专利名称：一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，更具体地说，本发明涉及利用人二倍体细胞系培养轮状病毒，进而制备单价或多价灭活疫苗的方法。
背景技术：
人轮状病毒(human rotavirus，HRV)的感染是引起婴幼儿急性脱水性腹泻的主要原因，HRV在世界范围内传播。目前不论在发达国家还是发展中国家，轮状病毒仍然是造成的婴幼儿疾病和死亡的主要原因。轮状病毒的传染性很强，能在较短的时间内形成传播和流行。研制疫苗是控制和预防轮状病毒感染的有效途径。
轮状病毒疫苗的研制前期以口服减毒活疫苗为主，为了对多种HRV血清型产生良好的保护效果，研究人员发展了多价重配株疫苗。目前包括中国、美国、比利时、澳大利亚、印度在内的各国研究机构及公司所分别研制的6种轮状病毒活疫苗(单一血清型或重配株)都已经进入临床前研究或投放市场。虽然减毒活疫苗服用方便，能在体内增殖，刺激产生肠道保护抗体，但在安全性方面，却存在着缺陷，例如，1998年美国FDA批准的人猴重配疫苗Rotashield由于存在着引发肠套叠的隐患而撤出了美国市场)，尤其是HRV属于RNA病毒，具有高变异性的特点，且疫苗株在人体内和环境中的循环还存在着毒力回复突变及产生新的变异株的风险。在疫苗的安全性方面，灭活疫苗具有绝对的优势。但轮状病毒的灭活疫苗目前仍处于研究阶段，还没有进入临床。
由于灭活疫苗是以注射的方式进行接种，选择许可的，安全的细胞基质对病毒进行扩增是非常重要的。人二倍体细胞系是目前疫苗生产首选的细胞基质。从目前发展来看，用二倍体细胞制备疫苗将有取代其它原代细胞和传代细胞的趋势。作为灭活疫苗，经肌肉注射多次免疫，可能引起免疫超敏反应，因此灭活疫苗的细胞基质要求更高。将轮状病毒适应至人二倍体细胞，采用人二倍体细胞系作为大规模培养的细胞基质，将具有低超敏反应，有高价值的开发前景。
轮状病毒在细胞上的增殖存在着如下的特点即动物来源的轮状病毒较易繁殖，人的轮状病毒在体外培养时的增殖能力较弱，滴度也较低。轮状病毒在其敏感细胞如MA104，CV-1等细胞上增殖较快，但在人二倍体细胞上则不能增殖，或增殖很弱。现有技术中，关于轮状病毒株在人二倍体细胞上的高效增殖尚无相关的文献报道。
美国专利5,610,049，Human rotavirus HCR3A and method of growing saidrotavirus描述了一种轮状病毒株HCR3A在人二倍体细胞WI38上扩增至高滴度(106-109PFU/mL)的能力。该专利采用较独特的方法从粪便中的分离该病毒，并采用了逐步适应的方法将其适应到人二倍体细胞上。该专利覆盖了利用此病毒株制备疫苗，或与其它血清型轮状病毒的制备重配株的方法和开发成为疫苗的应用权力。专利中提到，HCR3A作为一株从临床标本中分离到的新的轮状病毒，属于G3型，与猴轮状病毒SA11具有相似的抗原性，但是核酸电泳带型完全不同，对该毒株适应于人二倍体细胞培养的原因并未作深入的分析和阐述，并且为特定的轮状病毒株HCR3A在人二倍体细胞WI38培养，只有一种血清型，并未解决轮状病毒在人二倍体细胞上培养扩增的难题。
美国专利US 2005/0277194A1，A Packaging Cell Line中提到，利用腺病毒35型E1区转化人二倍体细胞系，使其表达Ad35，E1B序列，这个细胞系可有效繁殖除腺病毒以外的如人流感病毒、疱疹病毒、轮状病毒和麻疹病毒。但未见进一步相关的报道。
中国发明专利申请CN 1686540A报道了一种四价轮状病毒灭活疫苗的制备方法，利用小牛肾细胞或vero细胞扩增轮状病毒G1、G2、G3和G4型。扩增后的轮状病毒经物理混合后，浓缩纯化，用福尔马林或β丙内酯灭活，经无菌检定后作为疫苗原液，但使用的培养细胞系仍然不是人二倍体细胞，可能具有较高的超敏反应。
因此，如何制备出安全性高、具有良好免疫原性的轮状病毒灭活疫苗，是本领域急待解决的一个技术难题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种以人的二倍体细胞为培养基质的轮状病毒灭活疫苗的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
本发明提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法使轮状病毒株G1，G2，G3，G4适应至人二倍体细胞系，并在人二倍体细胞系上高效繁殖，将制得的轮状病毒作为轮状病毒灭活疫苗的生产毒株。
其中，所述的人二倍体细胞系为KMB17，同时，本发明提供了轮状病毒的灭活和纯化方法，适用于不同血清型轮状病毒灭活疫苗的研制；纯化后的灭活病毒与佐剂混合免疫实验豚鼠后，采集动物的血清，用纯化后的轮状病毒或其外壳蛋白作为抗原包被酶标板，用ELISA方法检测轮状病毒特异的中和抗体，中和抗体滴度最高为1∶1024，最低为1∶128，几何平均滴度为415.8。
与现有的技术相比，本发明具有以下有益效果1.本发明第一次将轮状病毒适应到人二倍体细胞KMB17上，从轮状病毒在其许可细胞系MA104的增殖过程中，筛选出可以在人二倍体细胞系上高效繁殖的毒株，同时对人二倍体细胞系进行筛选，发现KMB17细胞系最适于这些轮状病毒株的培养，并且找到了敏感克隆。扩增得到的轮状病毒可作为轮状病毒疫苗毒种，经浓缩纯化灭活后，制成轮状病毒单价或多价灭活疫苗，用于预防婴幼儿的轮状病毒感染性疾病。
2.选用人二倍体细胞系作为灭活轮状病毒疫苗生产的细胞基质，与现有的其它细胞基质(例如vero细胞)相比，更安全。因此，利用建立的技术平台，可以采用轮状病毒的其它血清型作为研究对象，开发成为轮状病毒灭活疫苗。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步清楚地说明，但它们并不是对本发明保护范围的限定。
实施例1——单价至五价灭活轮状病毒的制备方法，采用以下步骤(1)细胞的培养人二倍体细胞2BS，SL-7，WI38，KMB17，优选K/MB17用MEM培养基进行培养，培养基的成分为5％-10％的胎牛血清(体积比)，300-592mg/L的L谷氨酰胺，青霉素和链霉素各100～200U/mL，0.66g-1.32g/L的碳酸氢钠；于37℃，5％二氧化碳培养至长成单层后，用于接种轮状病毒。
(2)病毒的接种病毒毒种的滴度大于或等于107.5TCID50/mL，使用终浓度为15-50μg/mL的胰酶，优选25μg/mL的胰酶于37℃激活20-45分钟(优选45分钟)，以感染复数为m.o.i＝0.1～3接种细胞，于37℃吸附40-90分钟，吸弃病毒液，加入含有终浓度为0.5-1μg/mL胰酶的无血清MEM培养基，于37℃培养至产生明显的细胞病变。
(3)病毒的收获当有75％的细胞发生病变时，收获病毒。将培养物于37℃，和-20℃反复冻融2-4次，以8000-10,000rpm/min离心30-60分钟，弃细胞沉淀，收集上清液，于-80℃保存。
(4)病毒的浓缩将收获的上清液用截流分子量为100kD-300kD的超滤膜超滤浓缩。应用QuickStand超滤设备，对病毒收获液进行浓缩，通过计算浓缩前后的体积比，超滤外液中的轮状病毒颗粒含量进行检测，统计浓缩的比例和得率应等于或大于为1∶35和95％，也可以用PEG 8000来浓缩，浓缩目的达到即可。
(5)病毒的纯化利用凝胶过滤，上样缓冲液为0.5-1M的PBS，洗脱缓冲液为20-30mM的PBS，pH值为7.0-7.4。病毒颗粒将主要存在于洗脱峰中，而核酸和其它分子量较小的杂蛋白将出现在后续的峰中。经过凝胶过滤粗纯后，使用阴离子交换层析进一步的精纯。也可用蔗糖密度梯度离心法来纯化，纯度达到95％即可。
(6)病毒的灭活采用1∶4000的β-丙内酯于4℃灭活24-72小时。经0.2μm或0.45μm的滤膜除菌过滤后，即为单价的病毒原液。也可以用福尔马林来灭活，灭活后灭活完全，灭活试剂残留量达到指标即可。
(7)成品的配制将单价的病毒原液按等体积比混合。混合后的疫苗原液即为成品。
实施例2四价轮状病毒灭活疫苗的制备方法，采用以下的工艺步骤(1)细胞的制备将KMB17细胞用胰酶消化分散，加入MEM完全培养基，于37℃培养至长成汇流状单层，于种毒前12小时将培养基更换为不含血清的MEM维持液。
(2)病毒的接种和培养将轮状病毒株G1，G2株，G3株，G4株用终浓度为20μg/mL的胰酶，于37℃激活45分钟，吸弃维持液，用同样的维持液将KMB17细胞再清洗一次，以感染复数为m.o.i＝3接种细胞，于37℃吸附90分钟，吸弃病毒液，加入含有终浓度为0.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养基，于37℃培养至产生明显的细胞病变(一般为3-5天，m.o.i＝3)。
(3)病毒收集约有75％的细胞发生病变时，收获病毒。将培养物于37℃，和-20℃反复冻融3次，以10,000rpm/min离心30分钟，弃细胞沉淀，收集上清液，于-80℃保存。
(4)病毒的浓缩将收获的上清液用截流分子量为100kD的超滤膜超滤浓缩。应用QuickStand超滤设备，对病毒收获液进行浓缩，通过计算浓缩前后的体积比，超滤外液中的轮状病毒颗粒含量进行检测，统计浓缩的比例和得率为1∶35和95％。
(5)病毒的纯化利用凝胶过滤，上样缓冲液为1M的PBS，洗脱缓冲液为20mM的PBS，pH值为7.2。病毒颗粒将主要存在于洗脱峰中，而核酸和其它分子量较小的杂蛋白将出现在后续的峰中。经过凝胶过滤粗纯后，使用阴离子交换层析进行进一步的精纯。
(6)病毒的灭活采用1∶4000的β-丙内酯于4℃灭活24小时。经0.2μm的滤膜除菌过滤后，即为单价的病毒原液。
(7)单价的病毒疫苗原液应经灭活效力试验，即在轮状病毒敏感细胞上盲传3次，结果应为阴性。将各单价的灭活病毒原液过滤除菌，即为灭活轮状病毒疫苗原液，灭活病毒原液加入终浓度为3mg/mL的甘氨酸作为稳定剂，终浓度为5.0mg/mL的2-苯氧乙醇作为防腐剂。选择氢氧化铝作为佐剂，将浓度为6-8％的氨水溶液缓慢加入至浓度为4％(g/V)的三氯化铝中，于60℃下以每分钟15-20转的速度搅拌，至pH6.9制成氢氧化铝佐剂。免疫的灭活样品中氢氧化铝的终浓度为1.0mg/mL，与灭活疫苗于室温搅拌30分钟混合。配不同价疫苗时，佐剂的终浓度与混合方法都是一样的。
实施例3——参考中国生物制品规程进行原液检定，(1)蛋白含量测定利用Lowry法测定，蛋白质含量应不高于20μg/mL。测定结果均小于20μg/mL。
(2)抗原量用购买或自制针对两种轮状病毒型特异的商品化单克隆抗体包被酶标板，进行检测。采用双抗体夹心酶联免疫法，抗原量应不低于3200EU/mL。
(3)无菌检查依法检查，样品为无菌，符合规定。
(4)牛血清白蛋白残留量用酶联免疫法检测，牛血清白蛋白残留量应不高于50ng/mL。检测结果的平均值为20ng/mL。
(5)病毒灭活验证试验灭活后取样在KMB17细胞上于37℃培养5天，同法连续盲传三代，用ELISA法检测轮状病毒抗原，应为阴性。检测合格。
(6)pH值应为6.0～7.0。检测合格。
(7)细菌内毒素检查应小于10EU/mL(凝胶限量试验法)。检测合格。
(8)佐剂含量检测氢氧化铝的含量应为0.80～1.20mg/mL。检测合格。
(9)辅料含量测定2-苯氧乙醇的含量应为4.0～6.0mg/mL。
(10)效力测定经检定合格的病毒原液即为灭活病毒疫苗成品。
实施例4～8将接种的轮状病毒株分别改为G1，G3株，G2株，G4，G9株中的一种，其它过程重复实施例2。
实施例9～18将接种的轮状病毒株分别改为G1和G3株，G1和G2株，G1和G4株，G3和G2株，G3和G4株，G2和G4株，G1和G9株，G2和G9株，G3和G9株，G4和G9株中的一种组合，其它过程重复实施例2。
实施例19五价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将接种的轮状病毒株改为G1，G3株，G2株，G4株和G9株，其它过程同实施例4。
实施例20～27将接种的轮状病毒株改为G1G2G3株，G2G3G4株，G1G3G4株，G1G2G9株，G2G3G9株，G1G3G9株，G3G4G9株，G2G4G9株中的一种组合，其它工艺步骤同实施例2。
实施例28四价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将培养轮状病毒的细胞基质改为人二倍体细胞2BS，其它过程与实施例2相同。
实施例27～31单价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——接种的轮状病毒株改为G1，G3株，G2株，G4株和G9株，其它工艺步骤同应用实施例4～8。
实施例32～41二价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将培养轮状病毒的细胞基质改为人二倍体细胞2BS，其它工艺步骤同应用实施例9～18。
实施例42五价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将培养轮状病毒的细胞基质改为人二倍体细胞2BS，其它工艺步骤同应用实施例17。
实施例43～50三价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将培养轮状病毒的细胞基质改为人二倍体细胞2BS，其它工艺步骤同应用实施例20～27。
实施例51四价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将培养轮状病毒的细胞基质改为人二倍体细胞SL-7，其它工艺步骤同应用实施例2。
实施例51～56单价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将培养轮状病毒的细胞基质改为人二倍体细胞SL-7，其它工艺步骤同应用实施例4～8。
实施例57～66二价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将培养轮状病毒的细胞基质改为人二倍体细胞SL-7，其它工艺步骤同应用实施例9～18。
实施例67五价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将培养轮状病毒的细胞基质改为人二倍体细胞SL-7，其它工艺步骤同应用实施例19。
实施例68～75三价轮状病毒灭活疫苗的制备方法——将培养轮状病毒的细胞基质改为人二倍体细胞SL-7，其它工艺步骤同应用实施例20～27。
权利要求
1.一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法使轮状病毒株G1，G2，G3，G4适应至人二倍体细胞系，并在人二倍体细胞系上高效繁殖，将制得的轮状病毒作为轮状病毒灭活疫苗的生产毒株。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的人二倍体细胞系为KMB17，
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，将纯化后的灭活病毒与佐剂混合免疫实验豚鼠后，采集动物的血清，用纯化后的轮状病毒或其外壳蛋白作为抗原包被酶标板，用ELISA方法检测轮状病毒特异的中和抗体，中和抗体滴度最高为1∶1024，最低为1∶128，几何平均滴度为415.8。
全文摘要
本发明公开了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法。该方法使轮状病毒株G1，G2，G3，G4适应至人二倍体细胞系，并在人二倍体细胞系上高效繁殖，将制得的轮状病毒作为轮状病毒灭活疫苗的生产毒株。其中，所述的人二倍体细胞系为KMB17。本发明选用人二倍体细胞系作为灭活轮状病毒疫苗生产的细胞基质，与现有的其它细胞基质相比，更安全。因此，利用建立的技术平台，可以采用轮状病毒的其它血清型作为研究对象，开发成为轮状病毒灭活疫苗。
文档编号A61P31/14GK101020053SQ200710065708
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月13日 优先权日2007年3月13日
发明者刘馨, 孙茂盛 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所