专利名称：一种可以抑制结核杆菌生长的化合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新的可以抑制结核杆菌(H37Ra、H37Rv和临床耐药菌株)生长的N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(英文名N′-[1-(2-hydroxyphenyl)ethylidene]-4，5-dihydro-1H-benzo[g]indazole-3-carbohydrazide，以下简称化合物)化合物及其应用。
背景技术：
结核病是由结核杆菌引起的严重危害人类健康的重大传染病。全球接近32％的人口约21亿感染结核杆菌。每年约有280万人死于结核病。世界卫生组织2007发布的数据显示，全球新感染肺结核的患者达到每年880万人的创纪录水平，而且结核杆菌的抗药性也在不断增强。肺结核已经成为全球最为致命、同时也是治疗成本最高的传染病之一。我国是世界第二结核病大国，有5亿以上人口受到结核菌感染，传染性肺结核患者达200万，每年因结核病死亡人数有25万之多，国民经济损失达35亿元。卫生部的统计显示，2006年中国的结核病发病率和死亡率高居传染病首位。结核病疫情回升的主要原因之一是耐药结核杆菌的肆虐。因此，开发针对耐药结核杆菌的新型抗结核药物迫在眉睫。
国内外的研究表明，生物信息学、功能基因组学的发展及其与药物创新的融合，为创新药物研究的突破提供了前所未有的机遇。生物信息学、高性能并行计算和基因组技术与药物设计的紧密结合是快速、高效发现新靶标和获得药物先导化合物的有效途径，如美国Locus Discovery公司通过靶标结构模拟和先导化合物结构设计，将发现活性化合物的时间由2-3年缩短到几个月，而筛选化合物所用的经费从几千万美元降至几千美元。所以，以生物信息学和基因组学带动药物靶标发现，并以药靶挖掘促进新型药物发现的时代已经来临。
而通过生物信息学分析，并结合对结核病、结核分枝杆菌基础生物学和抗结核药物作用机制的认识，基于已经建立的结核分枝杆菌基因组数据库中发现的新候选靶基因，及基因功能的研究；模拟基因编码蛋白的三维晶体结构，利用计算机从各种化合物数据库中筛选出可能作用于候选靶蛋白的化合物，将会是一个高通量获取结核治疗药物的重要手段。
色氨酸是细菌生命活动中的重要氨基酸。色氨酸生物合成过程中，吲哚-3-甘油磷酸合成酶(indole-3-glycerol phosphate synthase，IGPS)[1]催化最后一步的环形闭合反应。IGPS也是与结核分支杆菌细菌细胞壁糖和脂质代谢有关的酶，与结核分枝杆菌中密度脂蛋白代谢和呼吸作用相关，对结核分枝杆菌的存活起着极其重要作用，是结核分枝杆菌生存必需的。基因trpC是编码IGPS的基因，转座子突变法证实trpC是结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌的必需基因。此外，本课题组通过双向电泳[2]证实，IGPS在异烟肼耐药株中的表达显著高于异烟肼敏感株，抗结核治疗后IGPS表达显著下调。同样证明了该基因是结核杆菌耐药的关键基因之一。IGPS属于芳香族氨基酸生物合成过程中的关键酶，而哺乳动物和人类中均不存在该酶的编码基因；同时，用BLAST软件在NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中进行搜索，并未发现人类存在与IGPS同源的蛋白质或部分氨基酸序列[3]。因此，IGPS有望作为筛选抗结核药物的候选靶位，尤其对异烟肼耐药菌株。针对IGPS开发的新型抗结核药不仅具有特异性，而且可以避免毒副作用的产生。
发明内容
本发明的一个目的是提供对结核杆菌具有抑制剂作用的化合物N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(英文名N′-[1-(2-hydroxyphenyl)ethylidene]-4，5-dihydro-1H-benzo[g]indazole-3-carbohydrazide)。
本发明的另一个目的是提供含N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(英文名N′-[1-(2-hydroxyphenyl)ethylidene]-4，5-dihydro-1H-benzo[g]indazole-3-carbohydrazide)化合物在制备治疗结核病及其他微生物引起的疾病的药物中的应用。
本发明以晶体结构1VC4(PDB ID)为模板，同源模建结核杆菌H37Rv来源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS)的三维结构。借助计算机辅助药物设计技术，从化合物数据库中筛选与IGPS结合较好的化合物。通过生物学实验验证筛选到能够与IGPS很好的结合(平衡解离常数1.2e-6)、能够有效抑制IGPS酶活性的化合物N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(英文名N′-[1-(2-hydroxyphenyl)ethylidene]-4，5-dihydro-1H-benzo[g]indazole-3-carbohydrazide，以下简称化合物)。并说明该化合物在体外能够有效抑制结核杆菌H37Ra(最小抑菌浓度0.625μg/ml)，H37Rv(最小抑菌浓度0.1μg/ml)和耐药结核杆菌(最小抑菌浓度0.1μg/ml)的生长。该化合物的结构式如下
本发明利用的体外化合物对IGPS的抑制实验、化合物与IGPS的结合实验和化合物体外对结核杆菌的抑制试验来筛选IGPS抑制剂的方法，具体步骤如下1、N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物体外抑制IGPS酶活性的测定(1)底物烯醇式1-(O-羧基苯氨基)-1-脱氧核酮糖-5′-磷酸(CdRP)的化学合成①27.4mg邻氨基苯甲酸溶解于0.2mL95％乙醇(1M)，54.8mg核糖-5-磷酸二钠融解于0.2mL水(1M)；②将上述溶液两者混合，室温避光放置5-17h；③用pH4.8-5.1的水稀释10倍，室温避光放置1h，以水解残余的PRA；④用5mL饱和的乙酸乙酯萃取3次，除去多余的邻氨基苯甲酸；⑤产物为30mMCdRP，保存于-20℃。
(2)化合物抑制以CdRP为底物的重组IGPS的活性实验在反应体系中加入470μl 5mM Tris，10μl CdRP，20μl 50μg/mL IGPS在280nm处检测吸光值。并与只有IGPS无CdRP，以及只有CdRP无IGPS在同样反应条件下进行对照，以排除IGPS和CdRP对吸收值的影响。0.1mM CdRP完全转化为IGP导致280nm处OD值增加0.448，将37℃条件下每分钟形成1μM IGP定义为1U。化合物溶于DMSO中配成浓度为10-4M的溶液。
在37℃，pH值为8.0的缓冲体系条件下，检测化合物对IGPS酶活性的影响。
2、N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物与IGPS的体外结合能力的测定将IGPS蛋白(720μg/ml)溶于1％DMSO的PHBS缓冲液。然后在芯片上进行固定。将化合物配置成10-5M、0.5×10-5M、0.25×10-5M、0.125×10-5M、0.625×10-6M、0.3125×10-6M、0.15625×10-6M、0.78125×10-7M、0.390625×10-7M、0.1953125×10-7M等浓度。在大分子互作仪biacore3000上与蛋白质发生结合，测定平衡解离常数(Kd)。
3、N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物体外抑制结核杆菌生长测定(1)结核杆菌的接种方法取制备好的1mg/ml结核杆菌菌悬液5μl，含菌数量1-5×105，分别接种于每支含500ul7H9的液体培养基(7H9干粉4.7g/L，含2ml/L(v/v)甘油和10％ADC，)中。
(2)N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物体外最小抑菌浓度(MIC)的测定将N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三-2，4-二胺化合物稀释成不同浓度梯度，并于按上述方法接种完结核杆菌的培养管中添加各浓度梯度的化合物。接种完毕后，置37℃恒温孵箱内培养，3周观察结果。将能抑制培养基中细菌生长的最低浓度定为该化合物的最小抑菌浓度(MIC)。
有益效果本发现找到了一种可有效抑制结核杆菌生长的N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物。
该类化合物可用于制备治疗与含有编码吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS)编码基因的微生物引起的相关疾病的药物，包括制备治疗由结核杆菌、大肠杆菌等病原引起的疾病的药物。
表1、化合物的体外抑菌实验部分结果。该表列出了化合物的部分抑菌实验结果，化合物对H37Ra的最小抑菌浓度(MIC)为0.625μg/ml；化合物对H37Rv和临床耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)为0.1μg/ml。实验结果重复了3次。
表1 化合物抑制结核杆菌生长的部分实验结果
图1、化合物对IGPS酶活性的抑制作用。带方块的曲线表示没有化合物作抑制剂时，随着反应的进行，反应体系的光吸收值增加。带圆点的曲线表示化合物(图中标注为comp7)加入反应体系后，体系的光吸收值没有明显的增加。结果表明，化合物显著降低了IGPS酶的催化活性。
图2、化合物与IGPS酶的相互作用。反应曲线由下向上，依次代表浓度由低到高变化时，化合物与IGPS的结合反应曲线。结果说明，随着化合物浓度的升高化合物与IGPS酶的结合能力增加。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括H37Ra、H37Rv和临床耐药菌株均购自上海市肺科医院，而且H37Rv和临床耐药菌株的抑菌实验在上海市肺科医院进行；邻氨基苯甲酸和核糖-5-磷酸二钠均购自SIGMA公司；7H9干粉和7H10干粉购自DIFCO公司。
实施例1 N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物体外抑制IGPS酶活性实验(一)试验方法(1)底物烯醇式1-(O-羧基苯氨基)-1-脱氧核酮糖-5′-磷酸(CdRP)的化学合成①27.4mg邻氨基苯甲酸溶解于0.2mL95％乙醇(1M)，54.8mg核糖-5-磷酸二钠融解于0.2mL水(1M)；②将上述两者混合，室温避光放置5-17h；③用pH4.8-5.1的水稀释10倍，室温避光放置1h，以水解残余的PRA；④用5mL饱和的乙酸乙酯萃取3次，除去多余的邻氨基苯甲酸；⑤产物为30mM CdRP，保存于-20℃。
(2)化合物抑制以CdRP为底物的重组IGPS的活性实验在反应体系中加入470μl5mM Tris，10μl CdRP，20μl 50μg/mL IGPS。在280nm处检测吸光值。并与只有IGPS无CdRP，以及只有CdRP无IGPS在同样反应条件下进行对照，以排除IGPS和CdRP对吸收值的影响。0.1mM CdRP完全转化为IGP导致280nm处OD值增加0.448，将37℃条件下每分钟形成1μM IGP定义为1U。化合物溶于DMSO中配成浓度为10-4M的溶液。
在37℃，pH值为8.0的缓冲体系条件下，检测化合物对IGPS酶活性的影响。
(二)试验结果实验结果(图1)表明，N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物能够显著的抑制IGPS酶的催化活性。使IGPS的酶活性降低为不加化合物时的46.56％。这说明，化合物在体外能够显著的抑制结核杆菌体内的重要潜在药物靶标-IGPS酶的活性。
实施例2 N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物与IGPS相互作用分析实验(一)试验方法将IGPS蛋白(720μg/ml)溶于1％DMSO的PHBS缓冲液。然后在芯片上进行固定。将化合物配置成10-5M、0.5×10-5M、0.25×10-5M、0.125×10-5M、0.625×10-6M、0.3125×10-6M、0.15625×10-6M、0.78125×10-7M、0.390625×10-7M、0.1953125×10-7M等浓度。化合物在biacore3000分析仪上与蛋白质发生结合，测定平衡解离常数(Kd)。
(二)试验结果实验结果证明，N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物与IGPS酶具有较强的结合能力(图2)。不同浓度时化合物与IGPS的结合曲线表明，随着化合物浓度的升高，化合物与IGPS酶的结合能力也在提高，即化合物与IGPS酶的结合能力跟化合物浓度存在一定的正相关性。化合物与IGPS的平衡解离常数(Kd)为1.2e-6。上述实验结果有力的证明，化合物在体外可以很好的与IGPS酶结合。
实施例3N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物体外抑制结核杆菌生长测定(一)试验方法(1)结核杆菌的接种方法取制备好的1mg/ml结核杆菌(H37Ra、H37Rv和临床耐药菌株)株菌悬液5ul，含菌数量1-5×105，分别接种于每支含500ul7H9的液体培养基(7H9干粉4.7g/L，含2ml/L(v/v)甘油和10％ADC，)中。
(2)N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物体外最小抑菌浓度(MIC)的测定将N-苯基-6-哌啶基-N’-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三-2，4-二胺化合物稀释成不同浓度梯度(200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，0.625μg/ml，0.5μg/ml、0.4μg/ml、0.3μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml)，并于按上述方法接种完结核杆菌的培养管中添加各浓度梯度的化合物。接种完毕后，置37℃恒温孵箱内培养，3周观察结果。将能抑制培养基中细菌生长的最低浓度定为该化合物的最小抑菌浓度(MIC)。
(二)试验结果结果发现，N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物能够在较低浓度下显著抑制结核杆菌的生长。其中，化合物对结核杆菌H37Ra的最小抑菌浓度(MIC)为0.625μg/ml；化合物对标准有毒株的最小抑菌浓度(MIC)为0.1μg/ml；化合物对结核杆菌临床耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)为0.1μg/ml。实验结果重复3次(表1)。
上述3个实施例的结果都有力的说明，N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺化合物通过与结核杆菌来源的吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGPS)结合抑制IGPS酶的催化活性，从而有效的抑制了结核杆菌的生长。化合物对H37Ra的MIC为0.625μg/ml；化合物对有毒株和临床耐药菌株的MIC为0.1μg/ml。化合物具有开发成新型抗结核药物的潜力。
参考文献[1]H Zalkin，JL Paluh，M van Cleemput，WS Moye and C Yanofsky，Nucleotidesequence of Saccharomyces cerevisiae genes TRP2 and TRP3 encoding bifunctionalanthranilate synthaseindole-3-glycerol phosphate synthase，J.Biol.Chem.，1984，259，3985-3992. 乐军，刘丽蓉，谢建平，刘蓓，梁莉，王洪海，异烟肼耐药和敏感结核分枝杆菌的比较蛋白质组学研究，中华微生物学和免疫学杂志，2004，24258-262. Yang YP，Zhang M，Zhang HM，Lei JQ，Jin RL，Xu SF，Bao JL，Zhang L，Wang H，Purification，characterization and structural study of Mycobacterium tuberculosisindole-3-glycerol phosphate synthase.Biochemistry(Moscow)2006，71s38-s43.
权利要求
1.一种可以抑制结核杆生长的化合物，其特征在于名称为N-苯基-6-哌啶基-N′-奎宁-8-并哒嗪-1，3，5-三嗪-2，4-二胺，结构式为
2.如权利要求1所述的化合物在制备治疗结合病药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体为一种N－苯基－6－哌啶基－N′－奎宁－8－并哒嗪－1，3，5－三嗪－2，4－二胺(N′－[1－(2－hydroxyphenyl)ethylidene]－4，5－dihydro－1H－benzo[g]indazole－3－carbohydrazide)化合物及其应用，该化合物在对结核杆菌生长的体外抑制试验中，能够显著的抑制结核杆菌的生长。其中，化合物对结核杆菌H37Ra的最小抑菌浓度(MIC)为0.625μg/ml；化合物对标准有毒株H37Rv的最小抑菌浓度(MIC)为0.1μg/ml；化合物对结核杆菌临床耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)为0.1μg/ml。该化合物可以用于制备治疗结核病及其他微生物引起的疾病的药物。
文档编号A61P31/06GK101054375SQ20071004076
公开日2007年10月17日 申请日期2007年5月17日 优先权日2007年5月17日
发明者王洪海, 沈洪波, 黄强, 胡海荣, 徐胜凤, 张雪莲, 王菲菲 申请人:复旦大学