专利名称：：山楂内金制剂的含量测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种中成药的含量测定方法。
背景技术：
：中国专利申请号200410034161.9公开了"一种健脾和胃、消积化滞的药物"，该发明涉及一种以天然植物、动物药材为主要药用成分的具有健脾和胃、消积化滞、益智安神功效的药物组合物。是由下述重量配比的原料制成的药剂山楂100-1500、藏菖蒲80-1300、荠菜50-1100、鸡矢藤50-1100、连翘90-1500、枇杷叶50-800、蝉蜕10-250、鸡内金50-800。能治疗脾胃虚弱所致的胃炎，引起的消化不良、口臭腹胀、消痩无力，心神不宁、失眠多梦，健忘等病症，又可治疗小儿疳积(西医称小儿多动症)等症。该发明公开了以上药物制剂的组成、制备方法以及药效学资料，但如何对其含量进行准确测定，更好地对其质量进行控制是亟待解决的问题。山楂内金制剂的现行国家药品标准(试行)中，用液相色谱法测定连翘苷含量，采用了中性氧化铝柱层析纯化供试品，但因杂质较多，存在基线较高、分离度不好的问题。连翘苷液相色谱法含量测定中，中国药典2005年版等国家药品标准绝大多数采用中性氧化铝柱层析纯化供试品，桑菊感冒片则采用三氯甲垸萃取；文献资料中还有用硅胶色谱柱、大孔树脂柱纯化的。在国家药品标准关于药材或制剂含量测定项下供试品溶液的制备方法中，未检索到在同一色谱柱中填装两种填充剂纯化某种成分的方法。
发明内容本发明的目的是提供一种山楂内金制剂的含量测定方法。本发明所述的山楂内金制剂的含量测定方法由以下步骤组成一、色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水梯度洗脱，或以乙腈-水(25:75)为流动相，检测波长为277nm或230mn，理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000;二、对照品溶液的制备精密称取连翘苷对照品适量，加甲醇制成每lml含15吗的溶液，即得；三、提取液的制备取山楂内金口服液，混匀，精密量取550ml，精密加入23倍体积甲醇，密塞，摇匀，放置1030分钟，滤过，精密量取续滤液1050ml，水浴上浓縮至25%±10%体积，作为浓縮液；或取山楂内金胶囊内容物，研匀，取l5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入1040倍体积甲醇，密塞，称定重量，超声处理30分钟，冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液550ml，加所量取体积25°/。的水，水浴上浓縮至25%±10%体积，作为浓縮液；四、供试品溶液的纯化步骤(三)的浓縮液用水移至大孔树脂一中性氧化铝柱上，器皿用少量水多次洗涤，洗涤液全部移至柱上，柱内径l5cm，下部为50400目中性氧化铝310g，上部为高度315cm的预处理好的大孔树脂，以每分钟15ml的流速通过色谱柱，依次用水50150ml、1025%乙醇溶液60200ml洗涤，再用5095%乙醇溶液60200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇或50%甲醇使溶解，转移至525ml量瓶中，加甲醇或50°/。甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；五、测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10^d或2(Hi1，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明所述的含量测定方法是在进行了大量的实验基础之上得到的。在提取溶剂的选择上，多数国家药品标准采用甲醇为提取溶剂，测定药材或制剂中连翘苷的含量，根据本品实际，申请人进行了提取溶剂筛选试验，试图确保提取率的同时减少杂质溶出量，结果表明，几种提取溶剂比较，甲醇提取最为充分，且提取物杂质少，因此选择甲醇作为提取溶剂。在提取方式上，山楂内金口服液国家试行标准采用蒸干口服液，加甲醇超声提取，口服液蒸干过程很费时，且若温度过高易对被测成分造成破坏，申请人采用口服液直接加甲醇混匀，静置1030min，沉淀去除大部分蜂蜜，滤过；试验证明此法可行，提取杂质少，操作简单。在浓縮方式上，因为连翘苷只有在水或较低浓度的醇溶液中方能吸附于大孔树脂上，与其他杂质分离，因此，提取液水浴上蒸去甲醇，留下水溶液直接上柱，与先蒸干再用水溶解转移比较，操作比较简便，更重要的是容易转移且转移完全。更为独特的是纯化方法，现有的各提取液纯化方法如中性氧化铝、大孔树脂、硅胶、RP—C18柱层析或萃取等经过实验均存在各自不同的问题，结果均很难到达有关技术要求，因此，申请人考虑通过在同一柱中用两种填充剂一次性进行纯化，经研究、预试验，在同一色谱柱中，下部装填中性氧化铝，上部装填大孔树脂，理论上比较合理，实际效果也比较好，色谱效果有明显改善，且省时，操作简便。在洗涤过程中，鉴于连翘苷吸附于大孔树脂的性质，对于色谱柱上部的大孔树脂，用水和低浓度的醇溶液(小于30%乙醇)洗涤，可以只充分去除那些不被吸附或吸附较弱的杂质，达到纯化提取液的目的；对于色谱柱下部的中性氧化铝，溶剂的洗脱能力为水>醇溶液>醇(醇溶液中醇浓度越低，洗脱能力越强)，因此，从大孔树脂上洗涤下来的杂质几乎都不被中性氧化铝吸附，极少量吸附的杂质也不能被随后的洗脱液(5095%乙醇)洗脱下来，从而不会干扰测定；在洗脱过程中，对于色谱柱上部的大孔树脂，用5095%乙醇溶液已可以将连翘苷完全洗脱下来，而少量吸附较强的杂质仍留在树脂上；对于色谱柱下部的中性氧化铝，在5095%乙醇溶液中的连翘苷完全不能被吸附，因而回收率较高，而伴随连翘苷被5095%乙醇溶液从大孔树脂上洗脱下来的杂质却大部份被中性氧化铝所吸附，进一步达到纯化提取液的目的。经综合评价，结合各系统适用性参数情况，并经方法学验证，该法准确度(加样回收率)、重复性、专属性等指标均比较好，达到国家药品标准要求。具体实施例方式实施例l:山楂内金口服液的含量测定取山楂218g、藏菖蒲141g、荠菜115g、鸡矢藤115g、连翘192g、枇杷叶90g、蝉蜕39g、鸡内金90g。加水浸泡，煎煮二次，第一次1.5小时，第二次l小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至相对密度为1.03-1.06(55~65°C)的清膏，加入蜂蜜、甜蜜素、山梨酸钾，加水至规定量，搅匀，滤过，灌装，灭菌，制成口服液1000ml。鉴别(1)取本品30ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，溶液通过中性氧化铝柱(120目，3g，内径10mm，湿法装柱，用甲醇预洗)，用甲醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取鸡矢藤对照药材3.5g，加水100ml，微沸煎煮30分钟，滤过，滤液浓縮至30ml，同法处理，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5pl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨水(9:2:0.2)为展开剂，展开，取出，晾千，喷以10%硫酸乙醇溶液，置105'C下烘至斑点清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(2)取本品30ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取枇杷叶对照药材3g，加水100ml，微沸煎煮30分钟，滤过，滤液浓縮至30ml，同法处理，残渣加甲醇lml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5^1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已垸-乙酸乙酯-冰乙酸(16:8:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，置105°C下烘至斑点清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(3)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品色谱中应呈现与对照品色谱中主峰保留时间相同的色谱峰。检査相对密度应不低于1.03(中国药典2005年版一部附录VnA)。pH值应为4.0-6.0(中国药典2005年版一部附录VHG)。其他应符合合剂项下有关的各项规定(中国药典2005年版一部附录IJ)。含量测定照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为230nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>对照品溶液的制备取连翘苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每lml含15吗的溶液，即得。供试品溶液的制备取装量项下的本品，混匀，精密量取10ml，精密加入甲醇25ml，密塞，混匀，放置10分钟，滤过，精密量取续滤液20ml，水浴上浓縮至约5ml，用水转移并缓缓加至大孔树脂一中性氧化铝柱(内径2cm，湿法装柱；下部为100200目中性氧化铝5g;上部为高度6cm的预处理好的D101大孔树脂)上，静置10分钟后，以每分钟23ml的流速通过色谱柱，依次用水50ml、20%乙醇溶液80011洗涤，再用50%乙醇溶液80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50%甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各iow，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每支含连翘以连翘苷(C"H340u)计，不得少于100pg。实施例2:山楂内金胶囊的含量测定取山楂1090g、藏菖蒲705g、荠菜575g、鸡矢藤575g、连翘960g、枇杷叶450g、蝉蜕195g、鸡内金450g，加水浸泡12小时后，煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至相对密度为1.20-1.22(60°C)的稠膏，干燥，粉碎成粉末，加入淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，加入滑石粉、硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，制成胶囊1000粒。鉴别(1)取本品内容物2g，加水30ml，置6(TC水浴中温浸30分钟，离心，取上清液转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，溶液通过中性氧化铝柱(120目，3g，内径10mm，湿法装柱，用甲醇预洗)，用甲醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取鸡矢藤对照药材3.5g，加水100ml，微沸煎煮30分钟，滤过，滤液浓縮至30hi1，同法处理，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5pl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲垸-甲醇-浓氨水(9:2:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，置105'C下烘至斑点清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(2)'取本品内容物2g，加水3()ml，置60'C水浴中温浸30分钟，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取枇杷叶对照药材3g，加水100ml，微沸煎煮30分钟，滤过，滤液浓縮至30ml，同法处理，残渣加甲醇lml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5pl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已烷-乙酸乙酉旨-冰乙酸(16:8:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，置105'C下烘至斑点清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。(3)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品色谱中应呈现与对照品色谱中主峰保留时间相同的色谱峰。检查应符合胶囊剂项下有关的各项规定(中国药典2005年版一部附录IL)。含量测定照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为230nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>对照品溶液的制备取连翘苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每lml含15iig的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物，研匀，取lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，加水5ml，水浴上浓縮至约5ml，用水转移至大孔树脂一中性氧化铝柱(内径2cm，湿法装柱；下部为100200目中性氧化铝5g;上部为高度6cm的预处理好的DIOI大孔树脂)上，，以每分钟23ml的流速通过色谱柱，依次用水50ml、20%乙醇溶液80ml洗涤，再用50%乙醇溶液80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50%甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10nl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每粒含连翘以连翘苷(C27H340)计，不得少于70pg。权利要求1、一种山楂内金制剂的含量测定方法，由以下步骤组成一、色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水梯度洗脱，或以25∶75的乙腈-水为流动相，检测波长为277nm或230nm，理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000；二、对照品溶液的制备精密称取连翘苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含15μg的溶液，即得；三、提取液的制备四、提取液的纯化步骤(三)的浓缩液移至大孔树脂-中性氧化铝柱上，器皿用少量水多次洗涤，洗涤液全部移至柱上，以每分钟1～5ml的流速通过色谱柱，依次用水50～150ml、10～25％乙醇溶液60～200ml洗涤，再用50～95％乙醇溶液60～200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇或50％甲醇使溶解，转移至5～25ml量瓶中，加甲醇或50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；五、测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl或20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；其特征在于步骤(三)提取液的制备步骤为取山楂内金口服液，混匀，精密量取5～50ml，精密加入2～3倍体积甲醇，密塞，摇匀，放置10～30分钟，滤过，精密量取续滤液10～50ml，水浴上浓缩至25％±10％体积，作为浓缩液；或取山楂内金胶囊内容物，研匀，取1～5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入10～40倍体积甲醇，密塞，称定重量，超声处理30分钟，冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5～50ml，加所量取体积25％的水，水浴上浓缩至25％±10％体积，作为浓缩液；上述步骤(四)中大孔树脂-中性氧化铝柱内径为1～5cm，下部为50～400目中性氧化铝3～10g，上部为高度3～15cm的预处理好的大孔树脂。全文摘要本发明涉及一种中成药的含量测定方法。由以下步骤组成一、色谱条件与系统适用性试验；二、对照品溶液的制备；三、提取液的制备样品经甲醇提取后，提取液浓缩至低醇或无醇溶液；四、提取液的纯化步骤(三)的浓缩液转移至大孔树脂一中性氧化铝柱上，下部为中性氧化铝，上部为预处理好的大孔树脂，依次用水、10～25％乙醇溶液洗涤，再用50～95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣溶解，定容，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；五、测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl或20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。文档编号A61K36/888GK101167909SQ20071006636公开日2008年4月30日申请日期2007年11月7日优先权日2007年11月7日发明者杨增明申请人:云南本善制药有限公司