专利名称：一种抗痛风的双黄酮类化合物药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有双黄酮类成分的植物提取物或者双黄酮类成分的衍生物或盐类，制备成预防或治疗高尿酸血症和痛风疾病的药物。
背景技术：
痛风是一种嘌呤代谢紊乱引起的疾病。临床特点为高尿酸血症、痛风性关节炎、关节畸形、肾脏病变和尿酸结石、痛风结石形成等。其中高尿酸血症是血中尿酸超过正常的一种状态，是痛风疾病发展过程中的一个阶段；痛风性关节炎是血清尿酸水平增高后，尿酸沉积于关节组织，刺激关节并引发一系列的炎症反应。
现有的药物针对痛风患者在不同时期所表现的症状选择性进行治疗。如抗炎镇痛药物秋水仙碱和消炎痛用于痛风急性发作治疗；排尿酸药物如丙磺舒、苯溴马龙用于间隙期及慢性期治疗；黄嘌呤氧化酶抑制剂药物别嘌呤醇抑制尿酸合成。但上述药物毒副作用大，患者往往不能坚持长期服用，以至不易控制病情。秋水仙碱和消炎痛具有胃肠道刺激作用，前者还导致白细胞降低和脱发等；丙磺舒、苯溴马龙具有胃肠道反应、肾绞痛、及激发痛风急性发作等副作用；别嘌呤醇优质变态反应发生率高达10～15％、超敏综合症可导致27.5％出现斑丘症患者死亡、骨髓抑制虽少见，但后果严重。
血液中的次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化作用下氧化成黄嘌呤，黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化作用下生成尿酸和水，高浓度的尿酸在血液中就形成了高尿酸血症。别嘌呤醇由于能竞争性抑制黄嘌呤氧化酶，所以能有效阻断尿酸的形成，缓解症状。但是这仅仅是一种对症治疗，长期应用有副作用。
天然存在的的黄酮类成分是黄嘌呤氧化酶抑制剂最广泛的来源，其中槲皮素具有较强的抑制黄嘌呤氧化酶的活性，但还没有明显的证据表明单纯用槲皮素纯品有较好的疗效。目前发现和报道天然存在的卷柏属多种植物及其提取物具有抑制黄嘌呤氧化酶和脂氧化酶等多种活性，但是没有揭示其起作用的主要活性成分群及其组合配比。
本专利研究发现，天然存在的双黄酮化合物具有较好的黄嘌呤氧化酶抑制活性和治疗痛风的疗效，其中尤以包含有罗波斯塔双黄酮(robustaflavone)、罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚、穗花杉双黄酮(amentoflavone)等双黄酮成分进行配比组合的植物提取物的抑制效价比较高。我们观察到这样一些事实这些双黄酮化合物的分子量一般大于500，有较大的空间位阻。因此，我们推论这些双黄酮化合物不能自由进出细胞，一般不会进入细胞、干扰细胞内的氧化还原反应，而主要在细胞外液中发挥抗氧化作用和抑制黄嘌呤氧化酶的作用，同时保护细胞膜使其不被氧化，所以虽然它们对黄嘌呤氧化酶的活性不及槲皮素等成分，但其疗效较高，副作用较少。第二个事实是虽然这些双黄酮化合物中某些成分的单体对黄嘌呤氧化酶的抑制效价较高，但它们的纯品无论是水溶性或是脂溶性都不好，所以分散度不高，疗效还是有限，必需通过衍生化改善溶解性能。第三，含有一定比例的多种双黄酮类成分混合物的药用植物提取物的溶解性能能够大大改善，这些混合物中通常含有一定比例的罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚和穗花杉双黄酮。在同样比例下，含有这些双黄酮化合物的粗提取物与较纯的总双黄酮提取物相比较其抑制效价并不降低，或者抑制效价更高；而且事实上它们的溶解性和治疗效果也更好。
发明内容
从药用植物中分离得到的穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚等双黄酮化合物具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性，它们能被用于治疗痛风和由黄嘌呤产生尿酸导致的一系列症状。含有的这些双黄酮化合物的药用植物细叶卷柏、薄叶卷柏、翠云草、江南卷柏的提取物，同样具有较好的黄嘌呤氧化酶抑制活性、同时具有更好的溶解性，因而有更好的治疗效果。实验证实这些双黄酮化合物和这些提取物具有较低的细胞毒性，较大的半数致死率，因而有极其安全的使用剂量，可以作为抗痛风药物开发。同时，这些双黄酮化合物具有抗脂氧化酶和环氧化酶的作用，可以较好地缓解由于尿酸生成过程中产生的自由基导致的炎症反应，减轻痛风的各种症状。
本发明通过以下技术方案实现一种抗痛风的药物制剂，其特征在于该药物制剂主要是由天然提纯的或未提纯的或合成的罗波斯塔双黄酮(robustaflavone)、罗波斯塔双黄酮-4’-甲醚(4’-O-methylrobustaflavone)、罗波斯塔双黄酮7″-甲醚(7″-O-methylrobustaflavone)、穗花杉双黄酮(amentoflavone)、扁柏双黄酮(hinokiflavone)、苏铁杉双黄酮(Sotetsuflavone)、异柳杉双黄酮(isocryptomerin)、银杏双黄酮(bilobetin)、白果双黄酮(ginkgetin)、鸡毛松双黄酮A(7，7″，4′-tri-O-methylrobustaflavone)、鸡毛松双黄酮B(7，7″-di-O-methylrobustaflavone)、贝壳杉双黄酮(agathisflavone，即5-acetyl-7，4-dimethoxyflavone-(6-8)-5-acetyl-7，4-dimethoxyflavone)、倭氏藤黄双黄酮(volkensiflavone即5，7，4’-trimethoxy-flavanone-(3-8)-5-acetyl-7，4-dimethoxyflavone)、桑藤黄双黄酮(morelloflavone)，2″，3″-二氢-4′-甲氧基穗花杉双黄酮(2″，″-dihydro-4′-O-methyl Amentoflavone)等双黄酮化合物中的一种或一种以上的双黄酮化合物组成，或者由上述至少一种化合物与辅助成分的药物组成。
本发明所述的抗痛风的药物制剂，其所含的罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮、苏铁杉双黄酮、异柳杉双黄酮、银杏双黄酮、白果双黄酮、鸡毛松双黄酮A、鸡毛松双黄酮B、贝壳杉双黄酮、倭氏藤黄双黄酮、桑藤黄双黄酮成分，2″，3″-二氢-4′-甲氧基穗花杉双黄酮，来自于天然植物提取物，其天然植物提取物至少含有其中一种双黄酮类成分。
本发明所述的抗痛风的药物制剂所含的双黄酮化合物质量配比为罗波斯塔双黄酮0～50％，罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚0～50％、穗花杉双黄酮0～50％，该药物制剂至少含有上述其中一种双黄酮类成分。
本发明所述的抗痛风的药物制剂，其所含的双黄酮化合物可以是罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚、穗花杉双黄酮的衍生物或盐，例如罗波斯塔双黄酮的四硫酸钾盐。
本发明所述的抗痛风的药物制剂，以不同的给药途径配以不同的辅料、制成相应的内服或外用的剂型，用于治疗高尿酸血症引起的各种痛风症状。
本发明所述的剂型是任何一种药剂学上所说的剂型。是为所述的双黄酮化合物与任何一种药剂学上所述的辅料混合制成的任何一种药剂学上所说的剂型。
具体实施例方式
实施例1双黄酮化合物及其组合物体外抑制黄嘌呤氧化酶的实验1.1样品材料、试剂穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮(robustaflavone)、罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚等双黄酮化合物纯品系湖北中医学院实验室从卷柏属药用植物中分离得到的单体化合物，经结构鉴定确证，用归一法计算含量97％以上。双黄酮化合物组合物是从药用植物中经提取得到的主含多种双黄酮化合物的药用植物提取物，其总黄酮含量35％～45％，其所含穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮(robustaflavone)、罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚的比例见表1。
表1 各种提取物中三种双黄酮的组合比例(质量百分数)
仪器和试剂 DU640分光光度计(Beckman Inc.USA)，带有动力学/时间软件。黄嘌呤氧化酶(XOD)(Sigma，lot024K3783)，黄嘌呤(Sigma，lot85H71952)；槲皮素(中国药品生物制品检定所，10081-9906)；二甲亚砜(Amresco)，其余试剂均为分析纯。
1.2方法1.2.1底物溶液由0.2毫摩尔/升黄嘌呤溶液和0.2摩尔/升磷酸钾盐缓冲液(pH 7.5，含1毫摩尔/升EDTA)组成。
1.2.2XOD活力测定在黄嘌呤氧化酶的催化下，黄嘌呤被氧化成尿酸，即发生下列反应
XOD活力由检测产物尿酸的特征吸收峰(λ＝290nm)处的光度值确定。实验方法参照文献(P.Cos，et al.Structure activity relationship and classification offlavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scanvengers.J.Nat.Prod.，1998，6171)描述的方法，在290nm处用分光光度法测定。每隔5秒钟在290.0nm处纪录吸光度及吸光度增长的数值，共计5分钟。在任意一个适当长的时间段内，吸光度随时间呈线性增加，斜率为反应速率(dA/min)，斜率越大，说明酶的活力越强。
1.2.3样品测定把植物提取物溶解在二甲亚砜(DMSO)中，得到不同浓度的样品溶液(DMSO最终浓度＜1％)。取适量加到石英比色皿中。重复上述操作，每隔5秒钟在290nm处纪录吸光度增长的数值，共计1分钟。每个样品平行操作3次，分别记录反应速率，取平均值计算样品的抑制率。
1.2.4空白对照重复上述操作，不加样品和黄嘌呤氧化酶，但加与样品同样体积的二甲亚砜，记录吸光度的变化，作为空白对照。
1.2.5黄嘌呤氧化酶对照品测定方法与样品测定相同，只是不加样品。
1.2.6阳性对照品为了核对实验结果的可信性，取槲皮素溶解在二甲亚砜中得到不同浓度的溶液，重复上述实验，计算IC50。
1.3结果采用SPSS 13.0统计软件包进行数据处理，先根据下列公式计算样品对XOD的抑制率抑制率＝[1-(Rs-Ro)/(Rp-Ro)]×100％式中Rs、Ro、Rp分别表示样品、空白对照和XOD对照品的反应速率。
再以抑制率(inhibitory rate)为因变量，以样品浓度(concentration)为自变量计算回归方程。因抑制率与样品浓度呈线性关系，故直接根据回归方程计算抑制率为50％的样品浓度IC50。实验结果见表2。
表2 双黄酮化合物及含有这些化合物的提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用(IC50mg·L-1)
1.4小结以上，对三种双黄酮化合物和含有双黄酮化合物的四种卷柏属药用植物提取物进行了体外抑制黄嘌呤氧化酶活性的实验，发现罗波斯塔双黄酮、穗花杉双黄酮和几种含有双黄酮化合物的卷柏属药用植物提取物具有较高的黄嘌呤氧化酶抑制活性。罗波斯塔双黄酮一4’-甲醚虽然黄嘌呤氧化酶的抑制活性不高，但其在提取物中的含量一般较高，它并未较大幅度降低整个粗提取物的活性，而是大大增加了提取物的溶解性。
实施例2、双黄酮化合物及其组合物体外抑制脂氧化酶的实验2.1材料、仪器和试剂双黄酮化合物和几种双黄酮化合物的组合物同实施例1。
仪器和试剂 DU640分光光度计(Beckman Inc.USA)，带有动力学/时间软件。脂氧化酶LOX(Sigma，lot118F03422)、亚油酸(Sigma，lot015K1200)；槲皮素(10081-9906)；二甲亚砜和吐温-20(Tween-20 Amresco)，其余试剂均为分析纯。
2.2方法2.2.1试液配制3.3毫摩尔/升底物溶液取亚油酸157.2微升，吐温-20(Tween-20)157.2微升，水10毫升，再加1摩尔/升NaOH 0.5毫升使溶液澄清，加水至25毫升，混合均匀得到底物储备液。底物储备液用0.2摩尔/升磷酸盐缓冲液稀释得3.3毫摩尔/升底物溶液，使用前充氧2分钟。
2.2.2LOX活力测定实验方法参照文献(Chen，AO；Whitaker，JR.Purification andcharacterization of a lipoxygenase from immature English peas[J].J.Agri.FoodChem，1986，34203~211.)描述的方法，在234nm处用分光光度法测定，脂氧化酶浓度为1.08微克/·毫升，每隔5秒钟在234nm处纪录吸光度及吸光度增长的数值，测定时间5分钟，吸光度随时间呈线性增加，斜率为反应速率(dA/min)，斜率越大，说明酶的活力越强。
2.2.3样品测定把植物提取物溶解在二甲亚砜(DMSO，最终浓度＜1％)中，得到不同浓度的溶液。取适量加到石英比色皿。重复上述操作，每隔5秒钟在234nm处纪录吸光度增长的数值，共计2分钟。每个样品平行操作3次，分别记录反应速率，取平均值计算样品的抑制率。
2.2.4空白对照重复上述操作，不加样品和LOX，但加与样品同样体积的二甲亚砜，记录吸光度的变化，作为空白对照。
2.2.5LOX对照品测定方法与样品测定相同，只是不加样品。
2.2.6阳性对照品为了核对实验结果的可信性，取槲皮素溶解在DMSO中得到不同浓度的溶液，按2.3方法进行测定。
2.3结果采用SPSS 13.0统计软件包进行数据处理，先根据下列公式计算样品对LOX的抑制率抑制率＝[1-(Rs-Ro)/(Rp-Ro)]×100％，式中Rs、Ro、Rp分别表示样品、空白对照和LOX对照品的反应速率。再以抑制率(inhibitory rate)为因变量，以样品浓度(concentration)为自变量计算回归方程。因抑制率与样品浓度呈线性关系，直接根据回归方程计算抑制率为50％的样品浓度IC50，实验结果见表3。
表3 双黄酮化合物及其组合物对脂氧化酶的抑制作用(IC50/μg·mL-1)
2.4讨论和小结脂氧化酶涉及到白三烯、前列腺素等的生物合成路径并诱导脂肪酸的氧化，这些也涉及到炎症、硬化、癌症等过程。实验结果显示，上述卷柏属几种植物的提取物对LOX的IC50一般小于10微克/毫升，均显示了较强的LOX抑制活性，是主要活性部位。从这些部位分离得到了具有活性的多种双黄酮化合物。因此这些植物提取物和化合物在抑制黄嘌呤氧化酶的同时，也能抑制质氧化酶，抗击高尿酸血症导致的炎症和细胞膜氧化，有利于症状的缓解。
从实验结果看，几种双黄酮化合物单体活性成分有较强LOX抑制活性，但并不比上述含有这些成分的植物粗提取物的活性强很多。这些植物中含有双黄酮的粗提取物比含有这些双黄酮化合物较纯的总提取物具有更好的溶解件能，因而具有更好的作用效果，组合物3给出了明显的证据。
实施例3、体内抗高尿酸血症的药效学实验3.1实验材料雄性昆明种小鼠，体重(24±2)克，购于湖北省实验动物中心。某药用植物的80％乙醇提取物，其中总黄酮含量大于35％，其所含有的双黄酮化合物中穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚之比为75∶15∶5。
2、实验方法将40只雄性小鼠随机分成4组，每组10只，每天i.g(灌胃).给药一次，连续4天，其中生理盐水组和高尿酸血症模型组每天按100毫升/千克剂量i.g.生理盐水，高尿酸血症模型组在采血前2小时ip(腹腔注射)氧嗪酸钾盐，给药组在最后一次给药前一小时ip氧嗪酸钾盐。最后一次给约后2小时从动物眼眶后静脉丛采血，测定血清尿酸水平。
含有双黄酮化合物组合物的植物提取物对血清尿酸水平的影响结果见表4。在此实验条件下，提取物和对照组别嘌呤醇均能显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平。
表4 提取物对血清尿酸水平的影响结果
与模型空白对照组相比较**P＜0.01以上结果说明这些双黄酮化合物的组合物能显著降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平。
实施例4、制剂实施实例11、处方 选用下列用量的药物组合物和附加剂，制备分散片穗花杉双黄酮 75克罗波斯塔双黄酮15克罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚 5克聚乙二醇(PEG)6000 900克淀粉 适量(加至1200克)乳糖 50克聚乙烯吡烷酮(PVP) 50克硬脂酸镁 5克制成2000片。
2、制备取穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚、聚乙二醇6000，将PEG6000加热熔融，取药物加热溶解于适量无水乙醇中，再加入到熔融状态下的载体中不断搅拌，使混合均匀，并于80℃搅拌挥去溶媒，然后迅速倾倒入预冷的不锈钢板上，涂成薄层，在-20℃条件下冷却固化，成品贮于干燥器中数日，研细，过60目筛，再加入淀粉、乳糖，聚乙烯吡烷酮湿法制粒，烘干，整粒，加入硬脂酸镁等，混匀，压片，包衣，即得。
实施例5、制剂实施实例21、处方 选用下列用量的药物组合物和附加剂，制备胶囊剂总黄酮提取物 100克(总黄酮提取物含总黄酮50％～60％，其中穗花杉双黄酮30～40％，罗波斯塔双黄酮5～10％，罗波斯塔双黄酮-4’--甲醚3～8％)碳酸钙10％淀粉 加至300克制成1000片。
2、制备取总黄酮提取物、碳酸钙、淀粉，湿法制粒，烘干，整粒，过80目筛，干法制粒，整粒，灌装于胶囊中，即得。
实施例6、制剂实施实例3处方罗波斯塔双黄酮(含量90％)50克聚乙二醇(PEG)4000+卵磷脂900克淀粉适量(加至1200克)乳糖50克聚乙烯吡烷酮50克硬脂酸镁5克制成2000片。
2、制备取聚乙二醇4000、卵磷脂加热熔融，取药物加热溶解于适量无水乙醇中，再加入到熔融状态下的载体中不断搅拌，使混合均匀，并于80℃搅拌挥去溶媒，然后迅速倾倒涂成薄层，在-20℃条件下冷却固化，成品贮于干燥器中数日，研细，过120目筛，再加入淀粉、乳糖，聚乙烯吡烷酮湿法制粒，烘干，整粒，加入硬脂酸镁等，混匀，压片，包衣，即得。
权利要求
1.一种抗痛风的药物制剂，其特征在于该药物制剂主要是由天然提纯的或未提纯的或合成的罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’-甲醚、罗波斯塔双黄酮7″-甲醚、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮、苏铁杉双黄酮、异柳杉双黄酮、银杏双黄酮、白果双黄酮、鸡毛松双黄酮A、鸡毛松双黄酮B、贝壳杉双黄酮，倭氏藤黄双黄酮、桑藤黄双黄酮、2″，3″-二氢-4′-甲氧基穗花杉双黄酮化合物中的一种或一种以上的双黄酮化合物组成，或者由上述至少一种双黄酮化合物与辅助成分的药物组成。
2.根据权利要求1所述的抗痛风的药物制剂，其特征在于它所含的罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮-4’-甲醚、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮、苏铁杉双黄酮、异柳杉双黄酮、银杏双黄酮、白果双黄酮、鸡毛松双黄酮A、鸡毛松双黄酮B、贝壳杉双黄酮、倭氏藤黄双黄酮、桑藤黄双黄酮成分，2″，3″-二氢-4′-甲氧基穗花杉双黄酮，来自于天然植物提取物，其天然植物提取物至少含有其中一种双黄酮类成分。
3.根据权利要求1所述的抗痛风药物制剂，其特征在于它所含的双黄酮化合物混合物的质量比为罗波斯塔双黄酮0～50％，罗波斯塔双黄酮-4’一甲醚0～50％、穗花杉双黄酮0～50％，该药物制剂含有上述混合物或至少含有上述其中一种双黄酮类成分。
4.根据权利要求1所述的抗痛风的药物制剂，其特征在于该药物制剂剂型是任何一种药剂学上所说的剂型。
5.根据权利要求1所述的抗痛风的药物制剂，其特征在于该药物制剂剂型，是由所述的双黄酮化合物与任何一种药剂学上所述的辅料混合制成的任何一种药剂学上所说的剂型。
全文摘要
一种抗痛风的双黄酮类化合物药物制剂，它主要由天然存在的经提纯、或未提纯的、或合成的罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔双黄酮－4’－甲醚、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮、苏铁杉双黄酮、异柳杉双黄酮、银杏双黄酮、白果双黄酮、鸡毛松双黄酮A、鸡毛松双黄酮B、贝壳杉双黄酮、倭氏藤黄双黄酮、桑藤黄双黄酮、2″，3″－二氢－4′－甲氧基穗花杉双黄酮中的一种或一种以上的化合物组成，或者由上述至少一种化合物与辅助成分药物组成。这些化合物单独应用或者它们相互配伍制成药剂学上的剂型，或者与药剂学上所述的任一辅料混合制成药剂学上的剂型，具有抑制黄嘌呤和次黄嘌呤氧化成尿酸的能力，有明显的抗氧化活性，能有效地缓解高尿酸血症及其继发性炎症，预防和治疗痛风症。
文档编号A61P19/06GK101049301SQ20071005215
公开日2007年10月10日 申请日期2007年5月14日 优先权日2007年5月14日
发明者陈科力, 谭文界, 徐嘉诚, 黎莉, 江雪平, 范小磊 申请人:湖北中医学院