专利名称：治疗肝病的药物组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗肝病的药物组合物，尤其涉及含有免疫调节剂与香豆草醚类化合物的治疗肝病的药物组合物。
背景技术：
肝病困扰着我国人民的健康，肝炎病毒感染已经成为一个严重的公共卫生问题。据有关资料显示，全世界约有3亿乙型肝炎病毒感染者，仅中国就有1亿人，且每年新增3000万乙肝患者，而这一数字目前正呈上升趋势。另一方面，近年来随着人民生活水平的提高，脂肪肝、肝硬化等与生活方式关系密切的慢性肝病，正演变成为新的医学社会问题。
中华医学会肝病学分会将常见的肝病分为5组病毒性肝炎、脂肪性肝病、肝纤维化、肝脏肿瘤及肝移植。病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的，以肝脏炎症和坏死病变为主的一组常见传染病。临床上以乏力、食欲减退、肝区疼痛、肝肿大、肝功能异常为主要表现，部分病例出现黄疸和发热，常见无症状感染。常见的肝炎病毒有甲、乙、丙、丁、戊五种。其中甲型和戊型肝炎多表现为急性肝炎，乙、丙、丁型主要表现为慢性肝炎并可发展为肝硬化和肝癌。在慢性病毒性肝炎的发病过程中，病毒持续在肝细胞内复制，使肝细胞不断地受到免疫损伤，且由于肝细胞代谢失常所致肝内形成的免疫调节因子(IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8等)发生质与量的改变，从而导致免疫调节功能紊乱，造成肝脏或其他组织器官更加严重而持续的损害。
因此，临床上迫切需要新的有效治疗肝病的药物，能显著抑制或消除肝炎病毒，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和阻止疾病的进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、肝癌及其并发症的发生，从而改善患者的生活质量和延长存活时间。
目前，众多研究者对肝病的发病机理进行深入的研究与探讨，发现免疫调节因子与肝脏疾病的发生、发展密切相关。干扰素(IFN)是目前研究最为广泛的免疫调节因子之一，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。1957年，Issaces和Lindenman首次报道了一种能干扰病毒在宿主细胞中增殖的蛋白质，将其命名为“干扰素”。干扰素的生物学功能主要有以下四个方面①广谱抗病毒作用，对许多病毒都有抑制作用，并有一定的种属特异性，同时也有一定的交叉性。②增强免疫功能的作用，对T、B淋巴细胞的功能有促进作用，但用量太大会出现抑制效应。同时，干扰素对NK细胞和巨噬细胞的功能也有促进作用，是很好的免疫增强剂(其中，IFN-γ的免疫增强作用较IFN-α或β更为明显，因此IFN-γ也曾被称为“免疫干扰素”)。③对细胞生长具有抑制作用，如抑制成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和造血细胞的增殖。④抑制和杀伤肿瘤细胞。IFN-α作为抗病毒药物，其使用范围广泛，适应症包括肝炎(乙肝、丙肝)、艾滋病、带状疱疹、寻常疣、病毒性角膜炎等。对巨噬细胞病毒、普通感冒也有一定的疗效。同时，IFN-α也是很好的抗肿瘤治疗药物，对血液系统的肿瘤疾病、淋巴系统的肿瘤、实体瘤等均有不同程度的疗效。近年来发现IFN-γ与肝纤维化的形成有关。Rockey及Mallat等研究证实，IFN-γ对肝脏星形细胞(HSC)的增殖、胶原合成均有抑制作用(Inhibition of rat hepatic lipocyteactivation in culture by interferon-γ.Rockey DC，Maher JJ，Jarnagin WRet al.Hepatology，1992，16(3)776-784；Interferon alfa and gamma inhibitproliferation and collagen synthesis of human Ito cells in culture.MallatA，Preaux AM，Blaze jewski S et al.Hepatology，1995，21(4)1003-1010)。蔡卫民等研究表明，IFN-γ可缓解慢性病毒性肝炎纤维化的进展(γ-干扰素抗肝纤维化临床疗效的初步观察.蔡卫民，陈智，陈峰，等.临床肝胆病杂志，1998，14(1)21-23)。在临床上，IFN-γ广泛地应用于治疗亚急性重症肝炎、肝纤维化等。但是，IFN-γ也有一些轻微的不良反应，如一过性发热、关节痛、肌痛等感冒样症状，一般持续10天左右。实验室检查可发现短暂的白细胞和血小板降低，但停药后可恢复。
但是由于大部分的化学药物缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的毒副作用，因此目前迫切需要可以在保证化学药物的治疗效果的前提下，减少其带来的毒副作用的技术方案。化学药物的毒副作用与很多因素有关，例如病人个体情况、药物本身的特异性以及药物的用量和疗程。因此如何在保证治疗效果的前提下，减少化学药物的用量变得尤其重要。有一些研究表明将我国的传统中药与西药合用，可以发挥协同作用，可以增强疗效并减少药物用量。
我国的传统中药具有悠久的历史，是我国传统医药的瑰宝，但是传统中药在迎接现代化的挑战中遇到了重大的难题。中药的特点是多组分、多作用、多靶点，如何对于中药的某特定的药理作用从大量成分中筛选出有效部位或者有效成分，如同大海捞针一般是一项复杂、具有挑战的工作，而其后的如何将筛选出的有效部位或有效成分加以科学的药学应用就更是一项复杂的工作了。
本发明人经过深入研究，发现中药墨旱莲中存在多种有效的化学成分黄酮，皂甙，香豆草醚类化合物等，并对其含有的香豆草醚类化合物进行进一步的研究，发现其具有治疗类风湿性关节炎、哮喘、肿瘤等多种药理作用，并已申请国家发明专利，专利申请号分别为200310124512、200510023677、200510112435。本发明人经过进一步的研究发现香豆草醚类化合物有一定的保肝、护肝作用，能有效治疗自身免疫性肝病，并已申请国家发明专利，专利申请号为200710036458.2。于是尝试性进行了香豆草醚类化合物是否可以减少免疫调节剂，尤其是干扰素的毒副作用的研究，结果意外地发现，香豆草醚类化合物与免疫调节剂合用，尤其是与干扰素合用可以发挥协同作用，减少干扰素的用量，减轻干扰素的毒副作用，并且在香草醚类化合物在现用剂量下未见任何毒副作用。
发明内容
本发明的目的为提供一种治疗肝病的药物组合物，它包含免疫调节剂与香豆草醚类化合物。
本发明的另一目的是提供一种药物组合物在制备治疗肝病的药物中的用途。
本发明的另一目的是提供一种治疗肝病的药盒。
本发明的另一目的是提供一种化合物在制备减轻肝病治疗药物的毒副作用的制剂中的用途 在本发明的第一方面，提供了一种治疗肝病的药物组合物，它含有以下组分 (a)免疫调节剂，所述免疫调节剂选自干扰素； (b)式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含有该化合物的植物提取物，
式中， R1代表氢原子、羟基、甲氧基， R2代表氢原子、C1-8烷基，优选具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，最优选甲基， R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基； (c)药学上可接受的载体； 其中，免疫调节剂和香豆草醚类化合物占组合物总重量的0.001-99.9％，并且所含的免疫调节剂与香豆草醚类化合物的摩尔比为1∶1×108-1∶1×104，较佳地为1∶5×107-1∶5×104，更佳地为1∶1×107-1∶1×105。
在另一优选例中，所述的免疫调节剂选自下组IFN-α、IFN-β、IFN-γ。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐或酯是式I化合物与选自下组的酸所形成的盐或酯氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐是式I化合物与选自下组的碱金属或碱土金属所形成的盐钠、钾、钙、镁等。
在另一优选例中，所述的式I化合物或所述的提取物是从菊科植物中提取的。
在另一优选例中，所述的菊科植物选自醴肠(Eclipta prostrate Linn)、蟛蜞菊(Wedelia chinensis)、旱莲草(Eclipta alba)，或其组合。
在另一优选例中，所述的式I化合物是具有式II的蟛蜞菊内酯或其药学上可接受的盐或酯
在另一优选例中，所述的肝病选自下组病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌。
在另一优选例中，所述的病毒性肝炎选自下组(按病原学分类)甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎。
在另一优选例中，所述的自身免疫性肝病选自下组自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型选自下组注射剂、注射用无菌粉末、片剂、胶囊、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、栓剂。
在本发明的第二方面，提供了一种组合物在制备治疗肝病的药物中的用途，所述的组合物含有 (a)免疫调节剂，所述免疫调节剂选自干扰素； (b)式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含有该化合物的植物提取物，
式中， R1代表氢原子、羟基、甲氧基， R2代表氢原子、C1-8烷基，优选具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，最优选甲基， R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基； (c)药学上可接受的载体； 其中，免疫调节剂和香豆草醚类化合物占组合物总重量的0.001-99.9％，并且所述免疫调节剂与所述香豆草醚类化合物的摩尔比为1∶1×108-1∶1×104，较佳地为1∶5×107-1∶5×104，更佳地为1∶1×107-1∶1×105，所述的组合物用于制备治疗以下肝病的药物病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌。
在另一优选例中，所述的免疫调节剂选自下组IFN-α、IFN-β、IFN-γ。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐或酯是式I化合物与选自下组的酸所形成的盐或酯氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐是式I化合物与选自下组的碱金属或碱土金属所形成的盐钠、钾、钙、镁等。
在另一优选例中，所述的式I化合物或所述的提取物是从菊科植物中提取的。
在另一优选例中，所述的菊科植物选自醴肠(Eclipta prostrate Linn)、蟛蜞菊(Wedelia chinensis)、旱莲草(Eclipta alba)，或其组合。
在另一优选例中，所述的式I化合物是具有式II的蟛蜞菊内酯或其药学上可接受的盐或酯
在另一优选例中，所述的病毒性肝炎选自下组(按病原学分类)甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎。
在另一优选例中，所述的自身免疫性肝病选自下组自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型选自下组注射剂、注射用无菌粉末、片剂、胶囊、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、栓剂。
本发明的第三方面提供了一种治疗肝病的药盒，其中，含有以下成分 (a)第一剂，所述第一剂中含有干扰素； (b)第二剂，所述第二剂中含有香豆草醚类化合物，所述香豆草醚类化合物为式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含该化合物的植物提取物，
式中， R1代表氢原子、羟基、甲氧基， R2代表氢原子、C1-8烷基，优选具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基， R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基。
本发明的第四方面提供了一种化合物的用途，所述化合物选自式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含有该化合物的植物提取物，
其中，所述用途为所述化合物在制备减轻肝病治疗药物的毒副作用的制剂中的用途。
图1显示了蟛蜞菊内酯对IFN-γ细胞因子的活力的增强作用。
图2显示了蟛蜞菊内酯对IFN-γ的活力的增强作用呈时间依赖性。
具体实施例方式 本发明人经过广泛而深入的研究发现，免疫调节剂(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)与某种植物提取物(如香豆草醚类化合物)一起施用时，对于病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌等肝病的治疗可发挥协同作用，可以增加疗效，并可以减少药物用量。
组合物 本发明的药物组合物含有以下组分 (a)免疫调节剂，所述免疫调节剂选自干扰素； (b)式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含有该化合物的植物提取物，
式中， R1代表氢原子、羟基、甲氧基， R2代表氢原子、C1-8烷基，优选具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，最优选甲基， R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基； (c)药学上可接受的载体， 其中，免疫调节剂和香豆草醚类化合物占组合物总重量的0.001-99.9％，并且免疫调节剂与香豆草醚类化合物的摩尔比为1∶1×108-1∶1×104，较佳地为1∶5×107-1∶5×104，更佳地为1∶1×107-1∶1×105。
在本发明中，优选的免疫调节剂选自下组IFN-α、IFN-β、IFN-γ。
在本发明中，优选的香豆草醚类化合物为具有式II的蟛蜞菊内酯或其药学上可接受的盐或酯
本发明的这些治疗肝病的药物组合物中，所含的免疫调节剂与香豆草醚类化合物的摩尔比为1∶1×108-1∶1×104，较佳地为1∶5×107-1∶5×104，更佳地为1∶1×107-1∶1×105。所述比例可随所选的有效成分的种类以及所要治疗的疾病及症状的程度等适量增减。
本发明的药物组合物可以是普通型(即活性成分的浓度适合于直接使用)，也可以是浓缩型(即活性成分的浓度需经稀释后才可使用)。在本发明的组合物中所含的有效成分，即免疫调节剂与香豆草醚类化合物为组合物总重量的0.001-99.9wt％，较佳地为0.01-90wt％，更佳地为0.05-50wt％，最佳地为0.1-20wt％。可根据所选的有效成分的种类以及所要治疗的疾病及症状的程度等适当增减。
用途 本发明的药物组合物可用于治疗肝病，代表性的例子包括(但并不限于)病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌。
所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。对大部分大型哺乳动物而言，每天施以有效成分的总剂量(即免疫调节剂和香豆草醚类化合物的总重量)约为0.01-1000mg。通常，成人临床给药量的范围为0.01-200mg/日，优选为0.05-100mg/日。
在使用本发明药物组合物治疗肝病时，还可与其他治疗剂联用。例如与选自下组的一种或多种辅助活性成分联用 抗病毒药物利巴韦林、单磷酸阿糖腺苷、拉米夫定、阿昔洛韦、泛昔洛韦、胸腺肽； 免疫抑制剂强的松、甲基强的松龙、雷公藤、硫唑嘌呤、环孢素、他克莫司(FK506)、雷帕霉素、霉酚酸脂、咪唑立宾； 抗肝纤维化药物维甲酸、S-腺苷甲硫氨酸、秋水仙碱、己酮可可碱； 护肝药物硫普罗宁、葡醛酸钠、还原型谷胱甘肽、甘草酸二胺、门冬氨酸鸟氨酸。
本发明还包括治疗肝病的方法，它包括给哺乳动物施用药物有效量的本发明药物组合物。
通常，当本发明组合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末、栓剂等。
本发明的化合物可经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。
上述剂型中可经口服给药的剂型为片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、醑剂。固态载体包括淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括无菌水、乙醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括调味剂、着色剂、防腐剂(如羟苯烷基丁酯、苯甲酸钠、山梨酸)和抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯)。
上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括注射剂、注射用无菌粉末，它们是将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括无菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，还需加入抑菌剂(如苯甲醇、羟苯丁酯、硫柳汞)、等渗调节剂(如氯化钠、葡萄糖)、助悬剂(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、增溶剂(吐温-80、卵磷酯)、抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。优选口服给药。
在本发明中，除了将免疫调节剂和香豆草醚类化合物配制在一起形成组合物之外，还可以将两者单独配制成药物组合物，然后将两种组合物制剂置于同一药盒中，形成含有免疫调节剂组合物和香豆草醚类化合物组合物两种组合物的药盒。使用时，可以将这种药盒中的两种组合物分别(同时或先后)施用，或者混合在一起施用。
本发明的优点在于 1、强协同效应。本发明的治疗肝病的药物组合物，与单独的免疫调节剂或香豆草醚类化合物相比，对于病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌的治疗具有较强的协同作用。
2、显著降低免疫调节剂，尤其是干扰素的用量，从而减少毒副作用。
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数均按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 旱莲草(Eclipta alba)中提取化合物蟛蜞菊内酯 (1)浸泡及过滤 旱莲草全草300kg，完全浸入0.75吨乙醇(浓度95％)中→浸泡过夜(10小时)→粗滤，从而除去全草残渣(保留)→净滤(抽滤)或高速离心(10000rpm，10分钟)，从而除去灰尘及细渣→绿色澄清滤液。
(2)乙醇回收 蒸馏回收乙醇，温度不超过60℃→每次回馏2小时，将反应釜中的浸膏移出至收集桶中(浸膏呈深墨绿色，略粘稠状)→重复上述步骤，直至回收全部乙醇。
(3)二次浸泡及回馏 回收乙醇0.75吨，重新浸泡全草残渣→浸泡过夜，粗滤、净滤及蒸馏回收要求同前。得到浸膏。
(4)乙酸乙酯萃取 取上述浸膏50-80℃(更佳地60-70℃)加热水振荡混匀，热水加量为浸膏体积的50倍，抽滤得到热水相液。按照水相酯相体积比为1∶1的比例加入萃取用的乙酸乙酯，充分混匀震荡后，静置，待水相/酯相分层。移出乙酸乙酯层，50℃真空减压蒸馏至干燥，加入少量乙醇溶解，置于烧杯中于4℃保存过夜，底部出现沉淀。减压抽滤获得沉淀，50℃烘箱干燥，得到粗品。
(5)产品的分离精制 取粗品5g，拌样于10g 200～300目硅胶，进行硅胶柱层析(200g，200-300目)，用石油醚-丙酮梯度洗脱，每100mL收集一次，分别得到不同极性组份，合并所需的组份(TLC石油醚-丙酮1∶1，Rf＝1/3)。将合并的组份浓缩后，再拌样于硅胶进行柱层析，用二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，每50mL收集一次，分别得到不同极性组份，合并所需的组份(TLC二氯甲烷-丙酮3∶1，Rf＝1/6)。将合并的组份浓缩后，再拌样于硅胶进行柱层析，用甲苯-丙酮-甲酸梯度洗脱，每50mL收集一次，分别得到不同极性组份，合并所需的组份(TLC甲苯-丙酮-甲酸10∶10∶1，Rf＝1/2)。将合并的组份浓缩后，再拌样于硅胶进行柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，每25mL收集一次，分别得到不同极性组份，合并所需的组份(TLC二氯甲烷-甲醇20∶1，Rf＝1/6)。得到纯度＞90％的产品，收率约1％。
(6)标准品精制 将纯度＞90％的样品30mg溶于70％甲醇中，用Lichroprep RP-18(40～63μ)柱进行反相洗脱，用TLC检测，收集70％洗脱下来的样品，合并得到纯度＞98％的标准品。收率约90％。标准品的性状、分子式、熔点和IR，EIMS，1HNMR，13CNMR峰的归属如下 灰白色粉末，分子式C16H10O7，mp 315℃(分解)，UV λmax(MeOH，nm)211.5(4.65)，247(4.40)，304(4.01)(sh)，350(4.48)。IR(KBr)cm-13300，1715，1640，1620，1445，1415，1320，1205，1155，1070。EIMS m/z(％)314(M+，100)，313(22)，299([M-CH3]，28)，285(5)，271([M-CH3-CO]，8)，243([M-CH3-CO-CO]，28)，187(17)，69(42)。1HNMR(δ)7.23(s)，7.14(s)，6.58(d，J＝2.3Hz)，6.42(d，J＝2.3Hz)，3.90(s) 13CNMR(δ)158.0(C-1)，101.1(C-2)，159.6(C-3)，95.6(C-4)，99.3(C-5)，161.1(C-6)，95.0(C-7)，155.5(C-8)，155.0(C-9)，104.7(C-10)，145.2(C-11)，144.3(C-12)，99.0(C-13)，114.0(C-14)，148.7(C-15)，55.7(C-16)。
结果表明，获得的化合物是具有式II的蟛蜞菊内酯
将通过上述方法提取得到的蟛蜞菊内酯(以下称AP-1)，用于以下各实施例中。
实施例2蟛蜞菊内酯增强IFN-γ细胞因子的活力 JAK/STAT信号传导系统是IFN和I型细胞因子广泛采用的信号传导通路。这些细胞因子首先激活JAK激酶，而后磷酸化并且激活STAT蛋白，活化的STAT蛋白发生核转位，对基因的表达进行调控。
实验材料 1)细胞株稳定转染了STAT1-luciferase报告基因质粒的HepG2细胞 2)待测药物AP-1，IFN-γ(Sigma，Cat.NO.T0157) 3)荧光素酶检测试剂盒(Promega，Cat.NO.E4550) 实验方法 1)将生长状态良好的HepG2细胞用胰酶消化，以DMEM培养基重悬细胞并调整细胞浓度至1×106个/ml，取1ml细胞悬液接种于96孔板内，在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，直至细胞完全贴壁； 2)当细胞生长至密度为60-70％时，将其随机分为以下5组 a、阴性对照组(图中简称con)，不加IFN-γ和AP-1； b、DMSO组，加入DMSO至终浓度为0.5％； c、AP-1组，加入AP-1至终浓度为50μM，孵育5小时； d、IFN-γ组，加入IFN-γ至终浓度为100IU/ml，设5个时间梯度，分别为0、2、5、10、24小时； e、联合用药组(图中简称AP-1+IFN-γ)，加入AP-1至终浓度为50μM，再加入终浓度为100IU/ml的IFN-γ，并设5个时间梯度，分别为0、2、5、10、24小时。
3)取出96孔板，小心吸弃培养基，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次； 4)每孔加入100μl 1x荧光素酶裂解液(CCLR)，轻轻摇动10-15分钟，待细胞完全裂解后将其吸入1.5ml的eppendorf管中，漩涡震荡1分钟，13200rpm离心2分钟，将上清液吸入另一离心管中； 5)在96孔检测板中加入20μl细胞裂解液和100μl荧光素酶底物，轻轻混匀，于Luminometer(TECAN GENion)中检测。
以上实验重复3组细胞，将所得结果用SPSS统计软件进行one-way方差分析。
实验结果见图1、图2。
结果表明，蟛蜞菊内酯能进一步增强由IFN-γ诱导的JAK/STAT信号传导通路的活化，联合用药组与AP-1组、IFN-γ组相比具有显著性差异(p＜0.01)，提示蟛蜞菊内酯可能通过激活JAK/STAT信号传导通路，调控某些炎症相关基因的表达，从而发挥肝保护作用。另外，由图可知蟛蜞菊内酯对IFN-γ的活力的增强作用呈时间依赖性。
实施例3 AP-1与IFN-α合用对ConA诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用 1992年，Tiegs等成功地应用刀豆蛋白A(ConA)诱发了小鼠特异性肝损伤，近年来其逐渐发展成为研究免疫细胞介导的肝损害的主要实验模型。
刀豆蛋白(Concanavalin，ConA是植物凝集素，具有促有丝分裂作用，作为有丝分裂原刺激T淋巴细胞表达多种细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2介导肝损伤，ConA诱导T淋巴细胞依赖性肝损伤病理与人类自身免疫性肝病、急慢性病毒性肝炎相似，并能被免疫抑制剂所缓解。
给予ConA后8小时，即见血浆ALT、AST、LDH明显升高，肝内大量T淋巴细胞浸润，部分汇管区淋巴细胞浸润呈“套袖”样改变，大量肝细胞核破裂、出现凋亡小体和脂肪变性等。这些均证明，T淋巴细胞与本模型发病机制密切相关。而自身免疫性肝病、病毒性肝炎等所致的肝损害，均与免疫细胞的活化密切相关。
实验动物雄性SPF级KM小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，体重为18-22g，SPF级动物房饲养，12h光照/12h黑暗，自由摄取饲料和水。
实验方法 1.造模方法小鼠尾静脉注射剂量为20mg/kg的ConA； 2.给药情况小鼠禁食不禁水13小时后，将其分别随机分为5组(每组10只)(1)正常组，(2)模型组，(1)(2)组小鼠腹腔注射体积为0.1ml/10g的蒸馏水；(3)IFN-α组，小鼠腹腔注射剂量为2.5×106IU/kg的rhIFN-α2a(沈阳三生制药有限公司)；(4)AP-1组，小鼠灌胃给药，剂量为10mg/kg的AP-1；(5)联合用药组，小鼠腹腔注射剂量为5×105IU/kg的rhIFN-α2a，同时灌胃剂量为10mg/kg的AP-1。以上各组，分别于造模前5小时、1小时给药。
本实验通过ConA造模前提前两次给药(分别为5小时和1小时)，从而使药物在血液中的浓度明显升高，达到治疗有效量。
造模8小时后摘眼球取血，4℃静置30分钟，3500rpm离心8分钟。取血清，用赖氏法通过A492间接测定血清中的ALT含量。
计算抑制率 抑制率＝(模型组A492-实验组A492)/模型组A492×100％。
计算每组平均值，用SPSS统计软件进行单因素方差分析，以及进行两两组间比较。
实验结果见表1。
表1 AP-1与IFN-α合用对ConA诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用 *表示p＜0.05，与模型组相比有显著性差异； Δ表示p＜0.05，与正常组相比有显著性差异； **表示p＜0.01，与模型组相比具有极显著差异。
结果表明，模型组小鼠血清中ALT含量(0.112±0.018)与正常组(0.009±0.001)相比具有显著差异，表明造模成功；(3)、(4)、(5)组小鼠血清中ALT含量明显低于模型组，差异有显著性，抑制率分别为30.36％、38.39％和74.11％。AP-1与IFN-α联合用药可明显降低小鼠血清中ALT的含量，同时还可减少IFN-α的剂量、降低其副作用，对免疫性肝病具有预防性的保护作用。
实施例4 AP-1与IFN-α合用体外抗乙型肝炎病毒的药效研究 实验材料 1.细胞株HBV基因转染的人肝癌细胞系(HepG2 2.2.15)，购自武汉大学细胞保藏中心。
2.试剂IFN-α2b，购自先灵葆雅公司；MTT、ELISA试剂盒，购自北京华美生物工程公司。
实验方法 1.细胞培养及药物作用细胞生长至对数生长期后，用0.25％胰酶消化细胞，调整细胞浓度至1×105/ml。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱(37℃，5％)中培养4d。将细胞分为4组1)IFN-α组，每孔加入一定量的IFN-α，至终浓度为500IU/ml；2)AP-1组，每孔加入100μl AP-1，至终浓度为0.5μg/ml；3)联合用药组，每孔加入IFN-α以及AP-1，至终浓度分别为500IU/ml和0.5μg/ml；4)空白对照组，加入等量的细胞培养基。以上各组均设6个复孔。
2.MTT比色分析法检测细胞吸光度值培养箱中培养66h后，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37℃放置4h。每孔加入三联液(5％ SDS，10mM HCl，5％异丙醇)，37℃过夜。490nm测吸光度值(OD)。对OD值进行t检验，并计算药物对细胞生长的抑制率抑制率＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100％。
3.HBsAg、HBeAg的检测用酶联免疫吸附试验(ELISA法)分别检测每孔HBsAg、HBeAg的P/N值，操作按试剂盒说明书进行，根据公式计算抑制率药物对HBsAg或HBeAg的抑制率＝(对照组平均P/N-给药组平均P/N)/对照组平均P/N×100％。
4.统计学处理采用SPSS10.0软件，配对t检验。
实验结果见表2、3、4。
表2药物对HepG2 2.2.15细胞生长的抑制作用(Mean±SD，n＝6) *表示p＜0.05，与空白对照组相比，有显著性差异； **表示p＜0.01，与空白对照组相比，有极显著差异。
表3 药物对HBsAg表达的抑制作用(Mean±SD，n＝6) *表示p＜0.05，与空白对照组相比，有显著性差异； **表示p＜0.01，与空白对照组相比，有极显著差异。
表4 药物对HBeAg表达的抑制作用(Mean±SD，n＝6) *表示p＜0.05，与空白对照组相比，有显著性差异； **表示p＜0.01，与空白对照组相比，有极显著差异。
结果表明，由表2可见，IFN-α、AP-1组以及联合用药组均可抑制HepG2 2.2.15细胞的生长，且联合用药组抑制效果尤为显著，与空白对照组相比，具有极显著性差异(p＜0.01)。
由表3、4可见，IFN-α、AP-1组以及联合用药组均能抑制HepG2 2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg，与空白对照组相比，差异具有显著性。
因此，本实验结果提示，联合用药能较好的抑制HepG2 2.2.15细胞的生长以及病毒颗粒的产生和分泌。
实施例5 AP-1与IFN-γ合用抗四氯化碳诱导的肝纤维化 实验动物纯系SD雄性大鼠50只，体重180-210g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，SPF级动物房饲养，普通颗粒饲料及葵花籽喂养。
实验试剂AST、ALT试剂盒，购自中生北控生物科技股份有限公司；PLD、SA试剂盒，购自上海海军医学研究所生物技术中心。
实验方法 1.造模方法每只大鼠按0.3ml/100g体重给予40％四氯化碳橄榄油溶液，双下肢轮流皮下注射，每周2次，连续12周。
2.给药情况将大鼠分别随机分为5组(每组10只)(1)正常组，(2)模型组，大鼠腹腔注射体积为0.1ml/10g的蒸馏水；(3)IFN-γ组，大鼠每天腹腔注射剂量为50 000IU的大鼠重组IFN-γ(R&D公司，1μg＝10000IU)；(4)AP-1组，大鼠灌胃给药，每天剂量为10mg/kg的AP-1；(5)联合用药组，大鼠每天腹腔注射剂量为10000IU的大鼠重组IFN-γ，同时灌胃剂量为10mg/kg的AP-1。以上各组，分别于造模6周后开始给药。
造模12周后摘眼球取血，4℃静置30分钟，3500rpm离心8分钟。取血清，测定血清中的天门冬氨酸氨基酸转移酶(ALT)、丙氨酸氨基转移酶(AST)、唾液酸(SA)、脯氨酸肽酶(PLD)含量(按试剂盒说明书进行操作)。
处死大鼠，取肝脏称重，并计算肝指数。肝指数＝肝重量/体重。
实验结果见表5、6、7。
表5 药物对大鼠肝指数的影响(Mean±SD，n＝10) *表示p＜0.05，与模型组相比，有显著性差异； Δ表示p＜0.05，与正常组相比，有显著性差异； **表示p＜0.01，与模型组相比，有极显著性差异。
表6 药物对大鼠血清AST、ALT含量的影响(Mean±SD，n＝10) *表示p＜0.05，与模型组相比，有显著性差异； Δ表示p＜0.05，与正常组相比，有显著性差异； **表示p＜0.01，与模型组相比，有极显著性差异。
表7 药物对大鼠血清SA、PLD含量的影响(Mean±SD，n＝10) *表示p＜0.05，与模型组相比，有显著性差异； Δ表示p＜0.05，与正常组相比，有显著性差异； **表示p＜0.01，与模型组相比，有极显著差异。
结果表明，(1)(5)组大鼠毛发有光泽，活动多，精神状态好，食欲佳；而(2)(3)(4)组大鼠毛发凌乱无光泽，食欲差，精神萎靡活动少，对外界刺激反应慢。说明联合用药组能显著降低IFN-γ的毒副作用，改善大鼠的毛发及精神状态。
由表5可见，与模型组相比，(3)(4)(5)组大鼠的肝指数均有所下降，且(5)组尤为突出。说明联合用药能够显著降低肝硬化大鼠的肝指数。
由表6可见，模型组大鼠血清AST、ALT水平与正常组相比显著升高，p＜0.05。(3)(4)(5)组药物可显著降低大鼠血清中的AST、ALT水平，联合用药效果尤为显著(p＜0.01)。
PLD和SA含量增加是肝纤维细胞增殖旺盛的重要标志。由表7可知，模型组大鼠血清SA、PLD含量较正常组显著升高，p＜0.05。(3)(4)(5)组药物对血清SA、PLD水平均有降低作用，差异具有显著性，p＜0.05。其中，联合用药效果尤为显著，p＜0.01。
实施例6片剂的制备 利用常规技术，混合以下组分，然后直接压片，制备片剂形式的药物组合物，其配方如下
实施例7注射剂的制备
①将尼泊金加于500ml注射用水中，加入羧甲基纤维素钠，混匀，浸泡过夜(24小时)，全溶后，用210目尼龙布过滤； ②将溶液①水浴加热，加入吐温-80，混匀； ③至水浴沸腾，加入蟛蜞菊内酯，混匀，继续加热30分钟，取出冷却至室温； ④另将IFN-α冻干粉加注射用水适量进行溶解； ⑤将③和④溶液混合，G6垂熔玻璃漏斗过滤，加无菌注射用水至1000ml，混匀，灌封，即得。
实施例8药盒的制备 药盒的组分 第一剂蟛蜞菊内酯片剂 按照以下处方制备蟛蜞菊内酯片剂100片
第二剂干扰素片剂 按照以下处方制备干扰素片剂100片
将制得的蟛蜞菊内酯片剂100片以及干扰素片剂100片放置在同一药盒中，使用时可按照1∶1(片数比)的配比服用，两剂可同时服用，也可以先后服用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种治疗肝病的药物组合物，其特征在于，含有以下组分
(a)免疫调节剂，所述免疫调节剂选自干扰素；
(b)式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含有该化合物的植物提取物，
式中，
R1代表氢原子、羟基、甲氧基，
R2代表氢原子、C1-8烷基，优选具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，
R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基；
(c)药学上可接受的载体；
所述免疫调节剂和所述香豆草醚类化合物占组合物总重量的0.001-99.9％，并且所述免疫调节剂与所述香豆草醚类化合物的摩尔比为1∶1×108-1∶1×104。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的免疫调节剂选自IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的盐或酯是式I化合物与选自下组的酸所形成的盐或酯氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的盐是式I化合物与选自钠、钾、钙、镁的碱金属或碱土金属所形成的盐。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的式I化合物或所述的提取物是由菊科植物中提取获得。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的式I化合物是具有式II
的蟛蜞菊内酯或其药学上可接受的盐或酯。
7.权利要求1-6中任一项所述的药物组合物在制备治疗肝病药物中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肝病选自病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌。
9.一种治疗肝病的药盒，其特征在于，含有以下成分
(a)第一剂，所述第一剂中含有干扰素；
(b)第二剂，所述第二剂中含有香豆草醚类化合物，所述香豆草醚类化合物为式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含该化合物的植物提取物，
式中，
R1代表氢原子、羟基、甲氧基，
R2代表氢原子、C1-8烷基，优选具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，
R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基。
10.一种化合物的用途，所述化合物选自式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含有该化合物的植物提取物，
其特征在于，用于制备减轻肝病治疗药物的毒副作用的制剂。
全文摘要
本发明提供了一种治疗肝病的药物组合物及其用途，该组合物的特征在于，含有以下组分(a)免疫调节剂，所述免疫调节剂选自干扰素；(b)式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含有该化合物的植物提取物；(c)药学上可接受的载体；其中，免疫调节剂和香豆草醚类化合物占组合物总重量的0.001-99.9％，并且免疫调节剂与香豆草醚类化合物的摩尔比为1∶1×108-1∶1×104，较佳地为1∶5×107-1∶5×104，更佳地为1∶1×107-1∶1×105。
文档编号A61P31/20GK101310768SQ200710041068
公开日2008年11月26日 申请日期2007年5月23日 优先权日2007年5月23日
发明者强 俞 申请人:上海安普生物科技有限公司