专利名称：金黄色葡萄球菌 DNA 疫苗pcDN A3.1(+)－Minigene及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene及其制备方法。
背景技术：
DNA疫苗的出现是疫苗发展史上的第三次革命。作为一种新型疫苗，DNA疫苗既能刺激抗体反应又能刺激CTL反应。它是利用基因重组技术直接将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA)与质粒重组后，直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，DNA疫苗具有如下优点①免疫保护力增强；②制备简单，省时省力；③同种异株交叉保护；④应用较安全；⑤产生持久免疫应答；⑥贮存、运输方便；⑦可用于防治肿瘤。2005年7月18日世界上首个DNA疫苗获准上市，是DNA疫苗科技的一个里程碑；我国广州解放军第458医院研究的治疗性乙肝DNA疫苗也获得了国内SFDA批准，进入了2期临床研究。这些都显示了DNA疫苗广阔的发展前景。
金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)是人畜化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，但至今仍未有十分有效的疫苗能预防金葡菌的感染。因此，本发明采用新型的DNA疫苗技术，利用其能同时引起细胞和体液免疫的特性，以期能有效地保护机体抵御金黄色葡萄球菌的感染。
金葡菌疫苗一直是众多学者研究的焦点，其候选抗原主要有金葡菌感染初期的黏附素，感染后期的毒素分泌调控因子以及金葡菌分泌的各种毒素。以下为本发明所选用候选抗原的介绍在众多金葡菌感染实验中发现，金葡菌的识别黏附基质的细胞表面组分(MSCRAMM)纤连蛋白结合蛋白(FnBP)是一种重要的黏附素，而MSCRAMM与细胞外基质的相互作用被认为是细菌感染的先决条件。几乎所有的金葡菌都拥有FnBP，有研究发现金葡菌的FnBP能促进菌体在乳腺中的定殖[1]，同时Wubshet等人报道，含金葡菌纤维素结合蛋白(FnBP)的血清对金黄色葡萄球菌型奶牛乳房炎有调理作用。
同时，研究发现AIP(auto-inducing peptides)和RAP(RNAIII activatingprotein)是在金葡菌感染后期中重要的信号肽。细菌在处于高密度时分泌这些分子，它们能下调黏附素的表达同时上调各种酶与毒素的表达。而其中RAP蛋白是通过TRAP蛋白的磷酸化而激活RNAIII转录。因此，TRAP蛋白磷酸化是金黄色葡萄球菌外毒素分泌起始和关键因素。高亚萍等[2]用重组的TRAP蛋白免疫家免得到多抗血清，纯化后的抗体可以特异性识别不同菌株的TRAP蛋白，并抑制TRAP蛋白磷酸化，降低金葡菌外毒素的分泌。目前，已经在不同菌株中发现多种TRAP蛋白，不同的TRAP蛋白之间的同源性都大于85％。
以上2种候选抗原均有相关研究报道显示其蛋白疫苗能有效地刺激机体产生特异性的抗体，但目前尚无发现联合使用这2个抗原作为疫苗的报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene。
本发明的目的之二在于提供该DNA疫苗的制备方法，期望该DNA疫苗能起到调理和抑制金葡菌黏附细胞外基质的作用的同时还能降低金黄色葡萄球菌外毒素的分泌，从而对机体起到免疫保护作用，抵御金葡菌的攻击感染。
为达到上述目的，本发明利用真核表达载体pcDNA3.1(+)，创新性地融合了FnBP的抗原决定簇(D1和D3)以及TRAP的抗原决定簇(该融合基因命名为Minigene)的基因序列，构建多阶段、多价激发多种免疫反应的多表位DNA疫苗。有报道显示象这样呈线性排列抗原肽是一种激活T细胞的有效方式[3，4]，由于疾病复发的主要原因是细胞内感染的金葡菌，因此这样设计是为了能增强其产生的细胞免疫，以达到彻底清除感染部位金葡菌的目的。
根据上述机理，本发明采用如下技术方案一种金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene，其特征在于该疫苗具有SEQ NO 5所示的碱基序列。
上述的金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO 6所示的氨基酸序列。
上述的金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的制备方法，其特征在于该方法具有以下步骤a.Minigene的人工合成根据，FnBP的配体结合基序(D121-34；D320-33)和TRAP蛋白C末端的12个氨基酸的基因序列，设计重组融合基因的序列如下CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACAAGTTATTTTGAAAGATATCTATACCCAATAAAAGAA；再根据上段基因设计上下游引物上游引物5’-CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACT-3’下游引物5’-TTCTTTTATTGGGTATAGATATCTTTCAAAATAACTTGTATCTTCTTCAAAGTCAACACTATTGTGTCCA-3’上述引物互为模板进行PCR扩增，得到120bp的Minigene片段，回收纯化扩增产物；b.重组质粒pcDNA3.1(+)-Minigene的构建根据Minigene末端20个核苷酸序列设计上下游引物上游引物5’-TAAGCTAGCACCATGGGTCAAGGTGGCAATATCGTAGA-3’下游引物5’-GCCGGTACCTTATCATTCTTTTATTGGGTATAGAT-3’以步骤a所得Minigene片段用Nhe I和Kpn I双酶切后插入质粒pcDNA3.1(+)的Nhe I/Kpn I之间，构成重组质粒pcDNA3.1(+)-Minigene。
上述的金黄色葡萄球菌DNA疫苗在制备预防金黄色葡萄球菌感染引起的各种疾病疫苗中的应用pcDNA3.1(+)表达载体是Invitrogen公司开发的较为成熟的真核表达载体，被广泛地应用于基因治疗和核酸疫苗的研究中。目前核酸疫苗的载体多采用的人巨细胞病毒(hCMV)的启动子，可使外源基因得到较好的表达，pcDNA3.1(+)正是采用了CMV启动子。同时pcDNA3.1(+)质粒含有氨苄青霉素抗性基因以用作筛选标记。Raz小组已证实这一抗性基因中含有2个可显著增强基因免疫效果的六寡核苷酸序列5’-AACGTT-3’。此序列含CpG结构，称为免疫激活DNA序列(immuno-stimulatory DNA sequence，ISS)，该序列可作用于多种免疫活性细胞，诱导细胞因子IFN-7、TNF、IL-6、IL-12、IL-18产生，增强DNA疫苗诱导的Th1型免疫应答。
DNA疫苗作为新型的第三代疫苗，与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，DNA疫苗具有如下优点①免疫保护力增强；②制备简单，省时省力；③同种异株交叉保护；④应用较安全；⑤产生持久免疫应答；⑥贮存、运输方便；⑦可用于防治肿瘤。具有广阔的发展前景。
图1为重组质粒pcDNA3.1(+)-Minigene的构建流程2为pcDNA3.1(+)-Minigene免疫小鼠血清中抗Minigene抗体的动态变化。
图3为pcDNA3.1(+)-Minigene免疫小鼠的淋巴细胞体外受融合蛋白Trx-Minigene和Con A刺激后的增殖反应。
具体实施例方式
实施例一金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene及其制备方法1.Minigene的人工合成根据，FnBP的配体结合基序(D121-34；D320-33)和TRAP蛋白C末端的12个氨基酸的基因序列，设计重组融合基因的序列如下CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACAAGTTATTTTGAAAGATATCTATACCCAATAAAAGAA根据上段基因设计上下游引物进行人工合成上游引物5’-CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACT-3’下游引物5’-TTCTTTTATTGGGTATAGATATCTTTCAAAATAACTTGTATCTTCTTCAAAGTCAACACTATTGTGTCCA-3’互为模板进行PCR扩增，得到120bp的Minigene基因。回收纯化扩增产物.
2.构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Minigene根据Minigene末端20个核苷酸序列设计上下游引物，加入酶切位点上游引物5’-TAAGCTAGCACCATGGGTCAAGGTGGCAATATCGTAGA-3’下游引物5’-GCCGGTACCTTATCATTCTTTTATTGGGTATAGAT-3’以先前合成得到的Minigene为模板，PCR扩增之后就得到了120bp左右的Minigene基因。回收纯化扩增产物。
Minigene片段用Nhe I和Kpn I双酶切后插入质粒pcDNA3.1(+)的Nhe I/KpnI之间，构成重组质粒pcDNA3.1(+)-Minigene。转化大肠杆菌DH5α，挑选出抗Ampicillin的阳性克隆。重组质粒pcDNA3.1(+)-Minigene用Nhe I和Kpn I双酶切，得到120bp和5.4kb两个片段，与预期结果相符。DNA序列测定表明，Minigene基因的序列正确。
实施例二DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的免疫效果的评估1质粒DNA的大量制备(1)每250ml培养物用150ml用冰预冷的STE重悬后，4℃，8000rpm离心6min，弃上清，菌体存-20于℃；(2)取一定量的菌体用300ml溶液I重悬，OD为10左右；(3)加入600ml新配置的溶液II，温和颠倒4-6次混匀，室温放置5-10min；(4)加入300ml用冰预冷的的溶液III，温和颠倒4-6次混匀，冰上放置10min；4℃，10000rpm离心30min，弃沉淀，上清用纱布过滤；(5)加入0.6倍体积异丙醇，室温放置10min；室温(25℃)12000g离心15min；小心弃上清，倒置于纸巾上，去除残余上清；(6)室温70％乙醇刷洗管底及管壁，弃乙醇，用1ml枪小心吸去残余乙醇；将离心管倒置在纸巾上，室温干燥10-15min(不要过长)；
(7)30mlTE溶解，冰浴至0℃；(8)加入30ml5mol/LLiCl，混匀，4℃12000g离心10min；(9)弃沉淀，上清加等体积异丙醇，混匀，室温(25℃)12000g离心10min；(10)重复步骤6；(11)将离心管倒置在纸巾上，室温干燥数分钟，不要过长，保持核酸沉淀湿润；(12)2ml含20μg/mlRNase的TE(pH8.0)溶解沉淀，移至1.5ml离心管中；(13)室温放置30min；(14)用等量酚∶氯仿抽提一次，如发现蛋白过多，可以多抽提几次然后再用氯仿抽提一次；(15)加0.1倍体积3mol/L乙酸钠(pH5.2)及两倍体积乙醇(注意次序)沉淀DNA；(16)质粒DNA沉淀用1ml灭菌水溶解，再加入0.5mlPEG-MgCl2溶液；(17)室温沉淀15min，再室温最大转速离心20min；(18)沉淀用0.5ml用70％乙醇重悬，除去痕量PEG，室温最大转速离心10min；(19)重复步骤18，室温晾干20min；(20)最后以少量无菌PBS(pH7.2)溶解DNA。
以紫外分光光度计测DNA溶液的OD260/OD280比值，比值接近1.9认为达到纯度，以OD260＝0.1时的DNA含量为50μg/ml来计算DNA的浓度，将质粒DNA浓度调整为1mg/ml，-20℃冻存备用。
2免疫程序与标本采集将大量抽提纯化得到的重组质粒pcDNA3.1(+)-Minigene，采用肌肉注射分别在第0，2，4周免疫SPF级BALB/c小鼠，每次每只小鼠免疫100μg质粒。同时从第一次免疫起，每隔2周，用毛细血管从小鼠内眦静脉内取血0.5ml，室温静置30分钟后，10000rpm离心20分钟，小心吸取上清(血清)冻存备测。第3次免疫后2周，小鼠用70％酒精消毒后固定，剪开腹部皮肤、腹膜，无菌取脾脏制备细胞悬液。
3 ELISA检测免疫小鼠血清抗Minigene抗体结果免疫pcDNA3.1(+)-Minigene质粒的小鼠抗Minigene抗体产生趋势见图2和表3-1(免疫血清的抗Minigene抗体的平均滴度均为1∶100)，在第6周后，免疫小鼠血清中出现了抗Minigene抗体，并呈现逐渐上升的趋势，在第10周达到顶点(抗体效价为3200)，此时抗体略有下降；同时与注射空质粒的小鼠在同一时期的抗体水平比较有显著性差异(P＜0.05)，参见表1。该结果表明构建的pcDNA3.1(+)-Minigene质粒在体内表达了相应的蛋白，该蛋白具有刺激机体产生体液免疫应答的免疫原性表1pcDNA3.1(+)-Minigene免疫小鼠血清中抗Minigene抗体的动态变化(*表示与空质粒组在统计学上有明显差异性)
4免疫小鼠的淋巴细胞增殖实验结果将细胞悬液以200ul/孔加入96孔细胞培养板中。实验组其中一孔中加入1μgCon A，一孔中什么都不加，其余每孔加入10μg相对应的融合蛋白，调零孔只加培养基不加淋巴细胞。于37℃50ml/L CO2孵箱中培养68h。
取上述培养的细胞，每孔加入20ul MTT(5g/L溶于PBS，pH7.2)，继续培养4h后终止培养，以1000r/min离心10min。吸弃上清，每孔加/入200g/L DMSO150ul，振荡10min，测定OD570值，结果用刺激指数(stimulationindex，SI)表示。SI＝A实验组/A对照组。结果显示，pcDNA3.1(+)-Minigene质粒免疫小鼠可诱导较明显的特异性淋巴细胞增殖(图3)，SI值分别为1.682±0.2542，与空载质粒免疫小鼠相比有显著性差异(P＜0.05)。
5金黄色葡萄球菌攻毒实验结果选用前期实验中免疫14周的小鼠，使用蛋白疫苗加强免疫7天后，通过腹腔注射5×108CFU的进行金葡菌攻毒实验，攻毒实验结果参见表2表2黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene攻毒实验结果
由上表可见该剂量的致死率约为37.5％，实验组的存活率与对照组有显著性差异(P＜0.01)，同时对照组中的小鼠都不同程度地出现安静少动，蜷缩，精神萎糜，毛发疏松，而实验组的小鼠均一切正常。
本发明构建的DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene，通过免疫小鼠实验显示，该DNA疫苗能刺激小鼠机体产生明显和持久的特异性淋巴细胞增殖反应以及一定水平的体液免疫，与相应的pcDNA3.1接种的阴性对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。同时从攻毒实验的结果来看，pcDNA3.1(+)-Minigene质粒能诱导小鼠产生了抗金葡菌感染的抗体，对免疫小鼠起到了免疫保护的作用。
参考文献1 Brouillette E，Talbot BG，Malouin F.The fibronectin-binding proteinsof Staphylococcus aureus may promote mammary gland colonization in alactating mouse model of mastitis.Infect Immun 2003；712292-5.
2.高亚萍，杨光，丁红梅等.TRAP蛋白的抗体制备和初步应用.生物技术通讯，2004，15(5)474-476.
3.Thomson SA，Elliott SL，Sherritt MA，Sproat KW，Coupar BE，Scalzo AA，et al.Recombinant polyepitope vaccines for the delivery of multiple CD8cytotoxic T cell epitopes.J Immunol 1996；157822-6.
4.An LL，Whitton JL.A multivalent minigene vaccine，containingBcell，cytotoxic T-lymphocyte，and Th epitopes from severalmicrobes，induces appropriate responses in vivo and confers protectionagainst more than one pathogen.J Virol1997；712292-302.REKDVSLTAFVLIALHEAKDICEAQVNSLGRSIAKAGDFLENHYRELRRPYTVA IAAYALALLGKLEGDRLTKFLNTAKEKNRWEEPNQKLYNVEATSYALLALLARKDYDTTPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDVPDHKELNLDVSIQLPSRNGSGGGGSGGGGSGSHLIQTPSGCGEQNMIGMTPTVIAVHYLDSTDQWEKFGLEKRQESLELIRKGYTQQLAFRQKSSAYAAFQYRPPSTWVTAYVVKVFALAANLIAIDSKDLCETVKWLILEKQKPDGIFQEDGPVIHQEMIGGFRDTREKDVSLTAFVLIALHEAKDICEAQVNSLGRSIAKAGDFLENHYRELRRPYTVAIAAYALALLGKLEGDRLTKFLNTAKEKNRWEEPNQKLYNVEATSYALLALLARKDYDTTPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDVPDHKELNLDVSIQLPSRNGSGGGGSGGGGSGSHLIQTPSGCGEQNMIGMTPTVIAVHYLDSTDQWEKFGLEKRQESLELIRKGYTQQLAFRQKSSAYAAFQYRPPSTWVTAYVVKVFALAANLIAIDSKDLCETVKWLILEKQKPDGIFQEDGPVIHQEMIGGFRDTREKDVSLTAFVLIALHEAKDICEAQVNSLGRSIAKAGDFLENHYRELRRPYTVAIAAYALALLGKLEGDRLTKFLNTAKEKNRWEEPNQKLYNVEATSYALLALLARKDYDTTPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDVPDHKELNLDVSIQLPSRN949(这段是C3d3的氨基酸序列，是否应该删掉？)
序列表<110>上海大学<120>金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene及其制备方法<140>
<141>
<160>6<210>1<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>1CAA GGT GGC AAT ATC GTA GAT ATC GAT TTT GAT AGT GTA CCT CAA TTC GGT GGACAC AAT AGT GTT GAC T<210>2<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>2TTC TTT TAT TGG GTA TAG ATA TCT TTC AAA ATA ACT TGT ATC TTC TTC AAA GTCAAC ACT ATT GTG TCC A
<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>3TAA GCT AGC ACC ATG GGT CAA GGT GGC AAT ATC GTA GA<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>4GCC GGT ACC TTA TCA TTC TTT TAT TGG GTA TAG AT<210>5<211>120<212>DNA<213>人工合成<220>
<222>
<223>
<400>5CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGAC
TTTGAAGAAGATACAAGTTATTTTGAAAGATATCTATACCCAATAAAAGAA120<210>6<211>40<212>PRT<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<220>
<222>
<223>
<400>6QGGNIVDIDFDSVPQFGGHNSVDFEEDTSYFERYLYPIKE 40
权利要求
1.一种金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene，其特征在于该疫苗具有SEQ NO 5所示的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的编码蛋白，其特征在于该疫苗具有SEQ NO 6所示的氨基酸序列。
3.一种根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Minigene的制备方法，其特征在于该方法具有以下步骤a.Minigene的人工合成根据，FnBP的配体结合基序(D121-34；D320-33)和TRAP蛋白C末端的12个氨基酸的基因序列，设计重组融合基因的序列如下CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACAAGTTATTTTGAAAGATATCTATACCCAATAAAAGAA；再根据上段基因设计上下游引物上游引物5’-CAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTTGATAGTGTACCTCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACT-3’下游引物5’-TTCTTTTATTGGGTATAGATATCTTTCAAAATAACTTGTATCTTCTTCAAAGTCAACACTATTGTGTCCA-3’上述引物互为模板进行PCR扩增，得到120bp的Minigene片段，回收纯化扩增产物；b.重组质粒pcDNA3.1(+)-Minigene的构建根据Minigene末端20个核苷酸序列设计上下游引物上游引物5’-TAAGCTAGCACCATGGGTCAAGGTGGCAATATCGTAGA-3’下游引物5’-GCCGGTACCTTATCATTCTTTTATTGGGTATAGAT-3’以步骤a所得Minigene片段作为模板进行PCR，扩增得到的片段用Nhe I和Kpn I双酶切后插入质粒pcDNA3.1(+)的Nhe I/Kpn I之间，构成重组质粒pcDNA3.1(+)-Minigene。
4.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌DNA疫苗在制备预防金黄色葡萄球菌感染引起的各种疾病疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种金黄色葡萄球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)－Minigene及其制备方法。本发明构建的DNA疫苗pcDNA3.1(+)－Minigene，通过免疫小鼠实验显示，该DNA疫苗能刺激小鼠机体产生明显和持久的特异性淋巴细胞增殖反应以及一定水平的体液免疫，与相应的pcDNA3.1接种的阴性对照组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。同时从攻毒实验的结果来看，pcDNA3.1(+)－Minigene质粒能诱导小鼠产生了抗金葡菌感染的抗体，对免疫小鼠起到了免疫保护的作用。
文档编号A61P31/04GK101066463SQ20071004116
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者陈宇光, 倪继祖, 沈彦萍 申请人:上海大学