缓慢滴入药物生理盐水中，滴完后60℃继续搅拌1小时，所得溶液过0.8μm的微孔滤膜，即得脂质体。丹参总酚酸包封率为24.7％，粒径为422.3±98.5nm。实施例8复乳法丹参总酚酸100mg大豆磷脂(PC含量＞95％)250mg胆固醇62.5mg生理盐水5mL三氯甲烷15mL1％甘氨酸-HCl缓冲溶液(PH＝4.00)20mL分别称取上述处方量的大豆磷脂和胆固醇加入三氯甲烷，室温溶解。称取处方量的丹参总酚酸加入生理盐水，待溶解后，将以上两种液体混合，探头超声形成初乳，另取1％甘氨酸-HCl缓冲溶液(PH＝4.00)，和上述初乳混合，搅拌进行二次乳化，得W/O/W乳浊液，置于茄形瓶中，室温下旋转蒸发除去有机相，过0.8μm的微孔滤膜，即得脂质体。丹参总酚酸包封率为60.5％，粒径为226.3±49.1nm。实施例9薄膜分散法丹参总酚酸100mg大豆磷脂(PC含量＞90％)250mg胆固醇62.5mg生理盐水5mL乙醚5mL分别称取上述处方量的大豆磷脂和胆固醇加入乙醚，室温溶解，将乙醚液在玻璃瓶中旋转蒸发，形成薄膜；称取处方量的丹参总酚酸溶于生理盐水，加入烧瓶中，加入玻璃珠数枚，搅拌2min，室温放置2h，再搅拌2h，依次过1.2μm，0.8μm的微孔滤膜，即得脂质体。丹参总酚酸包封率为23.1％，粒径为500.3±145.6nm。权利要求1.丹参总酚酸脂质体，其特征在于由丹参总酚酸、磷脂、胆固醇及pH调节剂组成，所述的丹参总酚酸与磷脂的质量比为1∶1～1∶100，磷脂与胆固醇的质量比为1∶1～10∶1。2.根据权利要求1所述的丹参总酚酸脂质体，其特征在于所述的丹参总酚酸是指以中药丹参为原料，经过提取纯化得到的水溶性提取物，其中以丹酚酸B计的丹参总酚酸的含量为50％～100％，丹酚酸B的含量为不低于40％。3.根据权利要求1所述的丹参总酚酸脂质体，其特征在于所述的磷脂选自卵磷脂，包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂；或氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、双肉豆蔻磷脂酰胆碱、双肉豆蔻磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油或二硬脂酰磷脂酰胆碱。4.根据权利要求3所述丹参总酚酸脂质体，其特征在于所述的磷脂选自大豆卵磷脂。5.权利要求1所述的丹参总酚酸脂质体的制备方法，其特征在于通过下述步骤按重量比称取磷脂、胆固醇溶于氯仿和/或甲醇溶剂中，加入丹参总酚酸的缓冲溶液，采用探头超声、高压乳匀或搅拌方法形成乳剂，除去有机溶剂，即得丹参总酚酸脂质体。6.根据权利要求5的制备方法，其特征在于制得的脂质体脂质体粒径为50～500nm。7.根据权利要求5的制备方法，其特征在于所述的缓冲溶液pH为3.00～6.00。8..根据权利要求5的制备方法，其特征在于所述的缓冲溶液选自甘氨酸—盐酸缓冲溶液、柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸—氢氧化钠—盐酸缓冲液或乙酸—乙酸钠缓冲液。9.根据权利要求1所述的丹参总酚酸脂质体，其特征在于制成注射液、冻干粉针剂或喷雾剂。10.根据权利要求9所述的丹参总酚酸脂质体，其特征在于所述的冻干粉针剂由脂质体与冻干支持剂组成，其中冻干支持剂的用量为1％～30％；所述的冻干支持剂选自蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、果糖或甘露糖，或上述任意两种或两种以上混合。全文摘要本发明属于医药
技术领域：
，涉及一种中药有效部位丹参总酚酸的脂质体及其制备方法。本发明由丹参总酚酸、磷脂、胆固醇及pH调节剂组成，所述的丹参总酚酸与磷脂的质量比为1∶1～1∶100，磷脂与胆固醇的质量比为1∶1～10∶1。采用溶剂注入法、薄膜分散法或逆相蒸发法等制备。经实验证实，本发明丹参总酚酸脂质体可减缓药物释放、延长药物在体循环中的滞留时间并显著提高药物的生物利用度。文档编号A61K9/14GK101062095SQ20071004111公开日2007年10月31日申请日期2007年5月22日优先权日2007年5月22日发明者王建新,张丽红,韩丽妹,傅艳申请人:复旦大学