专利名称：：大叶蛇葡萄提取物在制备治疗高血压药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及大叶蛇葡萄提取物蛇葡萄素(Ampelopsin)、杨梅素(Myricetm)和杨梅苷(Myricetrin)的提取方法和用途，特别涉及蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷在制备治疗高血压药物中的应用。技术背景大叶蛇葡萄(v4wpe/opw'.wega/op/z^/aDielset.Gilg)又称大叶山葡萄，是葡萄科蛇葡萄属植物，为湖北省恩施地区的民间药物，其药用部位是嫩茎及叶。该药收载于《湖北中草药志》，具有降血压、降胆固醇之功效；临床用于治疗原发性高血压病，疗效显著。恩施地区的民间于夏季采摘嫩枝叶，置沸水中稍烫一下，即时捞起，沥干水分，摊放于通风处吹干，至表面出现星点白霜时即可烘干收藏，称为霉茶，开水泡茶服，治疗高血il。大叶蛇葡萄生长于海拔700米左右的山坡林缘处，主产于我国云南东北部、贵州、四川、湖北、陕西和甘肃南部。蛇葡萄属药用植物在我国分布广泛，主要含有黄酮类、酚类及鞣质、五环三萜类、甾醇类、有机酸、有机醇类、挥发油等成分；药理实验研究表明本属植物多具有消炎镇痛、祛痰止咳、抑菌、抗高血压、保肝护肝等多方面显著的药理活性；临床上适用于多科多种病症的治疗，具有极高的开发价值和可靠的开发前景。有关大叶蛇葡萄及其主要成分蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷的公开的专利和发表的文献大致可分为—二类第一类是关于利用中药鉴定和中药化学的方法研究大叶蛇葡萄品种鉴定、蛇葡萄素提取分离和以杨梅素计总黄酮在植物中的含量。张汉萍，凌智群，全笑雨，杨林.大叶蛇葡萄化学成分的研究.同济医科大学学报，1998，27(4):267;张秀桥，程莲银，张琦，钱桢.霉茶的性状和显微鉴别.中药材，2004，27(5):330;张秀桥，杨文双，钱桢.霉茶中黄酮类成分的定性鉴别及总黄酮的含量测定.长春中医学院学报，2004，20(40):35等。第二类是关于蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷生物活性的研究。在这些报道中蛇葡萄素具有祛痰、止咳以及保肝、护肝作用，钟正贤，覃洁萍，周桂芬等.广西瑶族藤茶中二氢杨梅树皮素的药理研究.屮国民族医药杂志，1998,4(3):4244;二氢杨梅素F和G，表现出明显的抗四氯化碳和半乳糖胺所导致的肝损伤，又证实了ampelopsinE和反式a卿elopsinE表现出抗肝炎毒素作用，Yoshiteru0shima，etal.AmpelopsinsFandG,novelbridgedplantoligostilberesfromAmpelosisbrevi印edunculatavar.hanceiroots.Tetrahedron,1993,49(26):5801;蛇葡萄素对小鼠黑色素瘤B16细胞有明显的抑制作用，刘德育，丘明祺，梁婷韵.无剌根中蛇葡萄素的提取及其对黑色素瘤的抑制作用.中山医科大学学报，1999，20(2):127129;蛇葡萄素对人肝癌Bel-7402细胞和白血病HL-60，K362细胞增殖有明显的抑制作用，朱孝峰,谢冰芬.蛇葡萄素诱导肝癌细胞凋亡及周期影响.中草药，1999,30(增刊)165167;周宁宁，朱孝峰,谢冰芬等.无刺根中蛇葡萄素体外抗肿瘤作用研究.广东药学，2000，10(4):78。第三类是关于蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷提取方法和生物活性的研究方面的专利。CN1596887公开了二氢杨梅素在制备降血脂的药物和保健品中的用途。CN1596888;公开了二氢杨梅素在制备镇痛、祛痰的药物和保健品中的用途。CN1288892公开了一种从葡萄科植物中提取二氢杨梅素的方法，包括通过各种溶剂(水和/或有机溶剂)煎煮葡萄科植物，煎煮一次或多次，煎煮液经过滤，浓縮，再用热水溶解，乘热过滤，滤液直接用色谱分离；或者用超声提取，合并滤液，蒸出溶剂，再用热水溶解，乘热过滤，滤液直接用色谱分离，得二氢杨梅素晶体；该发明还涉及二氢杨梅素在制备治疗肝炎，保肝护肝，抗菌消炎和增强免疫系统免疫力的药物和保健品中的用途。CN1288747公开了具有治疗肝炎，保肝护肝，抗菌消炎，镇痛，降血脂，祛痰和增强免疫系统免疫力作用的含有二氧杨梅素的药物组合物和保健品。CN1375289公开了一种具有治疗肝炎，保肝护肝，抗菌消炎和增强免疫系统免疫力作用的总黄酮组合物，其含有10—70wt^的蛇葡萄素，0.5—3wt^的杨梅甙，0.2—3wt^的没食子酸；公开了其制备方法，以及其在制备治疗肝炎，保肝护肝，抗菌消炎和增强免疫系统免疫力的药物或保健品或饮料中的用途。CN1393443公开了用显齿蛇葡萄植物生产二氢杨梅树皮素的方法。该生产方法是取显齿蛇葡萄植物干燥茎叶，用水或乙醇按料液比l:(1-20)在50-IOO'C的温度下，浸提0.5-3小时，减压过滤，浓缩滤液，得粗二氢杨梅树皮素的粗提液，干燥粗提液，得粗二氢杨梅树皮素干燥物，再对其进行提纯和精制。所制得的二氢杨梅树皮素可作为抗心律失常、抗心肌缺血、抗高血压和祛痰、消炎、止咳、降脂、保肝护肝的新型药物。CN1375289公开了一种具有治疗肝炎，保肝护肝，抗菌消炎和增强免疫系统免疫力作用的总黄酮组合物，其含有10—70wt^的蛇葡萄素，0.5—3wtX的杨梅甙，0.2—3wtX的没食子酸；公开了其制备方法，以及其在制备治疗肝炎，保肝护肝，抗菌消炎和增强免疫系统免疫力的药物或保健品或饮料中的用途。CN1442136考察了蛇葡萄素体外抗HIV-l的作用，在小鼠免疫抑制模型中对细胞免疫功能的调节功能，观察了蛇葡萄素对HIV-l感染人PBMCs及MT-4细胞的保护作用、对HIV-l辅助受体CXCR4的抑制作用，表明蛇葡萄素具备体外抗HIV的作用，能够下调PBMCs表面的CXCR4，能够增强小鼠免疫抑制模型的免疫功能，表明蛇葡萄素具有预防、治疗艾滋病的作用，可用于制备防治艾滋病的药物。CN1605335公开了含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在制备广谱抗病毒药物和制备提高免疫力药物中的用途，其中所述含有二氢杨梅索和杨梅素的组合物中二氢杨梅素含量是20%至98%重量比，杨梅素含量是2%至80%重量比，所述药物组合物所抗病毒是乙肝病毒、流感病毒和/或冠状病毒。CN1478473公开了含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在制备降血糖药物中的用途，其中所述含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物中二氢杨梅素含量是20%至98%重量比，杨梅素含量是2%至80%重量比。CN1457774公开了一种降血糖的药物组合物，特征在于其含有降血糖有效量的蛇葡萄素和药学可接受赋形剂。所述组合物优选含有2%至98%重量比的蛇葡萄素。该发明还公开了所述组合物的制备方法，以及蛇葡萄素在制备降血糖药物中的用途。CN1457775公开了一种新的组合物，其含有二氢杨梅素和杨梅素，其中二氢杨梅素含量是20%至98%重量比，杨梅素含量是2%至80%重量比，所述组合物还含有一种或几种选自下面的成分杨梅甙，没食子酸和/或茶多酚。所述组合物在制药领域和保健品领域具有广泛用途。该发明还公开了所述组合物的制备方法。CN1644199公开了一种广谱抗病毒药物组合物，其含有抗病毒有效量的蛇葡萄素和药学可接受赋形剂，其中所述药物组合物所抗病毒是乙肝病毒、流感病毒和/或冠状病毒。该发明还公开了所述组合物的制备方法，以及蛇葡萄素在制备广谱抗病毒药物中的用途。CN1611215公开了二氢杨梅素在制备药物中的应用。具体用于制备治疗口腔溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急性或慢性咽炎、盆腔炎和/或附件炎、慢性胃炎和/或肠炎的药物。可以和在药学上能接受的载体混合，制备的药物可以只含二氢杨梅素，也可以是含二氢杨梅素的组合物；可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂；每片或每粒胶囊或每小包或每支中含二氢杨梅素50-1000mg。发明还涉及采用低温处理重结晶从显齿蛇葡萄中制备二氢杨梅素的方法。CN1634028考察了蛇葡萄素对血管内皮细胞的增殖的抑制功能，还考察了蛇葡萄素对人肝癌细胞合成分泌VEGF、bFGF的抑制作用，结果表明蛇葡萄素对血管内皮细胞的增殖有抑制作用，对VEGF、bFGF的合成分泌有抑制作用，表明蛇葡萄素可望作为血管生成抑制剂，实验表明无论采用口服、注射剂型均有效。CN1682713公开了一种预防和/或治疗与醛糖还原酶相关疾病的药物，其含有预防和/或治疗与醛糖还原酶相关疾病的有效量的蛇葡萄素和药学可接受赋形剂，其中所述与醛糖还原酶相关疾病包括高血糖并发症，高血糖并发症包括糖尿病并发症。该发明还公开了所述药物在制备预防和/或治疗与醛糖还原酶相关疾病的药物中的用途。在国家知识产权局相关检索中并未发现关于蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷在制备治疗高血压药物中的应用的文献。
发明内容本发明的目的在于针对高血压治疗领域急需解决的问题，寻找出新的低毒、高效天然药物资源。本发明提供一种从大叶蛇葡萄04mpe/o;w提取取物蛇葡萄素(Ampelopsin)、杨梅素(Myricetin)和杨梅苷(Myricetrin)用于制备治疗高血压制剂原料药的工艺，以及3个单体成分或三者之任意组合与药理学上允许的添加成分相组合而成的治疗高血压制剂剂型。本发明提供的治疗高血压制剂中的蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷由大叶蛇葡萄提取，其纯度分别大于99%、98%和98%，作为制备治疗高血压制剂中的有效成分。所说的高血压为医学上所属的二类高血压，包括第一类原发性高血压(essentialhypertension)又称高血压病(hypertensivedisease);第二类为继发性高血压(secondaryhypertension)又称症状性高血压(symptomatichypertension)。本发明提供的治疗高血压制剂，为蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷与药理学上允许的添加成分相组合而成的剂型。所述制剂剂型为经口给药的固体制剂片剂、胶囊剂、颗粒剂，或经口给药的液体制剂糖浆剂。从大叶蛇葡萄得到提取物的提取工艺步骤是(参见附图1):步骤l、称取大叶蛇葡萄叶和嫩茎，粉碎，分别以原料药质量10倍量的95%、75%乙醇渗漉提取一次，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至小体积，加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部位减压回收溶剂，并减压干燥得浸膏；步骤2、取步骤l得到的浸膏与硅胶按质量l:l拌匀，加入到硅胶柱上端，进行柱色谱分离，依次用石油醚-丙酮梯度洗脱，石油醚-丙酮体积比分别为9:1、8:2、7:3、6.5:3.5、5.5:4.5、4.5:3.5、3:7，然后用丙酮洗脱。以500mL为一个流份号，收集1257号流份，合并相同流份；步骤3、将步骤2流份用高血压模型进行活性筛选，筛选出具降压活性的部位主要集中在石油醚-丙酮梯度混合液体积比为6.5:3.53:7的流份；步骤4、对步骤3筛选出的6.5:3.5流份，进一步用硅胶色谱柱、S印hadexLH-20色谱柱及重结晶方法分离，得到杨梅素(Myricetin)，含量1.52%;步骤5、对步骤3筛选出的5.5:4.5流份，进一步S印hadexLH-20色谱柱及重结晶方法分离，得到蛇葡萄素(A即el叩sin)，含量4.4%;步骤6、对步骤3筛选出的4.5:5.5和3:7流份，进一步S印hadexLH-20色谱柱及重结晶方法分离，得到杨梅苷(Myricetrin)，含量0.004%。图l是从大叶蛇葡萄提取、分离杨梅素、蛇葡萄素和杨梅苷3个单体的工艺流程图；图2是杨梅素(Myricetin)的分子结构式；图3是蛇葡萄素(Ampel叩sin，二氢杨梅素)的分子结构式；图4是杨梅苷(Myricetrin)的分子结构式。具体实施方式下面通过实施例对本
发明内容作进一步说明。实施例1:按图1的工艺流程从大叶蛇葡萄提取、分离得到蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷3个单体提取物。步骤l、称取大叶蛇葡萄叶和嫩茎8.5kg，粉碎，分别以85kg(大叶蛇葡萄叶和嫩茎质量的10倍量)95%、75%乙醇渗漉提取一次(浸泡24h，流速10ml/min)，合并提取液，减压回收乙醇并浓縮至小体积(5.5L),加水分散(共加水至12L)，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部位减压回收溶剂，并减压干燥得浸膏1360g;步骤2、取步骤l得到的浸膏200g与硅胶按质量l:l拌匀，加入到2000g硅胶柱上端，进行柱色谱分离，依次用石油醚-丙酮梯度洗脱，石油醚-丙酮体积比分别为9:1、8:2、7:3、6.5:3.5、5.5:4.5、4.5:3.5、3:7，然后用丙酮洗脱。以500mL为一个流份号，收集1257号流份，合并相同流份。步骤3、将步骤2流份用高血压模型进行活性筛选，筛选出具降压活性的部位主要集中在石油醚-丙酮梯度混合液体积比为6.5:3.5、5.5:4.5、4.5:3.5、3:7的流份；步骤4、对步骤3筛选出的6.5:3.5流份，进一步用硅胶色谱柱、S印hadexLH-20色谱柱及重结晶等方法分离，得到杨梅素(Myricetin)，19g;步骤5、对步骤3筛选出的5.5:4.5流份，进一步S印hadexLH-20色谱柱及重结晶等方法分离，得到蛇葡萄素(Ampelopsin)，55g;步骤6、对步骤3筛选出的4.5:5.5和3:7流份，进一歩S印hadexLH-20色谱柱及重结晶等方法分离，得到杨梅苷(Myricetrin)，50mg。所得的大叶蛇葡萄提取物蛇葡萄素(Ampelopsin)、杨梅素(Myricetin)和杨梅苷(Myricetrin)3个单体化合物的理化表征如下1.蛇葡萄素(Ampel叩sin)，分子结构式(参见附图3)无色针状结晶，mp244'C245'C(甲醇)，分子式为C1SH1208。盐酸-镁粉反应和三氯化铁反应均为阳性；锆盐-枸橼酸反应，先呈黄色，加入枸橼酸黄色不褪；Molish试验为阴性。UV光谱入^，291nm处仅显示一个主要吸收带。13C_NMR(CD3C0CD3):显示了15个碳原子信号，出现在S70200之间。分别为198.0、167.8、164.9、164.0、146.2、134.1、128.9、107.9、101.4、96.9、95.9、84.6、73.1。'H-醒R(CD,,C0CD3):6.62(2H，s);5.98(1H，d，L8Hz)、5.94(1H，d，1.8Hz);4.94(1H，d，J=11.4Hz)、4.56(1H，d，J=11.4Hz);11.72(1H,s)。2.杨梅素(Myricetin)，分子结构式(参见附图2)黄色针状结晶，rap:324。C325。C(甲醇)，分子式为C15H1()08。盐酸-镁粉反应和三氯化铁反应均为阳性。锆盐-枸橼酸反应，先呈黄色，加入枸橼酸黄色不褪；Molish试验为阴性。UV光谱A^，253nm、367nm处有两个主要吸收带。'H-NMR(CD3C0CD3):7.42(2H,s);6.51(1H，d，J=1.8Hz)、6.26(1H，d，J=1.8Hz);12.16(1H，s)。3.杨梅苷(Myricetrin),分子结构式(参见附图4)浅黄色粉末状结晶，mpl77t:178'C(甲醇)。盐酸-镁粉反应和三氯化铁反应均为阳性；锆盐-枸橼酸反应，先呈黄色，加入枸橼酸黄色褪去，提示不含有3-0H或被取代，但含有5-0H;Molish反应显阳性。化合物经酸水解后，得到沉淀和水液两部分，沉淀经TLC鉴定为杨梅素，水液部分经TLC鉴定为鼠李糖。UV光谱X=，262nm、349nm处有两个主要吸收带。'H-丽(CD:i0D)S:6.94(2H，s);6.19(1H，d，J:1.8Hz)、6.35(1H，d，J二1.8Hz)、5.31(1H，d，J=1.8Hz)为鼠李糖端基氢信号，根据其J值，确定为a-型苷键。3.304.21(4H，m)为Rha-H-2Rha-H-5的信号。0.96(3H，d，J=6.0Hz)为Rha-H-6信号。实施例2:大叶蛇葡萄提取物蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷对实验性高血压的作用。步骤1、在乳钵中先加入食用花生油10mL，然后加入Span-8010mL搅拌均匀后，缓缓加入蒸馏水80mL，沿同一方向不断搅拌直至成乳白色乳浊液，即得空白对照试药。步骤2、取复方罗布麻片IL234g置于乳钵中，加入食用花生油10mL,然后加入Span-8010mL搅拌均匀后，缓缓加入蒸馏水80mL，沿同一方向不断搅拌直至成乳白色乳浊液，即得阳性对照试药。步骤3、分别取大叶蛇葡萄提取物蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷适量，置于乳钵中，加入食用花生油10mL,然后加入Span-8010mL搅拌均匀后，缓缓加入蒸馏水80mL，沿同一方向不断搅拌直至成乳白色乳浊液，即得三种实验组试药。步骤4、取健康大鼠，称重，随机分为6组，每组6只，标记鼠号。步骤5、将各组每只大鼠分别进行以下操作用麻醉乙醚进行吸入麻醉；仰卧固定于手术台，腰部下方用小沙袋垫高23cm，剪去胸腰背部毛；从第10胸椎到第3腰椎沿正中线切开皮肤，在左侧季肋下1.52cm和距脊椎lcm处，用小血管钳分开肌肉，分离出左侧肾脏，将肾蒂部用手术线结扎夹持45h;用戊巴比妥钠40mg/mL腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台，颈部剪毛，沿颈部正中线切开皮肤，分开肌肉，找出气管，插入气管插管，结扎。分出颈总动脉，将含有0.1%肝素生理盐水的细塑料管插入颈总动脉，结扎固定，另端连接BL—410生物机能实验系统，描记血压；从腹正中线打开腹腔，找到十二指肠，将配有5ral注射器的尖头细塑料管(十二指肠插管)直接插入十二指肠并用细线固定之，然后关闭腹腔；以上所有手术结束后，于舌下静脉注射肝素生理盐水，体积0.lml/100g，使大鼠体内肝素化；待血压平稳后，记录血压值；然后放开肾蒂部的手术线，大鼠血压在数分钟内可逐渐升高至评值，记录坪值血压；由十二指肠插管给药，体积lraL/100g，观察并记录其降压效果和降压后的血压值。步骤6、详细记录实验中各组每只大鼠放夹前、放夹后及给药后的血压值，并分别以收缩压及舒张压两个指标进行考察，实验数据统计结果见表l、2。步骤7、结果分析如下将蛇葡萄素组、杨梅素组、杨梅苷组的放夹后血压与给药后血压，分别与空白对照组采用成组资料两样本均数比较的t检验方法进行分析，分别以收縮压及舒张压两个指标进行考察，结果见表3。表l3个单体提取物对急性肾动脉型高血压大鼠收缩压的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2:3个单体提取物对急性肾动脉型高血压大鼠收缩压的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3各提取物组的放夹后血压、给药后血压与空白对照组的t检验<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>以上实例说明大叶蛇葡萄提取物蛇葡萄素(Ampelopsin)、杨梅素(Myricetin)和杨梅苷(Myricetrin)对实验性高血压有降压的作用。下面是应用上述所得提取物蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷制备治疗高血压制剂的实施例。实施例3:片剂蛇葡萄素或杨梅素或杨梅苷或三者之任意组合1份重量，乳糖0.5-2份重量，糊精0.5-2份重量，羧甲基纤维素钠0.03-0.15份重量，上述组分在混合机中混合后压制成片。实施例4:胶囊蛇葡萄素或杨梅素或杨梅苷或三者之任意组合1份重量，淀粉0.5-2份重量，上述组分混合均匀后制粒，装入胶囊。实施例5:颗粒剂蛇葡萄素或杨梅素或杨梅苷或三者之任意组合1份重量，蔗糖l-3份重量，可溶性淀粉l-2份重量，上述组分混合均匀制粒干燥后，即得颗粒剂。实施例6:糖浆剂蛇葡萄素或杨梅素或杨梅苷或三者之任意组合l份重量，蔗糖l-4份重量，适量水，混合上述成分得到糖浆剂。权利要求1、大叶蛇葡萄提取物在制备治疗高血压制剂中的应用，其特征在于，用作制备治疗高血压制剂的有效成分，所说的大叶蛇葡萄提取物为蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷或三者之任意组合。2、如权利要求1所说的提取物在制备治疗高血压制剂中的应用，其特征在于，蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷纯度分别大于99%、98%和98%，作为制备治疗高血压制剂中的有效成分。3、如权利要求1所说的提取物在制备治疗高血压制剂中的应用，其特征在于，所说的高血压为医学上所属的二类高血压，包括第一类原发性高血压，第二类为继发性高血压。4、如权利要求1所说的提取物在制备治疗高血压制剂中的应用，其特征在于，所说的制剂为蛇葡萄素、杨梅素和杨梅苷与药理学上允许的添加成分相组合制成的制剂。5、如权利要求1所说的提取物在制备治疗高血压制剂中的应用，其特征在于所述的制剂剂型为经口给药的固体制剂片剂、胶囊剂、颗粒剂，或经口给药的液体制剂糖浆剂。全文摘要本发明公开了一种大叶蛇葡萄提取物在制备治疗高血压药物中的应用。公开了从大叶蛇葡萄(Ampelopsmegalophylla)提取用于制备治疗高血压制剂原料药蛇葡萄素(Ampelopsin)、杨梅素(Myricetin)和杨梅苷(Myricetrin)的工艺，以及3个单体成分或三者之任意组合与药理学上允许的添加成分相组合而成制剂具治疗高血压作用，具有良好的应用前景。文档编号A61K36/185GK101152355SQ20071005338公开日2008年4月2日申请日期2007年9月27日优先权日2007年9月27日发明者刘焱文,张秀桥,伟沈,舒凌纬,陈夏净,陈树和申请人:湖北中医学院