专利名称：治疗乙型肝炎的药物的制作方法
技术领域：
本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一种治疗乙型肝炎的药物组合物，其制备方法，以及该药物组合物在制备抗乙型肝炎抑制剂药物和抗乙型肝炎药物中的应用
背景技术：
乙型肝炎是严重危害人体健康的病毒性传染病。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属DNA嗜肝病毒科，主要是通过血液制品、母婴和性接触等途径传播，且易转成慢性肝炎，是引发肝硬化、肝癌的主要病因之一。乙型肝炎病毒的复制过程涉及5步结合、侵入、转录、翻译、基因复制和包装。首先病毒颗粒通过受体附着于肝细胞，侵入胞浆后脱去外膜，形成核心颗粒。核心颗粒移至肝细胞核，HBV DNA核心颗粒脱壳而出，在细胞核内形成cccDNA。cccDNA是乙型肝炎病毒复制的模板，是肝细胞长期持续受感染的关键物质。cccDNA有2种功能，其一是合成病毒颗粒的各种构件，如HbsAg(hepatitis B virus surface antigens，表面抗原，构成外膜)，HBcAg(hepatitis virus c antigens，核心抗原，构成内膜)，HBeAg(hepatitis Bvirus e antigens，e抗原，分泌到血液中)；其二是合成下一代HBVDNA。大部分新合成的HBV DNA用于新病毒颗粒的包装，部分则重新进入肝细胞核，成为cccDNA的另一个来源。部分新合成的HBVDNA首先与HBcAg组装成核心颗粒，进而与HBsAg组装成完整的HBV颗粒，向细胞外释放。过剩的HBsAg有时独自释放入血液，形成小球型颗粒或管型颗粒。研究报道中，草药中的具有抗HBV活性的植物大多是抑制HBsAg，而对HBeAg作用明显的植物提取物或单体化合物的报道较少。目前对乙型肝炎尚缺乏专属性较强的治疗药物。国外对治疗病毒性肝炎新药的研制侧重于开发抗肝炎病毒药，在抗肝炎病毒药物的研究中取得一些进展。80年代曾经进行试验的阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、阿昔洛韦、齐多夫定，因疗效不佳，毒性反应大，在国外已不再用于治疗乙肝。近几年开发了多种核苷类药物，对HBV有明显的抑制作用，如拉米夫定(lamivudine)，泛昔洛韦(famciclovir)，洛布卡韦(lobucavir)，阿地福韦(adefovir)，FTC(二脱氧氟硫代胞嘧啶)，FMAU(氟甲阿糖尿嘧啶)，FDDC(氟二脱氧胞嘧啶)，BMS 200475(环氧羟碳脱氧鸟苷)，这些药物具有下列共同点均为核苷类的衍生物；分别为胞嘧啶，尿嘧啶，鸟嘧啶或嘌呤化合物，在体外或体内实验中，对HIV、HBV或HCV等病毒有抑制作用。其作用机制为药物进入细胞内成为三磷酸化合物，通过对底物的竞争，对病毒的聚合酶或反转录酶抑制，最终抑制病毒DNA的合成及病毒的增殖；经过长期的治疗后，病毒可能出现变异和耐受性；短期应用仅有暂时的效果，需长期用药，如与不同作用靶点的其他药物联合应用，可提高疗效，降低耐药性发生。综上所述，抗肝炎药物有非常大的市场需求，但是现在临床应用的抗肝炎药物普遍存在耐药性的问题，成功地开发出能解决药物的耐药性，临床效率高且毒副作用较小的新一代抗乙型肝炎的药物，将具有很强的市场竞争力和市场前景。迄今，现有技术中没有二氢白屈菜红碱化合物作为有效成分的药物组合物的报道，也没有该化合物或其药物组合物应用在制备或治疗乙型肝炎药物中的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供用于治疗乙型肝炎药物组合物，其中含有治疗乙型肝炎有效量的式(I)二氢白屈菜红碱及药用载体和/或赋形剂，提供该药物组合物的制备方法，该化合物或其药物组合物在制备抗乙型肝炎抑制剂药物和在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案用于治疗乙型肝炎的药物，其中含有式(I)化合物二氢白屈菜红碱(dihydrochelerythrine)及可药用载体和/或赋形剂。
本发明制备含二氢白屈菜红碱的药物的方法是取岩黄连，干燥，粉碎，用90％乙醇回流提取3次，每次2-3小时，合并醇提液，过滤，减压回收乙醇至无醇味，该提取液悬浮于2％HCl水溶液中，搅拌，过滤；滤液用25％的氨水溶液调pH值至10，用氯仿萃取得氯仿部分；氯仿萃余液再用饱和的10％NaOH溶液调pH至12，用正丁醇萃取得正丁醇部分，氯仿部分用氯仿-甲醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干，研碎，经硅胶干柱柱层析，用2∶1的氯仿∶甲醇洗脱，分为四部分，其中第一部分用减压柱层析，以15∶1-2∶1的石油醚∶乙酸乙脂梯度洗脱得化合物二氢白屈菜红碱，加入可药用载体和/或赋形剂即可。
本发明同时提供了本发明药物化合物二氢白屈菜红碱在制备抗乙型肝炎抑制剂药物中和制备抗乙型肝炎药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，下面将用本发明的试验例来说明本发明式(I)化合物二氢白屈菜红碱的药理作用结果，但不以此试验例来限定本发明。
试验例1二氢白屈菜红碱对Hep G2.2.15细胞的药物毒性和对HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用1材料和方法1.1材料二氢白屈菜红碱来自岩黄连(Corydalis saxicola)、白屈菜(Chelidonium majus)、飞龙掌血(Toddalia aculeata)的根和茎；拉米夫定(lamivudine)(葛兰素史克制药(苏州)有限公司，国药准字H20030581)；Hep G2.2.15细胞(引自广州空军医院)；高糖DMEM(GIBICO)；G418(GIBICO)；胎牛血清(天津血研所)；L-谷氨酰胺(AMRESCO)；青霉素，链霉素(石药集团中诺药业(石家庄)有限公司)。
1.2 Hep G2.2.15细胞，用高糖DMEM液培养，培养液添加10％胎牛血清，0.03％L-谷氨酰胺，100mg/L G418，105IU/L青酶素，100mg/L链霉素，5％NaCO3调pH至6.8-7.0。
1.3仪器酶标仪Bio-RAD 680(美国)；CO2培养箱Thermo Forma3310(美国)；倒置生物显微镜XD-101型(南京)等。
1.4实验过程用胰蛋白酶将Hep G2.2.15细胞消化，用添加了0.03％L-谷氨酰胺，100mg/L G418，100 IU青酶素，100 IU链霉素的高糖DMEM液制成单细胞悬液，每孔按3×105×0.1mL-1分种于96孔板，0.1mL/孔，24h后换用含2％的胎牛血清，380μg/mL的含药培养液，每种药物设四个药物浓度，每个浓度设三孔，四倍稀释，同时设三孔不加药物的细胞对照组及一孔空白细胞组，并以拉米夫定做阳性药物对照；7d后收集上清，用ELISA法测定HBsAg和HBeAg的分泌情况。同时用MTT法测定药物对细胞的毒性。
1.5药物对细胞半数毒性浓度(CC50)的测定 根据Mosmann建立的MTT法检测药物的细胞毒性(Y.Nakajima，Y.Saton，M.Katsumata，K.Tsujiyama，Y.Ida，and J.Shoji，Phytochemistry 1994，36，119-127)。具体方法是向吸去上清的细胞孔中加入0.4mg/mLMTT，0.1mL/孔，37℃5％CO2培养4h，去上清，每孔加入0.1mL二甲基亚砜，孵育10min，在酶标仪上测定溶液在490nm下的吸光度值。药物对细胞的破坏百分率ηdestroy＝(A细胞对照组-A供试样品组)/(A细胞对照组-A空白组)×100，50％毒性浓度(CC50)为实验孔存活细胞为对照孔50％时的药物浓度。CC50＝Anti 1g[(C50-＜50％破坏率的百分数)/(＞50％破坏率的百分数-＜50％破坏率的百分数)×C+1g B]，A；破坏率大于50％的药物浓度；B破坏率小于50％的药物浓度；C＝1g A-1g B。
1.6药物对细胞半数抑制浓度的测定 采用酶联免疫法(ELISA)测定。药物对HBsAg、HBeAg的抑制百分率ηinhibitory＝(A细胞对照组-A供试样品组)/A细胞对照组-A空白组)×100，50％抑制浓度(IC50)为HBsAg或HbeAg以抑制率为50％时的药物浓度，计算方法同CC50。
2.结果最终结果以选择指数(SI，为评价药物临床应用前景的参数，SI＝CC50/IC50)来评价，其中SI＞2为无毒有效，1＜SI＜2为有毒有效，SI＜1为有毒无效。具体结果见表1、表2和表3表1二氢白屈菜红碱对Hep G2.2.15细胞的毒性作用
表2.二氢白屈菜红碱对Hep G2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用
表3.二氢白屈菜红碱对Hep G2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的抑制效果
3.结论实验结果显示，二氢白屈菜红碱在体外对Hep G2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有一定的抑制作用。
以下通过实施例来进一步阐明本发明的制备方法及药物组成。
实施例1二氢白屈菜红碱的制备二氢白屈菜红碱的提取分离采集岩黄连，其学名经鉴定为Corydalis saxicola Bunting，室温阴干，粉碎。取5.5kg干粉，用90％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并醇提液，过滤，减压回收乙醇至无醇味。该提取液悬浮于2％HCl水溶液中，快速搅拌，然后过滤；滤液用25％的氨水溶液调pH值至10，用氯仿萃取，得氯仿部分(93.6g)；氯仿萃余液再用饱和的10％NaOH溶液调pH至12，用正丁醇萃取得正丁醇部分(63.6g)。氯仿部分用氯仿-甲醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干，研碎，经硅胶干柱柱层析，用氯仿-甲醇(2∶1)洗脱，分为四部分，其中第一部分用减压柱层析，以石油醚-乙酸乙脂(15∶1-2∶1)梯度洗脱得一黄色粉末(86mg)。通过分析该化合物的1H，13C NMR及质谱数据，与文献报道的二氢白屈菜红碱(dihydrochelerythrine)(Oechslin，S.M.，Knig，GM.，Oechslin-Merkel，K.，Wright，A.D.，Kinghorn，A.D.，Sticher，O.，1991.An NMR study of four benzophenanthridine alkaloids.J.Nat.Prod 54，519-524)一致。二氢白屈菜红碱的提取分离制备方法也适用于从白屈菜、飞龙掌血等含有该成分的植物中提取分离制备。
二氢白屈菜红碱结构数据熔点用北京泰克仪器有限公司的X-4数字显示显微熔点仪测定；旋光经SEPA-300仪测定；红外光谱用Bruker Tensor 27型红外光谱仪测定，采用KBr压片；质谱(MS)用VG Auto Spec-3000型质谱仪测定，采用FAB-MS技术；核磁共振谱(1H NMR和13C NMR)用BrukerAM-400超导核磁共振仪测定，TMS作内标；青岛海洋化工厂出品的200-300目和10-40μm硅胶作为柱层析材料；薄层层析用青岛海洋化工厂出品的硅胶板指导分离。
展开剂A氯仿-甲醇(2∶1，v/v)；B石油醚-乙酸乙酯(7∶3，v/v)。显色剂改良碘化铋钾生物碱显色剂。
结构如图所示 分子式C21H19NO4分子量349性状黄色粉末(氯仿)mp 169-171℃[α]D20-10°(c 0.2，氯仿)。
IR(KBr)Vmax2920，2846，1625，1605，1495，1464，1272，1247，1220，1072，1039cm-1。
FAB-MS(m/z)350[M+H]+(100)。
1H NMR(C5D5N)δ7.92(1H，d，J＝8.5Hz，H-11)，7.89(1H，s，H-1)，7.70(1H，d，J＝8.4Hz，H-10)，7.65(1H，d，J＝8.5Hz，H-12)，7.38(1H，s，H-4)，7.05(1H，d，J＝8.4Hz，H-9)，6.06(2H，s，OCH2O-2，3)，4.42(2H，s，H-6)，3.86(3H，s，OCH3-8)，3.78(3H，s，OCH3-7)，2.60(3H，s，NCH3)。
13C NMR(C5D5N)δ104.9(CH，C-1)，148.7(C，C-2)，148.2(C，C-3)，101.1(CH，C-4)，127.0(C，C-4a)，143.2(C，C-4b)，49.2(CH2，C-6)，126.5(C，C-6a)，146.7(C，C-7)，153.0(C，C-8)，111.9(CH，C-9)，119.2(CH，C-10)，126.4(C，C-10a)，124.9(C，C-10b)，120.8(CH，C-11)，124.4(CH，C-12)，131.5(C，C-12a)，55.8(CH3，OCH3-7)，60.9(CH3，OCH3-8)，101.8(CH2，OCH2O-2，3)，41.4(CH3，NCH3)。
实施例2按实施例1的方法先制得二氢白屈菜红碱，用少量的DMSO溶解后，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例3按实施例1的方法先制得二氢白屈菜红碱，用少量的DMSO溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例4将所分离得到的二氢白屈菜红碱，按其与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例5按实施例1的方法先制得二氢白屈菜红碱，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例6按实施例1的方法先制得二氢白屈菜红碱，按常规口服液制法制成口服液。
实施例7按实施例1的方法先制得二氢白屈菜红碱，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
实施例8按实施例1的方法先制得二氢白屈菜红碱，按其与赋形剂重量比为3∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
权利要求
1.治疗乙型肝炎的药物，含有式(I)化合物二氢白屈菜红碱(dihydrochelerythrine)及可药用载体和/或赋形剂。
2.制备权利要求1药物的方法，其特征在于取岩黄连，干燥，粉碎，用90％乙醇回流提取3次，每次2-3小时，合并醇提液，过滤，减压回收乙醇至无醇味，该提取液悬浮于2％HCl水溶液中，搅拌，过滤；滤液用25％的氨水溶液调pH值至10，用氯仿萃取得氯仿部分，氯仿萃余液再用饱和的10％NaOH溶液调pH至12，用正丁醇萃取得正丁醇部分，氯仿部分用氯仿-甲醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干，研碎，经硅胶干柱柱层析，用2∶1的氯仿∶甲醇洗脱，分为四部分，其中第一部分用减压柱层析，以15∶1-2∶1的石油醚∶乙酸乙脂梯度洗脱得化合物二氢白屈菜红碱，加入可药用载体和/或赋形剂即可。
3.式(I)化合物二氢白屈菜红碱在制备抗乙型肝炎抑制剂药物中的应用。
4.式(I)化合物二氢白屈菜红碱在制备抗乙型肝炎药物中的应用。
全文摘要
用于治疗乙型肝炎药物，含有治疗乙型肝炎有效量的化合物二氢白屈菜红碱及药用载体和/或赋形剂，该药物化合物二氢白屈菜红碱的制备方法，以及在制备抗乙型肝炎抑制剂药物和治疗乙型肝炎药物中的应用。
文档编号A61P31/00GK101019866SQ200710065709
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月13日 优先权日2007年3月13日
发明者陈纪军, 吴颖瑞, 赵友兴, 马云保, 姚淑英, 周俊 申请人:中国科学院昆明植物研究所